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南京农业大学生命科学学院 生物化学技术原理及应用 第八章基因重组与基因分析 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 2 2020 1 9 2 南京农业大学生命科学学院 第一节核酸的分离纯化检测 核酸是遗传信息的携带者 是基因表达的物质基础 无论是进行核酸结构还是功能研究 首先需要对核酸进行分离和纯化 核酸样品质量将直接关系到实验的成败 核酸包括DNA RNA两种分子 在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在 要纯化核酸就必须去除与核酸结合的蛋白质以及多糖 脂类等生物大分子 去除其他不需要的核酸分子 同时要保持所要提取核酸分子的结构和活性不被破坏 核酸的性质 DNA为白色类似石棉样的纤维状物 RNA的纯品呈白色粉末或结晶 核酸和核苷酸大都呈酸味 DNA RNA和核苷酸都是极性化合物 一般都溶于水 不溶于乙醇 氯仿等有机溶剂 它们的钠盐比游离酸易溶于水 呈黏性胶体溶液 在酸性溶液中 DNA RNA易水解 在中性或弱碱性溶液中较稳定 2020 1 9 3 南京农业大学生命科学学院 第一节核酸的分离纯化检测 1 核酸分离 纯化原则保持核酸分子一级结构的完整性意义 遗传信息全部储存在一级结构之中 核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式 分离核酸原则 温度不要过高 控制一定的pH值范围 pH值5 9 保持一定的离子强度 减少物理因素对核酸降解的机械剪切力 2020 1 9 4 南京农业大学生命科学学院 第一节核酸的分离纯化检测 1 核酸分离 纯化原则保持防止核酸的生物降解细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键破坏核酸一级结构 所用器械和一些试剂需高温灭菌 提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂 DNA酶抑制剂金属离子螯合剂 DNA酶需要金属二价离子Mg2 Ca2 的激活 因此使用金属二价离子螯合剂 可抑制DNA酶活性 如EDTA 8 羟基喹啉 阴离于型表面活性剂 如SDS 该试剂除对核酸酶有抑制作用外 还能使蛋白质变性 并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物 该复合物在高盐溶液中沉淀 2020 1 9 5 南京农业大学生命科学学院 保持防止核酸的生物降解RNA酶抑制剂 RNAase分布广泛 极易污染样品 而且耐高温 耐酸 耐碱 不宜失活 皂土 皂土带负电荷 能吸附RNase 使其失活 DEPC 二乙基焦碳酸盐 粘性液体 强核酸酶抑制剂作用机制 与蛋白质中His结合使蛋白变性 使用注意 DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环 但浓度比使蛋白质变性的浓度大100 1000倍 容易降解 保存在4 或液氮中 提RNA时 0 1 DEPC浸泡器皿37 2h 剧毒 其它 肝素 复合硅酸盐 RNase阻抑蛋白 氧钒核糖核苷复合物 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 6 第一节核酸的分离纯化检测 2 核酸提取的过程与原理核酸提取的主要步骤为 裂解细胞 去除与核酸结合的蛋白质以及多糖 脂类等生物大分子 去除其他不需要的核酸分子 如提取DNA分子时 应去除RNA 反之亦然 浓缩沉淀核酸 纯化核酸 去除盐类 有机剂等杂质 检测纯度与质量 核酸的保存保存 2020 1 9 7 南京农业大学生命科学学院 2 核酸提取的过程与原理细胞的破碎细胞破碎的方法有 高速组织捣碎机捣碎 玻璃匀浆器匀浆 超声波处理法 液氮研磨法 化学处理法 SDS LDS 吐温80等 生化法 溶菌酶 纤维素酶等 该过程要在低温下进行 并避免核酸酶对核酸的水解 核蛋白的解聚 变性蛋白的去除核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力 核酸与碱性蛋白的结合 氢键和非极性的范德华力 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开 同时避免核酸降解 核蛋白有核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白两种 针对所提核酸的种类 要选择合适的方法 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 8 核蛋白的解聚 变性蛋白的去除常用方法 加入浓盐溶液 如NaCl 核酸 蛋白质加入NaCl后 破坏静电吸力 使氢键破坏 核蛋白解聚 常选用0 14mol L的氯化钠溶液提取RNP 而选用1mol L的氯化钠溶液提取DNP 加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外 还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能 酚 氯仿抽提 酚 氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果 并对核酸酶有抑制作用 氯仿比重大 能加速有机相与水相分层 减少残留在水相中的酚 同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用 可加上一定量的异戊醇可防止起泡和促使水相与有机相的分离 酚 氯 异戊醉 25 24 1 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 9 核酸的沉淀浓缩核酸和蛋白质分离后 经离心后溶液分为三层 上中下分别是核酸溶液 变性蛋白质凝胶和氯仿 接下来要浓缩核酸 沉淀是浓缩核酸最常用的方法 沉淀的具体方法见第二章 优点 改变核酸的溶解缓冲液 重新调整核酸的浓度 去除溶液中某些盐离子与杂质 一般强调 核酸沉淀在低温长时间下进行 低温长时间沉淀 易导致盐与DNA共沉淀 影响以后的实验 一般使用0 冰水 10 15min DNA样品足可达到实验要求 核酸的纯化得到核酸沉淀后 还要要去除盐类 有机剂等杂质 通常是用乙醇洗涤 由于乙醇易挥发 最后只剩下比较纯的核酸 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 10 核酸的浓度与纯度的测定紫外分光光度法测定DNA和RNA的含量前提 核酸样品要较纯 无显著蛋白质 酚 琼脂糖及其他核酸污染 测定浓度应大于0 25 g ml 结论 在波长260nm紫外光下 1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50 g ml 单链DNA为37 g ml RNA为40 g ml 测DNA 纯的DNA样品OD260 OD280应为1 8 OD260m OD230应大于2 0 OD260 OD280大于1 9时 表明有RNA污染 小于1 6时 表明样品中存在蛋白质或酚污染 OD260 OD230小于2 0时 表明溶液中有残存的盐和小分子杂质 如核苷酸 氨基酸 酚等 可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1 8的情况 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 11 核酸的浓度与纯度的测定紫外分光光度法测定DNA和RNA的含量测RNA纯RNA样品其OD260 OD280应介于1 7 2 0之间 OD260 OD230比值应大于2 0 若RNA样品OD260 OD280比值太小 有蛋白质或酚污染 比值大于2 0时 可能被异硫氰酸胍等污染 OD260 OD230比值小于2 0时表明有小分子及盐存在 溴乙锭荧光法测定核酸的含量如果DNA和RNA的量很少或有较多杂质的情况下 其含量可用溴乙锭荧光法测定 此法的比较主要基于目测 是估计水平 电泳检测核酸的含量和质量通过电泳 可以观察所得核酸样品降解情况 也可以通过与标准Marker亮度比较来估计所得核酸含量 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 12 核酸的保存DNADNA样品溶于pH8 0的TE 4 或 20 保存 长期保存样品中可加入一滴氯仿 RNARNA样品溶于0 3mol LNaAc pH5 2 或双蒸灭菌水中 70 保存 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中 在RNA溶液中 加1滴0 2mol LVRC 氧钒核糖核苷复合物 冻贮于 70 可保存数年 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 13 第一节核酸的分离纯化检测 3 植物总DNA的提取 CTAB法 操作步骤 取2g清洗凉干的新鲜叶片于研钵中 加1 3药匙石英砂和4mL2倍的CTAB提取液 迅速研磨 将1mL研磨液转入1 5mL离心管中 置于65 水浴中保温20min 其间颠倒混匀2 3次 破碎细胞12000r min离心5min 取上清液700 L转到另一离心管中 加入等体积氯仿 异戊醇 24 1 混合液 充分颠倒混匀 12000r min 离心5min 抽提去蛋白将上清液移入新的1 5mL离心管内 加600 L异丙醇 颠倒混匀 可见DNA絮状沉淀 沉淀核酸12000r min 离心1min 倒掉上清液 将离心管倒置干燥 将沉淀回溶于20 LTE缓冲液待测 2020 1 9 14 南京农业大学生命科学学院 3 植物总DNA的提取注意事项 选取新鲜材料 研磨迅速彻底 研磨好的材料应与CTAB抽提液充分混匀 若提取产物有颜色 可能是材料中含有较多的多酚类物质 添加巯基乙醇 尽可能选取幼嫩的材料 收集CTAB与核酸形成的复合物时不要离心过度 否则沉淀再溶解难 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 15 为了获得具有生物活性的天然核酸 在分离制备过程中必须采用温和的条件 避免过酸过碱 剧烈地搅拌 防止热变性 同时还要避免核酸降解酶类的降解 可加少量Rnase降解RNA 第一节核酸的分离纯化检测 4 细菌质粒DNA的提取细菌质粒染色体外小型 1 200kb 的共价 闭合 环状的双链DNA分子 cccDNA 能自主复制并能稳定遗传的遗传因子 常编码一些对宿主有利酶的基因 这些基因的表型包括抗生素抗性 产生抗生素 限制酶 修饰酶等 常用作基因重组的载体 质粒提取要去除的物质 蛋白 基因组DNA 脂类及小分子杂质 RNA 常用的方法有碱裂解法 煮沸裂解等 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤 培养细菌使质粒扩增 收集和裂解细菌 分离质粒DNA 2020 1 9 16 南京农业大学生命科学学院 第一节核酸的分离纯化检测 4 细菌质粒DNA的提取 碱裂解法 碱裂解法的原理 碱裂解法主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们 在碱性PH DNA变性 恢复中性时 线性染色体DNA不能准确复性 与其它大分子共沉淀 而质粒DNA却可以准确复性 留在上清中 碱性下 变性蛋白是可溶的 酸性 中性下变性蛋白不溶而沉淀 几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性 由于操作原因提取的质粒可有三种结构 线形 开环 闭环超螺旋 2020 1 9 17 南京农业大学生命科学学院 4 细菌质粒DNA的提取所用试剂 溶液I 作用 分散细胞 鳌合金属离子使金属酶失活溶液II 作用 细胞壁肽聚糖碱性下水解 核酸和蛋白质变性 溶液III 作用 酸性下质粒DNA复性 变性蛋白 SDS与线性DNA沉淀 K 可中和DNA酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 作用 氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离 平衡酚pH7 8 酸性下DNA分配于有机相 酚的密度大 可使DNA在上清中 异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫 无水乙醇 除去DNA水化层 使DNA沉淀TE缓冲液 溶解DNA 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 18 4 细菌质粒DNA的提取所用试剂 溶液I 作用 分散细胞 鳌合金属离子使金属酶失活溶液II 作用 细胞壁肽聚糖碱性下水解 核酸和蛋白质变性 溶液III 作用 酸性下质粒DNA复性 变性蛋白 SDS与线性DNA沉淀 K 可中和DNA酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 作用 氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离 平衡酚pH7 8 酸性下DNA分配于有机相 酚的密度大 可使DNA在上清中 异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫 无水乙醇 除去DNA水化层 使DNA沉淀TE缓冲液 溶解DNA 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 19 4 细菌质粒DNA的提取提取步骤 取1 5ml培养物倒入eppendorf管中 12000r min 4 离心30秒 弃上清 将管倒置于吸水纸上使液体流尽 将细菌沉淀悬浮于100 l溶液I中 室温下放置5 10分钟 加200 L溶液II 新鲜配制 盖紧eppendorf管 快速温和颠倒5次 混匀内容物 将Eppendorf管放在冰上5分钟 加入150 L溶液III 冰上预冷 盖紧管口 颠倒数次使混匀 冰上放5min 12000r min 离心5min 将上清夜转至另一eppendorf管中 在上清液中加入0 6倍体积的异丙醇 振荡混匀后置于 20 冰箱中放置20分钟 然后4 下离心10分钟 用1ml70 乙醇洗涤质粒DNA沉淀 振荡并离心 倒去上清夜 真空抽干或室温干燥 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 20 4 细菌质粒DNA的提取注意事项制备质粒过程中 所有操作必须缓和 以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 同时也应防止DNase引起DNA的降解 用酚 氯仿混合液除蛋白的效果比单独使用酚或氯仿更好 为充分除去残余蛋白质 可进行多次抽提 直至两相间无絮状蛋白沉淀 提取的各步操作尽量在低温条件下进行 冰浴上 提取用的菌体不宜太多 因菌体多杂酶也相应增加 给提取 纯化带来困难 电泳后得到的DNA条带不整齐 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 21 电泳检测时 可以分离相对分子质量相同但构型不同的质粒分子 共价闭环超螺旋DNA cccDNA 直线DNA LDNA 2条链发生断裂 开环的双链环状DNA ocDNA 1条链发生断裂 第一节核酸的分离纯化检测 5 核酸提取的其他方法胍盐提取结合二氧化硅吸附法 二氧化硅具有特异吸附核酸的特性 异硫氰酸胍可使细胞裂解 因此在高浓度异硫氰酸胍存在下 从细胞 包括细菌 或病毒颗粒中释放出来的核酸成分可以结合在二氧化硅上 利用此特性可提取血液和尿液中DNA和RNA TRIzol试剂提取RNA方法 TRIzol试剂盒是由GIBCOBRI公司推出的产品 其操作方法简单方便 一小时内即可完成 用TRIzol试剂裂解细胞 再加入氯仿 离心后可见三层 上层为透明的水相含有RNA 中间层含DNA 下层为红色的有机相 含蛋白质 2020 1 9 22 南京农业大学生命科学学院 第一节核酸的分离纯化检测 5 核酸提取的其他方法旋转离心柱提取 旋转离心柱技术是用于微量核酸分离纯化的较为简单的方法 属于硅吸附方法的一种 利用裂解液促使细胞破碎 使细胞中的核酸释放出来 把释放出的核酸特异地吸附在特定的硅载体上 这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力 对其他生化成分如蛋白质 多糖 脂类则基本不吸附 因而在离心时被甩出柱子 把吸附在特异载体上的核酸用洗脱液洗脱下来 分离得到纯化的核酸 此法也可用于DNA测序前核酸的纯化 又叫过柱纯化 旋转离心柱技术具有广泛的发展前景 该产品可应用于生物学 遗传学 免疫学 考古学 法医学等各方面的基因分析 2020 1 9 23 南京农业大学生命科学学院 第二节DNA的体外合成 DNA的化学合成 DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物 有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸 目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的 大多数DNA合成仪是以固相磷酰亚胺法为基础设计制造的 1 合成的原理 核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上 然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长 每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作 由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上 所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去 合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基 再经纯化即可得到最终产物 2020 1 9 24 南京农业大学生命科学学院 DNA的化学合成1 合成的原理 核酸固相磷酰亚胺法合成时 末端核苷酸的3 OH与固相载体成共价键 5 OH被4 4 二甲氧基三苯甲基 DMTr 保护 下一个核苷酸的5 OH亦被DMTr保护 3 OH上的磷酸基上有 N C3H7 2和 OCH3两个基团 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 25 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 26 DNA的化学合成2 合成后处理合成后的寡核苷酸链仍结合在固相载体上 且各种活泼基团也被保护基封闭着 要经过以下合成后处理才能最后应用 切割 合成的寡核苷酸链仍共价结合于固相载体上 用浓氨水可将其切割下来 切割后的寡核苷酸具有游离的3 OH 脱保护 切割后的寡核苷酸磷酸基及碱基上仍有一些保护基 这些保护基也必须完全脱去 磷酸基的保护基 氰乙基在切割的同时即可脱掉 而碱基上的保护基苯甲酰基和异丁酰基则要在浓氨水中55 放置15h左右方能脱掉 纯化 纯化的目的主要是去掉短的寡核苷酸片段 盐及各种保护基等杂质 通常采用的纯化方法有电泳法 高效液相色谱法和高效薄层色谱法等 纯化这一步操作是可以选择的 对要求不高的应用如PCR等可不纯化 近年来发展了一些修饰试剂 可在合成寡核苷酸时 对某些核苷酸进行一定的修饰 为寡核苷酸探针的非放射性标记提供了新途径 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 27 第二节DNA的体外合成 聚合酶链式反应 PCR 聚合酶链式反应是上世纪80年代发展起来的一种体外快速扩增特异DNA序列的技术 此技术于1985年由Mullis发明 1988年耐热TaqDNA聚合酶的发现令该技术使用更加方便 有效 PCR可以说是20世纪核酸分子生物学研究领域的最重大发明之一 这不仅表现在该方法本身的简单和巧妙 而且还表现在它的出现高速发展了大量在以前看来似乎不可能的生物学技术 Mullis因其卓越的贡献而获1993年的诺贝尔化学奖 2020 1 9 28 南京农业大学生命科学学院 聚合酶链式反应 PCR PCR的原理 原理类似于DNA的天然复制过程 即在模板DNA 寡核苷酸引物 四种脱氧核糖核苷酸 dNTP 底物和Mg2 存在的条件下 由耐热的TaqDNA聚合酶催化DNA的复制 合成靶DNA PCR包括三个基本过程 变性 加热模板使其解离成单链 退火 降低温度使人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA中所要扩增的靶序列的两侧按碱基配对原则相结合 延伸 在适宜条件下 TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3 端向前延伸 合成与模板碱基完全互补的DNA链 这样变性 退火和延伸构成一个循环 每一次循环的产物可作为下一次循环的模板 经过30 35个循环后 界于两个引物之间的靶序列得到大量复制 拷贝数约增加106 107倍 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 29 聚合酶链式反应 PCR PCR的原理 原理类似于DNA的天然复制过程 即在模板DNA 寡核苷酸引物 四种脱氧核糖核苷酸 dNTP 底物和Mg2 存在的条件下 由耐热的TaqDNA聚合酶催化DNA的复制 合成靶DNA PCR包括三个基本过程 变性 加热模板使其解离成单链 退火 降低温度使人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA中所要扩增的靶序列的两侧按碱基配对原则相结合 延伸 在适宜条件下 TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3 端向前延伸 合成与模板碱基完全互补的DNA链 这样变性 退火和延伸构成一个循环 每一次循环的产物可作为下一次循环的模板 经过30 35个循环后 界于两个引物之间的靶序列得到大量复制 拷贝数约增加106 107倍 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 30 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 31 聚合酶链式反应 PCR PCR的原理 这样变性 退火和延伸构成一个循环 每一次循环的产物可作为下一次循环的模板 经过30 35个循环后 界于两个引物之间的靶序列得到大量复制 拷贝数约增加106 107倍 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 32 典型PCR的反应体系 耐热DNA聚合酶 耐热DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶 TthDNA聚合酶 VENTDNA聚合酶 SacDNA聚合酶 其中Taq聚合酶应用最广泛 Taq酶在92 5 95 和97 5 时半衰期分别为40min 30min和5 6min 故PCR中变性温度不宜高于95 Taq酶的最适温度是72 较高温度下的DNA合成错误率较低 因此一次加酶可满足PCR反应全过程的需要 使PCR走向自动化 纯化的TaqDNA聚合酶有5 3 外切酶活性 而无3 5 外切酶活性 无校对活性 因此在PCR中每2 104个核苷酸中有可能掺入一个错误核苷酸 这对一般的PCR产物分析不会有多少影响 但将PCR扩增产物用于分子克隆时 需使用更准确的DNA聚合酶 在100 L反应体系中 一般需TaqDNA聚合酶0 5 5单位 酶浓度过高 可引起非特异产物的扩增 浓度过低则扩增产物量减少 TaqDNA酶可在 20 贮存至少6个月 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 33 典型PCR的反应体系 PCR反应的缓冲液 PCR的缓冲液一般制成10 含有 500mmol LKCl 100mmol LTris HCl pH8 3 15mmol LMgCl2 0 1 明胶 使用时要稀释10倍 各组分的作用 Tris HCl可维持反应体系的pH KCl有利于引物退火 但浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶活性 明胶可保护酶不变性失活 Mg2 能影响Taq酶的活性 影响反应的特异性和扩增DNA的产率 因此要将Mg2 浓度调至最佳 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 34 典型PCR的反应体系 PCR引物 PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计 引物设计一般遵循以下原则 引物长度 一般为15 30bp 引物太短 就可能同非靶序列杂交得到不需要的扩增产物 G C含量 G C含量一般为40 60 引物的G C含量和引物Tm值应该协调 按公式Tm 4 G C 2 A T 估计引物的Tm值 碱基的随机分布 引物中4种碱基应随机分布 不要多个嘌呤或多个嘧啶连续出现 引物自身不应存在互补序列 以免自身折叠成发夹结构影响与模板的退火结合 两引物之间也不应有互补性 尤其是避免3 端的互补而形成引物二聚体 使靶序列的扩增量下降 引物浓度 引物的浓度一般为0 1 0 5 mol L 引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 35 典型PCR的反应体系 dNTP dNTP常用的浓度为20 200 mol L 而且4种dNTP的终浓度相等 dNTP浓度过高虽可加快反应速度 但会增加碱基的错误参入率 适当的低浓度会提高反应的精确度 另外 dNTP是磷酸根的来源 会与Mg2 结合 应注意协调Mg2 浓度和dNTP浓度之间的关系 模板DNA 模板可以是基因组DNA 质粒DNA 扩增后的DNA cDNA等 RNA的扩增需要首先逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环 含有靶序列的DNA可以单链或双链形式加入PCR混合液 通常小片段模板DNA的PCR效率要高于大分子DNA PCR反应中模板加入量一般为102 105拷贝的靶序列 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 36 典型PCR的反应体系 温度循环参数变性温度一般为在90 95 变性所需的时间取决于DNA的复杂性 一般用94 30s对模板DNA进行变性 过高的温度及过长的时间会降低Taq酶的活性 引物退火温度通过Tm 4 G C 2 A T 计算得到 一般55 80 30s 延伸温度选在70 75 之间 此时Taq酶活性最高 延伸反应的时间根据扩增片段的长度而定 一般1kb以内延伸1min 更长的片段需相应延长时间 PCR的循环次数取决于模板DNA的浓度 一般20 30次 循环次数越多 非特异性产物也越多 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 37 第二节DNA的体外合成 聚合酶链式反应 PCR PCR技术的扩展典型的PCR经过一定的调整可用于特殊的研究工作 使PCR技术扩展到分子生物学的各个方面 较常用的技术扩展有 1 巢式 PCR先用一对引物对模板进行扩增 然后再用另一对引物扩增第一对引物扩增的产物 这一PCR技术即巢式PCR 第一次扩增所用引物称外引物 第二次扩增作用的引物称内引物 进行 巢式 PCR可将外引物设计得比内引物长一些 且用量较少 用外引物进行时 采用较高退火温度使内引物不能与模板结合 故只有外引物扩增 经过若干循环 待外引物基本消耗完毕后 只需降低退火温度即可直接进行内引物的PCR扩增 这种PCR技术被称为 中途进退式 PCR 巢式 及 中途进退式 PCR主要用于极少量模板的扩增 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 38 PCR技术的扩展2 反转录PCR RT PCR PCR由于Taq酶只能以DNA为模板 当待扩增模板为RNA时 需 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 39 先将其反转录为cDNA才能进行PCR扩增 这种PCR技术称为反转录PCR RT PCR常用于基因cDNA文库的构建和基因表达水平的分析 该技术需要用到反转录酶 PCR技术的扩展3 荧光定量PCR RT PCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针 对PCR产物进行标记跟踪 实时在线监控反应过程 结合相应的软件可以对结果进行分析 计算待测样品的初始模板量 萤光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪 通常配有电脑系统及相应的分析软件 荧光定量实时PCR的特点 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 40 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控 能够实时地观察到产物的增加 直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合 提高PCR特异性 增加定量的精确性 全程监控 准确定量 结果分析更加快捷方便 无需跑胶 3 荧光定量PCR RT PCR 基本原理 通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性分析 在实时荧光定量PCR反应中 引入了一种荧光化学物质 随着PCR反应的进行 PCR反应产物不断累计 荧光信号 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 41 强度也等比例增加 每经过一个循环 收集一个荧光强度信号 这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化 从而得到一条荧光扩增曲线图 3 荧光定量PCR RT PCR 基本原理 一般而言 荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段 荧光背景信号阶段 荧光信号指数扩增阶段和平台期 只有在荧光信号指数扩增阶段 PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系 可以选择在这个阶段进行定量分析 实时荧光定量pcr技术中的一些重要因素 Ct值 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 Ct值与起始模板的关系 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系 起始拷贝数越多 Ct值越小 可利用来计算出该样品的起始拷贝数 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 42 3 荧光定量PCR RT PCR 基本原理 实时荧光定量PCR中荧光化学 荧光定量pcr所使用的荧光化学可分为两种 荧光探针和荧光染料 现将其原理简述如下 TaqMan荧光探针 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针 该探针为一寡核苷酸 两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团 探针完整时 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收 PCR扩增时 Taq酶的5 3 外切酶活性将探针酶切降解 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离 从而荧光监测系统可接收到荧光信号 即每扩增一条DNA链 就有一个荧光分子形成 实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步 SYBR荧光染料 在PCR反应体系中 加入过量SYBR荧光染料 SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后 发射荧光信号 而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 43 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 44 TaqMan荧光探针 SYBR荧光染料 PCR技术的扩展4 复合PCR在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段的方法称复合PCR 复合PCR主要用于同一病原体分型及同时检测多种病原体 此外也常用于多点突变性分子病的诊断 5 不对称PCR两种引物比例相差较大的PCR称不对称PCR 不对称PCR可制备用于核酸序列分析的单链DNA片段或核酸杂交探针等 6 涂片PCR直接对载玻片上细胞涂片或组织切片进行PCR扩增的方法称涂片PCR 涂片PCR结合原位杂交技术特别适用于病理切片中含量较少的靶序列的PCR检测 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 45 PCR技术的扩展7 反向PCR 扩增引物相反方向DNA序列的PCR技术称反向PCR 在反向PCR中 要先将含有一段已知序列的感兴趣的未知DNA片段进行酶切和环化 然后直接进行PCR 也可将已知序列酶切后再进行PCR 反向PCR主要用于已知序列两翼未知DNA序列的扩增 8 锚定PCR用酶法在一通用引物反转录的cDNA3 端加上一段已知序列 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行PCR扩增称为锚定PCR 可用于未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建 9 修饰引物PCR为达到某些特殊应用目的如定向克隆 定点突变 体外转录及序列分析等 可在引物的5 末端加上酶切位点 突变序列 转录启动子及序列分析物结合位点等 这种PCR技术称为修饰引物PCR 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 46 第三节核酸序列测定 DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列 也就是核苷酸排列方式 RNA测序则通常将RNA提取后 反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序 在分子生物学研究中 DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础 目前应用最广泛的是 Sanger双脱氧链终止法 Maxam GilbertDNA化学降解法 新技术 杂交测序法 质谱法 单分子测序法 原子探针显微镜测序法 DNA芯片法 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 47 第三节核酸序列测定 Sanger双脱氧链终止法基本原理 在模板指导下 DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3 OH末端 使引物延长 合成出新的互补的DNA链 如果加入双脱氧三磷酸核苷 ddNTP 由于双脱氧核糖的3 位置上缺少一个羟基 故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键 即形成一种全部具有相同5 引物端和以ddNMP残基为3 端结尾的一系列长短不一片段的混合物 由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA 从而读取DNA核苷酸序列 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 48 Sanger双脱氧链终止法基本原理 测序所用的ddNTPddNTPs是反应终止剂 可以当作正常碱基参与复制 一旦链入DNA中 其后就不能再继续连接 反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs 一般1 3 4 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 49 在自动测序中将荧光素连在4种ddNTP上 Sanger双脱氧链终止法基本步骤 测序模板的纯化与定量测序反应 PCR仪测序反应产物纯化与变性上样电泳 测序仪分析结果 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 50 2020 1 9 51 南京农业大学生命科学学院 2020 1 9 52 南京农业大学生命科学学院 毛细管电泳荧光检测 Sanger双脱氧链终止法测序结果 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 53 DNA测序仪的多种应用 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 54 第三节核酸序列测定 Maxam GilbertDNA化学降解法基本原理 在一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解 其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基 因此生成一系列放射性标记的分子 从共同起点 放射性标记末端 延续到发生化学降解的位点 每组混合物中均含有长短不一的DNA分子 其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置 此后 各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离 再通过放射自显影来检测末端标记的分子 鲜明特点是可以探测DNA构象中的蛋白质 DNA相互作用 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 55 Maxam GilbertDNA化学降解法基本原理 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 56 化学降解法与双脱氧法的比较Maxam Gilber化学降解法所能测定DNA序列的长度要比Sanger法短一些 通常说来 化学降解法对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳 如今双脱氧核苷酸末端终止法远比Maxam Gilbert化学降解法应用得更为广泛 但是 化学降解法具有一个Sanger法所不具备的明显优点 即所测核酸序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝 因此 利用Maxam Gilbert法可以对合成的寡核苷酸进行测序 分析诸如甲基化等DNA修饰的情况 也可以通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用 然而 由于Sanger法的简便快速 仍不失为现今DNA测序的最佳选择方案 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 57 第三节核酸序列测定 基因组测序在大规模DNA测序中 目标DNA分子的长度可达上百万个bp 现在还不能直接测定整个分子的序列 然而 可以得到待测序列的一系列序列片段 序列片段是DNA双螺旋中的一条链的子序列 或子串 这些序列片段覆盖待测序列 并且序列片段之间也存在着相互覆盖或者重叠 在一般情况下 对于一个特定的片段 我们不知道它是属于正向链还是属于反向链 也不知道该片段相对于起点的位置 另外 这样的序列片段中还可能隐含错误的信息 序列片段的长度范围300 1000bp 而目标序列的长度范围是3 100万bp 总的片段数目可达上千个 DNA序列片段组装 又称序列拼接 的任务就是根据这些序列片段 重建目标DNA序列 如果能够得到DNA一条链的序列 那么根据互补原则 另一条链的序列也就得到了 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 58 基因组测序基因组的测序过程一般包括三个步骤 建立克隆的物理图谱 如酵母人工染色体YAC克隆 细菌人工染色体BAC克隆等 利用鸟枪法测定每个克隆的序列 序列拼装和注释 当得到一段DNA序列之后 可以利用序列分析工具 进行序列的拼接 继而通过与数据库序列的比较 得到与该序列相关的信息 进而对序列的生物学特性进行注释 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 59 鸟枪测序法 大分子DNA被随机地 敲碎 成许多小片段 收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体 小片段测序完成后 根据重叠区计算机将小片段整合出大分子DNA序列 这就是所谓的鸟枪测序法 基因组测序鸟枪法测序的缺点随着所测基因组总量增大 所需测序的片段大量增加 造成重复测定 也易丢失某些序列 且数据处理分析工作量大 高等真核生物 如人类 基因组中有大量重复序列 导致判断失误 引物步移策略将待测DNA片断克隆在质粒载体上 利用引物步移延伸 从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定 直至另一端为止 克服了鸟枪法的盲目性 并省去亚克隆制备步骤 也减轻了数据分析工作量 但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基顺序 才能合成适当的引物进行测序 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 60 第四节分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物中最常用的基本技术之一 其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下按碱基互补原则退火形成双链 此杂交过程是高度特异性的 但杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补 杂交的双方是待测核酸序列及探针 将核酸从细胞分离纯化后可在体外与探针杂交 也可直接在细胞或组织内进行原位杂交 用于检测的已知核酸片段称之为探针 probe 为了便于示踪 探针必须用一定的手段加以标记 以利于随后的检测 常用的标记物是放射性核素 近年来也发展了一些非放射性标记物 检测这些标记物的方法都是极其灵敏的 核酸分子杂交技术被广泛应用于基因克隆的筛选和酶切图谱制作 基因组中特定基因序列的定量和定性检测 基因突变分析以及疾病的诊断等方面 它的应用也大大推进了分子生物学的迅猛发展 如基因芯片就是分子杂交技术进一步扩展的产物 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 61 第四节分子杂交 核酸分子杂交的发展分类 液相杂交 Hall等1961年将探针与靶序列在溶液中杂交 通过平衡密度梯度离心分离杂交体 该法很慢 费力且不精确 但它开拓了核酸杂交技术的研究 固相杂交 Bolton等1962年设计了第一种简单的固相杂交方法 称为DNA 琼脂技术 膜杂交 60年代中期Nygaard等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素 NC 膜上的DNA序列奠定了基础 Brown等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基因的拷贝数 原位杂交 Orth 1970 应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交 首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 62 第四节分子杂交 1 探针探针 带有供反应后检测的合适标记 并仅与特异靶分子结合 探针的种类与选择 根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类 根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针 RNA探针 cDNA探针 cRNA探针及寡核苷酸探针等几类 DNA探针还有单链和双链之分 探针选择正确与否 将会直接影响到杂交结果的分析 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 63 1 探针DNA探针DNA探针指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针 现已获得DNA探针数量很多 有细菌 病毒 原虫 真菌 动物和人类细胞DNA探针 这类探针多为某一基因的全部或部分序列 这些DNA片段须是特异的 DNA探针的优点 这类探针多克隆在质粒载体中 可以无限繁殖 取之不尽 制备方法简便 DNA探针不易降解 相对RNA而言 一般能有效抑制DNA酶活性 DNA探针的标记方法较成熟 有多种方法可供选择 如缺口平移 随机引物法 PCR标记法等 能用于同位素和非同位素标记 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 64 1 探针cDNA探针 cDNA中由于不存在内含子及其它高度重复序列 因此是一种较为理想的核酸探针 但cDNA探针不易获得 从而限制了它的广泛应用 另外 还须注意其中的poly dT 产生的非特异性杂交问题 制备方法 RT PCR RNA探针mRNA作为探针的优点是 RNA RNA和RNA DNA杂交体的稳定性较DNA DNA杂交体的稳定性高 因此杂交温度可提高10 左右 杂交的特异性更高 RNA中不存在高度重复序列 非特异性杂交较少 杂交后可用RNase将未杂交的探针消化掉 从而使本底降低 但是 RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解 mRNA作为探针 其来源极不方便 因此 一般通过cDNA克隆 甚至基因克隆经体外转录而得到mRNA样或anti mRNA样探针 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 65 1 探针反义RNA探针通过改变外源基因的插入方向或选用不同的RNA聚合酶 可以得到同义RNA探针和反义RNA探针 反义RNA又称cRNA 可用于反义核酸研究 还可用于检测mRNA的表达水平 因为探针和靶序列均为单链 所以杂交的效率要比DNA DNA杂交高几个数量级 RNA探针除可用于检测DNA和mRNA外 还可以在研究基因表达时 常常需要观察该基因的转录状况 前述几种探针均是可克隆的 优点 在DNA序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时 因为克隆探针较寡核苷酸探针特异性强 较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列少 可获得较强的杂交信号缺点 较长的探针对于靶序列变异的识别能力又有所降低 这既是其优点 又是其缺点 优点是当用于检测病原微生物时 不会因病毒或细菌DNA少许变异而漏诊 缺点则是不能用于点突变的检测 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 66 1 探针寡核苷酸探针 寡聚核苷酸探针可根据需要随心所欲地用DNA合成仪合成 避免了天然核酸探针中高度重复序列所带的不利影响 寡核苷酸探针长度只有15 30bp 其中即使有一个碱基不配对也会显著影响其Tm 因此它特别适合于基因点突变分析 另外 由于序列的复杂性降低 因此杂交所需时间也较短 优点 由于链短 其序列复杂度低 所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短 寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化 因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值 一次可大量合成寡核苷酸探针 1 10mg 使得这种探针价格低廉 与克隆探针一样 寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 67 1 探针寡核苷酸探针应用寡核苷酸针的原则长18 50nt 较长探针杂交时间较长 合成量低 较短探针特异性会差些 碱基成分 G C含量为40 60 超出此范围则会增加非特异杂交 探针分子内不应存在互补区 否则会出现抑制探针杂交的 发夹 状结构 避免单一碱基的重复出现 不能多于4个 如 CCCCC 一旦选定某一序更符合上述标准 最好将序列与核酸库中核酸序列比较 探针序列应与含靶序列的核酸杂交 而与非靶区域的同源性不能超过70 或有连续8个或更多的碱基的同源 否则 该探针不能用 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 68 第四节分子杂交 2 标记物放射性核素标记物常用于标记核酸探针的放射性核素有32P 3H和35S 有时也用14C 125I以及131I等 各种放射性核素的适用范围是由其物理特性所决定的 32P释放的 粒子能量高 穿透力较强 放射自显影所需时间短 灵敏度高 被广泛应用于各种滤膜杂交以及液相杂交中 特别适合于基因组中单拷贝基因的检测 其缺点是半衰期短 射线散射严重 导致X 片上带型轮廓不清 有时会影响到结果的分析 35SS原子可以取代磷酸分子上的一个氧原子 从而形成35S标记的核苷酸分子 其检测灵敏度较32P稍低 由于其射线的散射作用较弱 在X 光胶片上成影分辨率较高 另外 35S的半衰期较32P长 是其受欢迎的原因之一 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 69 2 标记物非放射性核素标记物根据其检测方法 非同位素标记物可分为以下几类 半抗原 目前使用较多的非放射性标记物是生物素和地高辛 它们都是半抗原 可以利用这些半抗原的抗体进行免疫检测 配体 生物素还是一种抗生物素蛋白 卵白素 avidin 和链霉菌类抗生物素蛋白 streptavidine 的配体 可以利用亲和法进行检测 荧光素 如FITC 罗丹明类等 可以被紫外线激发出荧光进行观察 主要适用于细胞原位杂交 化学发光 一些标记物可与另一物质反应而产生化学发光现象 可以象放射性核素一样直接对X 光胶片进行曝光 这类标记物可能是今后研究的主流 光密度或电子密度标记物 如金 银等 适用于细胞原位杂交 可在光镜下或电镜下进行观察 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 70 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 71 酶促生物素标记技术 第四节分子杂交 3 探针标记法探针的放射性核素标记切口平移法 线状 超螺旋及带缺口的环状双链DNA均可作为切口平移法的模板 首先 极微量的DNaseI在Mg2 的存在下 在DNA链上随机形成单链切口 利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5 3 核酸外切酶活性在切口处将旧链从5 末端逐步切除 同时 在DNA聚合酶I的5 3 聚合酶活性的催化下 在切口的3 末端 OH上合成新的DNA单链 如果在反应液中含有一种或多种标记的核苷酸 如32P dCTP 则这些标记的核苷酸将替代原来的核苷酸残基 从而形成高放射活性的DNA探针 2020 1 9 南京农业大学生命科学学院 72 3 探针标记法探针的放射性核素标记随机引物法 随机引物是含有各种可能排列顺序的寡核苷