（食品科学与工程专业论文）葡萄糖6磷酸脱氢酶在桃果实花色苷合成中的作用.pdf

中国农业大学博：l 学位论文 中文摘要 果实色泽是果实重要的外观品质，而且是影响加：i 产品的重要因素。果实成熟过程中，颜色 的形成足一个复杂的生理生化过f ，! ，受遗传、环境等吲素的调节控制。目前，有关果实花色苷的 研究热点之一为类黄酮代谢途径_ ；f | | 苯丙烷类代谢途径。花色苷合成的前体物质一苯丙氮酸是莽 草酸途径的一个产物，而氧化戊糖磷酸途径( o p p p ) 为莽草酸途符提供赤藓糖- 4 磷酸等。作为 o p p p 的关键酶，葡萄糖6 一磷酸脱氯酶( g 6 p d h ) 在低温、紫外等环境条件下被显著诱导表达。 但是，在果实花色营形成的研究中，尚未见g 6 p d h 所起作用的报道。本文以桃粜实为试材较 为系统地研究了g 6 p d h 在桃果实中的分布、分子量和活性调h ，以及在调控花色苷形成中的作 州。主要结果如下： ( 1 ) 通过不同离心力分离桃果肉细胞组分，对比细胞质和质体标志酶与g 6 p d h 活性及其恢 复率，研究了桃果实中g 6 p d h 活性分布和分子最，结果表明，1 5 ，0 0 0g 能够分离开细胞质和质 体组分，并可以保持质体的完整。细胞质和质体中都有g 6 p d h 活性。对不同的编分进行 s d s p a g e 、n a t i v e p a g e 币免疫印迹分析，检测到桃果实中g 6 p d h 基为7 2k d a 利6 1k d a ， 而在细胞质中只自一条7 2k d a 的砸基：完整的g 6 p d h 大小为2 5 2k d a 刊l3 8k d a 。推洲桃果丈 g 6 p d h 由四个亚基或者两个t 基组成。 ( 2 ) 通过对桃果实的果皮和粜肉维管束，进行了g 6 p d h 的胶体金免疫电子显微镜细胞定 位，结果显示，g 6 p d h 主要分布于绌胞质、叶绿体、有色体和维管组纵加厚的次生鼬巾，而不 存在1 j 淀粉粒、液泡和初生细胞罐中。在转色期的桃果实中，叶绿体转变为有色体，而且其中 g 6 p d h 密度显墙增加：维管组织的韧皮薄晕细胞中出现很多有色体，大嚣g 6 p d h 胶体金颗粒出 现在其中。 ( 3 ) 自然生艮的桃果实j 转色期，细胞质和质体- pg 6 p d h 活性都增加，而且质体g 6 p d h 数量增加显若，苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 活性也什随g 6 p d h 活性增加而增加之后花色苗等酚 类物质迅速积累。套袋处理4 0d 后摘袋的果实，g 6 p d h 数量和活性明显增加，苯丙氨酸解氨酶 ( p a l ) 活性也伴随增加，果皮。i t 花色苷等酚类物质也迅速积累。 ( 4 ) 利川来自于野生薯芋中的、能够抑制动物血红细胞g 6 p d h 的抑制剂d h e a ，处理 套袋4 0d 的果实结粜显示，d h e a 能够抑制桃果皮中g 6 p d h 活性，并且抑制果皮中花色苜含 量的增加，表明g 6 p d h 在花色苷等酚类物质台成中具有重要作用。 ( 5 ) 在o p p p 途径中，g 6 p d h 的底物葡萄糖一6 磷酸平产物6 一磷酸葡萄糖酸，能够明显提高 p a l 活性，而h 增加总酚年总类黄酮含量。通过免疫定位显示，p a l 土要分布丁桃果肉细胞质、 川绿体、有色体咀及维管纠纵细胞的加厚次生肇中，而不存在丁淀粉粒、液泡利初生细胞掣中， 结粜表明p a l 羊g 6 p d h 具有相同的亚细胞分医。 ( 6 ) g 6 p d h 片段的克隆：通过r t - p c r 方法和数据库资料，殴计简j f 引物，扩增得剑6 2 0b p 的桃细胞质g 6 p d h 片段，与马铃薯( n o x 7 4 4 2 1 ) 、烟草( n o a j 0 0 7 7 0 ) 和拟南芥( n o a j 0 1 0 9 7 0 ) 细胞质g 6 p d h 同源性达刨8 97 2 ，可以川作桃果实细胞质g 6 p d h 的探针。 ( 7 ) g 6 p d h 平| p a l 对蔗糖的吣同响应：以双层果实袋对桃果实套袋处理4 0d ，在白然生| 王= 桃转色之前采摘，以这些桃果实的果皮为试验材料，建立蔗糖温育试验系统。结果表明，2 0 0m m 蔗糖能诱导桃果皮细胞质g 6 p d h m r n a 以及蛋a 数量和活性都增加，p a l 活性和数量也相应增 加，花色“h - - 等酚类物质含量也伴随增加。 关键词：桃果实，葡萄糖6 磷酸脱氢酶，花色甘，糖，苯丙氨酸解氨酶 中国农业大学博i j 学位论文 a b s t r a c t f r u i tr e dc o l o ri so n eo fi m p o r t a n tq u a l i t i e s ，a n dh a sar o l ei np r o d u c t sp r o c e s s e df r o mf r u i t t h e r e dc o l o r a t i o ni sac o m p l e xd e v e l o p m e n t a lp r o c e s sd u r i n gf r u i tm a t u r e ，a n di sc o n t r o l l e da n dr e g u l a t e d b yg e n e sa n de n v i r o n m e n t sf a c t o r s a n t h o c y a n i nb i o s y n t h e s i sh a sb e e ne x t e n s i v e l ys t u d i e di nm a n y p l a n ts p e c i e s ，h o w e v e r , d e t a i l e di n f o r m a t i o no ft h ec o u r s eo fr e a c t i o nf o c u s e so nt h ep h e n y l p r o p a n o i d p a t h w a y a sp r e c u r s o ro ft h ep h e n y l p r o p a n o i dp a t h w a y , l - p h e n y l a l n i n ei ss y n t h e s i z e db yt h es h i k i m a t e p a t h w a y a n dt h eo p p pp r o v i d e sk e yi n t e r m e d i a r ym e t a b o l i t e sf u ro t h e rp a t h w a y s ，f u re x a m p l e ， e r y t h r o s e - 4 一p h o a p h a t ei sas u b s t r a t eo ft h es h i k i m a t ep a t h w a yt h eg l u c o s e - 6 p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ( g 6 p d h ，e c1 i 14 9 ) ，t h er a t e - l i m i t i n ge n z y m eo ft h eo p p ri si n d u c e di nu vl i g h ta n dd a r kc h i l l i n g h o w e v e r , v e r yt i t t l ei sy e tk n o w na b o u tt h ef u n c t i o n so fg 6 p d hi nf r u i td e v e l o p m e n ts o m ew o r k so f g 6 p d hw e r ec a r r i e do u ta b o u tt h es u b c e l l u l a rd i s t r i b u t i o n ，w e i g h tm a s s ，e n h a n c e m e n to fa n t h o c y a n i n b i o s y n t h e s i s ，a n dc o - i n d u c t i o nw i t hp a l ，a n dd e s c r i b e da sf o l l o w s ， ( 1 ) t h ew e i g h tm a s so fg 6 p d hi np e a c hf r u i t ：f r u i tt i s s u e sc o u l db es e p a r a t e db y1 5 ，0 0 0g c e n t r i f o g a t i o ni n t op l a s t i d i c a n d c y t o s o l i cf r a c t i o n s ，t h ep r o p o r t i o no ft h et o t a l g 6 p d ha c t i v i t y r e c o v e r e di nt h ep e l l e tw a sc o m p a r e dw i t ht h a to f t h ep l a s t i d i ca n dc y l o s o l i cm a r k e re n z y m e s s d s - a n d n a t i v e - p a g ea n a l y s e ss h o w e dt h a th a dt w oi s o e n z y m e so fg 6 p d hi np l a s t i d ，a n de a c hi s o e n z y m ew a s c o m p o s e do f7 2k d aa n d6 1k d ap e p t i d e sw i t ht h em o l e c u l a rm a s s2 5 2k d aa n d1 3 8k d a i tw a s s u p p o s e dt h a tt h ep e a c hg 6 p d h sc o n s i s t e do f f o l i tr t w oo f 7 2k d aa n dt w oo f 6 1k d a la n dt w os u b u n i t s ( o n eo f 7 2k d aa n do n eo f 6 tk o a ) ( 2 ) t h es u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o no fg 6 p d hi np e a c hf r u i t ：i m m u n o g o l de l e c t r o n - m i c r o s c o p e l o c a l i z a t i o ns t u d yr e v e a l e dt h a tg 6 p d hi s o e n z y m e sw e r em a i n l yp r e s e n ti nt h ec y t o s o l ，t h es e c o n d a r y w a l la n dc h l o r o p l a s t sa n dc h r o m o p l a s t s ，b u tw e r es c a r c e l yf o u n di nt h es t a r c hg r a n u l e sa n dt h ec e l lw a l l i n p e a c hf r u i t u pt ot h ef r u i tm a t u r es l a g e ，t h es t r u c t u r eo fc h l o r o p l a s te n t i r e l yd i s a p p e a r e d ，a n dt h e a m o u n to fi m m u n o g o l dp a r t i c l e sw a ss i xt i m e sa st h a to ft h ef r u i ta th a r de n d o c a r ps t a g e a n dap l e n t y o f g 6 p d hp a r t i c l e sw e r ep r e s e n ti nc h r o m o p l a s t si np h l o e mc e l lo f v a s c u l a r t i s s u e ( 3 ) t h ea c t i v i t ya n da m o u n to fg 6 p d hi nn o n - b a g g e dn a t u r a lf r u i t sw a sh i g ha ty o u n gf r u i ts t a g e a n da tf u l lr i p e ns t a g ew h e na n t h o c y a n i na c c u m u l a t e d t h ea c t i v i t ya n da m o u n to fg 6 p d hi nb a g g e d f r u i t sr e a c h e dap e a ku n d e rs u n l i g h ti r r a d i a t i o n ，a n da tt h es a m et i m et h ea n t h o c y a n i na c c u m u l a t i o n i n c r e a s e dr a p i d l yt h ec h l o r o p l a s t sw e r eg r a c i l ea n dp r o c r e a t e db yc l e a v a g ew i l hb a g g i n gt r e a t m e n ta t y o u n gf r u i ts t a g e ，t h e nt h et h y l a k o i ds t r u c t u r eb r o k eu pw i t hl e n g t h e no fb a g g i n gt i m e ，a n dt h ea m o u n t o fi m m u n o g l o dp a r t i c l e si n c r e a s e dr a p i d l y ，a n dd e c r e a s e da tt h ei n i t i a lr i p e ns t a g e ，t h e ni n c r e a s e da tf u l l r i p e ns t a g eo ra f t e rb a gb e i n gr e m o v e d ( 4 ) d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e ( d h e a ) ，f r o m m e x i c a nw i l dy a m ，w h i c hc o u l di n b i b i t g l u c o s e - 6 p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ( g 6 p d h ) i nr e db l o o dc e l l ，c o u l di n h i b i tt h ea c t i v i t yo fg 6 p d hi n p e a c hf r u i ta n dc a u s e dad e c r e a s ei na n t h o c y a n i np r o d u c t i o n ( 5 ) t h ea c t i v i t yo fp a li nf r u i tw i t hg l u c o s e ，g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e ( s u b s t r a t ef o rg 6 p d h ) a n d 6 - p h o s p h a t e g l u c o n a t e ( p r o d u c tf r o mg 6 p d h ) i n c u b a t i o ni n c r e a s e d ，i nc o n c e r to na c c u m u l a t i o no f t o t a l v a b s t r a c i p h e n o l sa n dt o t a lf l a v o n o i d s a n dp a li s o e n z y m e sw e r em a i n l yp r e s e n ti n t h ec y t o s o l ，t h es e c o n d a r y w a l la n dp l a s t i d s ，b u tw e r es c a r c e l yf o u n di nt h e s t a r c hg r a n u l e sa n dt h ec e l lw a l li np e a c hf r u i t t h e s a m ec o m p a r t m e n to fg 6 p d ha n dp a la tt h es u b c e l l u l a rl e v e li sc o n v e n i e n tf o rt h e s ee n z y m e s c o e x p r e s s i o n ( 6 ) c l o n i n go fc y t o s o l i cg 6 p d hf r a g m e n t ：d e g e n e r a t ep r i m e r sb a s e dt h r e eh i g h l yc o n s e r v e d r e g i o n s i nt h e c y t o s o l i cg 6 p d hs e q u e n c e f r o ms o l a n u mt u b e r o s u m ，n i e o t i a n at a b a c u m ，a n d a r a b i d o p s i st h a l i a n aw e r eg e n e r a t e d p c rp r o d u c to f6 2 0b pw e r ec l o n e da n ds e q u e n c e d ，a n dh i g h e r h o m o l o g y ( 8 9 7 2 ) o fp c rf r a g m e n ti ss h a r e dw i t ht h r e es e q u e n c e sa b o v e a n dt h i sp a i ro fp r i m e r s c o u l db eu s e da ss p e c i f i cp r i m e r sf o rg 6 p d ht r a n s c r i p ta n a l y s e s ( 7 ) c o i n d u c t i o no fg 6 p d ha n dp a lb ys u c r o s ei n c u b a t i o n ：u s i n gt h et e c h n i q u eo f nv i v o i n c u b a t i o no ft h ep e a c hf r u i t ( b e i n gb a g g e df o r4 0d ) d i s k si nt h e2 0 0m ms u c r o s e c o n t a i n e dm e d i u m ， t h ee f f e c to fs u c r o s eo ng 6 p d ha n dp a lw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts u c r o s ec o u l di n d u c e t h ee n r i c h m e n to fg 6 p d hm r n aa n dt h es y n t h e s i so fn e wg 6 p d hp r o t e i n ，a n di n c r e a s eo fi t sa c t i v i t y a n dt h et i m e c o u r s ec u r v e so fp a la n dg 6 p d he x p r e s s i o nw e r es i m i l a r , w h i c hi m p l i e dt h a tt w o e f l z y n l e sw e r ec o - e x p r e s s e di nc o f l c t 州o ns u c r o s es t i m u l a t i o n k e y w o r d s ：p e a c hf r u i t ，g l u c o s e 一6 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ，a n t h o c y a n i n ，s u g a r , p h e n y l a l a n i n e a m m o n i a - l y a s e x 中国农! l k 大学博士学位论文 缩略语表 英文缩写 4 c l 6 p g d h a m p a n s a t p b c l p b s a c 4 h c d n a c h i c h i c h r c h s c 1 a b c w c v t d a f b d a h p s d e p c d f r d h e a d t t e d t a f 3 h f l s f n r g 6 p d h g l c 6 p g p t h e p e s h k i g g l p t g m e s n n a d p h n a ， v a b b r e v i a t i o n 英文名称 4 - c o u m a r a t e ：c o e n z y m eal i g a s e 6 - p h o s p h o g l u c o n a t ed e h y d r o g e n a s e a r n p i c i l l i n a n t h o c y a n i ns y n t h a s e a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e 5 - b r o m o 一4 一c h l o r o 3 - i n d o l y lp h o s p h a t e b o v i n es e r u ma l b u m i n c i n n a m a t e - 4 - h y d r o x y l a s e c o m p l e m e n t a r yd n a c h a l c o n ei s o m e r a s e c h l o r o p l a s t c h r o m o p l a s t c h a l c o n es y n t h a s e c e t y lt r i e t h ya m m o n i u mb r o m i d e c e l l w a l | c y t o p l a s m d a y sa f t e rf u l lb l o o m 3 - d e o x y - d a r a b i n o h e p t u l o s o n a t e7 - p h o s p h a t es y n t h a s e d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e d _ 1 1 y d r o n a v o n o l4 - r e d u c t a s e o e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e d i t h i o t h r e i t o l e t h y l e n e d i a m i n et e t r a - a c e t i ca c i d f l a v a n o n e3 - h y d r o x y l a s e f l a v o n o ls y n t h a s e f e r r e d o x i n n a d pr e d u c t a s e g l u c o s e - - 6 - - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e g l u c o s e 一6 一p h o s p h m e g l c 6 p ，p h o s 曲a t et r a n s l o c a t o r 4 - r 2 一h y d r o x y e t h y l ) p i p e r a z i n ee t h a n e s u l f o n i ca c i d h e x o k i n a s e i m m u n o g o l b u l j ng l s o p r o p y l t h i o b d g a l a c t o p y r a n o s i d e 2 - ( n m o r p h o i n e o ) a h a n es u l f o n i ca c i d n u c l e u s n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l u o t i d ep h o s p h a t es o d i u m s a l t n b t n i t r ob l u et e r a z o l i u m 中文名称 4 香豆酰：辅酶a 迮接酶 6 磷酸葡萄糖酸脱氢酶 氨卞青霉素 花色素台成酶 三磷酸腺苷 5 溴4 一氯3 哼| | i 朵磷酸 牛血清蛋向 肉梓酸一4 一羟化酶 互：补d n a 查耳酮异构酶 叶绿体 有色体 布耳酮合成酶 十六烷基二乙基溴化铵 细胞壁 细胞质 盛花后天数 3 脱氧d 阿拉伯庚酮糖7 磷酸合成酶 焦炭酸二乙酯 二氢黄酮醇还原酶 脱氢异雄酮 二硫费：糖醇 乙二胺四乙酸 黄烷醇3 羟化酶 黄烷醇台成酶 铁氧还蛋i 刍- n a d p 还原酶 葡萄糖6 。磷酸脱氢酶 葡萄糖6 一磷酸 葡萄糖，磷酸转运子 己糖激酶 免疫球蛋向 异丙基b ，d 硫代、r 乳糖甘 二一( n 吗啡啉) 一乙磺酸 细胞核 烟酰胺腺嘌吟核苷酸磷酸 钠 氮监四唑 缩略语表 n c n i t r a t ec e l l u l o s e 硝酸纤维索 n u n u c l e o l u s核仁： o p p p o x i d a t i v ep e n t o s ep h o s p h a t ep a t h w a y 氧化戊糖磷酸途径 p p a s t i d质体 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p a l p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e 苯丙氮酸解氨酶 p c r p o l y m a e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p m s fp h e n y 】m e n f h y 】s uj f o n y jf l u r i d e 苯甲磺酰氟 p m s p h e n a z i n em e t h o s u l f a t e 吩嗪硫酸甲酯 p p p h l o e mp a r e n c h y m ac e l l 韧皮部薄壁细胞 p v pp o l y v i n y lp y r r o l d i o n e 聚乙烯吡咯烷酮 r t - p c rr e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m a e r a s ec h a i nr e a c t i o n 反转录- 聚合酶链式反应 s c w s e c o n d a r yc e l lw a l l次生壁 s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 s g s t a r c hg r a i n 淀粉粒 t r i s t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) 一a m i n om e t h a n e 三鞲甲基氮基甲烷 t r i t o nx 一1 0 0 p o l y x y e t h y l e n e - ( 9 ，1 0 ) - p t o c t o p h e n o l u f g a l tu d pg a l a c t o s e ：f l a v o n o i d3 - o - g a 汕r a n s 触”5 乳鬻铲酮糖苷转 u f g l u t u d pg i u c o s e ：f l a v o n o i d3 侧u c os y l t r a n s f e u d p 葡糖鬻酮糖惭澎 v v a c u o l e 液泡 x - g a l 5 - b r o m o - 4 c h i 。r 0 _ 3 抽d 。i y lp d g a t 吲d e 5 - 溴4 氯。裂哚。p 1 d ! 乳 v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加咀标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名獬商时间：2 0 0 6 年6 月8 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：a 行差府 时间：矽，年，月，占日 翩躲、嘭o 、 甜 时间：z 卅移年占月f 多日 第一章引言 农产品1 j h _ 1 2 产品的色泽是重要的质量因素。果实色泽是果实重要的外观品质，除了影响人们 的购买欲望还对果实j j n - l r = n k n i ( 如红葡萄酒) 的品质具有重要影响( k e l l e r 等，1 9 9 8 ：b o u l t o n 等，2 0 0 1 ) 。成熟果实中的色素主要包括类胡萝h 索，如前茄( 朱澈和方昭希，1 9 9 5 ：b r a m l e y , 2 0 0 2 ) 或者花色苷，如苹果、葡萄和桃等( h o n d a 等，2 0 0 2 ；j i a 等，2 0 0 5 ) 。其中，花色营是一类重要 的类黄酮，受到人j f i 3j 泛关注。果实花色苛的形成，除了受遗传因素的控制之外，光照、水分、 矿物质和激素等对果实着色也具有重要的调：仃作用( c r i p p e n 等，1 9 8 6 ；b e n t a l 和k i n g ，1 9 9 7 ) 。 在果实、花瓣以及一些植物的根、茎等组织中，糖含鼙比较高时，一般形成的花色苷就多( h r a z d i n a 等，1 9 8 4 ：j a m a lu d d i n 等，2 0 0 】) ，而且外源使用糖处理也可以促进花色苷的合成( h o s o k a w a 等，1 9 9 6 ；h a r a 等2 0 0 3 ) 。但是花色营等酚类物质合成的研究主要集中在莽草酸途径、苯丙 烷类代目 途径和类黄酮代谢等途径上( j a a k o l a 等，2 0 0 2 ；h o n d a 等，2 0 0 2 ：j i a 等，2 0 0 5 ；s o l f a n e l l i 等，2 0 0 6 ) 。 果实是植物重要的代谢库。在幼果蹦，叫片中的光合产物经过运输在果实中积累，果皮中也 有人是的叶绿素，粜实自身具有一定的光台能力。随着粜实成熟，果皮中的叶绿索降解，光合能 力消火果实中积累的淀粉转化为各种寡糖，如果糖葡萄糖等( b e r u t e r 雨ls t u d e rf e u s i ，1 9 9 7 ) 。 葡萄糖在葡萄糖6 磷酸脱氢酶( g 6 p d h ，e c1 1i4 9 ) 的作川r 转入氧化戊糖磷酸途径( o x i d a t i v e p e n t o s ep h o s p h a t ep a t h w a y ，o p p p ) ，o p p p 途径为其他代谤 途释提供很多重要的中间产物，是碳 源从精酵解途径转向合成酚类物质、植保索和术质索等酚类代谢途径的必经中间途径( h a u s c h i l d 平v o ns c h a e w e n ，2 0 0 3 ) 。但是，粜实成熟过程中o p p p 的训f 究很少，本文着重研究果实中的 g 6 p d h 种类、特性利功能，探讨桃果实酚类物质，尤其花色苛合成过程中g 6 p d h 的作用。 1 1 果实花色苷类物质代谢及其相关研究 1 1 1 花色苷类物质的合成 桃、葡萄等果实花色营积累始于果实的始熟蚶j ，与粜实中精的积累密切相关( p i r i e 和m u l l i n s ， 1 9 8 0 ) 。果实成熟时，果皮叶绿素逐渐减少，类胡萝h 索逐渐增加，叶绿体转变为有色体。有些 植物的开花过群与果实发育相似，绿色花瓣逐渐变成鲜陋的颜色，n t 绿体转变为有色体，生理和 结构发生都很大变化( w h a t l e y 和w h a t l e y ，1 9 8 7 ；m a r a n o 等1 9 9 3 ) 。在花和果实发育的不同阶 段，质体的结构平u 生化特性发生很大变化，质体功能也不同。在开花和果实成熟时，叶绿体类囊 体膜结构消失，一些具有光合同化功能的蛋白不再合成，新的蛋白和膜结构形成( p i e c h u l l a 等， 1 9 8 7 ：k u n t z 等，1 9 8 9 ；w e s t o n 和p y k e ，1 9 9 9 ) 。 花色苷的合成是受发育凋：仃的，其主要在果实f 表皮细胞质和内质网中合成，然后运输，i ：贮 存到液泡中。在果实发育初期，果实f 表皮细胞的形状雨i 结构与果肉细胞没有差别，但是到果实 成熟时，这些细胞的细胞壁加厚。一般含有花色苷的细胞和不含有花色苷的细胞相问随机分布 ( l a n c a s t e r 等，1 9 9 4 ；a w a r d 等，2 0 0 1 ) 。 花色营是花色素的糖营形式，一般花色紊难溶于水，在植物中主要以糖苜的形式存在。花色 素种类很多，主要有花青索、花葵素和花翠索等，不同果实中花色素种类和含量部不同，而且3 一 中困农业大学博。卜学位论文 年”( 或) 5 - o h 均与葡萄糖、半乳糖帚l 鼠李糖等寡糖形成糖营。 1 1 2 花色苷合成相关酶的研究 j 划l 所示的是从糖到花色苷类主要的代谢途径。 类黄酮途径是植物体内重要的次生代酣途径，作为类重要的类黄酮物质花色素茁，其 合成从对香显酰c o a 和丙二酰c o a 由金：耳酮合成酶( c h s ，e c 2 3 1 7 4 ) 催化合成奄耳酮开始， 再经过查耳酮异构酶( c h i ，e c ，5 5 1 6 ) 、黄烷酮3 羟化酶( f 3 h ，e c1 1 4 1 1 9 ) 、二氢黄酮醇 4 还原酶( d f r ，e cil l2 1 9 ) ，花青素合成酶( a n s ，e c l 1 41x ) 、u d p 葡萄糖：类黄酮3 o 精营转移酶( u f g i u t ，e c2 41 x ) 的作j _ ：i ，生成花色素葡萄糖苷等( s a i t o 等，1 9 9 9 ；h o l l m a n 和a r t s ，2 0 0 0 ：h o n d a 等，2 0 0 2 ：m a r l e s 等，2 0 0 3 ) 。l i s m r 等( 1 9 9 6 ) 研究表明，c h i 和u d p 半 乳糖：类黄酮3 - 0 、r 乳糈精营转移酶( u f g a l t ，e c2 41 x ) 都与苹果花色苷的合成呈正相关关 系。另外，牟少五个花色苛形成相关的基因卉耳酮合成酶、黄烷酮3 羟化酶、二氢黄酮醇4 还原酶、花青茁合成酶雨li j d p 葡萄糖：类黄酮3 f 川瑭营转移酶基因在苹果着色过程中协同表达 ( h o n d a 葛，2 0 0 2 ；h a r a 譬，2 0 0 3 ：k i m 等，2 0 0 3 ) 。 苯烷类代谢途径位于类黄酮代酣途径的【游，主要由苯丙氨酸解氩酶( p a l ，e c4 3 1 5 ) 、 肉棒酸4 。羟化酶( c 4 h ，e c1 1 4l311 ) 年4 - 香豆酰c o a 连接酶( 4 c l ，e c6 2 1 1 2 ) 等组成酶 复合体( b r e n d a ，1 9 9 9 ：w e i s s h a a r 和j e n k i n s ，1 9 9 8 ) 。在葡萄、桃、苹果平草莓等果实成熟过稃 中苯而氨酸解氨酶活性都与化色。自的合成具有正相关关系( a r a k a w a 等，1 9 8 6 ；k a t a o k 等，】9 8 3 ； g i v e n 等，1 9 8 8 ；l i s t e r 等，1 9 9 6 ) 。但b l a n k e n s h i p 币lu n r a t h ( 1 9 8 8 ) 报道显示，在p a l 活性升 高之前，花色前l 经开始合成。但是p a l 袖：果实花色前合成过程中仍是必要的( j u 等1 9 9 5 b ) ， 冈为p a l 为色素合成提供前体物质，当前体物质不足n , j ，p a l 对j 一化色b ：的合成是关键性的： 当前体物质充足时，p a l 活性高低并不与花色苷合成具有相关关系。 莽草酸造径的终产物是分支酸，分支酸进一步转化产生色氩酸、酪氨酸和米丙氧酸等，为苯 而烷类代谢提供前体物质。3 脱氧d 阿拉伯庚酮糖7 磷酸合成酶( d a h p s ，e c4l2 1 5 ) 是莽草 酸途释的第一个酶，催化赤藓糖4 磷酸雨i 磷酸烯醇式丙酮酸合成3 一脱氧- d - 5 拉伯一庚酮糖- 7 - 磷酸 ( s c h m i d 和a m r e i e i n ，1 9 9 5 ：w e a v e r 和h e r r m a n n ，1 9 9 7 ) 。莽草酸途径主要的酶都存在丁质体 巾( h e m n a n n 和w e a v e r ，1 9 9 0 ；w e a v e r 和h e r r m a n n ，1 9 9 7 ) 。n o r t h e r n 杂交分析显示莽芹：酸途 径所有的酶都是转录调：1 ，的( h e r r m a n n 和w e a v e r ，1 9 9 0 ；b i s c h o f f 等，1 9 9 6 ：2 0 0 1 ) 。研究发现， 当植物受机械伤害时，数小时内d a h p sm r n a 转录增加，从而d a h p s 活性增加，产生足够的 分支酸h j 二伤口愈合需要的芳香旗次生物质的合成( d v e l 等，1 9 8 9 ) 。l o g e m a n n 等( 2 0 0 0 ) 使刚 紫外线照射芹菜，诱导娄l , l i 酮物质的积祟过科一 j 发现，细胞质g 6 p d h 、p a l 、c h s 平删朋峪的 m r n a 都被诱导表达，而且具有伴随性，表明这些酶协同表达从而促进类黄酮的合成。 氧化戊糖磷酸途径( o p p p ) 是重要的初生代谢途径，g 6 p d h 是o p p p 的第一个酶，也是控 制o p p p 的关键酶( w i l l i a m s ，】9 8 0 h a u s c h i l d 和y o ns c h a e w e n ，2 0 0 3 ) 。o p p p 的中间产物为其 他代谢提供前体物质，如为莽草酸途径供应赤藓糖4 磷酸( w e a v e r 和h e r r m a n n ，1 9 9 7 ) 。s h e t r y 等( 2 0 0 2 ) 通过使用紫外线j 嫩射蚕豆1 5 小时，g 6 p d h 活性增加，酚类物质的合成也增加。而玉 葡0 糖! ! 兰一葡糖一。一磷酸( g 。) ! ! ! ：! ! 坠葡糖酸矗磷酸! 璺! 旦坚核利糖。磷酸 o， 7 、 h cc o o h h o o c i 、 hl l 。i 1 。一 p h ( 预苯酸) ， 、 、1 队。r l c 。h r 斗一c 。 r7 【|i i 7 m 景w 黜n h 2 ( 肉香鳓 o h c h i h o o h h c