（植物学专业论文）植物dhs生物学功能的初步研究.pdf

中文摘要e i f 一5 a ( e u k a r y o t i ct r a n s l a t i o ni n i t i a t i o nf a c t o r5 a ，真核细胞翻译起始因子) 是目前发现的唯一含有特殊氨基酸一羧腐胺赖氨酸残基( h y p u s i n e ) 的蛋白质。d h s ( d e o x y h y p u s i n es y n t h a s e ，脱氧羧腐胺赖氨酸合酶) 催化e l f 一5 a 翻译后进行羧腐胺赖氨酸修饰。e i f 一5 a 是目前发现的d h s 唯一底物，二者功能密不可分。在人与酵母中已有众多对e l f 一5 a 及d h s 的研究，表明与细胞中许多生命活动有关，但确切功能还不清楚。本研究对d h s 和e i f 一5 a 基因的表达特性进行了r t p c r 分析，并且利用病毒诱导基因沉默( v i g s ) 及反义r n a 技术对本生烟草( n i c o t i a n ab e n t h a m i a n a )与普通烟草( n i c o t i a n at a b a c u m ) 中d h s 表达进行抑制，初步探索了d h s 与e i f _ 5 a在植物中的生物学功能，并试图验证是否抑制植物d h s 表达水平可以作为植物遗传改良的新途径。本研究已取得如下相关研究进展：1 通过半定量r t - p c r 方法对d h s 基因在杨树、烟草和拟南芥中的表达特异性检测，分析了d h s 基因在植物体中的表达特点。2 通过r t p c r 方法，分离了本生烟草( n i c o t i a n ab e n t h a m i a n a ) d h s 的同源基因的c d n a 片段：构建重组病毒表达载体；利用v i g s 系统抑制烟草内源d h s 基因的表达水平，运用各种分子生物学检测手段证实目标基因已被沉默；并对d h s 基因表达沉默的植株进行了生物学鉴定，结果d h s 抑制后，植株表现出生长增强、叶片衰老延缓和开花推迟等表型，且具有一定的抗旱性。3 构建d h s 的反义表达载体，利用农杆菌介导的方法转化普通烟草( n i c o t i a n at a b a c u m ) ，获得了整合反义d h s 基因的转基因烟草。对t 1 代转基因烟草植株进行表型观察分析，表明抑制d h s 的表达产生了对干旱、低温和高盐等逆境有明显抗性的效应。综合2 与3 的结果，暗示抑制d h s 表达可能是植物遗传改良的新途径。4 为了探索抑制d h s 在植物遗传改良中的应用，并考虑到抑制d h s 表达影响种子产量，本研究选择了以营养器官为经济用途的杨树为目标植物，从中分离了杨树d h s 的c d n a 序列，构建反义及正向d h s 表达载体，农杆菌介导转化杨树，现已获得二十株反义d h s 基因转化的p c r 阳性杨树苗，为该研究的后续实验奠定了基础。同时，对提高农杆菌介导的杨树遗传转化率的规律进行扔步探索。5 分离了杨树d h s 和拟南芥d h s 和3 个e l f 5 a 基因的启动子，并且构建了由这些启动子转录调控g u s 基因的检测表达载体，转化杨树与拟南芥，为研究这些启动子的表达特征奠定基础。关键词：d h se l f - s av i g s 反义r n a 烟草杨树拟南芥a b s t r a c te l f 5 a ( e u k a r y o t i ct r a n s l a t i o ni n i t i a t i o nf a c t o r5 a ) i st h eo n l yk n o w np r o t e i nw h i c hc o n t a i n st h es p e c i a la m i n oa c i d - h y p u s i n es of a r t h ep r o t e i ni si n v o l v e di nm a n yc e l l u l a rb i o l o g i c a lf u n c t i o n s e s p e c i a l l yc o r r e l a t e sc l o s e l yw i mb o t hc e l lp r o l i f e r a t i o na n dc e l ls e n e s c e n c e d h s ( d e o x y h y p u s i n es y n t h a s e ) c a t a l y s e st h ef i r s ts t e po fh y p u s i n a t i o n e l f 一5 ai st h eo n l yk n o w ns u b s t r a t eo fd h s l o t so fr e s e a r c h e sa b o u td h sa n de l f - 5 ai nh u m a nb e i n ga n dy e a s ti n d i c a t et h a tt h e yi n v o l v e di nm a n yc e l l u l a ra c t i v i t i e s ，b u tt h e i re x a c tf u n c t i o n sr e m a i n e du n k n o w n8 0f a r i nt h ep r e s e n ts t u d yw ec o n c e n t r a t eo n , f i r s t l y ,t e s t i n gt h ee x p r e s s i o n a lc h a r a c t e r i s t i co fd h sg e n ei np l a n t sb yu s i n gs e m i q u a n t i t i v er t - p c r a n dt h e n , t h ee x p r e s s i o no fd h sg e n ew a sd e p r e s s e di nn i c o t i a n ab e n t h a m i a n aa n dn i c o t i a n at a b a c u mb yt h et e c h n i q u e so fv i g s ( v i r u si n d u c e dg e n es i l e n c e ) a n da n t i s e n s er n a , r e s p e c t i v e l y , t oi n v e s t i g a t et h eb i o f u n c t i o no fd h sa n de l f 5 ai np l a n t s w ea l s oe x p l o r e dw h e t h e ri tc 2 t nb ean e ww a yo fg e n e t i c a l l ym o d i f y i n gp l a n t sb yd o w n r e g u l a t i n gd h sg e n ee x p r e s s i o n a ll e v e l w eh a v eo b t a i n e ds e v e r a lp r o g r e s s ：1 t e s te x p r e s s i o n a lc h a r a c t e r i s t i co fd h si n t a b a c u m a r a b i d o p s i st h a l i a n aa n dp o p l a rb ys e m i q u a n t i f i v er t - p c r ，a n dt h e na n a l y s et h ee x p r e s s i o np a t t e r no fd h si np l a n t s 2 e x t r a c te d n as e q u e n c eo fd h sg e n ef o r mn i c o t i a n ab e n t h a m i a n ab yr t - p c r ,c o n s t r u c tt h et r a n s g e n i cv i r u se x p r e s s i o nc a r r i e r , a n dt h e nr e s t r a i nt h ee x p r e s s i o no ft a r g e tg e n e - d h si nt h ep l a n tb yt h ev i g ss y s t e m , t h e nw eo b t a i n e dt h ef u n c t i o n - t o s sp h e n o t y p eo fd h si nn b e n t h a m i a n a c o m p a r i n gt ot h ew i l dt y p ep l a n t s ，t h ed h sr e s t r i c t e do n e sg r o wf a s t e r , w i t l ld e l a y e di nl e a v e ss e n e s c i n ga n df l o w e r i n ga n dt o l e r a n c ea g a i n s td r o u g h t 3 c o n s t r u c tt h ea n t i s e n s e d h se x p r e s s i o nc a r r i e r , a n dt r a n s f o r mi ti n t ot h e t a b a c u mm e d i a t e db ya g r o b a c t e r i u m w eh a v eo b t a i n e ds e v e r a lt r a n s g e n i cp l a n t s s t u d i e so fp h e n o t y p e so nt h et 1g e n e r a t i o no ft r a n s g e n i ct a b a c u m ，t h er e s u l t sr e v e a lt h a tt h et r a n s g e n i cp l a n t se x h i b i to b v i o u st o l e r a n c et od r o u g h t , c o l da n ds a l ts t r e s s e s s oi ti si n f e r r e dt h a td o w n - r e g u l a t i n gd h se x p r e s s i o nm a yb ean e ww a yt om o d i f yg e n e t i ct r a i ti np l a n t s 4 i no r d e rt oe x p l o r et h ea c t u a la p p l i c a t i o no fd o w n - r e g u l a t i n gd h se x p r e s s i o ni np l a n tg e n e t i c a lm o d i f i c a t i o n ，a n dc o n c e r n i n gt h a td h sr e s t r a i n i n gm a yi n f l u e n c et h ey i e l do fs e e d s ，w ec h o o s ep o p l a r , w h i c hv e g e t a t i v eo r g a n ( s t e m ) w a su s e da s0 1 1 1 e c o n o m i ct a r g e t e x t r a c tc d n as e q u e n c eo f p o p l a rd h sg e n e , c o n s t r u c tt h es e n s e a n t i s e n s ed h se x p r e s s i o nc a r r i e r s t r a n s f o r mp o p l a rm e d i a t e db ya g r o b a c t e r i u m a n dw eh a v ea l r e a d yo b t a i n e d2 0t r a n s g e n i cs e e d l i n g sw h i c hw e r ec o n f i r m e db yu s i n gp c r d u r i n go u rs t u d y , w ea l s om a k ea ni n i t i a le x p l o r a t i o nt oi m p r o v et h em e t h o do ft r a n s f o r m i n gp o p l a rm e d i a t e db ya g r o b a c t e r i u m 5 i s o l a t et h ep r o m o t e rs e q u e n c eo fd h sf r o mp o p l a ra n da r a b i d o p s i sa n dt h a to f3e l f - 5 ai na r a b i d o p s i s , c o n s t r u c tt h ee x p r e s s i o nc a r r i e r , w h o s et h er e p o r t e rg e n eg u sw a si n s e r t e dd o w n s t r e a m i n gt h e s ep r o m o t e r s a n dt r a n s f o r m i n gp o p l a ra n da r a b i d o p s i sa r eu n d e r w a y t h e s ew o r k sp a v et h ef o u n d a t i o nf o rs t u d y i n gc h a r a c t e r i s t i c so ft h e s ep r o m o t e r s k e yw o r d s ：d h se l f 5 av i g sa n f i s e n s er n at o b a c c oa r a b i d o p s i sp o p l a r首都师范大学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：凌3 午日期：口7 年朔拥首都师范大学位论文授权使用声明本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名：砑己、于第一章文献综述本论文拟对植物中d h s 和e l f 一5 a 的功能进行初步研究，并试图探索抑制d h s 的表达是否为植物遗传改良的新途径，采用的生物技术手段包括反义r n a 技术、病毒诱导基因沉默技术、烟草与杨树的遗传转化等，因此，本论文除了综述d h s 和e i f 一5 a 的研究外，还简单介绍了病毒诱导基因沉默技术与反义r n a 技术。第一节e i f 一5 a 功能及其在植物改良中应用的研究e i f - 5 a ( e u k a r y o t i ct r a n s l a t i o ni n i t i a t i o nf a c t o r5 a ) 是一个分子量为1 6 - 1 8 k d的蛋白质。迄今为止，e l f 5 a 是唯一发现含有羧腐胺赖氨酸( h y p u s i n e ) 残基的蛋白质。羧腐胺赖氨酸是一种特殊的氨基酸，每一成熟的e l f 5 a 仅含一个残基。最初认为，e l f 5 a为真核细胞蛋白转译起始因子，早先命名为e l f 4 d ，后新命名为e i f 5 a 。羧腐胺赖氨酸是在e l f 5 a 翻译后经特定位置的赖氨酸的修饰加工形成的。此修饰包括两步酶促反应【1 i ：第一步是从亚精胺上将4 丁基氨基基团转移到e l f 5 a 前体的一个特殊赖氨酸残基上的e 氨基簇上，形成中时体。这步反应由脱氧羧腐胺赖氨酸合酶( d h s ) 催化完成，并需要n a d h 。第二步是在4 丁基氨基基团上发生羟化作用，形成羧腐胺赖氨酸，催化的酶为脱氧羧腐胺赖氨酸羟化酶( d h h ) 。e i f 5 a 前体没有活性，在翻译后立即进行羧腐胺赖氨酸修饰，才能形成活性e l f 5 a 蛋自【2 】。1 1e i f 5 a 的高度保守性许多研究表明各个物种中e l f 5 a 有共同起源，不同植物问e l f - 5 a 的氨基酸序列同源性大于8 0 【3 1 。一种生物的e l f 5 a 能被其他生物的d h s 催化完成羧腐胺赖氨酸修饰，尽管甲烷球菌( m e t h a n o c o c c u s j a n n a s c h i i ) 与人类、酵母( & c e r e v i s i a e ) 的e l f 5 a 仅有3 1 的氨基酸序列同源性，却能被人类和酵母的d h s 催化形成羧腐胺赖氨酸娜。这支持了e l f 5 a 有共同来源的说法。各个物种的e l f 5 a 中，能被羧腐胺赖氨酸修饰的赖氨酸残基及其周围的1 1 个氨基酸序列非常保守1 5 1 ，高度的保守性表明该位点在生物进化中具有非常重要的功能。目前，已从几种植物中克隆了编码d h s 和e l f 5 a 的基因。与重组动物d h s 一样，酋辟噼l 也j 、n 6 t1 论乏讯物d h s 乍扔。j j j 能的丰j j 七钾 t重组植物d h s 也町催化动物的非活性e l f 一5 a 日“体进彳丁羧瞒版赖氨酸修饰，向重组的植物e l f 5 a 也町被动物d h s 催化【6 】。进一步证明了在生物进化过程中e l f 5 a 的保守性。e l f 5 a 普遍存在于真核生物和原始细菌中【2 1 ，但在真细菌中却没有发现d h s 或者e l f 一5 a 的存在。最近研究发现一些细菌中存在d h s 的类似基因，却没有发现e l f 5 a 或其类似物【7 】o 该基因在细菌中的功能还不知道，b r o c h i e r 等【7 】推测d h s 基因可能通过横向基因转移作用从古细菌转移到细菌中，然而e i f 5 a 基因没有转移过来，导致细菌中d h s 没有完好的遗传下来。由此可以推测e l f 5 a 与d h s 协同进化。1 2e i f - 5 a 的功能研究e l f 5 a 的研究在人与酵母细胞中比较多，仅有极少数的报道涉及植物。但是迄今e l f 5 a 在细胞内的确切功能还不得而知。众多的研究结果表明，e l f 5 a 与细胞中的许多生命活动有关。1 2 1 参与细胞增殖酵母中存在两个编码e l f 5 a 的基因( t i f 5 1 a 与皿巧，曰) ，同源性为9 0 。t i f 5 1 a表达失活使酵母细胞生长缓慢：t i f 5 1 b 突变则停止生长。如果t i f 5 1 a 与t i f 5 1 b 同时失活，酵母细胞不能存活t s l 。d h s 突变的酵母中，细胞停止生长，细胞变大，推测e l f - s a的修饰为细胞增殖所必需 9 1 。有人利用亚精胺类似物作为竞争抑制剂来抑制e l f 5 a 的修饰，结果在细胞内及试管中都发现羧腐胺赖氨酸的功能受到抑制，并发现蛋白质合成减少和细胞生长缓慢。在许多哺乳动物的研究中发现，羧腐胺赖氨酸的合成速率( 或者晚合成时间1 与细胞的分裂进程紧密相关，由此推测它在细胞分裂增殖过程中有重要作用【l o 】。1 2 2 在蛋白质翻译中的作用e l f 5 a 最早是从未成熟血红细胞中分离得到的。它可在体外促进二肽类似物甲二磺酰嘌呤霉素的合成 “1 ( 模拟蛋白生物合成中第一个肽键的形成) ，因此认为e l f 5 a是转译起始因子。抑制酵母中e i f 5 a 的表达，细胞中仍可合成7 0 的蛋白质n 2 1 ，故推测e l f 5 a 仅为某些特殊m r n a 翻译所必需。z u k 掣”1 在e l f 一5 a 突变的酵母中也发现蛋白质合成下降了约3 0 。h a n a u s k e 等【h 1 利用含羞草碱( m i m o s i n e ) 可逆地抑制d h h 的表达，发现仅有部分特殊蛋白的m r n a 与核糖体的结合减少，推测抑制e l f 5 a 的表达只能阻碍细胞内部分蛋白质的翻译合成。j a o 和c h e r t 证明e l f 5 a 与一系列构成8 0 s 核糖体的蛋白相互作用，形成e l f 5 a 核糖体复合物。该复合物对r n a 酶和e d t a 非常敏感，表明e l f 5 a 不是与某个蛋白单体作用，而是依赖羧腐胺赖氨酸与一个分子配体相互2作用，推测与台翻译活性的饮檐体的相互作用町能是e l f 一5 a 的核心作用。1 2 3 与m r n a 降解有关l i u 等【1 6 】研究表明抑制酵母e i f 5 a ( h y p 2 ) 基因表达可造成在核区某些特异m r n a的显著积累。在限制生长的温度时，酵母e l f 5 a 突变体( 肌，4 ) 的几种m r n a 降解速度明显降低，同时细胞内积累了大量的未加帽m r n a ( u r a 5 的未加帽m r n a 含量增加l 倍) ，推测e i f s a 影响m r n a 的降解【1 3 1 。类似的报道还有v a l e n t i n i 等【1 7 1 对酵母突变体的研究，将突变酵母在3 7 c 中生长4 h ，用转录抑制剂硫族黄菌素( t h i o l u t i n ) 处理细胞，以n o r t h e r n 检测转录被抑制后不同时间的h h t 2m r n a 含量。结果显示在酵母突变体t f 5 1 a j 与t f 5 1 a 3 中，该m r n a 更为稳定，而t 筘l a - 2 与野生型相同，推测c i f 5 a与m r n a 降解有关，且不同e i f 5 a 作用不同。e i f - 5 a 能与特殊的r n a 结合，这些r n a含有共同保守序列a a a u g u 或a a a u g u c u c a c a c ，e l f 5 a 可以调控其稳定性【1 81 9 1 。1 2 4 参与细胞周期g i s 转化用亚精胺和d h s 抑制剂或一些金属螫合物抑制脱氧羧腐胺赖氨酸羧化酶的功能，可以使哺乳动物细胞停止分化1 2 0 - 2 2 ，细胞周期停留在g 1 s 转化时期。肌动蛋白的极性化是g 1 s 转化期必需的，而有研究结果表明e l f 5 a 参与建立肌动蛋白的极性t 2 3 】，即e i f 5 a是细胞周期中g 1 期到s 期转化的必需因子。靳宝锋等o ”发现e l f 5 a 的羧腐胺赖氨酸修饰与g 1 s 细胞周期转换相关蛋白的表达调控有关，更进一步验证了c i f 5 a 是细胞周期中g 1 期到s 期转化的必需因子。1 2 5 核转出因子c i f 5 a 可能是细胞核与细胞质之间的转运蛋白的推测最早来源于对h i v - i 病毒的研究。h i v - 1 病毒的繁殖需要r c v 反式激活子蛋白参与。r e v 是一个细胞核与细胞质之闯的穿梭蛋白，并介导未剪切或不完全剪切的病毒m r n a 从细胞核向细胞质运输。p o l l a r d掣2 5 1 证实e l f 5 a 可与r c v 结合并与其m r n a 转运功能有关。虽然e i f 5 a 本身没有核定位信号( n l s ) ，但其c 端包含一段富含亮氨酸的结构域，与核运出信号( n e s ) 极为相似。c r m l 是一种重要的核运出受体蛋白，可与n e s 信号相互作用。r o s o r i u s 等2 6 】通过免疫荧光与免疫胶体金电子显微镜观察发现e l f 5 a 在核孔附近大量富集，并证实e i f 5 a与c r m l 相互作用。显微注射实验表明e l f 5 a 可以从核中被转运至细胞质。l e p t o m y c i n3首拊，帅地人。产埘，f 论乏衍拗d l i s 寸 勿学功能的例j b 研究自! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! s ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 自! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 量b “j 抑制c r m i 介导的核运出，样町抑制e l f 5 a 的核延出。由此，他们认为e i f 一5 a是一种核与细胞质之间的穿梭蛋白。但是，也有一些研究认为e l f 5 a 并不是核质转运蛋白。s h i 等鲫用r n a 与蛋白合成抑制剂处理c o s 7 细胞，观察e i f 5 a 与r e v 的细胞定位。结果发现蛋白抑制剂处理并不影响r e v 的亚细胞分布；r n a 合成抑制剂促使其在细胞质富集，表明r e v 可穿梭于细胞核内外。r n a 合成被抑制，e l f 5 a 的分布不变；以p u r o m y c i n 抑制蛋白合成( 使核糖体解体) ，在约3 0 的细胞中，e i f 5 a 由核周内织网( e r ) 向整个细胞质扩散，但其他蛋白合成抑制剂( c a l n e x i n 与c h x ) 并无此效应由此认为e i f 5 a 并不穿梭于细胞核与细胞质之间，它可能与e r 相互作用影响蛋白质合成。v a l e n t i n i 等【1 7 1 也在细胞亚定位研究中认为e i f 5 a 并不参与h i vr e v 蛋白的核运出。何昆等发现，g f p e l f 5 a 瞬时转染细胞后，起初d f 5 a 分布于全细胞，之后逐渐集中于细胞质；突变的e l f 5 a 则分布于整个细胞。他们认为e l f 一5 a 具有核质穿梭功能，羧腐胺赖氨酸修饰可影响亚细胞定位j 进而影响功能。并且他们认为e i f 5 a 的亚细胞定位是一个动态变化过程，仅对某个时间段的细胞进行研究不能反映e i f 5 a 的真实定位，这也是产生上述不同研究结果之间矛盾的原因。目前的研究还不能明确回答作为核质转运蛋白的e i f 5 a 可以转运什么样的大分子物质。x u 和c h e n t 擂】研究认为e i f 5 a 既能与蛋白质结合又能与一些特殊的r n a 结合。e i f 5 a具有和r n a 结合蛋自类似的结构【蛳。k i m 等通过对甲烷球菌( m e t h a n d c o c c u sj a n n a s c h i i ) e l f 一5 a ( m je l f 5 a ) 的晶体结构分析，认为e i f 5 a 具有两个空间折叠结构域，其中一个与原核生物冷激蛋白及翻译起始因予( i f i ) 的核苷酸结合结构域非常相似，暗示e l f 5 a 可与核酸结合。s c h a t z 等f 3 哪研究发现e i f 5 a 细胞突变体中，r e v 功能被抑制，且影响h i v - 1 的增殖，表明e i f 5 a 是一个关键蛋白，与r e v 的r n a 转运系统密切相关。l 5 是5 sr r n a 转运的核心蛋白组份，可与e i f 5 a 相互作用。抑制e l f 5 a 的功能可阻止r e v 的活性。由此可以推测e i f 5 a 通过选择性地将特定的m r n a 从细胞核转运到细胞质中，对这些m r n a 的翻译和降解进行调控。1 2 6e l f 5 a 参与细胞衰老与凋亡近年来研究表明，e i f 5 a 的表达与细胞凋亡密切相关。靳宝锋等i 2 4 发现m g 1 3 2 诱导白血病细胞凋亡过程中，e i f 5 a 的羧腐胺赖氨酸修饰处于被抑制的状态；反义抑制e i f - 5 a 研究证明非修饰的d f - s a 的富集程度与诱导细胞凋亡的效应密切相关。组织谷氨4苎型2 兰：= i = 竺! 生兰i 窖兰2 望：望：兰鐾塑型兰竺：j酰股酶( t t g a s e ) 早已被验证与绌胞程序性死亡有关1 。c a r a g l i a 等卫1 认为细胞l 卜lt t g a s e是通过降低e l f 5 a 的羧腐胺赖氨酸修饰水平诱导细胞凋亡的。他们对人类口腔癌细胞的研究则表明e i f 5 a 同时调控细胞的衰老与死亡【3 3 1 。许多研究表明，p 5 3 具有多重细胞功能，如细胞生长分化、细胞周期调控、细胞衰老与凋亡等。在p 5 3 大量积累的不分化肿瘤细胞中，d f 5 a 高水平表达鳓。“等3 5 】贝u 发现e l f 5 a 可与s y n t e n i n 特异性结合，调控p 5 3 的活性。他们认为e l f 5 a 不仅与细胞存活有关，还与细胞凋亡有关。l e e 等【3 6 1 用g c 7 ( d h s 抑制剂) 处理人脐静脉内皮细胞( h u v e c ) ，当g c 7 浓度为1 0 m m o l l 时，细胞内几乎停止e l f - 5 a 的羧腐胺赖氨酸修饰，且细胞生长郁滞( c y t o s t a s i s ) 。用5 0 m m o l l 的g c 7 处理细胞4 d ，并不影响细胞贴壁与分化，也不诱导细胞凋亡。当用g c 7 ( 5 5 0 m m o l l ) 预处理细胞9 6 h 后，细胞反而可以产生抵抗因血清饥饿带来的细胞凋亡。因此推测，e l f 5 a 的羧腐胺赖氨酸修饰对细胞增殖与凋亡都很重要。1 3 植物中e i f - 5 a 的功能研究x u 等【19 】对番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ) 的研究表明，在正常组织d h s 的表达水平很低，很难从植物提取物中直接检测其活性；但正在衰老的番茄花、子叶、果实和因环境胁迫而发生细胞程序性死亡的叶片中，d h s 和e i f 5 a 及它们的同源蛋白的转录水平明显增加，由此推断e i f 5 a 可能参与植物自然衰老及环境诱导的细胞程序性死亡。m o y l e 等口7 】也在成熟的风梨果实中检测到e l f 5 a 的大量表达，也表明e l f 5 a 与植物细胞衰老的关系密切。w a n g 掣3 8 】在拟南芥翻煳6 玩唧括t h a l i a n a ) 上的实验结果表明，d h s和e l f 5 a 在衰老的叶片中有两个表达高峰，可能与叶片细胞死亡过程中生物大分子分解及营养物质重新分配有关。但a n k e 掣3 卅在大麻叶佩兰( 最c a n n a b i n u m ) 的不同组织中提取r n a ，进行半定量r t - p c r ，结果在前一年根、当年根、幼芽、嫩叶( 3 c m ) 、老叶( 1 3 e r a ) 、花芽、花盘及果实中，d h s 的表达量没有明显区别。t h o m p s o n 掣6 1 研究发现拟南芥中存在3 个表达特征不同的e i f 5 a 编码基因，w e s t e r n杂交分析表明e l f - 5 a 1 只在衰老组织中表达，e l f - 5 a 2 在受机械损伤的组织中高水平表达，而g 肛5 们在细胞分裂很活跃的吸胀的种子中高水平表达。过量表达e l f - 5 a 3 的拟南芥中，花瓣从正常的4 瓣变成5 瓣，叶子变为并生叶，种子变大( 为原来的2 倍) ，这说明e l f - 5 a 3 可能在发育早期就可促进细胞分裂。这个研究暗示植物中不同e l f 5 a 异构物分别与细胞分裂或细胞死亡有关，即在拟南芥中有两种e l f 一5 a 异构物与细胞死亡有关，而5前酃帅范人学砸沦z精物d h s 牛物学功能的初步研j z另一种e l f 5 a 与细胞分裂有关。由此“j 推测，植物中也存在着e l f 5 a 多重生物学功能的现象。而d u g u a y 等 4 0 l 构建d h s 启动子与e l f - 5 a i 驱动的g u s 表达载体，转化拟南芥后发现d h s 启动子驱动的g u s 有两个表达高峰，一个是在抽薹起始阶段，另一个在抽薹后，莲座叶开始衰老的时期。后一个时期的表达量更高，更明显。e l f - 5 a 1 启动子驱动的g u s 则主要在第二个时期高水平表达。另外，d h s 还在花芽、花及正在形成的花粉中表达，可以推测这些组织中e l f 一5 a 的活性水平比较高。1 4 存在不同类型e i f - 5 a有研究表明，e l f 5 a 在不同生物中都具有两个以上的编码基因，且表达特征不同。在线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 中存在两种e l f 5 a 同源蛋白i f f l 和i f f 2 ，i f f 2 在体细胞中表达，而i f f l 为细胞增殖以及进入减数分裂后配子形成所需4 1 1 。c l e m e n t 等【4 2 】研究表明e l f 5 a 1 在人细胞中组成性表达，e l f 5 a 2 在人正常细胞与大部分的癌细胞中表达量很低，仅在卵巢癌细胞( u a c c 1 5 9 8 ) 中检测到高水平表达。且利用d h s 的蛋白抑制剂g 0 7 处理u a c c 1 5 9 8 细胞后发现e l f 5 a - 1 与e l f 5 a - 2 在其中的合成水平相同，被修饰的效率也相似，修饰后的蛋白质在该细胞中的稳定性也相同。他们还在该细胞中发现3 端u t r 长度不同的e l f 5 a 2 ，其稳定性不同，越长则稳定性越弱，在细胞中存在的时间越短。上文中提到的拟南芥中存在3 个表达特征不同的e l f 5 a 6 i 。e l f 5 a 在生物体中非常重要，参与多种细胞生命活动，既能参与细胞的分裂增殖，又参与细胞程序性死亡，多个e l f 5 a 的存在与之相对应。1 5 抑制d t t s 的表达对植物产生的多重效应近年来，在植物中的研究都表明，抑制d h s 表达可产生多重效应。1 抑制d h s 能够延长植物的营养生长期，而且能够不同程度地延缓转基因植株或其组织的衰老。在拟南芥中，根据d h s 抑制程度的不同，可使莲座叶延长滞后2 - 6 周，且叶片衰老延缓时间最长( 大于6 周) 的转基因植株叶表现为抽薹滞后【3 8 l 。我们在本生烟草上有相似的发现，当d h s 表达受到抑制时，植株叶片绿期延长4 周，开花结实明显滞后，最长达8 剧4 3 1 。w a n g 掣3 8 1 认为，拟南芥叶片衰老起始是生殖器官开始发育的先决条件，所以叶片衰老滞后和生殖生长启动相偶联。在抑制d h s 的转基因植株中，采后叶片组织同样具有衰老和腐烂滞后的现象。在番茄的研究中，n o r t h e r n 杂交分析表明4 个编码e l f 5 a 的基因家族成员在番茄果实中均有表达，其中3 个在果实开始变软和衰老时，首邪帅范j 、7 坳li 仑zf f 物d h s t 物学功能的衲步硎，(随着d h sm r n a 的翻译l u 表达增加，推测住番茄中这3 种e l f 一5 a 川上酶参与细胞衰老。d h s 受抑制的转基因番茄中，其果实成熟时问与对照株没有差别；但转基因植株的采后果实表现为软化和腐烂时间滞后，且滞后时间与d h s 水平受抑制程度正相关】。2 抑制d h s 可以增强植物的抗逆性。在转基因拟南芥研究中，在引起8 0 9 0 的野生株致死的缺水情况下，d h s 抑制株有约9 5 的存活率。抑制d h s 的转基因拟南芥植株在缺水和贫瘠土壤上都呈现出根系量增大、叶片增大和种子产量增加等特征。在一定范围内抑制d h s 时，这些表型变异程度与d h s 受抑制强度成正相关。但是过强抑制d h s时，整个植株生长受阻【3 射。我们在烟草上的实验也表明，低湿度条件( 3 5 ) 下转基因植株受逆境影响明显小于野生株，表现为叶片增大，生物量增加；但是在湿度较为适宜( 7 5 ) 时，野生株和对照株的叶片大小差异不明显【4 3 1 。这两个结果都表明d h s 受抑制的植株对逆境胁迫表现出更强的抗性。3 抑制d h s 对种子产量的影响显著。干旱胁迫下，拟南芥中抑制d h s 的植株种子产量比野生株多约3 0 ；在正常条件下，d h s 植株种子产量比野生株多约1 3 。而当d h s 受抑制超过一定程度后，转基因株的种子产量比对照野生株少3 0 【3 8 】。在烟草和番茄中，当d h s 受抑制达到一定程度后，也表现为种子产量急剧减少，甚至不能产生种子，不结樊町”。可见一定范围内抑制d h s 来调节细胞中e i f 5 a 的水平，能使植物种子产量提高；而抑制程度太剧烈时将使植物种子产量下降甚至不能结实。4 e i f 5 a 可能与叶绿素的形成和降解有关。在拟南芥和番茄中，一定程度的抑制d h s表达后，均观察到在生长过程中叶片的叶绿素含量比对照株增加，且在衰老时，d h s 被抑制的拟南芥叶片中叶绿素含量降低的速率比对照株慢【3 8 4 4 1 。而我们在烟草中却观察到抑制d h s 表达，植株叶片的叶绿素含量降低，但d h s 抑制植株叶片的绿期比野生型植株增长，表明叶绿素降解受到抑制【4 3 1 。我们采用的是病毒诱导的基因沉默( v i g s ) 技术抑制烟草d h s 表达，而w a n g 等“】采用的是反义r n a 技术，这可能是造成叶绿素含量测定结果不同的原因。这些结果也暗示e l f 5 a 可能同时对叶绿素的形成和降解产生影响，但作用机理还需要更深入的研究。1 6 调控d h s 在植物遗传改良中应用的可能性抑制植物d h s 的表达可产生多重效应，有些效应利于植物经济性状改良。本文将探讨其在植物遗传中应用的可能。7前鄙师范j 、学硕i 论足f f i 物d h st 物7 r 功能的初步研究1 6 1d h s 通过调控o l f 。5 a 的羧腐胺赖氨酸修饰水平发挥功能d h s 调控e l f 5 a 的活性，而非表达水平。迄今为止，只在酵母中发现抑制d h s ( d y s i )基因表达可降低e l f 5 a 的含量，但适度过量表达d y s l 对细胞生长和细胞内e l f 5 a 的含量几乎没有影响；抑制d h s 一定时| 日j 后，e l f 5 a 含量下降1 4 5 1 。因此，并不能确定是由于细胞生长被抑制带来的e l f 5 a 表达下降，还是d h s 引起的。p a r k 等【lo 】发现同时在2 9 3 t及其他哺乳动物细胞中过量表达d h h ，d h s 及e l f 5 a 才能获得过量表达的羧腐胺赖氨酸修饰的e l f ，5 a 。因此，d h s 并不调控e l f 5 a 的表达水平。e l f 5 a 是d h s 目前唯一确认的底物。虽然o b e r 等【4 6 】研究认为植物d h s 能够将一个丁基从亚精胺转移到腐胺上，并在体外具有h s s 酶活性，但缺乏体内实验证据。n i s h i m u r a等f 4 7 】证明e l f 5 a 和多胺对细胞生长的影响独立的，而且用g c 7 抑制d h s 活性时，检测到细胞内e l f 5 a 水平迅速下降，而多胺含量没有发生变化，证明了d h s 对e l f 5 a 的特异性作用。在植物体中抑制d h s 除了影响e l f 一5 a 的合成外，尚未发现影响植物其他代谢途径。t h o m p s o n 等f 4 8 l 认为d h sn 端的a 一螺旋可能阻止与e i f 5 a 的结合，从而阻断催化活性。只有细胞需要活性e l f 5 a 时，a 螺旋才解开，d h s 被激活。由此推断，d h s是通过调控e l f 5 a 的羧腐胺赖氨酸修饰，即调控其活性水平来发挥生物学功能的。1 6 2 抑制植物d h s 的表达是植物遗传改良的新途径通过抑制d h s 的表达降低内源e l f 5 a 的活性水平，对植物的生长发育、衰老、种子产量和绿叶素含量产生了诸多影响，其中最明显的是延缓转基因植株的衰老和增强抗逆性。目前对该作用机理的解释还不明确，t h o m p s o n 等1 6 推测可能与植物对外界环境的应对性有关。植物在生长过程中，不断受到外界环境的非致死胁迫，可诱发衰老，并抑制生长【4 9 1 。由于胁迫是非致死性和间断性的，每次胁迫结束时，衰老停止而生长继续。因此，植物生长是一个间断性的过程。e l f 5 a 具有多重生物学功能，既参与细胞生长，又参与细胞程序性死亡。推测抑制d h s 的转基因植株中，死亡型e l f 5 a 的活性水平低，阻碍了植株因胁迫引起的衰老( 或延缓自然衰老) ，使植株在逆境中呈连续性生长，而非普通植株的阶段性生长。因此转基因植株生长增强，并具有一定的抗逆性【6 1 。但是不同程度地抑制d h s 表达时，植物表型差异很大，甚至出现相反的表型。目前还没有发现植物中存在功能分型的d h s ，产生差异的原因可能在于不同程度抑制d h s对不同e l f 5 a 同工酶的调控不同。c l e m e n t 等【5 0 1 体外实验证明，d h s 与e l f 5 a - 1 的底物亲和性( k i n1 5m i c r o m ) 是与e l f 5 a 一2 ( k m8 3m i c r o m ) 的5