（遗传学专业论文）过量表达hrpc拟南芥对苯酚和三氯苯酚的植物修复.pdf

陈晨 过量表达h r p c 拟南芥对苯酚和三氯苯酚的植物修复 过量表达h r p c 拟南芥对苯酚和三氯苯酚的植物修复 研究生 陈晨 导师 陈建民教授 姚泉洪研究员 扬少i 1 大学 江苏扬州 2 2 5 0 0 9 上海农科院 上海 2 0 11 0 6 摘要 苯酚和氯酚属于高危害的环境污染物 具有致癌性 致畸性和致突变性 其主要来源 为工业废水 农药 消毒剂和防腐剂等 目前针对酚类污染物的分解方法还不完善 如物 理方法和化学方法的成本昂贵 微生物法修复污染物需要比较长的周期才能达到一个理想 的水平 而自然界中的植物通常缺乏有效降解酚类化合物的能力 因此利用基因工程技术 将一些能有效降解有机污染物的基因转到植物中去 增强植物对有机污染物的抗性 提高 植物吸收和降解有机污染物的能力 从而达到利用植物及其共存微生物体系消除环境中的 污染物的植物修复的应用范围 是一种非常有潜力的土壤污染修复方式 辣根过氧化物酶 h i 冲 属于植物过氧化物酶超家族的第三类 已有研究报导该酶能 够在体外催化降解五氯酚 邻苯二酚等酚类污染物 本研究根据网上公布的辣根过氧化物 酶同工酶c h i 心c 序列设计引物 通过p t d s 方法合成了h r p c 基因 合成的h r p c 基因的氨基酸序列与网上公布的h r p c 基因的完全一致 为了进一步分析h r p c 在植物体 内的功能 构建了农杆菌双元载体并通过蘸花法转化拟南芥 经潮霉素筛选 g u s 活性检 测和p c r 检测验证筛选到转基因阳性植株 生理功能分析表明 转h r p c 基因植株对苯 酚和三氯苯酚的耐受性比野生型对照有明显的提高 同时h p l c 分析结果表明高表达 h r p c 基因能够提高拟南芥植株吸收降解酚类污染物的能力 本研究结果可以为污染土壤 的植物修复提供一个新的技术路线 关键词 辣根过氧化物酶 苯酚 三氯苯酚 植物修复 基因工程 扬州大学硕士学位论文 p h y t o r e m e d i a t i o no fp h e n o l a n dt r i c h l o r o p h e n o lb yo v e r e x p r e s s i n ga h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s eci nt r a n s g e n i ca r a b i d o p s i s p o s t g r a d u a t e c h e nc h e n a d i v i s o r p r o f j i a n m i nc h e n p r o f q u a n h o n gy a o y a n g z h o uu n i v e r s i t y y a n g z h o uj i a n g s u 2 2 5 0 0 9 s h a n g h a ia c a d e m yo f a g r i c u l t u r a ls c i e n c e s h a n g h a i 2 0 110 6 a b s t r a c t p h e n o la n dc h l o r o p h e n o lc a nb ec l a s s i f i e da s h i g h l y h a z a r d o u so r g a n i cp o l l u t a n t c h a r a c t e r i z i n gw i t hm u t a g e n e s i s c a r c i n o g e na n dt e r a t o g e n i ce f f e c ti nn a t u r ee n v i r o n m e n t s i tc a n b ef o u n di nw a s t e w a t e r so fi n d u s t r y f a r mc h e m i c a l s d i s i n f e c t a n ta n dp r e s e r v a t i v e c o n v e n t i o n a l m e t h o d sf o rr e m o v a lo fp h e n o l i cc o n t a m i n a n t sf r o me n v i r o n m e n ta r en o tp e r f e c ta n dr e q u i r et o b e i m p r o v e d f o re x a m p l e p h y s i c a l a n dc h e m i c a lm e t h o d sa r ec o s i l y i na d d i t i o n m i c r o o r g a n i s mm e t h o d su s u a l l yw i l lt a k eal o n gt i m et oa c h i e v eo p t i m a lr e s u l t m o r e o v e r t h o s e p l a n t si nn a t u r el a c k e df o re f f i c i e n te n z y m ew h i c hc a nr e m o v ep h e n o l i cc o n t a m i n a n t s t h u s g e n e t i ce n g i n e e r i n gt e c h n o l o g yi s c o n d u c t i v et oi m p r o v ep l a n t i t hr e s i s t a n c et oo r g a n i c p o l l u t a n t sb yt h em e a n so fi n t r o d u c i n gf o r e i g ng e n e w h i c hc a nr e m o v eo r g a n i cp o l l u t a n t s h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e i s o e n z y m e sb e l o n gt oc l a s s l i io ft h ep l a n tp e r o x i d a s e s u p e r f a m i l y h r p w a s r e p o r t e d t h ef u n c t i o no f c l e a n i n go d i h y d r o x y b e n z e n e a n d p e n t a c h l o r o p h e n o lb e l o n g t o p h e n o l i c c o n t a m i n a n t s nv i t r o i nt h i s p a p e r h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s ei s o e n z y m e sc h r p c g e n ew a ss u c c e s s i v e l ys y n t h e s i z e db yp c r b a s e dt w o s t e p d n a s y n t h e s i s p t d s t h es t u d yo nt h es e q u e n c eo fa m i n oa c i dr e s i d u e ss h o wt h es y n t h e s i z e d g e n ei sc o m p l e t e l yc o r r e c t t h ef l o r a l d i pm e t h o dw a su s e dt ot r a n s f e rh r p cg e n ei n t oa r a b i d o p s i st h a l i a n a t r a n s g e n i ca t h a l i a n a c o l u m b i ap l a n t so v e r e x p r e s s i n gh r p cw e r eo b t a i n e d f o rf u r t h e r a n a l y s i so ft h ep r e c i s ef u n c t i o no fh r p c t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eh r p ct r a n s g e m cp l a n t s e x h i b i t e dh i g h e rr e s i s t a n c et op h e n o la n dt r i c h l o r o p h e n o lt h a nw i l dt y p ec o n t r o lp l a n t si n g e r m i n a t i o nr a t e r e l a t i v er o o tg r o w t hw h e nt r e a t e dw i t hp h e n o la n dt r i c h l o r o p h e n 0 1 t h er e s u l t s 陈晨 过量表达h r p c 拟南芥对苯酚和三氯苯酚的植物修复 o fh p l ca n a l y s i sf u r t h e rc o n f i r m e dt h a tt h et r a n s g e n i cp l a n to w n e da b i l i t yt oa b s o r b e n c yo f p h e n o la n dt r i c h l o r o p h e n o lt h a nw i l dt y p ec o n t r o lp l a n t s t h e s er e s u l t sw i l lb ev a l u a b l ef o r t h e p h y t o r e m e d i a t i o nb a s e d o ng e n e t i ce n g i n e e r i n gt e c h n o l o g y k e yw o r d s h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e p h e n o l t r i c h l o r o p h e n o l p h y t o r e m e d i a t i o n g e n e t i c e n g m e e n n g 扬州大学硕士学位论文 i v 一一 符号及缩略语说明 h r p h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e h r p ch o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ei s o e n z y m ec r t p c rr e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r s e c h a i nr e a c t i o n p o dp e r o x i d a s e p c b s p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s p a h s p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s e d n a c o m p l e m e n t a r yd n a h y gh y d r o m y c i n g u s 1 3 g l u c u r o n i d a s e t o p r i m a r yt r a n s g e n i cp l a n t s t i f i r s tg e n e r a t i o no ft 0 t 2s e c o n dg e n e r a t i o no ft o c a m v c a u l i f l o w e rm o s a i cc i r u s c a m v3 5 sc a m v3 5 sr r n a p r o m o t e r a p a m p i c i l l i n o n p g o n i t r o p h e n y l3 d g a l a c t o p y r a n o s i d e x g a l 5 b r o m o 一4 c h l o r o 3 i n d o l y l 1 3 g l u c u r o n i ca c i d t c p 2 4 6 t r i c h l o r o p h e n o l p t d sp c r b a s e dt w o s t e pd n a s y n t h e s i s h p l c h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 辣根过氧化物酶 辣根过氧化物酶同工酶c 反转录聚合酶链式反应 过氧化物酶 多氯联苯 多环芳烃 互补d n a 潮霉素 p 一半乳糖苷酸酶 转基因植株当代 t 0 代转基因植株自交第1 代 t o 代转基因植株自交第2 代 花椰菜花叶病毒 c a m v3 5 s 核糖体r n a 启动子 氨苄青霉素 邻硝基苯一1 3 d p i 匕喃半乳糖苷 5 溴一4 氯 3 吲哚 b 半乳糖苷 2 4 6 三三氯苯酚 基于p c r 的两步d n a 合成法 高效液相色谱 陈晨 过量表达h r p 拟南芥对苯酚和三氯苯酚的植物修复 翌 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明 所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研究成果 除文中已经标明引用的内容外 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果 对本 文的研究做出贡献的个人和集体 均已在文中以明确方式标明 本声明的法律结果由本人 承担 学位论文作者签名 7 刍 应 签字日期 9 7 年占月 oe l 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 i l p 学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档 允许论文被查阅和借阅 本人授权扬州大 学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫 描等复制手段保存 汇编学位论文 同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录 到 中国学位论文全文数据库 并通过网络向社会公众提供信息服务 学位论文作者签名彳杏 应 签字日期 年z 月阳 导师签名 签字日期 j 必7 1 年占月刃日 l 1 陈晨 过量表达h r p c 拟南芥对苯酚和三氯苯酚的植物修复 第一章文献综述 1 辣根过氧化物酶的性质 功能 催化机理 1 1 过氧化物酶 过氧化物酶 p e r o x i d a s e p o d 广泛存在于各种植物 动物和微生物体内 催化由过 氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应 植物过氧化物酶的研究可追溯到1 8 0 9 年用愈创树 脂为底物进行的颜色反应 目前已知该酶的催化反应底物超过2 0 0 种 以及多种过氧化物 和辅助因子 1 1 1 植物过氧化物酶的分类 植物过氧化物酶的分类可以根据等电点 催化底物特性 植物来源 结合状态以及酶 的生理功能等特点来划分 如根据等电点大小可分为酸性 p i 7 0 三种p o d b u r e le ta 1 1 9 9 4 l e ee la 1 1 9 9 4 根据催化底物特性可分为愈创木 酚p o d 谷胱甘肽p o d 和抗坏血酸p o d 等 a s a d a e ta 1 1 9 9 2 根据植物来源不同可分为 辣根p o d 番茄p o d 花生p o d 等 根据结合状态可分为可溶态p o d 离子结合态p o d 和共价结合态p o d s a t oe ta 1 1 9 9 5 q u e s a d ae ta 1 19 9 0 不同种类的p o d 同工酶之间存在明显的组织和器官专化性 其中抗坏血酸p o d 分别 存在于叶绿体和细胞质内 二者在组成 结构 底物专化性亲和力以及在纯化过程中的稳 定性上有差异 木质素p o d 多存在于细胞壁内 许多p o d 可存在于细胞膜 细胞器 细 胞质以及质外体内 根据其组织专化性常称为线粒体p o d 叶绿体p o d 液泡p o d 胞 间和胞内p o d 等 p r a s a de t 讲 1 9 9 5 z a p a t ae ta 1 1 9 9 8 1 1 2 过氧化物酶的生理功能 过氧化物酶广泛存在于植物中 是植物细胞内的重要的组成成分 具有非常重要的生 理功能 在植物不同生长发育时期和不同组织器官内 过氧化物酶的酶谱带数及活性有很 大变化 由于其成分和结构的复杂性 同工酶的多样性 以及多基因编码特点 因此对其 功能的认识尚不全面 目前已经肯定的功能包括 1 参与活性氧代谢过程 分子氧 0 2 是相对无活性和对生物无毒性的 当氧分子的电子分布发生改变 其结 构即变成活性氧 活性氧的种类包括过氧化氢 h 2 0 2 羟自由基 o h 超氧阴离子 0 2 三种 在活性氧代谢过程中 过氧化物酶发挥了重要作用 细胞壁中的过氧化物酶可以催 化n a d h 或n a d p h 氧化产生0 2 0 2 进一步歧化为h 2 0 2 和分子氧 l e e 1 9 7 7 k a ye ta 1 扬州大学硕士学位论文 2 1 9 8 7 过氧化氢是 种相对稳定的分子 能够通过细胞壁运动 过氧化物酶和过氧化氢 酶一样都具有代谢h 2 0 2 的功能 有酚底物还原形成的自由基聚合形成木质素 2 参与木质素合成 木质素是所有维管组织细胞壁的主要成分 是抵抗病原菌侵入和扩展的重要防卫手 段 p o d 被认为是在木质素生物合成中催化最后一步反应的酶 已有研究结果证实木质素 和木栓质的积累与过氧化物酶活性增强之间的联系 l e w i se ta l 1 9 9 0 j o r g e n 1 9 9 8 从 白杨树木质部分离出5 中不同的木质部p o d 所有5 中p o d 均糖基化 分子量为4 5 k d a 5 4 k d a 其中p x p 3 4 和p x p 5 能氧化木质素单体 由于这些同工酶在木质部中有选择的表 达 因此 p x p 3 4 和p x p 5 被认为参与木质素的聚合 3 参与生长素的降解 p o d 具有氧化分解吲哚乙酸 i a a 的功能 i n t a p r u k e ta 1 19 9 4 z i n h u a n gl i ue ta 1 1 9 9 7 有关l 拟被p o d 氧化的机制 酶与底物形成中间复合体的过程等已有研究报道 g a z a r y a ne ta 1 1 9 9 6 s m i t he ta 1 1 9 8 2 许多植物的p o d 已被证明具有催化i a a 氧化脱 羧形成i n d o l e 3 y l m e t h a n o l 或3 m e t h y l e o x i n d o l e 的能力 b e f f ae l a l 1 9 9 0 然而 采用等电 聚焦酸性和碱性p a g e 对p o d 同工酶所具有的氧化i a a 功能的研究发现 并不是所有的 p o d 同工酶带都具有强m a 氧化能力 或表现出与p o d 一致的酶活性 某些p o d 活性 很强的带 其氧化i a a 的活性却不高 用烟草细胞培养进行的5 种碱性和2 种酸性p o d 的分离纯化和鉴定研究表明 只有碱性组分p o d 具有氧化i a a 的功能 且此组分主要位 于根皮细胞和韧皮部细胞t 为 m a r c oe ta 1 1 9 9 9 一般认为 阳离子p o d 碱性或称高等电 点p o d 与i a a 的亲和力强于阴离子p o d s i e g e le ta 1 1 9 9 3 d ef o r c h e t t ie ta 1 1 9 9 0 p r e s s e ye ta 1 1 9 9 0 l o u k i l ie ta 1 1 9 9 9 而阴离子p o d 可能主要参与木质素的合成 但也 有少数阴离子p o d 氧化i a a 的研究报道 4 参与其他物质的氧化过程 体外实验发现 过氧化物酶可参与催化谷胱甘肽 n a d h d t t 草酰乙酸 氢醌 酪氨酸 阿魏酸等酚类化合物的氧化 b a d i a n ie ta 1 1 9 9 0 h e n r i k s e ne ta 1 1 9 9 9 其可氧化 酪氨酸为d i t y r o s i n e i s o d i t y r o s i n e 和p o l y t y r o s i n e 这种氧化作用与细胞壁伸展蛋白的耦联 有关 z h e n ge ta 1 1 9 9 1 与伸展蛋白相关的过氧化物酶活性降低可导致细胞壁强度的降低 促进细胞膨大和植株生长 相反则可能有助于增强对病菌的抗性 过氧化物酶多重功能的发现证明了其生物效应的多样性和复杂性 由于实现这些不同 功能需要不同的辅助因子 因此在植物体内正常代谢过程中可能会通过各种因子的不同作 陈晨 过量表达h r p c 拟南芥对苯酚和三氯苯酚的植物修复三 用而发挥其差别调节作用 1 2 辣根过氧化物酶 辣根过氧化物酶 h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 简称h r p e c1 1 1 1 7 是植物中研究的最 深入的一种过氧化物酶 辣根过氧化物酶的分子量在4 0 0 0 0 左右 是一种含亚铁血红素 的蛋白质 等电点7 2 易溶于水 溶解度为5 w v 溶液呈棕红色 透明 早在1 9 4 0 年 t h o r e l l 就用电泳方法从部分纯化的辣根组织中区分出两种不同的h r p 此后此酶在 植物正常和应激反应代谢中发挥重要作用而受到广泛关注 并对该酶进行了大量的研究 包括酶的种类 等电点 氨基酸组成和序列 生理功能 以及基因表达和调控的分子机制 f u j i y a m ae ta 1 1 9 8 8 s i e g e le ta 1 1 9 9 3 v a nh u y s t e r e ta 1 1 9 8 7 随着酶标技术的发展 作 为标记酶 h r p 是临床检验试剂中的常用酶 广泛应用于免疫组织化学 电镜技术 酶联 反应和免疫印迹等生物学研究 并成为重要的诊断试剂 1 2 1h r p c 的结构 从辣根中分离出的过氧化物酶含有近3 0 种同工酶 广义指生物体内催化相同反应而分 子结构不同的酶 它们是由多个基因编码的 辣根过氧化物酶则是这些同工酶的总称 其 中以辣根过氧化物酶同工酶c h r p c 的含量最为丰富 1 9 9 0 年 s m i t h 等 1 9 9 0 成功获 得了重组h r p c 并用x 射线解答了其三维结构 1 9 9 7 年 g 句h e d e 等 1 9 9 7 详细阐述了 h r p c 催化循环中的催化中间体 1 2 2h r p c 的二维结构 辣根过氧化物酶同工酶c 由3 0 8 个氨基酸组成单肽链 其氨基酸序列已经由w e l i n d e r 等 1 9 7 6 钡q 定 n 末端连接着一个固定的吡咯烷酮羧基 c 末端连接的丝氨酸缺经常丢失 肽链中有四个由两分子半胱氨酸组成的二硫键 分别是c y s l l 9 1 c y s 4 4 4 9 c y s 9 7 3 0 1 和c y s l 7 7 2 0 9 同时还存在一个由a s p 9 9 和a r 9 1 2 3 组成的盐桥 整条肽链上共有9 个 潜在的糖基化位点 而其中的8 个已经被占据 在整个多糖分子中 一个含有7 个单糖的 残基占了总体的7 5 一8 0 但整个多糖的构型却由于其他单糖的变化而变化 在这些小 的单糖中 两端的g l c n a c 和中间的一些甘露糖却是固定不变的 单糖在糖基化位点上构 型的变化也使整个多糖的构型变得更为复杂 h r p c 含有两个不同的金属中心 正铁原卟啉 即血红素 和两个钙原子 图1 1 这 两个金属中心对酶的整体结构和功能都是非常重要的 通过血红素中铁原子的一个轴向结 合点与肽链上h i s l 7 0 侧链的n 原子结合 使血红素垂直连接在h i s l 7 0 上 而卟啉铁的另一 扬州大学硕士学位论文 个轴向结合点在静态酶中则是空着的 当有h 2 0 2 存在时 该结合点就能与c o 氰化物 氟化物或叠氮化物等小分子结合 这些小分子中有些是以质子化了的形式存在的 这样它 们还能通过氢键与a r g 和h i 一2 结合 使这些小分予更加稳定 在血红素平面的上下两侧 存在着两个钙原子的结合位点 它们通过一个氢键群与血红素结合区域相连 每个钙原子 都是7 供氧配合体 它们能同时与主肽链上含羰基的氨基酸 侧链上的a s p s e t 和t h r 以及 个末端结构水份子结台 钙离子的丢失将会导致h r p c 酶活和热稳定性的下降 h a s c h k ee t a l 1 9 7 8 还能使血红素的构型发生改变 1 2 3h r p c 三维结构 图1i 血红素结构 v e i t c he ta 1 2 0 0 4 a 辣棍过氧化物酶同工酶c 的x 一哪晶体结构的三维演示图 b 辣根过氧化物酶同工酶c 的血红紊结合域的关键氢基酸残基 r e i t c h a l 2 0 0 4 陈晨 过量表达h r p c 拟南芥对苯酚和三氯苯酚的植物修复三 h r p c 的三维结构于1 9 9 7 年由g a j h e d e 等 1 9 9 7 测定 酶的总体结构大部分是0 螺旋 和一些小的1 3 折叠 在血红素平面上下两侧存在着两个空白区域 该区域可能是由钙结合 位点与其他结构元素共同作用而成的 也可能是基因复制后留下的产物 图1 2 1 2 4h r p 与植物过氧化物酶超家族的结构关系 植物过氧化物酶超家族由细菌过氧化物酶 真菌过氧化物酶以及植物过氧化物酶组 成 h r p 属于植物过氧化物酶超家族的第三类 在这三类过氧化物酶中存在着一个共有的 区域叫过氧化物酶折叠中心 h r p 和其他第三类过氧化物酶在该中心都有3 个0 螺旋 其 中2 个a 螺旋 f 螺旋和f 螺旋 的氨基酸序列和种类都表现出了很强的可变性 但由于 c y s l 7 7 与c y s 2 0 9 之间存在着一个二硫键 使f 螺旋和f 螺旋所组成的区域在整体结构上保 持了相对稳定 由于f 螺旋可能存在着底物的结合位点和通道 所以该区域被认为对催化 反应中生成的基本产物的稳定性有重要作用 g a j h e d ee ta 1 1 9 9 7 1 2 5h r p 在植物体内的功能 在h r p 催化反应中 自由基的形成暗示了h r p 在植物细胞内中可能所起的作用 如 氧化偶合酚类化合物 交联酚类单体形成软木脂 酪氨酸交联形成双酪氨酸等 但是h r p 在植物体内的作用并没有完全被阐明 k a w a o k ae ta 1 1 9 9 4 1 3h r p 的作用机制 1 3 1h r p c 的催化机制 大多数由h r p c 以及其他辣根过氧化物酶同工酶催化的多数反应可由以下反应式表示 s t a n i s a v l j e v i ce ta 1 2 0 0 4 1 e h 2 0 2 e i h 2 0 2 e i a h 2 e i i a h 3 e i i a h 2 叶e a h h 2 0 其中a h 2 和a h 分别表示还原性底物以及自由基 还原性底物包括芳香族化合物 酚 类化合物 吲哚 胺类和磺酸盐 d u n f o r d 等 1 9 9 1 v e i t c h 等 2 0 0 1 广泛的研究了h r p 的 催化机制 特别是h r p c 图1 3 中以阿魏酸 f e r u l a t e 为还原性底物说明h r p c 在催化 反应中的特点 催化循环的第一步是静态酶中的f e i i i 和h 2 0 2 反应生成化合物i 化合 物i 是一个高氧化态的催化中间体 由一个含氧f e i v 中心以及一个带正电荷的卟啉组 成 在低温下 中间体i 形成前还检测到另一个短暂的催化中间体 该中间体被认为是f e i i i 与过氧羟基复合物 相关的分子动力学模拟实验由f i l i z o l a 等完成 f i l i z o l ae ta 1 扬州大学硕士学位论文 6 2 0 0 0 通常情况下 中间体i 再经过两步反应就能回到静态酶状态 第一步由一分子还原 性底物加入 生成含氧f e 1 v 中心的催化中间体i i 中间体i 和中间体1 i 都是强氧化剂 氧化还原电势接近 1v 第二步也是有 分子还原性底物参加 使中间体i i 还原成静态酶 图1 3h r p c 以阿魏酸为底物的催化循环 d u n f o r de ta 1 1 9 9 1 1 3 2h r p c 芳香族底物的结合位点 如图1 1 所示 在h r p c 中 底物的氧化位点是在血红素边缘 该区域包括血红素的c 1 8 甲基和c 2 0 碳原子 o r t i zd em o n t e l l a n o 等 19 9 2 在用苯肼 叠氮化钠及其他试剂使h r p c 失活的实验中验证了该位点 当h r p c 与h 2 0 2 相遇时 该位点就能与其他基团结合 生 成c 1 8 羟甲基及c 2 0 苯基等血红素衍生物 从而进一步生成氧化性底物 有研究表明 当 h r p 与球蛋白及细胞色素p 4 5 0 等其他含血红素的蛋白质比较时 h r p 在氧原子转移反应 中催化效果不如细胞色素p 4 5 0 其中一个原因是 当底物通过中间体i 和中间体i i 的含 氧f e i v 中心时 h r p c 自身蛋白质构型会对底物起阻碍作用 有研究表明 通过对 h r p c 基因的定点突变加以改善 突变后的h r p c 末梢氨基酸残基p h e 4 1 和h i s 4 2 就用更小 的氨基酸残基代替 以削弱其阻碍作用 陈晨 过量表达h r p c 拟南芥对苯酚和三氯苯酚的植物修复z 2 植物修复 2 1 背景 随着现代工业和农业的发展 人类活动给自然环境带来了越来越大的压力 对自然资 源 动植物 森林 水资源 的过渡开发利用 工业和矿业产生的废气 废水和废渣 巨 量的城市生活垃圾 农业生产中大量施用各类农药 杀虫剂和除草剂 这些污染物被大量 的释放到环境中 毒害动植物 破坏自然生态平衡以及严重危害人类的健康 按照化学组成划分 这些污染物可分为两大类 一类是元素污染物 包括有毒重金属 如汞 铅 镉 硒 砷 锌 镍 铜 和放射性元素 如 锶 铯 钴 铀等 第二类是 有机污染物 这类污染物数量庞大 种类繁多 主要包括多氯联苯 p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s p c b s 多环芳烃 p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s p a h s 卤代脂肪烃 硝基化合物 以及苯和苯的衍生物 这些污染物质大多性质稳定 不易在自然条件下被彻底降解和清除 由于这些污染物 被降解的速度远远低于其向环境排放的速度 因此环境中这些污染物越积越多 并通过空 气和水流的作用而传播 而自然界中的大多数生物都对这些污染物没有耐受性 使得这些污 染物对人类生存的自然环境造成了很大的影响 2 2 植物修复 2 0 世纪8 0 年代 美国开始了应用生态学原理和技术修复污染土壤 即生物修复 b i o r e m e d i a t i o n 特别是植物修复 p h y t o r e m e d i a t i o n 方面的研究 植物修复技术是以植 物忍耐和超量积累某种或某些污染物的理论为基础 利用植物及其共存微生物体系消除环 境中的污染物的 9 1 环境污染治理技术 唐世荣等 1 9 9 9 目前植物的修复技术基本类型主 要有以下几种 1 植物提取技术 p h y t o e x t r a t i o n 利用金属积累植物或超积累植物将土壤中的金属 萃取出来 富集并搬运到植物根部可收割部分和植物地上的枝条部位 适合植物萃取的理 想植物应具有忍耐和积累高浓度污染物的能力 生长速度快 周期短 生物量高 个体高 大 植物对农业措施如施肥等产生积极的反应 利于反复种植 多次收割 目前常用的植 物有 芸苔属植物 印度芥菜等 油菜 工业用的大麻等 2 根际过滤技术 r h i z o f i l t r a t i o n 利用超积累植物或耐重金属植物从污水中吸收 沉淀和富集有毒金属 适用于根际过滤技术的植物必须有较大的根系生物量 最好是须根 植物 目前常用的植物有各种耐盐的野草如佛吉尼亚盐角草 s a l i c o m i a v i r g i n i c a 牙买加 扬州人学硕士学位论文 8 一 克拉莎草 c l a d i u m j a m a i c e n s e 盐地鼠尾粟 s p o r o b l u sv i r g i n i c u s 杂交杨树 印度芥菜 向日葵以及各种水生植物如宽叶香蒲等 3 植物固化技术 p h y t o s t a b i l i z a t i o n 利用耐重金属植物或超积累植物降低重金属的 活性 从而减少重金属被淋滤到地下水或通过空气载体扩散进一步污染环境的可能性 4 植物辅助生物修复技术 p h y t o s t i m u l a t i o n 指通过植物跟的作用激活根际范围内 微生物的活动而进行生物降解的植物修复过程 一般情况下 植物本身不能吸收重金属 但植物的根部分泌物如氨基酸 糖 酶等物质能促进根际周围土壤的微生物的活性和生化 反应 有利于重金属的释放和土壤中有机化合物的降解 桑树 桑橙树和苹果树被人们用 来刺激能降解多氯联苯 p c b s 和多环芳烃 p a h 的微生物生长 它们的根际产物包含黄 酮类化合物和氧杂萘邻酮 5 植物转化技术 p h y t o t r a n s f o r m a t i o n 指通过植物本身的新陈代谢作用降解环境污 染物的过程 植物转化取决于污染物从土壤和水体中被植物直接吸收和在植物器官中新陈 代谢中被积累 植物转化目前主要的应用领域包括石化产品污染地和贮藏地 武器弹药废 弃物 燃料溢出物 氯化溶剂 垃圾掩埋中的淋滤物 农用化合物 杀虫剂和化肥 等 6 植物挥发技术 p h y t o v o l a t i l i z a t i o n 利用一些植物来促进重金属转变为可挥发的 形态 并将之挥发出土壤和植物表面 一些植物在其体内能将s e a s 和h g 等甲基化 而形成可挥发性的分子释放到大气中去 唐世荣等 1 9 9 6 植物修复技术是一种较为廉价的绿色治理技术 既安全又经济 植物修复技术不仅能 去除环境中有机污染物 还可以去除环境中的重金属和放射性核素 该技术在清理土壤中 的重金属污染物的同时 还可以清除污染土壤周围的大气或水体载体中的污染物 有较高 的美化环境价值 植物修复重金属污染物的过程也是土壤有机质含量和土壤肥力增加的过 程 被植物修复过的干净土壤适合于多种农作物的生长 植物固化技术能使地表长期稳定 有利于生态环境改善和野生生物的繁衍 而且维持固化的成本低 武正华等 2 0 0 2 2 3 植物修复机理 2 3 1 金属元素的植物修复机制 根据植物修复技术的类型 利用超积累植物治理重金属污染的机理分为植物稳定或固 化 植物挥发和植物吸收等三种类型 1 植物稳定或固化 p h y t o s t a b i l i z a t i o no rp h y t o i m m b o l i z a t i o n 植物稳定是利用植物吸收和沉淀来固定土壤中的大量有毒金属 以降低其生物有效性 和防止其进入地下水和食物链 从而减少其对环境和人类健康的污染风险 植物在植物稳 陈晨 过量表达h r p c 拟南芥对苯酚和三氯苯酚的植物修复 定中有两种主要功能 1 保护污染土壤不受侵蚀 减少土壤渗漏来防止金属污染物的淋移 2 通过在根部累积和沉淀或通过根表吸收金属来加强对污染物的固定 此外 植物还可以通过改变根际环境来改变污染物的化学形态 在这个过程中根际微 生物 细菌和真菌 也可能发挥重要作用 骆永明等 1 9 9 9 2 植物吸收 p h y t o e x t r a c t i o n 植物吸收是利用专性植物根系吸收一种或几种污染物特别是有毒金属 并将其转移 贮存到植物茎叶 然后收割颈叶 从而达到去除土壤重金属元素的目的 通常也称为植物 萃取 专性植物通常指超积累植物 可以从土壤中吸取和积累超寻常水平的有毒金属 例 如十字花科遏蓝菜属植物具有很强的吸收z n 和c d 的能力 目前被作为植物超积累研究 的模式植物 3 植物挥发 p h y t o v o l a l i z a t i o n 植物的挥发与植物吸收是相连的 它是利用植物的吸取 积累 挥发而减少土壤污染 物 即利用一些植物来促进重金属转变为可挥发的形态 并将之挥发出土壤或植物表面 目前这方面研究最多的是类金属元素h g 和非金属元素s e 例如 离子态汞 h 孑 它 在厌氧菌的作用下可以转化成对环境危害最大的甲基汞 利用细菌先在污染位点存活繁 衍 然后通过酶的作用将甲基汞和离子态汞转化成毒性小 可挥发的单质汞 通过运用生 物学技术将细菌体内对汞的抗性基因转导到植物中 使其具有在通常生物中毒的汞浓度条 件下生长的能力 而且还能将从土壤中吸取的汞还原成挥发性的单质汞 植物挥发为土壤 及水体环境中具有生物毒性汞的去除提供了可能 植物修复重金属污染物通常包括以下几个阶段 1 植物根系吸收重金属并运输到地上部 重金属元素在土壤中一般呈难溶态 只有把它从土壤固相中溶解活化到溶液中才能被 植物吸收 超富集植物的根系可以分泌特殊有机物 活化了土壤中不溶态的重金属 从而 促进了植物中重金属元素的吸收 2 超积累植物对重金属离子的螫合和贮存 超积累植物体内的有机酸与金属离子发生络合作用 促进重金属的迁移 超积累植物 中的根际微生物与重金属具有很强的亲和性 有毒金属可储存在细胞的不同部位或被结合 到胞外基质上 通过生物代谢过程 根系分泌物各组分 粘胶 多分子 低分子分泌物 均可与重金属发生络合作用 并使重金属向根表迁移 重金属离子可被沉淀或被螯合在可 扬州大学硕士学位论文 l o 溶或不溶性生物多聚物上 张太平等 2 0 0 3 由于超积累植物普遍具有生物量小 生长缓慢 的特点 为了提高植物的修复效率 螯合诱导植物修复技术作为强化植物吸收重金属的修 复技术备受关注和青睐 它通过向土壤中施加螯合剂 如e d t a d t p a e g t a 柠檬酸 等 迫使土壤固相键合的重金属释放 重金属在土壤颗粒表面由不溶态转化为可溶态 从 而增加土壤溶液重金属浓度 强化重金属吸收和从根系向地上部的运输 大幅度提高植物 对重金属的吸收和富集能力 达到提高植物修复效率的目的 虽然螯合剂在植物修复的使 用过程中提高了植物修复的效率 但螯合剂使用后所存在二次污染的潜在问题也不容忽 视 2 3 2 有机污染物的植物修复机制 植物修复有机污染物有三种机理 1 直接吸收并在植物组织中积累非植物毒性的代 谢物 2 释放促进生物化学反应的酶 3 强化根际的矿化作用 这与菌根菌和同生菌 有关 2 3 2 1 有机污染物的直接吸收和降解 植物可直接吸收位于浅层土壤的中度疏水有机污染物 然后将没有毒性的代谢中间体 储存在植物组织中 这是植物去除环境中中等亲水性有机污染物 辛醇一水分配系数为 l o g k o w 0 5 0 3 的一个重要机制 疏水有机化合物 1 0 9 k o w 3 0 易于被植物根表面强 烈吸附而难以运输到植物体内 致使它们在植物体内不能转移 而水溶性有机化合物 1 0 9 k o w 0 5 不易被根表吸附而迅速通过植物膜转移 有机污染物被吸收到植物体后 植物可将其分解 通过木质化作用使其成为植物体的 组成部分 在新的植物结构中贮藏有机物及其残片 也可通过挥发 代谢或矿化作用使其 转化成c 0 2 和h 2 0 去毒作用可将原来的化学品转化为对植物无毒的代谢物如木质素等 贮藏于植物细胞的不同部位 达到去除环境中有机污染物的目的 影响根系吸附吸收的主要因素是有机污染物的物理化学性质 如辛醇一水分配系数 k o w 电离常数 在土壤中的浓度等 此外 植物蒸腾作用强度 环境中的风速和相对湿 度 水分等也会直接影响有机污染物的吸收速率 2 3 2 2 植物释放分泌物和酶去除环境中有机污染物 植物释放酶和有机酸等分泌物到土壤中 以利于降解有毒化学物质 并可刺激根际微 生物的活性 这些分泌物与脱落的根冠细胞一起为根际微生物提供重要的营养物质 促进 根际微生物的生长和繁殖 并且 其中的有些分泌物也是微生物共代谢的基质 陈晨 过量表达h r p c 拟南芥对苯酚和三氯苯酚的植物修复旦 研究植物特有酶的降解有机污染物的过程为植物修复的潜力提供了有力的证据 陈玉 成等 2 0 0 3 如腈水解酶可以降解仁氯苯腈 去硝化酶和漆酶可以分解炸药废物 2 4 仁 三硝基甲苯 即t n t 并将破碎的环状结构结合到植物材料中或有机物残片中变为沉积有 机物的一部分 去卤代酶 脱卤酶 可以把氯代溶剂三氯乙烯降解还原为氯离子 c 0 2 和 水 易筱筠等 2 0 0 2 a l k o r t ae ta 1 2 0 0 1 但酶对环境要求较高 游离的酶系会在低p h 值 高金属浓度和细菌毒性下被摧毁或钝化 而植物生长在土壤中 酸性被中和 金属被生物 吸着或螯合 酶被保护在植物体内或吸附在植物表面 不会受到损伤 2 3 2 3 根际的生物降解作用 根际是受植物根系影响的根一土界面的一个微区 也是植物一土壤 微生物与其环境 条件相互作用的场所 由于根系的存在 增加了微生物的活动和生物量 根际微生物的群 落组成依赖于植物根的类型 直根 丛根 植物种类 植物年龄 土壤类型以及植物根 系接触有毒物质的时间 植物和微生物的相互作用是复杂的 互惠的 植物根表皮细胞和 根细胞的脱落 为根际的微生物提供了营养和能源 如碳水化合物和氨基酸 而且根细胞 分泌粘液和其它