（分析化学专业论文）拉曼光谱法在生物分子及细菌研究中的应用.pdf

两南大学硕十学位论文摘要 拉曼光谱法在生物分子及细菌研究中的应用 分析化学专业硕士研究生任毅华 指导教师周光明教授 摘要 s e r s 由于高灵敏度、无损检测技术能够提供分子骨架构象信息。本文用s e r s 研究了d n a 与抗菌药诺氟沙星，与中药紫草的相互作用，甘氨酸钙，大肠杆菌与 重组菌，以下为研究内容。 ( 1 ) 研究了诺氟沙星( n f x ) 及诺氟沙星胶囊内容物的f t - r a m a n 光谱和在 银胶基底上的表面增强拉曼光谱( s e r s ) ，归属了各个振动；以及诺氟沙星与d n a 的相互作用的s e r s 。结果表明：胶囊内容物的拉曼光谱图与对照品的拉曼光谱图 的特征振动：c f 键的伸缩振动，c = c 伸缩振动，o c o 的对称伸缩振动峰值未 发生变化，发生变化是的主要是分子骨架振动峰，诺氟沙星胶囊的辅料对拉曼光 谱无实质影响；诺氟沙星可以在没有金属离子的存在下与d n a 直接作用，n f x 分子中的平面结构插入d n a 的双螺旋碱基平面。 ( 2 ) 应用表面增强技术将薄层色谱与拉曼光谱相结合，研究了d n a 与左旋 紫草素的s e r s 光谱以及t l c 原位分离的化合物与d n a 作用。研究表明，银胶 微粒表面增强作用下，在薄层色谱原位可获得分子的主要特征谱带，化合物与d n a 的结合方式：萘醌母环中平面结构可能插入d n a 的双螺旋碱基平面。 ( 3 ) 利用傅立叶变换拉曼光谱与红外光谱技术研究甘氨酸钙、甘氨酸复合物， 从分析层面揭示了甘氨酸以及复合物的结构信息。 ( 4 ) 用s e r s 研究了生长周期的大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l ib l 2 1 以及重组菌e c o i lb l 2 1 ( p e t 3 2 - n r d h ) ，归属了各细菌的主要特征吸收峰，两者有定的不同之 处，结果表明用s e r s 可以表征和鉴定大肠杆菌与重组菌。 关键词：表面增强拉曼光谱d n a 甘氨酸大肠杆菌相互作用 两南大学硕十学位论文a b s t r a c t 皇曼曼曼量曼曼曼曼穹皇曼曼曼皇曼曼曼曼- - - - 一- - 一 _ -。 m ； ； 一i i ii i 量曼鼍曼曼曼曼皇曼曼曼曼毫 r a m a n s t u d yo nb i o m o l e c u l a ra n db a c t e r i a r e s e a r c h m a jo r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y p o s t g r a d u a t e ：y ih u ar e n s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rg u a n gm i n gz h o u a bs t r a c t t h ea t o m i s t i c s p e c i f i c i t y o fv i b r a t i o n a ls u r f a c e e n h a n c e dr a n l a n s p e c t r a l s i g n a t u r e sp r o v i d e sap o w e r f u la n de f f e c t i v em e t h o df o rm o l e c u l a rf r a m e w o r k i n f o r m a t i o n i nt h i sa r t i c l e ，t h ei n t e r a t i o no fd n aa n dn o r f l o x a c i n ，d n aa n ds h i k o n i n h a v eb e e nr e s e a r c h e d ，a sw e l la sg l y c i n ec a l c i u mc o m p l e x ，e s c h e r i c h i ac o l ib l 21a n d t h er e c o m b i n a n te c o i lb l 2 1 ( p e t 3 2 - n r d h ) t h em a i nc o n t e n t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) f t - r a m a na n ds u r f a c ee n h a n c e dr a m a ns p e c t r a ( s e r s ) o fn o r f l o x a c i na n d n o r f l o x a c i nc a p s u l eo nt h es i l v e rc o l l o i d a ls u b s t r a t ea r er e c o r d e d ，t h ev i b r a t o n a la n d e n h a n c e dp e a k sa r ea s s i g n e d ；i n t e r a c t i o n so fn o r f l o x a c i na n dd n aa r er e s e a r c h e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sp r o v e dt h a tc h a r a c t e r i s t i cv i b r a t i o n so fc a p s u l e sc o n t e n t a n d n f xs t a n d a r d ，w h i c hi sv ( c - f ) ，v s ( o - c o ) ，v ( c = c ) ，h a v e n tc h a n g e d ，w h i l et h e c h a n g e s a r em o l e c u l a rs k e l e t o n sv i b r a t i o n s a d d i v e sd o e s n ta f f e c tt h er a m a n s p e c t r o s c o p yo fn o r f l o x a c i ns u b s t a n t i v e l y , aa n a l y t i c a lm e t h o db yw h i c hn o r f l o x a c i n m e d c i n ei sd e t e c t e dc a nb ee s t a b l i s h e db yf t - r a m a n w i t h o u ta n yi r o n s ，b yw h i c h t h ei n s e r t i n g - a c t i o nm o d ei st h er i n go fn o r f l o x a c i ni n s e r tt h ed o u b l eh e l i xs t r u c t u r eo f d n a ，n o r f l o x a c i nc o u l di n t e r a c t 耐t 1 1d n ad e r e c t l y ( 2 ) t h ep a p e ra n a l y z e st h ei n g r e d i e n to fs h i k o n i ni nl i t h o s p e r m u mb ya s s o c i a t i n g h y p h e n a t e dh i 曲一e f f i c i e n c yt h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) w i t hs u r f a c e e n h a n c e d r a m a ns p e c t r o s c o p y ( s e r s ) t e c h n i q u e s ，t h es e r so fs h i k o n i n d n aa n di n t e r a c t i o no f s e p a r a t es h i k o n i nt l cs i g f 2 5 4w j t l 】d n ai sr e s e a r c h e d t h er e s u l t ss h o wt h a t h 两南大学硕十学位论文 a b s t r a c t m 一 m 。n - - - - - - _ _ 鼍皇曼皇寰皇曼皇曼鼍曼曼曼曼皇曼鼍曼鼍 c h a r a c t e r i s t i cs p e c t r a lb a n d so fs h i k o n i nc a l lb eo b t a i n e df r o mt h et l cs p o tw i t hs e r s b ys i l v e rn a n o p a r t i c l e s ，a n da l s ot h ei n t e r a c t i n gw a yo fs h i k o n i nw i t hd n a ：r i n go f s h i k o n i ni n s e r tt h ed o u b l eh e l i xs t r u c t u r eo fd n a ( 3 ) i nt h ep a p e r , t h ef o u r i e rt r a n s f o r mr a m a ns p e c t r o s c o p y ( f t - r a m a n ) o fg l y c i n e i sr e s e a r c h e d a n dg l y c i n ec a l c i u mc o m p l e xw a ss t u d i e db yi ra n dr a m a n s p e c t r o s c o p y ( 4 ) s u r f a c ee n h a n c e r a m a ns p e c t r aw e r ea c q u i r e df r o me s c h e r i c h i ac o l ib l 2 1i n i t s g r o w t hc y c l e ( i n c l u d i n gl a gp h a s e ，l o g a r i t h m i cp h a s ea n ds t a t i o n a r yp h a s e ) a n d s e r so ft h er e c o m b i n a n te c o i lb l 21 ( p e t 3 2 - n r d h ) i ns t a t i o n a r yp h a s ei so b t a i n e db y u s i n gf o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e d ( f t - i r ) r r m a ns p e c t r o s c o p y , t h ev i b r a t o n a la n d e n h a n c e dp e a k sa r ea s s i g n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts e r so ft h e md u et od n aa n d p r o t e i nm o l e c u l a rv i b r a t i o n so f c e l l sa n dt h e ya r ed i f f e r e n t ，a n dc a nb ei d e n t i f i e d k e y w o r d s ：s e r s ；d n a ；g l y e i n e ；e s c h e r i c h i ac o l ib l 2 1 ；i n t e r a c t i o n s l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位敝作者侮敏彳 签字日期洲年月矿日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口 保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：跨急笛聱 签字日期：a9 归年占月9 日 导师签名：c 司先币 签字日期2 0 1 0 年4 月3 0 日 两南人学硕七学位论文第章绪论 第一章绪论 第一节拉曼光谱概述 1 9 2 8 年，印度物理学家拉曼( r a m a n ) 首先发现了单色光在透过c c h 液体之后 散色光的频率发生变化的现象【l 】。这种散射光与入射光频率不同的现象被称为拉曼 散射。 拉曼效应起源于分子振动( 和点阵振动) 与转动。拉曼光谱仪收集和检测与入射 光成直角的散射光，拉曼散射强度是十分微弱的，大约为瑞利散射的千分之一， 拉曼光谱的应用和发展受到很大限制，为了得到一幅完善的光谱，往往很费时间。 激光器的出现使拉曼光谱学技术发生了很大的变革，光的单色性和强度大大提高， 拉曼散射仪的信号强度大大提高，拉曼光谱技术得以迅速发展，应用领域遍及物 理，材料，化学，生物等学科，并已成为光谱学的一个重要分支。 1 1 拉曼光谱的原理特点与应用 下图形象的解释了拉曼散射的过程，当激发光照射样品时，光子和样品分子 之间发生碰撞。根据e = h v ，瑞利散射即弹性碰撞，碰撞时光子只改变运动方向而 未发生能量交换；当光子和样品分子间发生非弹性碰撞，光子的能量和频率都发 生改变产发生拉曼散射。激发光能力大于散射光能量，产生拉曼散射的斯托克斯 线，如图1 。若光子与处于振动激发态的分子相互作用，使散射光的能量大于激发 光，产生反斯托克斯散射。由于室温下基态的最低振动能及的分子数目最多，与 光子作用后返回同一振动能级的分子也最多，散射出现的几率大小顺序为：瑞利 散射 s t o k e s 线 反s t o k e s 线。随温度升高，反s t o k e s 线的强度增加【2 1 。 jl j l j l r 1r1r v o + a vv ov 0 - a v 虚态 激发态 基态 图1 拉曼散射和瑞利散射 、，o 为瑞利散射；、，o + v 为反斯托克斯散射；v o a v 为斯托克斯散射 1 2 拉曼光谱的特点与应用 l 西南人学硕十学位论文第一章绪论 ( 1 ) 拉曼光谱的特剧3 4 5 j 采用拉曼光谱法样品处理简单，可测定各种溶剂，尤其是水溶液；金属与氧、 氮结合键的振动拉曼信号强；根据s t o k e s 、反s t o k e s 线的强度比可以测定样品体 系的温度；显微拉曼的空间分辨率很高，为l g m ；时间分辨测定可以跟踪1 0 d 2 s 量级的动态反应过程；利用共振拉曼、表面增强拉曼可以提高测定灵敏度。共振 拉曼效应可以用来有选择性地增强大生物分子特个发色基团的振动，这些发色基 团的拉曼光强能被选择性地增强1 0 0 0 到1 0 0 0 0 倍；激光束的直径在它的聚焦部位 通常只有0 2 2 m m ，常规拉曼光谱只需要少量的样品就可以得到。拉曼显微镜物镜 可将激光束进一步聚焦至2 0 微米甚至更小，可分析更小面积的样品，但激光光源 可能破坏样品，荧光性样品测定一般不适用，需改用近红外激光激发等等。傅立 叶拉曼光谱由于1 0 6 4 n m 近红外激发光源，可避免样品荧光干扰问题。 ( 2 ) 拉曼光谱的应用 通常的拉曼光谱可以进行半导体、陶瓷等无机材料的分析【6 】；激光拉曼光谱可 应用于分子筛研究，如分子筛的骨架振动、杂原子分子筛的表征、分子筛的合成【7 1 。 拉曼光谱研究在催化剂表面吸附行为博j ；拉曼光谱还是合成高分子、生物大分子分 析的重要手段 9 - 1 0 】。此外，拉曼光谱在燃烧物分析、大气污染物分析等方面有重要 应用i l l 】。 拉曼光谱技术还可对样品进行无损分析，是分析科学领域的研究热点。利用 拉曼技术分析过程中不会对样品造成化学的、机械的、光化学和热的分解。被广 泛应用于医药、文物考古、宝石鉴定和法庭科学等方面【1 2 。1 7 】。 1 2 表面增强拉曼光谱的应用 由于高灵敏度、高分辨率，稳定性好，表面增强拉曼光谱( s e r s ) 广泛应用 于表面化学，催化研究，痕量分析，氨基酸、d n a 、r n a 、蛋白质、核苷酸等生 物大分子的结构研究与结构分析等。 e p o d s t a w k a 和a k u d e l s k i j 等研究了磷酸酯与银表面的表面吸附方式。 c a r l o se b o n a n c e a 与g u s t a v om d on a s c i m e n t o 1 9 j 研究了偶氮染料j a n u sg r e e nb 的电化学与光催化降解，结果表明j a n u sg r e e nb 降解过程的第一步是还原机理。 z h u a n g ，z p ；c h e n g ，j b 【2 0 j 等通过对b p e 傅立叶拉曼光谱、表面增强拉曼光谱的 峰位归属，认为b p e 的分子结构没有大兀共轭体系，但在吡啶环中存在兀键共轭 体系与离域7 c 电子。s a n g y e o p ，l ；j u n g h y u n , c ；c h e n ，l x 【2 l 】等采用微流传感器技 术与s e r s 结合，建立了一种快速高灵敏度检测水中孔雀绿的定量分析技术。s i l v i a , a c ；j a c o b ，s t 2 2 1 等用s e r s 分析检测了一幅1 8 世纪晚期的艺术作品中所使用的乌 贼墨，通过对比按照艺术家的东西来源设计的乌贼墨色的配方和普通的乌贼墨的 2 两南大学硕十学何论文第一章绪论 傅立叶拉曼光谱与s e r s 提供快速辨别真伪的简便方法。c a r r a s c o f l o r e s ，e a 1 2 3 j 等 人采用拉曼光谱、表面增强拉曼光谱、表面增强红外光谱等分析手段研究了2 硝 基芴，当激发光是6 3 3 n m 时可获得最好的光谱图，三种检测方法稳定性与重现性 都很好。r e y e r ，j d 1 2 4 】等人用s e r s 方法检测神经传递物释放。通过老鼠p c i 2 细 胞研究了去消极化作用所诱发的儿茶酚胺类的分泌物，银胶作为稳定的基底加入 到细胞培养基中，而s e r s 可以成功的修正细胞各组分的贡献，研究通过分析儿茶 酚胺实验与文献的谱图检验修正系数并定位多巴胺与去甲肾上腺素。 第二节s e r s 在生物医学领域的应用 2 1 氨基酸、蛋白质与d n a 的s e r s 研究 s e r s 由于其灵敏度高，所需样品少，适用于生理水溶液状态的研究，可作为 研究溶液中生物大分子构象的有效技术，能够提供分子骨架构象以及碱基对信息， 可以研究氨基酸、蛋白质二级结构，核苷酸以及它们与药物的相互作用。 柯惟中等人【2 5 j 报道了甘氨酸、缬氨酸和赖氨酸在银胶溶液中的表面增强拉曼 光谱。郝雅琼【2 6 j 等人研究了半胱氨酸在银基底表面吸附机理的拉曼光谱，结果表 明只有当溶液的p h 值接近或高于等电点时，半胱氨酸分子才能以c 0 0 a 矿形式 被有效组装到银基底的表面。胡国进1 2 7 】等人研究了水溶性蛋白质、二肽和氨基酸 的表面增强拉曼散射光谱。l e o 2 卅等人用s e r s 获得了由色氨酸( m 、脯氨酸( p ) 以 及络氨酸( y ) 组成的一系列肽的拉曼光谱，w p y ，y p w ，w ppp y ，y ppp w ， w ppp ppy ，y ppp ppw 。这些肽几乎都是末端羧基发生键和，只有色氨酸 却由于大极化率与基地发生强的亲和力，在所有的样品中其最强特征吸收峰发生 在与环作用的键合模式，这些结果为用s e r s 研究蛋白质分子有重要的作用。 m o g e r t 2 9 j 等人建立一种以s e r s 作为检测丝氨酸与络氨酸残基的多肽磷酸化物的高 灵敏度技术。研究结果表明用这种方法检测连续化验中不同浓度的复杂蛋白质以 及其他磷酸盐化合物具有很大的潜力。实验中修饰了一种小蛋白的两个双半胱氨 酸的突变体，它的二硫键被打破，蛋白质以两种配体的形式与a g 纳米粒子络合， 这促进其团聚形成纳米粒子二聚体等小的聚合物。当使用激发光时，这种蛋白质 就自动定位于团聚体中带电磁性的热点。利用这种现象，可采用s e r s 研究近单分 子水平的蛋白质，而s e r s 振动峰也定位显示了发生相互作用的蛋白质的分子基 团。 衡航1 3 0 】等测定了经不同p h 值不同时间酸处理的d n a 溶液拉曼光谱分析，结 果表明，随着p h 值和时间的不同，d n a 分子内部发生了明显的质子化作用，拉 曼特征频率和强度均发生了不同程度的变化。唐玉龙【3 1 3 2 】等人用拉曼光谱研究了 两南大学硕十学何论文第章绪论 i m m m m-m mm umi i 紫外线对对小牛胸腺d n a 的损伤，远紫外区u v b ( 2 8 0 n m 3 2 0 n m ) 以一种较快的 方式对其产生损伤，紫外c ( v v c ) 产生全面的损伤，紫外b ( u v b ) 和紫外a ( u v a ) 对d n a 的损伤则具有选择性，周殿凤【3 3 】等人用拉曼光谱研究了紫外辐射对小牛胸 腺d n a 水溶液影响。 叶勇，胡继明1 3 4 j 等人合成了d 2 氨基葡萄糖c u ( i i ) ，z n ( i i ) ，n i ( 1 i ) ，f e ( ) ， c o ( i h ) 金属配合物，并用表面增强拉曼光谱( s e r s ) 研究了他们与d n a 的相互作用， 发现它们在银胶上的吸附方式基本相同，其中c u g l u ，c o ( i i i ) g l u 作为抗癌药物有 进一步研究的价值。r u i z c h i c a 3 5 ) 等人用傅立叶拉曼光谱和混合量子力学研究了组 胺与高聚物小牛胸腺d n a 的相互作用，以及组胺与小牛胸腺d n a 在不同摩尔比 情况下的拉曼光谱。s a n t i a g o 3 6 1 等人采用s e r s 研究了金丝桃素与d n a 的相互作 用，以及其可能的分子模型多聚腺嘌呤核糖核酸，多聚鸟嘌呤核糖核酸，结果表 明金丝桃素与d n a 能够相互作用的是末端的羟基与羰基，进一步研究d n a 结构 发现鸟嘌呤发生结合的峰位表现在6 0 0 c m l 8 5 0 c m 1 区域。 l a u r a 【3 刀等人建立了一种通过获得s s d n a p n a 杂交后的s e r s 信号鉴定单链 d n a 的简便新方法，这种方法比利用表面成键以及电子的相互作用更有优势。王 杰芳【3 8 】等人用f t - r a m a n 研究了质粒p u c 18d n a 的结构。s u m e e t 3 9 1 等人用s e r s 表征被修饰后的金表面d s d n a 的变性，不论电化学法，或者热力学导致的变性 d n a 都会在球形金壳基底上运动。为d n a 诊断及取证技术提供了可靠稳定的方 法之一，可鉴定生物突变，单核苷酸多态性以及基因序列的不同。f a n g ，y 【4 0 j 等人 采用f t s e r s 表征了多聚腺嘌呤脱氧核苷酸2 多聚胸腺嘧啶脱氧核苷酸d n a 的 结构，这种三螺旋在非原位的粗糙化银电极的d n a 比磷酸双螺旋结构更易被吸附 在带有正电荷的表面，而且很稳定，被增强的拉曼信号显示了长程而非短程特征， 核糖磷酸骨架以及胸腺嘧啶脱氧核糖碱基的相关振动显现出很多强的s e r s 峰， 这种现象打破了通常认为带电荷银表面的双螺旋核苷酸的拉曼信号增强主要是短 程增强机制的认识。 2 2 活体细胞的s e r s 研究 通过探测活体细胞的功能和变化，从分子水平了解活体细胞的生物学机制是 纳米生物学与医学的重要目标之一。这对发现病变初期细胞结构与功能的微小变 化对疾病做早期诊断。s e r s 不会对样品造成化学、机械等性状的改变，可对细胞 进行无损检测，是分子细胞检测的重要方法。 g a o ，x l 4 1j 等人采用n i r - f t r s 对比分析了正常以及恶化后的人体皮肤角化 细胞，数据显示d n a 的拉曼光谱，尤其是8 4 3 c m d 与8 1 0 c m l 的强度比可为是否 恶化以及癌变提供有效信息。李维红等【4 2 】率先利用傅立叶变换拉曼测定了正常腮 4 西南火学硕十学何论文第一章绪论 量! ! 曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼! 曼曼曼曼曼曼 i_ i i 鼍 i i i i , i 皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼! 曼曼曼曼曼曼蔓皇曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼皇曼量曼鼍 腺组织及腮腺恶性肿瘤组织。f r a r l l ( 等【4 3 j 测定了4 0 个胃切除手术标本( 胃正常组 织2 2 例、胃癌组织1 8 例) 黏膜面的傅立叶变换拉曼光谱。m a h a d e v a n 等先用近 红外傅立叶变换拉曼光谱仪在体外测定了3 6 个宫颈组织的傅立叶变换拉曼光谱。 a h c e n e 【4 5 】等人获得了两种不同前列腺细胞株( 正常的前列腺细胞株p n t l a 与恶化 的细胞株l n c a p ) 中3 0 个细胞的拉曼光谱，研究表明p l s d a s 与a b r s 的拉曼数 据可以鉴定病毒良性与恶化的前列腺细胞微小变化。 p r e m a s i r i 4 6 等人在7 8 5 n m 的激发光下，以覆盖着金纳米粒子的s i 0 2 为基底， 用s e r s 测定不同种的细菌。z e i r i 47 j 等人分析了四种细菌：e s c h e r i c h i ac o l i ， a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u sr a g ，p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ay s 7 以及b a c i l l u s m e g a t e r i u m 的表面增强拉曼光谱图，谱图都很相似说明对有特定的分子的物种， 拉曼光谱是具有一定的选择性和灵敏度。s e n g u p t a 4 驯等人发现可用s e r s 分析气溶 胶的特征，将大肠杆菌，铜绿假单胞菌，鼠伤寒沙门氏菌的悬浮溶液分别与纳米 银胶悬浮液混合后可获得他们的拉曼光谱。为了分析谱图，也获得了n 乙酰基葡 萄糖，l 赖氨酸，d 丙氨酸，d 谷氨酸的s e r s 光谱图，对特征峰区域的鉴定， 微生物的浓度，所需胶体粒子进行基础研究以获取最优的拉曼信号之后，将气溶 胶微生物转移到银纳米胶体悬浮液中后获得其拉曼光谱图。r o g e r 4 9 】等人用s e r s 分析临床导致泌尿道感染的细菌。 5 西南大学硕十学位论文 第一章绪论 第三节本文设想和主要研究内容 根据以上文献分析，我们认为用s e r s 研究d n a ，氨基酸等生物大分子，细 菌等活体细胞具有极大的潜力。可深入研究d n a 与诺氟沙星与的相互作用，d n a 与中药紫草的相互作用；采用拉曼光谱技术研究甘氨酸在无机纳米粉体中的应用。 在此基础上，对大肠杆菌与重组菌进行s e r s 研究。 ( 1 ) 诺氟沙星为杀菌剂，是第一个喹诺酮类抗菌药，通过作用于细菌d n a 螺 旋酶的a 亚单位，抑制d n a 的合成和复制而导致细菌死亡，在临床上有着非常广 泛的应用，然而随着氟喹诺酮类广泛应用，其耐药现象也不断出现，因此研究氟 喹诺酮诺药物的抗菌机理就显得尤为重要。拉曼光谱可以从分子水较深入地研究 分子的构象变化和相互作用的过程。我们分析了诺氟沙星胶囊的拉曼光谱，建立 用拉曼光谱检测喹诺酮类药物的分析方法，用拉曼光谱研究诺氟沙星对d n a 的影 响。以进一步从分子层面深入了解喹诺酮类抗生素的抗菌机理。 ( 2 ) 紫草具有止血、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤及抗剩余作用。植物药用化 学研究表明紫草主要生理活性物质为紫草素及其衍生物等萘醌类化合物。紫草素 和酰基紫草素抗肿瘤作用机制证明可破坏d n a 模板，抑制肿瘤细胞d n a 的复制 和转录。在本文中，我们将紫草素提取液用薄层色谱进行分离，在分离得到的左 旋紫草素原位滴洒灰色银胶，直接检测化合物的f t - s e r s 光谱，同时在左旋紫草 素原位滴加d n a 后测定复合物的f t o s e r s 光谱并研究左旋紫草素与d n a 的表面 增强拉曼光谱的相互作用。研究发现在薄层色谱原位可获得左旋紫草素的主要特 征谱带，可表征化合物与d n a 的结合方式：萘醌母环中平面结构可能插入d n a 的双螺旋碱基平面。拓展了s e r s 在中草药化学领域的应用，期望为中药成分的药 理提供分子层面的可靠依据。 ( 3 ) 超细碳酸钙作为无机材料的关键组分被广泛应用于塑料、陶瓷、涂料、橡 胶、新型材料中等行业。甘氨酸是最简单的氨基酸，甘氨酸不但可以作为酸与钙 源反应提取钙，而且可以作为碱中和碳化反应中所产生的酸，同时对成核和结晶 过程具有修饰和阻止晶体快速长大的作用。本文用拉曼光谱研究了以甘氨酸与电 石渣为原料制备的纳米级超细碳酸钙，为高附加值、低成本制备超细碳酸钙的工 业化生产技术提供可靠依据。 ( 4 ) 细菌是科学家的研究焦点，因为它们不仅是生物的重要系统，同时也与疾 病、传染病密不可分。大肠杆菌因培养简单、适用性强是最常被研究的细菌之一。 我们研究了大肠杆菌在迟缓期、对数期以及稳定期的拉曼光谱，用傅立叶拉曼光 谱对比分析大肠杆菌与重组菌特征光谱。 6 两南火学硕十学何论文第二章诺氟沙星与d n a 的拉曼光谱研究 第二章诺氟沙星与d n a 的拉曼光谱研究 2 1 引言 诺氟沙星为杀菌剂，是第一个喹诺酮类抗菌药，通过作用于细菌d n a 螺旋酶 的a 亚单位，抑制d n a 的合成和复制而导致细菌死亡【5 0 】，在临床上有着非常广 泛的应用，然而随着氟喹诺酮类广泛应用，其耐药现象也不断出现，因此研究氟 喹诺酮诺药物的抗菌机理就显得尤为重要。许多研究小组对喹诺酮药物抗菌作用 的机理进行了广泛的研究认为：喹诺酮抗菌素并不是直接作用于d n a 促旋酶而是 作用于d n a ，s h e n 5 l 】等认为在a t p 功能的情况下，d n a 促旋酶诱导引发产生特 异性的单链d n a 相结合；p a l u m b o 5 2 等指出喹诺酮药物与单链d n a 的结合中， 镁离子起着重要的连接作用。利用拉曼光谱可以得到生物大分子许多结构信息【5 3 】， 在此基础上展开结构与功能关系的研究，可以获得更加准确和全面的结果【5 4 巧6 1 。 当在核酸中加入药物，对他们进行加热、改变p h 值或加入酶激活剂等物理或化学 的处理之后，从拉曼光谱可以得知发生变化的基团，相互作用的位置与模式等。 从而能够从分子水较深入地研究它们的构象变化和相互作用的过程。深入研究药 物与d n a 作用，有助于从分子水平上理解d n a 的结构特性、基因突变、疾病的 来源、药物的抗癌、抗病毒的作用机制具有重要的意义1 57 。 本实验分析了诺氟沙星胶囊的拉曼光谱，建立了用拉曼光谱检测喹诺酮类药 物的分析方法，而且首次用拉曼光谱研究诺氟沙星对d n a 的影响。以进一步从分 子层面深入了解喹诺酮类抗生素的抗菌机理。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器 r f s 1 0 0 型傅立叶变换拉曼光谱仪( 德国b r u k e r 公司) ，n d ：y a g 激光光源 ( 1 0 6 4 n m ) ，液氮冷却g e 检测器。激光强度为5 0 m w ( 固态样品，扫描1 0 0 次) 和 3 0 0 r o w ( 液态样品，扫描2 0 0 次) ，光谱分辨率为4 c m 1 。 2 2 2 试剂 银胶的制备依据l e e 5 8 】的方法，用柠檬酸三钠还原硝酸银制取，呈灰色，放置 一周获得，室温下避光可保持数周稳定。小牛胸腺d n a 购自于美国s i g m a 公司， 使用前未做进一步处理；诺氟沙星对照品购于中国药品生物制品检定所，使用前 未做进一步处理；诺氟沙星胶囊购自于亚宝药业太原制药有限公司。所有试剂均 为分析纯。测试前用p h 值为7 0 的重蒸馏水配制d n a 溶液一份，浓度为o o l g m l ； 配制2 x l o 弓m o l l 的碱性诺氟沙星对照品标准溶液；取一粒诺氟沙星胶囊，用适量 7 两南大学硕+ 学何论文第二章诺氟沙星与d n a 的拉曼光谱研究 o 1 m o l l 的n a o h 溶解过滤，滤液转移至5 0 r a l 的容量瓶，加重蒸馏水稀释至刻度， 摇匀备用。 2 2 3 实验方法 制取固体d n a 及诺氟沙星胶囊内容物样品，分别测定其拉曼光谱图，见图2 ， 图3 。将诺氟沙星对照品溶液与d n a 溶液按照不同2 ：1 ，1 ：1 ，1 ：2 的比例混合，分 别测定n f x d n a 复合物的s e r s 。确定最佳比例后，再测定不同反应时间复合物 的s e r s 。 2 3 结果与讨论 2 3 1 诺氟沙星胶囊的拉曼光谱 诺氟沙星是第一个氟喹诺酮类药，萘啶环的6 位处连氟原子，7 位上连有哌嗪 环。诺氟沙星的结构如图1 。 r i | i 洲 c h 3 图i 诺氟沙星的结构式 图2 显示了诺氟沙星胶囊内容物与诺氟沙星对照品的拉曼光谱对比图， 2 4 6 c m 。1 - - 5 4 8 c m 。之间的振动峰为萘啶环的c h 的弯曲振动；6 3 6 c m 一是环变形振 动；7 0 3c m 一，7 3 7 c m 一，7 8 8c m d 为环的呼吸振动组峰；吡嗪环的呼吸振动为 1 0 3 3 c m 一，1 0 9 1 c m ，1 1 5 4 c m ，1 2 1 0 c m ；c f 键的伸缩振动在6 6 0 c m ，1 2 6 8 c m ； c - n 伸缩振动发生在8 5 1 c m 一，1 5 3 1 c m ；c = c 伸缩振动发生在1 5 8 3 c m 一，1 6 1 9 c m ； 1 3 8 9 c m 1 处的强峰为o c o 的对称伸缩振动；1 4 5 0 c m q 处的峰为o c o 的非对称 伸缩振动，9 2 8 c m ，9 7 0 c m 一，1 2 1 0 c m ，1 3 5 6 c m q 处的弱峰为c h 键的弯曲振动， 1 3 2 3 c m 。1 处的峰为混合振动【5 4 , 5 5 】。对比胶囊内容物的拉曼光谱图与对照品的拉曼光 谱图，发现两者的特征振动峰v ( c f ) ，v s ( o c o ) ，v ( c = c ) 未发生变化。发生变 化的是：萘啶环的c h 的弯曲振动2 4 1 c m q - 4 9 5 c m ；c h 键的弯曲振动9 6 8 c m ， 1 1 2 6 c m 一，1 2 3 5 c m l ，1 3 5 4 c m l ，象征c - 1 , , 1 伸缩振动的1 5 3 1 c m 。1 处弱峰变为1 4 3 6 c m 1 ， 8 西南大学硕十学何论文第二章诺氟沙星与d n a 的拉曼光谱研究 15 5 4 c r n 1 两峰，可看出发生变化是的主要是分子骨架振动。 表1 不同形态诺氟沙星的拉曼光谱与表面增强拉曼光谱 t a b l e1r a m a ns p e c t r aa n ds e r so f n o r f l o x a c i ni nd i f f e r e n ts t a t e 6 3 6 6 3 96 3 46 4 2 r i n gd e f o r m a t i o n 6 6 06 6 56 5 9c _ fs t r e t c h i n g 7 0 3 ，7 3 7 ，7 8 77 0 7 ，7 3 3 ，7 8 67 0 3 ，7 3 7 ，7 8 67 3 7 ，7 6 8 ，8 6 r i n gb r e a t h i n g 9 2 8 ，9 7 09 2 7 ，9 7 1 c hb e n d i n g 8 518 6 28 5 48 5 4c - ns t r e t c h i n g 1 0 3 31 0 3 8 1 0 9 l 1 0 3 3 1 0 9 1 10 3 4 p y r a z i n er i n gb r e a t h i n g 1 0 5 2 1 2 6 81 2 6 81 2 6 81 2 6 0 c s t r e t c h i n g 1 3 2 31 3 3 21 3 2 31 3 2 5m i x e dv i b r a t i o n 1 3 8 91 3 9 81 3 8 61 3 9 6v s ( o - c 0 ) 1 4 5 01 4 3 6 ，1 4 5 4 1 4 5 2 1 4 5 7v a s ( o c o ) 1 5 8 31 5 4 21 5 8 31 5 5 2c = c s t r e t c h i n g 1 6 1 91 6 3 01 6 1 81 6 2 7c = c s t r e t c h i n g 、，s 对称伸缩振动；v 弱非对称伸缩振动 比较n f x 水溶液在银溶胶中的s e r s 图谱与固体的r a n l a n 谱图，表1 显示了 9 两南人学硕十学位论文第二章诺氟沙星与d n a 的拉曼光谱研究 !iiii,- - 一h i一_ ii 皇曼皇曼曼曼曼曼皇曼曼舅曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼! 曼 属于吡嗪环呼吸振动的1 0 9 1 c m 1 消失，属于o c o 非对成伸缩振动的1 4 5 0 c m 1 消 失，出现了1 4 3 6 c m 1 和1 4 5 4 c m 。1 两峰。其余信噪位置与固体的g a m a n 图谱相似。 n f x 在固态与液态下的拉曼峰差别一是因为n f x 在水溶液中受到水的溶剂化作 用，另外在s e r s 中活性衬底对n f x 的吸附也会使其拉曼散射相互强度发生变化 5 9 , 6 0 。而胶囊中的辅料淀粉，磷酸氢钠，磷酸氢钙，环糊精等的存在对n f x 拉曼 测定产生一定影响，如图2 、3 和表1 ，固体状态下影响不大，液体状态下影响较 大。原属于c f 键伸缩振动的6 5 9 c m - 1 的峰消失，而标准品中6 6 5 c m 1 的存在说明 液体状态下胶囊中的辅料对c f 键有影响，同时，4 0 0 c m - 1 - - - 8 0 0 c m l 之间拉曼峰的 改变，与标准品s e r s 的差别都说明辅料影响了n f x 分子，使其骨架的振动改变 较大。诺氟沙星胶囊固液状态下象征c h 弯曲振动键不存在也说明辅料对n f x 分 子骨架产生一定的影响。但诺氟沙星胶囊中存在辅料在一定程度上影响分子的骨 架运动，并不会使诺氟沙星物质分子结构发生变化。因此，用拉曼光谱检测诺氟 沙星胶囊，辅料并不会对测定产生影响。 o c j c r a mshiftcmans h i f t c m 1k a m 图2 固体诺氟沙星的拉曼光谱( 1 ) 诺氟沙星胶囊；( 2 ) 诺氟沙星 1 0 西南人学硕十学位论文第二章诺氟沙星与d n a 的拉曼光谱研究 套 历 c _ 三 r a m a ns h i f t c m 。1 图3 诺氟沙星溶液的表面增强拉曼光谱( 1 ) 诺氟沙星；( 2 ) 诺氟沙星胶囊 2 3 2 诺氟沙星对d n a 的影响 本部分研究了诺氟沙星与d n a 作用的s e r s 变化情况( 见图4 ，5 ) 。d n a 水 溶液在银胶体系中没有明显的s e r s 信号，这可能是d n a 与银溶胶产生吸附的位 置在双链外侧的磷酸酯骨架上，使产生的s e r s 信噪比很弱而无特征的散射信号 6 1 1 。当加入d n a 后，n f x 中6 6 5 c m l ，1 2 6 c m 一，1 6 3 0 c m 1 信号明显降低且发生红 移，6 3 9 e m ，7 0 7 c m ，7 8 6 c m ，9 7 1 c m 一，8 6 2 c m ，1 3 31 c m - 1 , 1 4 3 6 c m ，1 4 5 4 c m 。1 散射峰消失，说明n f x 结构发生了变化。n f x 与d n a 复合物的s e r s 信号比n f x 本身的s e r s 信号强度明显减弱，这意味着其与d n a 相互作用的主要键合模式是 插入作用。n f x 分子中的平面结构可能插入d n a 的双螺旋碱基平面，进而产生非 共价键的舻兀堆积作用，使n f x 中芳环兀电子密度发生变化，引起s e r s 信号减 弱1 6 2 1 。6 6 5 c m 1 ，1 2 6 8 c m d 峰强降低且发生红移，但未消失，说明芳环平面与d n a 发生作用，6 3 9 c m ，7 0 7 c m ，7 8 6 c m ，9 7 1 c m 。1 属于n f x 骨架振动的峰由于芳环 与d n a 的插入作用消失，1 3 3 1 c m 1 处属于c _ _ n 伸缩振动的峰的消失也证实了这 一推测。