（遗传学专业论文）鱼类几种免疫相关基因的克隆与鉴定.pdf

浙江人学颂t 学位论史 一一 摘要 为了克隆草鱼免疫相关基因我们构建了草鱼n 绌胞c d n a 文库，同时埘利用生物 信息资源快速鉴定鱼类新的功能基因的方法进行了初步探讨，为今后深入丌展鱼类功 能基因研究奠定了良好的基础。 本文第一部分取病毒感染3 6 小时后的草鱼头肾并分离白细胞，用改进的异硫氰酸 ， 胍一步法从其中提取总r n a ，磁珠法分离纯化m r n a ，电泳检测其质量。怪逆转录 合成双链c d n a ，经过分离柱除去小片段d n a 后重组入噬菌体k g t l 0 载体中，转染宿 1 ， 主菌c 6 0 0 h 莎文库包装效率为4 2 1 0 7 p f u u g ，c d n a 插入片段大小在0 4 3 k b 之间o 1 用p c r 方法筛选文库，获得了草鱼干扰素( i n t e r f e r o n ，i f n ) 基因的部分序列。研究表 厂 明，所构建的文库质量较高，可以广泛用于草鱼免疫相关莲旦蛰趣达和迥量研究。 本文第二部分利用计算机表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a - 酝, e s t ) ，t i g rg e n e i n d e x 等数据库进行综合搜索分析，快速鉴定了鱼类两种新的功能基因：q m 和n k e f 基因，并对获得的c d n a 全序列进行了分析。最后，根掘拼排的n k e f 基因的开放阅 读框架( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) 的保守区设计特异引物，经p c r 反应( 在1 0 0u l 反应混合液：2 0 0 m m d n t p s ，1 5 m m m g c l 2 ，1 0 m l1 0 b u f f e r , 0 2 m mp r i m e r ，l 单 位t a q d n a p o l y m e r a s e 中进行，反应温度和时问条件是9 4 。c3 0 秒，5 5 。c3 0 秒及7 2 1 分钟，4 0 个循环后琼脂糖凝胶电泳检测) ，从文库中扩增到草鱼n k e f 基因o r f 的3 0 0 b p 长度的e d n a 片段。 ， 关键词 草鱼c d n a 文库：鱼类免疫功能基因；表达序列标签，沣箅 腕隆， 浙江人学硕p 学位论文 a b s t r a c t ac d n a l i b r a r yo fg r a s sc a r p ( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) l e u k o c y t e ss t i m u l a t e dw i t h v i r u sw a sc o n s t r u c t e di no r d e rt oc l o n ea n da n a l y z et h ei m m u n eg e n e sw h i c h a r ei n d u c e da n d e x p r e s s e db yv i r u s i n f e c t i o ni nt h ei m m u n es y s t e mo ft h i sf i s h i n i t i a ls t u d i e so nr a p i d i d e n t i f i c a t i o no ff i s h sn e wg e n e sb ye x p r e s s e ds e q u e n c et a ga n a l y s i sw e r ea l s ou n d e r t o o ki n t h i sp a p e r o u re f f o r t sw e r et a k e nt ol a yt h ef o u n d a t i o no ff u r t h e rs t u d i e so nc l o n i n ga n d f u n c t i o no fn e wg e n e si nf i s h t h ec o n s t r u c t i o na n de v a l u t i o no f t h e ? l g t l oc d n al i b r a r yo fg r a s sc a r pl e u k o c y t e sa r e d e s c r i b e d t o t a lr n aw a se x t r a c t e df r o mh e a d k i d n e yl e u k o c y t e su s i n gs i n g l e s t e pm e t h o do fr n a i s o l a t i o nb ya c i dg u a n i d i n i u mt h i o c y a n a t e p h e n o l - c h l o r o f o r me x t r a c t i o n p o l y ( a ) m r n aw a si s o l a t e dw i t h p a r a m a g e n t i cp a r t i c l e s m e t h o d t h ec d n a sw e r e s y n t h y s i z e d a f t e ras e r i e so f e n z y m e c a t a l y z e dr e a c t i o na n d t h e nc l o n e di n t ok g t l ov e c t o ra f t e rr e m o v i n gs h o r ts e g m e n t s b ye d n a s i z e df r a c t i o n a t i o nc o l u m n s t h ee f f i c i e n c yo f p a c k a g i n gi sc o n f i r m e dt ob ea b o u t 4 2 1 0 p f u u ga f t e ri n f e c t i n gt h eh o s tc 6 0 0 h f l t h el e n g t ho fi n s e a e de d n ar a n g e sf r o m o 4 k bt o3 k b i td e m o s t r a t e dt h a tt h el i b r a r yi so f h i g hq u a l i t ya n dc a nb eu s e da sav a l u a b l e r e s o u r c ef o r s t u d y i n gg e n ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t o r ym e c h a n i s m s m e a n w h i l e ，t h et a r g e t c d n a g e n e ss u c ha sg r a s sc a r pi n t e r f e r o n ( i f n ) a n dn a t u r a lk i l l e rc e l le n c h a c e n m e n tf a c t o r f n k e f ) w a sp r o b e dw i t hp c ra m p l i f i c a t i o n t h r o u g hi n t e r g r a t e da n a l y s i so fp u b l i c ed a t a b a s es u c ha se s t ，t i g rg e n ei n d e xi n s i l i c o ，u s i n gh u m a n i n m u n eg e n e ss e q u e n c e st h a ta r el i k e l yt ob ep r e s e n ti nf i s ha sq u e r y ，t w o n e wf i s h sg e n e sa s s o s i a t e dw i t hi m m u n e r e s p o n s ew e r ei d e n t i f i e d ，w h i c hi n c l u d i n gw i l m s t u m o rr e l a t e dg e n e ( q m ) a n dn k e f t h e i r f u l l l e n g t he d n as e q u e n c e sw e r ea s s e m b l e dw i t h f i s h se s t sf r o m p u b l i ce s td a t a b a s e s ，a n dt h e na n a l y z e db ys o f t w a r e ss u c ha so r f f i n d e r , c l u s t a lwa n dg e n e d o c a c c o r d i n gt ot h ec o n s e r v e dd o m a i n so fa l i g n e dn k e f g e n ea n dh u mn k e f g e n e ，ap a i r 0 1 p r u n e rw a sd e s i g n e d ：n k e fs p e c i f i c f o r w a r d ( 5 1 c a t t g g a t tt c a c c t t t g 3 ) ，n k e fs d e c i f i c r e ”e r s e ( 5 。t t c t c c g t g t t t g t c a g t 3 ) f o n yc y c l e so fa m p l i f i c a t i o n ( 9 4bf o r3 0s e c o n d s 5 5 f o r 3 0s e c o n d sa n d7 2 g f o rl m i n u t e s ) w e r ep e r f o r m e di ni 0 0u lr e a c t i o nm i x t u r e ( 2 0 0m m d n t p s 1 5m m 2 浙江大学硕上学位论文 m g c l 2 ，1 0u lio x b u f f e r ，0 2m mo f e a c hp r i m e ra n d1u n i to ft a qp o l y m e r a s e ) f o ri l l , h e rp u r i f i c a t i o n ， 10 0u lo ft h ep c r p r o d u c tw a ss e p a r a t e du s i n ga g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s o n ed e s i r e db a n d ( a b o u t3 0 0b p ) w e r eo b t a i n e d e s t a n a l y s i sh a sb e e nh a v i n gt r e m e n d o u si m p a c to nt h en u m b e ro fb i o d e f e n s e r e l a t e d g e n e s k n o w ni nf i s h w l f i l s tt h i sw i l ti n c r e a s e o v e rt h ei n c o m i n gy e a r s ，m o r em o d e l o r g a n i s m sa r et ob ef u l l ys e q u e n c e da n ds h o u l dr e v e a lm o r eg e n e sa v a i l a b l et ot e l e o s tf i s h c l e a r l yt h ec o m i n gy e a r sw i l lb eam a j o rt i m eo fg e n ed i s c o v e r yi nf i s ha n dm o s to fo t h e r o r g a n i s m s ，c o m b i n i n gl a b w o r k i n ga n db i o i n f o r m a t i c s ，a n dt h ei m m u n o l o g i c a lg e n e t i c so f f i s hw i l lb e n e f i t sf r o mt h e m g r e a t l ya n dm a k ear a p i dp r o g r e s s k e y w o r d s ：c o m p l e m e n t a r yd n al i b r a r y o fg r a s s c a r p ；i m m u n er e l a t e d g e n e s o ff i s h ； p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ；e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ；i ns i l i c oc l o n i n g 浙ij ：人学硕_ 上学位论文 文献综述 鱼类e s t 及基因组研究进展 自从人类基因组计划实施十余年来，d n a 测序技术和生物信息技术都取得了 长足的进步，e s t 分析已经成为科学家们发现新基因和研究基因调控及差异表达 的重要手段。随着e s t 数据库的越来越完善，必将大大加快人类及动植物基因组 的研究进程。近几年鱼类e s t 及基因组研究发展较迅速，我们参考有关资料对其 作一介绍。 e s t 即表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c e dt a g s ) 是指随机挑选c d n a 克隆 进行单向、一步大规模测序所获得的部分c d n a 序列。早在1 9 8 3 年，p u t a c y 等就在n a t u r e 上发表文章，认识到来源于c d n a 的短的d n a 序列可以用于鉴定 基因。1 9 9 1 年6 月，美国国立卫生研究院( n a t i o n a li n s t i t u t eo f h e a l t h ，n i h ) 的 生物学家j 、c v e n m r 发表了一种发现表达基因的新战略，即使用e s t 鉴定新的功 能基因。同年1 2 月用于基因查找的第一个程序g r a i l 开发成功，从而可以较快 地从大片段基因组序列中找出表达序列。1 9 9 3 年美国国立生物技术信息中心 ( n m i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ，n c b l ) 建立了专门的e s t 数据库 d b e s t ( d a t a b a s ee s t ) 来保存和收集所有的e s t 数据，当时只有7 种不同生物 体的2 疗多条e s t 序列。经过l o 年的发展，至2 0 0 2 年3 月8 日，e s t 总数已 经达到l o ，8 1 8 ，6 5 8 条，涉及几十个物神，其中人类e s t 4 ，1 7 1 ，2 2 0 条( 占3 8 5 ) ， 小鼠e s t 2 ，5 2 5 ，6 4 5 条( 占2 3 3 ) ，而硬骨鱼类的e s t 有2 6 5 ，7 0 4 条，占g e n b a n k 的d b e s t 总数的2 5 。鱼类到目前为止，硬骨鱼类中的e s t 研究较深入的有斑 鱼( z e b r a f i s h ) 1 2 , 2 5 1 ，h 本青鲻( m e d a k a ) ，河鲶( c h a n n e lc a t f i s h ) 1 3 , 4 , 5 , 9 j ，日本牙鲆 ( j a p a n e s ef l o u n d e r ) ，冬牙鲆( w i n t e rf l o u n d e r ) 1 8 , 2 3 l ，大西洋鲑鱼( a t l a n t i cs a l m o n ) 1 1 州， 普通鲤鱼( c o m m o n c a r p ) | 2 4 l ，虹鳟( r a i n b o w t r o u t ) f 1 ”。5 3 夕1 , ，在白虾( w h i t es h r i m d ) 也已经有了初步研究。本文对它们的e s t 及基因组研究的最新进展及相关应 用整理如下。 浙江大学硕士学位论文 l 、鱼类基因组计划 2 0 0 0 年底，美国、新加坡和英国的科学家共同组成的国际河豚基因组协会 宣布丌始实施河豚基因组测序计划。2 0 0 1 年1 1 月基因组研究所( t h ei n s t i t u t eo f g e n o m e r e s e a r c h ，t i g r ) 组织召开第1 3 届国际基因组测序和分析会议，首次公 布了河豚基因组工作框架图，这是第三个公之于众的脊椎动物基因组框架图，而 且它是目前为止已知序列最完整的。该框架图集成了河豚基因组约2 0 0 0 0 个重叠 群( c o n t i g s ) ，覆盖了3 1 0 兆单一d n a 序列，这一数目与人类基因组中包含的基 因数量相当，但是，它的基因组长度只有人类基因组长度的1 8 ，因此它的基因 和调控单元的鉴定相对比人要容易些。预计2 0 0 2 年上半年将发布一个有关河豚 基因组的分析结果，并将其所有序列信息公开化。 另一个鱼类基因组计划是华盛顿大学斑马鱼基因组资源计划，该计划的主 要目标是：( 1 ) 获得1 0 0 0 0 0 条e s t ，用于鉴定基因组中的2 5 0 0 0 3 0 0 0 0 个基因； ( 2 ) 拿到一张高密度的斑马鱼基因组的转录图谱。该计划的合作者在1 9 9 9 年已 向g e n b a n k 提交了3 8 0 0 0 条e s t 数据，并通过e s t 分析鉴定了1 0 0 0 0 1 5 0 0 0 个基因，在l n 5 4 r ht r a n s c r i p tm a p 上定位了1 7 5 0 多个e s t 和基因。现在斑马 鱼e s t s 数日已达2 0 0 ，0 0 0 多条，大大超过了预先定下的目标。该计划发展e s t ， 进行基因和e s t 作图，分配和设计e s t 作图引物到各个实验室，改良近亲交配 的( i n b r e d ) 斑马鱼作图品系。这些有用的基因组和遗传分析工具，加快了斑马 囱的分子生物学研究进程。该项目得到了n i h 资助”。 此外，鲶鱼( c a t f i s h ) 基因组学研究也取得了许多进展，主要有人量分r 标 记( m a r k e r ) 的形成，产生物种间和物种内的作图资源，产生了遗传连锁图框架， 鉴定了几种牛产性状连锁的d n a 标记。进来又启动了几项计划：将大片段插入 b a c 文库，构建物理图谱，进行转录本分析( t r a n s c r i p ta n a l y s i s ) 用r 鉴定鲶鱼 大多数基凼。 2 、鱼类e s t 研究进展 斑马鱼的e s t 数目占所有硬骨鱼类e s t 总数的7 8 ，达2 0 7 ，1 6 6 条，由于 其丰富的e s t 资源，t i g r 专门为其建立了斑马鱼基因索引( z e b r a f i s hg e n e i n d i c i e s ，z g i ) ，以便于人们能更好地利用这。e s t 资源。最近，t i g r 在2 0 0 2 年1 月2 日发布了z g i8 0 版1 1 5 , 1 6 1 。 另一个建立了基因索引的鱼类是河鲶鱼( c h a n n e lc a t f i s h ) ，2 0 0 2 年3 月2 8 日 更新到1 1 版。d b e s t 中河鲶鱼的e s t 数目已达4 5 6 9 9 条。基因组研究所基因 索引( t i g rg e n ei n d i c i e s ，t g i ) 是通过对e s t 和编码区进行严格分簇( c l u s t e r ) ， 是对公共数据库中的大量e s t 所代表的转录本的内容或功能的最好猜测。从 g e n b a n k 的d b e s t 下载的e s t 经过除去e s t 两端的载体序列、p o l ya t c t 序 列、d n a 片段如接头，衔接头等无用的d n a 序列，确定每个e s t 中的有用序 列。然后，通过逐碱基比较( p a i r w i s ec o m p a r i s i o n ) ，将e s t 和编码序列归类成簇， 无法归类到任何簇的e s t 称为s i n g l e t o n e s t s 。重叠碱基数目大于4 0 个、相似 性9 5 以上的e s t 被分到同一个簇，再将这些簇用t i g ra s s e m b l e r 4 4 1 程序进行 高度严格的组装，产生实验性的致序列( t e n t a t i v ec o n s e n s u ss e q u e n c e s t c s ) 。 这些t c s 经过第二轮的分簇和组装，以减少序列冗余性，将获得的t c s 和非冗 余的氨基酸数据库( n o n r e d u n d a n ta m i n oa c i dd a t a b a s e ，n r a a ) 比较，产生五条最匹配 的记录( t o ph i t s ) 用于推定t c s 的功能。t i g r 还提供一个b l a s t ( b a s i cl o c a l a l i g n m e n ts e a r c ht o o o t _ 具用于搜索t g i 。t g i 可以确定e s t 数据库中最忠实复制 的转录本序列。经过对e s t 和基因序列的组装，t i g r 目前已经建立了多达5 0 种动植物模型的t g i 。t g i 被证实是分析e s t 序歹0 ( g 9 9 3 - f k 2 _ - ，t g i 用途广 泛，每个科学研究团体都可以免费使用1 17 , 1 8 , 1 9 , 2 0 】。 表1 和表2 分别列出了近几年国际鱼类e s t 研究概况，n c b i2 0 0 2 年3 月2 8 闩公布的d b e s q 中的硬骨鱼类e s t 条目。从表l 中可以看出，鱼类还有许多未知 的新基因，4 0 以上的鱼类e s t 未得到有效鉴定，发现的免疫相关基因更是少， 这可能与鱼类e s t 研究起步较晚有关。 6 浙江大学硕：t 学位论文 表1 近几年国际鱼类e s t 研究概况一览 c d n a 文库的组织来分析的克隆被鉴定的克隆或 免疫相关韵参考文献 源或e s t 数目e s t 数目( )e s t 数目( ) 肝、脾3 9 l1 8 9 ( 4 83 )a o k tt 等，1 9 9 7 日本 h r v 感染的白细胞 5 9 63 8 6 ( “8 )6 6 ( 1 1 )a o k t t 等。1 9 9 9 牙鲆h r v 感染的白细胞 3 0 02 1 7 ( 7 23 )3 0 ( 1 0 )a o k lt 等。2 0 0 0 免疫剌、擞肽聚糖谎导1 9 89 2 ( 4 65 )k o n ot 等2 0 0 1 的肾 冬牙胃、肠、肝、脾、卵 9 2 8 4 5 3 ( 4 88 1d o u 由ss e 等，1 9 9 9 鲆巢、幽i - j 盲肠 i n h v 感染的肾和鳃1 9 81 5 8 ( 8 0 )k o n ot 等2 0 0 0 虹鳟肠、肾、肝 3 0 7 1 9 5 ( 6 3 丹0 )$ o o m i a gk i m 脑1 2 0 1 5 9 5 4 95 )1 0 8 )z , h m l i nj u 等2 0 0 0 鲶鱼 头肾2 2 2 81 4 9 5 ( 6 7 1 ) z h 1 mj u 等2 0 0 1 皮肤1 9 0 9 1 3 7 6 ( 7 2 l )z , h e n l i nj u 等2 0 0 2 鲑鱼肝、脑、卵巢、精巢、 1 0 2 8 5 1 0 ( 5 0 )g r a c ecd a v e - 脾、肌肉 等2 0 0 l 青鳓肝3 3 2 5 ( 7 5 7 1 a o k it 等，1 9 9 7 普通 l p s 、c o t l a 刺激豹头 2 0 0 1 2 9 ( 6 45 )2 1 ( 1 1 )r a ms a r a n 等，2 0 0 2 鲤鱼肾白细胞 臼虾 血细胞、肝胰脏 2 0 4 5 2 6 8 ( 1 3 ) p sg i - o $ $ 等，2 0 0 1 表2n c b i2 0 0 2 年3 月2 8 日公布的d b e s t 中的硬骨鱼类e s t 条目【2 2 0 0 2 年3 月2 8 日公布的d b e s t 在硬骨鱼类e s t ( e s t 总数1 0 ，8 18 ，6 5 8 )中的比例 z e b r a f i s h 2 0 7 ，1 6 67 7 9 7 j a p a n e s em e d a k a4 5 ，6 9 9 1 7 2 硬骨鱼类e s t 条目 c h a n n e lc a t f i s h 1 0 ，8 5 94 0 8 共2 6 5 ，7 0 4 条w i n t e rf l o u n d e r 9 1 j03 4 c o m m o nc a r p6 0 6 0 2 3 r a i n b o wt r o u t4 5 9 01 7 7 浙江大学硕士学位论文 3 、鱼类e s t 及基因组研究的应用前景 以往鱼类的分j 二遗传学研究主要集中在数量有限的基因和基因产物上。近年 来，随着人类基因组计划在世界范围内的开展，生物信息学作为一门热门交叉学 科，不断地完善和发展起来。作为一种强有力的工具，它帮助我们对巨量的生物 信息进行归纳和理解，从而揭示生命的奥妙，然而面对复杂和庞大的数据库，如 何驾轻就熟地获取我们所需要的信息已成为每个研究者关注的焦点1 4 ”。生物信息 技术和分子技术的发展，就使高通量的转录体分析成为可能。鱼类生物信息资源 包括已知基因、c d n a 、各种标记和e s t 的序列及定位；同源性，基因结构、功 能和氨基酸序列等信息；计算机信息技术将这些生物信息资源汇集成庞大的数据 库，借助于b l a s t 序列同源检索工具，c a p 3 4 9 1 组装软件等计算机程序，极大 方便了新基因的计算机克隆、定位及鉴定，e s t 序列组装和c d n a 的电予延伸， 使生命科学从此将向模型化和理论化迈出关键的一步。公共数据库中的e s t 数 据是比较和功能基因组学研究的重要资源，是注释基因组序列的一个有用工具。 ( 1 ) e s t 用于基因鉴定和分析基因表达情况 鉴定一种组织细胞中表达的基因的一个基本步骤是明白基因的组织生理学 功能。鉴定一个组织转录体的有效途径是对c d n a 文库中的c d n a 克隆进行部 分测序获得e s t 。e s t 分析不仅可鉴定特异组织中转录的基因，而且还能揭示用 于制备c d n a 文库的组织的基因表达概况。随着测序技术的发展，只要有必要的 实验设施，不需要花费昂贵的代价就可以产生大量的e s t ，这些e s t 足以代表 大多数基因在一个机体中的总体转录活动。 e s t 目前已经广泛用于人类基因和小鼠基因鉴定，然而e s t 在鱼类基因鉴 定方面还刚刚起步。基因组d n a 测序是获得一个机体全基因组基因的唯一精确 的途径，但是这个过程即费钱又费时。e s t 在基因发现中的关键作用，已经有大 量文献报道1 3 9 ，4 1 ，42 1 。如用果蝇t o l l 蛋白搜索d b e s t ，发现其有抗菌免疫反应的 功能，从而导致了e s t ( h 4 8 6 0 2 ) 的鉴定。由此可见，跳过分类学的边界迅速 克隆重要的人类基因是可能的。从模式机体中鉴定的基因到那些更复杂的人和鼠 中的基因，只要有一个足够大小和复杂度的数据库，就可以使用计算机进行数据 检索的方法( 本质上是计算机杂交实验) ，进行敏感的基因鉴定。而且，这种方 法允许基因组间的跳跃f 2 2 】。 e s t 大大促进了c d n a 微列阵技术在系统地鉴定基因差异表达研究中的应 用，大规模e s t 分析是基因鉴定和分析基因表达情况的有效途径。它使我们能 快速有效地看到那些在不同组织、不同生理状态下或在特定的发育阶段表达的基 【习。e s t 也已经成为基因作图的重要资源。经过测序分析，e s t 可以根据组织特 浙江大学硕t 学位论文 一一 异一陀，l 化途舱，或根据j f 冗余转录本的高保真性进行分类。这些分了类的e s r 1 1 r q - 被什jj 二点阵，来研究特定的代谢途径，特定的环境下的基n i j 目控和表达。如在 人t 细胞中新的热激基因和佛波脂调节基因，就是用微点阵法对1 0 0 0 个基因表 达的监测后鉴定的。 e s t 分析除了- 可以用于发现新基因，还可以用于快速鉴定和分析参与特殊生 物学途径的基因。最近，p a t t e r s o n 等使用转录体的方法，鉴定了鲶鱼6 0 s 核糖体 中的所有4 7 个核糖体蛋白基因，4 0 s 核糖体中的所有3 2 种核糖体蛋白基因。如 果使用传统的方法，这些工作要花费更多的精力和时间才能完成1 2 “。这种系统 e s t 分析适合用于鉴定选择性拼接产生的转录体，以及选择性聚腺苷酰化转录 体，表明e s t 分析的价值和作用是巨大的。 ( 2 ) 用于物理和遗传图谱构建 e s t 是基因组作图必不可少的工具1 4 7 a 8 】。基于e s t 的p c r 和杂交点阵还可 以用于鉴定y a c s ，或其它大插入片段的克隆，根据这些克隆可以构建基因组物 理图谱。将e s t 放置到物理图谱上可以快速鉴定基因间隔，包括含有剩余基因 的序列，负责基因表达的d n a 控制元件。分析这些元件是具体了解基因功能的 前提条件。物理图谱和遗传图谱的相互参照可以提供一个更强大完整的资源。有 一张完整的图谱，研究者可以将一个感兴趣的孟德尔性状基因定位到基因组间 隔，并且通过参考基于e s t 的基因图谱，我们就可以获得基因在间隔上的一个 列表。 w i l l i a mey o u n g 等1 9 9 8 年报道了第一张详细的虹鳟( r a i n b o wt r o u t ) 遗传连 锁图( g e n e t i cl i n k a g em a p ) ，估计图的最小长度2 6 2 7 5 厘米【3 2 】。 l a ng w o o d s 等”5 】于2 0 0 0 年在纯合二倍体减数分裂作图板上定位了6 9 1 个 基凼和e s t s ，使作图板上的标记总数达2 1 1 9 个( 包括1 5 0 3 个基因、e s t ，6 1 6 个先前被鉴定的简单序列多态( s i m p l e - s e q u e n c el e n g t hp o l y m o r p h i s m s ，s s l p ) 。 通过对被作图的斑马鱼基因序列进行分析，鉴定了8 0 4 个斑马鱼基因和e s t 与 人类基因有同源。作图比较揭示了1 3 9 个新的保i r 共线序歹i j ( s y n t e n t y ，o i las i n g l e c h r o m o s o m e ：在同一染色体上的两个或多个基因) ，也显示了斑马鱼和人的染色 体之问并非一一对应关系。减数分裂和放射杂交( r a d i a t i o nh y b r i d ，r h ) 作图 计划定位的1 1 0 0 多个基因和e s t 都可以作为快速检测突变的候选序列。遗传筛 选可以鉴定斑马鱼基因突变，从而鉴定了脊椎动物基因组中的数百个重要功能保 守的基因。到了2 0 0 1 年1 1 月，h u k r i e d en 等【4 6 】已经在l n 5 4 放射杂交板上放置 ，3 1 1 9 个e s t 和c d n a 序列。加上7 4 8 个s s l p 标记和4 5 9 个被作图的基因和 e s t s ，使斑马鱼基因组的l n 5 4 放射杂交板上的标记总数达4 2 2 6 个。比较基因 9 浙江大学硕士学位论文 图谱是比较研究的搬有+ 用的资源，随着斑马鱼图谱的密度增加，必将加速斑马鱼 突变的分子分析、鉴定，增进对脊椎动物基因组进化的理解【2 9 3 0 3 1 ，3 ”。 k i y o s h in a r u s e 等2 0 0 0 年用6 3 3 种标识( 4 4 8 个a f l p s ，2 8 个r a p d s ，3 4 i r s s ， 7 5 个e s t s ，4 s t s s 和4 个表型标记) 对青鳓作图。 获得青蝣遗传连锁图( g e n e t i cl i n k a g em a p s ) 总长1 3 5 4 5 厘米，发现与其2 4 个 单倍染色体棚列应的2 4 个连锁组( 1 i n k a g eg r o u p s ) 1 2 7 , “j 。 ( 3 ) e s t 和基因组序列的注释 鉴定从各种机体中来源的大量e s t ，就有可能将e s t 序列组装成实验性一 致序列( t c s ) 或基因索引数据，如u i n g e n e ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v u n i g e n e ) 和t i g r 基因索引( h t t p ：w w w t i g r o r g t d b t g i s h t m l ) 。这些t c s 可以用于提供推 定的基因的功能注释，可以与图谱和基因组测序相联系，还可以用于提供直向 平行进化同源基因之间的联系。e s t 结合连锁图谱和物理图谱信息，可以广泛用 于基因的功能注释。t i g r 开发了t i g r 直向进化同源基因对比( t i g ro r t h o l o g o u s g e n ea 1 i g n m e n t s ，t o g a ) 口3 j 数据库，用于提供真核生物基因组的相互参照注释， t o g a 是分析真核生物基因功能的重要新资源。此外分析许多物种的序列能使我 们对真核生物的进化过程有更深刻的了解f 3 4 l 。 尽管e s t 数据还不完善，但是即使有了精确的基因组d n a 序列数据，基 因的鉴定还是要依赖于e s t 。华盛顿大学基因组测序中心和s a n g e r 中心的合作， 对线虫基因组的1 0 0 百万碱基对中的7 0 百万碱基对进行测序，e s t 是用于分析 基因组序列，发现基因的系列工具之一；借助于计算机程序可以发现外显子，根 据e s t 匹配则可以提供有价值的转录的实验证据。根据e s t 与基因组d n a 序 列的匹配情况可以精确预测基因内含子和外显子的组成，鉴定选择性拼接事件， 鉴定碡因组异常情况。相似地，人和鼠e s t 在鉴定人基因组d n a 序列中新基因 时起重要作用 3 5 1 。 从很多物种都获得了许多e s t ，e s t 占g e n b a n k 条目总数的7 1 ，占 i n d i v i d u a ln u c l e o t i d e s 数的4 0 。我们可以通过e s t 了解各种机体基因的表达概 况。通过对序列数据的仔细分析可以提供重要的，附加的功能以及结构和进化信 息。 ( 4 ) 鱼类基因组和人类基因组研究 国际人类基因组计划，目的是为了鉴定所有人类基因以促进了解人类生物 学，同时对其它脊椎动物的基因组学研究具有极大的促进作用。除了人类基因组 外，几利1 其它的脊椎动物基因组正在研究中，这不仅有助于了解它们自身的生物 学，同时也可以作为解释人类基因组的模型。这些模式生物包括哺乳类的大鼠、 o 浙江大学硕士学位论文 小鼠，鸟类的鸡，两栖类的爪蟾和鱼类的斑马鱼、青鲻、河豚。斑1 5 鱼，青鲻， 爪蟾和鸡主要用于发育生物学研究，而火鼠、小鼠则被作为遗传学和生理学研究 的哺乳动物模型。随着大规模d n a 测序的出现，需要一个简洁的脊椎动物基因 组来作为复杂基因组的参照，用于发现脊椎动物的新基因和基因调控7 _ 亡件，进一 步了解基因组结构。日本河豚正好适于这一用途”“j 。 起先用随机测序和用单拷贝探针筛选基因组文库揭示了河豚4 0 0 m 基因组中 重复d n a 含量少于1 0 ，内含子片段也很短。事实上，大多数河豚内含子小于 3 0 0b p 3 8 j 。由于它含有足够的基因以形成脊椎动物的各种特征，因此人们预测它 有一个较高的基因密度。人类基因组只有3 的编码序列，河豚却有1 7 编码序 列，预计河豚中有6 8 0 0 0 个l k b 编码长度的基因。河豚基因与人类基因同源，由 于内含子被浓缩了7 倍。结果，那些含有大内含子的其它脊椎动物的基因在河豚 中显得特别小1 3 7 】。 可见，河豚是研究脊椎动物基因组的一个较为理想的微模型，它有较高的 基因比例，较低的非编码d n a ( j u n kd n a ) 。生物学家目前还没有鉴定人类基因 组的全部功能区域，小鼠序列的e e 较基因组学在解码人类基因组序列中已经被证 明是非常有成果的。河豚基因组和人类基因组有相同的重要基因和调节序列，因 此河豚基因组很有希望用于探测人类基因组中的可能的功能区域。随着河豚基因 组计划的完成，其简洁的遗传学特性必将加速人类基因及其关键调控序列的发现 【3 8 】。 4 、展望 e s t 可以迅速获得许多表达基因，可用于物理和遗传图谱构建及分析基因 组d n a 序列。这些用途奠定了e s t 的价值，也促使了e s t 数据大量出现。除 了这些用途，冗余性低的e s t 可以用于d n a 微列阵的研究。但是，在当前和未 来的e s t 研究中仍然会面临一些问题。尽管高水平表达的基因可以通过e s t 鉴 定，但同时也必定有。些低水平表达的基因片段仍然未被标签( u m a g g e d ) ，因为 这类基因很少出现在标准化的c d n a 文库中。减法技术及其它方法( 如直接选择 e d n a 克隆) 的大规模应用，有助于这些基因的序列标签。标签这些只在发育早 期阶段表达或只在少量细胞中表达的基因可能需要用新方法构建c d n a 文库。最 后，结合这些途径，紧密相关的物种的e s t 计划就有可能有助于新基因的鉴定。 我们看来e s t 不是对高精确率的基因组序列的替代，而是充当基因组序列解 释的和分析的一个关键工具。而且在基因组研究的探索阶段，e s t 使人们能快速 接近d n a 中最令人感兴趣的部分基因。随着模式生物基因组测序工作的完 成，可以预见未来几年e s t 在基因识别及阐明基因功能的工作中将发挥越来越 一塑些查兰堡主兰垡笙奎一一 人的作 瓶且也会有更多的功能更强大的生物信息学工具问世，使该领域的研究 1 作更方便迅捷。 参考文献： 1 、a d a j n s ，md ，k e l l e y ，j m ，g o c a y n e ，j d ，d u b n i c k ，m ，p o l y m e r o p o u l o s ，m h ，x i a o ， h m e r r i l ，cr ，w u ，a ，o l d e ，b ，m o r e n o ，r f ，k e r l a v a g e ，a r ，m c c o m b i e ，w r ， v e n t e r ，j c ，c o m p l e m e n t a r yd n as e q u e n c i n g ：e x p r e s s e ds e q u e n c et a g sa n d h u m a n g e n o m ep r o j e c t s c i e n c e1 9 9 12 5 2 ，1 6 5 1 - 1 6 5 6 2 、 g o n gz ，y a nt ，l i a oj ，l e es e ，h ej ，h e wc l r a p i di d e n t i f i c a t i o na n di s o l a t i o no f z e b r a f i s hc d n ac l o n e s g e n e 1 9 9 7 2 0 1 ( 1 2 ) ：8 7 9 8 3 、 a t t i l ak a r s i ，d o n g f e n gc a o ，p i n gl i ，a n d r e ap a t t e r s o n ，e ta l ，t r a n s c r i p t o m ea n a l y s i so f c h a n n e lc a t f i s h ( i c t a l u r u sp u n c t a t u s ) ：i n i t i a la n a l y s i