（果树学专业论文）番茄果实特异启动子在柑橘中的活性分析及柑橘果实差异表达基因的分离.pdf

英文缩写 a f l p b p c a m v c d n a c h v a d d a f b d n a d n t p s g u s h i g u s i m j i m p i n v n i h k a n l m c s m i n m p c r m s n p t i i p c r 英文全称 缩略语表 a b b r e v i a t i o n s 中文名称 a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 扩增片段长度多态性 b a s ep a i r c e l s i u sd e g r e e c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s 碱基对 摄氏度 花椰菜花叶病毒 c o m p l e m e n t a r yd n a 互补脱氧核糖核酸 a t t a c h m e n tp r o t e i ng e n ei n a g r o b a c t e r i u m 农杆菌结合蛋白基因 d a y d a y sa f t e rf u l lb l o o m d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e i ct r i p h o s p h a t e 1 3 g l u c u r o n i d a s e h o u r i n t r o ng u s i m m a t u r ej u i c ev e s i c l e i m m a t u r ep e e l i n v e g a s ei n h i b i t o r k a n a m y c i n l i t e r m i t o c h o n d n a lc i t r a t es y n t h a s e m i n u t e m u l t i p l e xp c r m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i u m n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 天 盛花后 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三磷酸 b 一葡糖苷酸酶 小时 含内含子的g u s 基因 未成熟果肉 未成熟果皮 转化酶抑制子 卡那霉素 升 柠檬酸合成酶 分钟 多重p c r m s 培养基 新霉素磷酸转移酶 聚合酶链式反应 p m e i r j r n a r p t d f s t m u x g l u c p e c t i nm e t h y l e s t e r a s ei n h i b i t o r r i p ej u i c ev e s i c l e r i b o n u c l e i ca c i d r i p ep e e l t r a n s c r i p t d e r i v e df r a g m e n t s m e l t i n gt e m p e r a t u r e u n i t 果胶甲酯酶抑制子 成熟果肉 核糖核酸 成熟果皮 差异表达转录片段 熔解温度 单位 5 b r o m o 4 c h l o r o 3 i n d o l y lp d g l u c u r o n i ca c i d5 溴 4 氯一4 一吲哚基 1 3d 葡萄糖醛酸 i i 摘要 果实特异启动子在利用转基因技术改良品质性状策略中起着重要作用 本研究利 用瞬时表达及转基因技术研究了番茄果实特异启动子刎j 在金柑 f o r t u n e l l a c r a s s i f o l i as w i n g l e 中对g u s 基因的表达调控 旨在探索番茄果实特异启动子可否应 用于柑橘育种 同时 利用c d n a a f l p 技术筛选了脐橙果实成熟期间差异表达的基 因片段 为果实特异启动子的分离奠定基础 主要结果如下 1 构建适于瞬时表达的植物表达载体并研究番茄果实特异启动子刎j j 在金柑 中指导g u s 基因表达的特性 为避免因g u s 基因在农杆菌细胞中表达对植物瞬时表达研究的干扰 本研究应用 接头连接酶切产物策略 以植物表达载体p c a m b i a l 3 0 1 的带内含子的g u s j 基 因替换植物表达载体p b l l 2 1 中的g u s 基因 构建了以p b l l 2 1 为基础载体并含有i g u s 的植物表达载体p l z l 3 其正确性得到p c r 酶切以及测序的验证 以金柑不同组织 为材料 通过农杆菌介导开展瞬时表达研究 结果表明p l z l 3 和p c a m b i a l 3 0 1 载体两 载体的g u s 在c a m v3 5 s 组成型启动子调控下的表达没有差异 同时 农杆菌染色表 明 两载体中的1 g u s 基因不会导致g u s 染色反应 本研究构建的p l z l 3 是一种同时 适于瞬时表达和转基因研究的植物表达载体 将克隆得到的番茄果实特异启动子2 么 j 代替p l z l 3 中的c a m v3 5 s 启动予构建 成适于瞬时表达研究的植物表达载体 通过农杆菌介导的瞬时表达研究 发现在弘j j 启动子指导下 i g u s 基因在金柑生殖器官中的表达较强 而在营养器官中表达很弱 或者不表达 研究结果表明番茄果实特异启动子2 么 j 具有作为金柑果实特异启动子 的潜力 2 获得了导入2 4 1 1 g u s 的转基因金柑植株 为验证瞬时表达的结果 本研究利用转基因技术对翻j 启动子调控g u s 基因的 表达特性进行研究 通过将g u s 基因构建于待测启动子刎 j 调控下 将s g u s 经 过截短的g 吣 基因置于c a m v3 5 s 启动子下 将两者置于同一个植物表达载体的 t d n a 区 构建成p l z l 6 植物表达载体 这样 通过转基因g u s 和s g u s 基因可 被插入到植物染色体的同一位点 排除插入位点侧翼序列对两基因表达影响的差 异 通过比较基因表达强度可判断刎j j 是否具有果实特异性 利用已经建立的金 柑遗传转化体系 将该载体导入了金柑 通过普通p c r 多重p c r 以及实时荧光定 量p c r 检测表明已获得3 株转基因植株 为后续启动子活性分析奠定基础 3 利用e d n a a f l p 技术分离了脐橙果实差异表达的基因 以脐橙成熟 未成熟果实的果皮和果肉为试材 应用e d n a a f l p 结合a m r e s c o 3 1h r b 琼脂糖凝胶电泳技术 采用6 6 对引物组合 对差异表达的基因进行了筛选 克隆了4 0 个差异表达的e d n a a f l p 片段 测序和氨基酸序列同源性分析表明 这 些基因参与了果实光合作用 呼吸作用 磷酯合成 基因转录以及对逆境和病原的响 应 同时发现其中一个e d n a 编码酸性转化酶 果胶甲酯酶基因家族的一个新成员 选择其中5 个基因表达差异明显的e d n a a f l p 片段 利用实时荧光定量p c r 技术验 证了这些基因特异表达的真实性 并分析了它们在不同果实发育时期及不同组织中的 基因表达情况 结果表明 它们在非果实组织中表达较低 而在成熟或未成熟的果皮 或汁囊中表达较强 因此是后续柑橘果实成熟特异启动子分离工作的理想候选基因 关键词 果实特异启动子 2 a 1 1 柑橘 金柑 遗传转化 实时定量p c r e d n a a f l p 基因表达 果实成熟 浙江大学博i 学位论文 2 0 0 7 第一章文献综述 1 组织特异启动子的研究现状 1 1 研究意义和必要性 果树以生产果实为主要目的 因而针对果实性状的改良一直是果树研究者的重 点 由于果树童期长 遗传背景高度杂合 传统育种存在周期长 优良性状的随机组 合难以控制等缺点 往往在获得新的优良性状的同时丢失了品种原有的优良性状 近 年来迅速发展的转基因为核心的遗传工程可克服果树育种周期长的缺陷 且针对性强 可成为传统果树育种理想的辅助手段 目前转基因技术在番茄果实品质等改良上已经取得了巨大的成功 番茄果实特异 启动子在此起到了极大的推动作用 f r a s e r 等 2 0 0 2 d a v i d o v i c h r i k a n a t i 等 2 0 0 7 m e h t a 等 2 0 0 2 d a v u l u r i 等 2 0 0 5 但同类工作在果树转基因研究中还相对较少 由于缺乏来自果树自身的组织和发育阶段特异启动子 果树转基因一般采用c a m v 3 5 s 启动子 在该启动子控制下 外源基因在转基因植株的各种组织 各个发育时期 均会表达 鉴于以往果树转基因研究所导入的外源基因大多与植株抗病和抗逆等特性 有关 这种组成型表达是可行的 也是必需的 但对于不少分子育种 如改变果实性 状的转基因而言 这种组成型表达是不必需的 甚至是不可行的 外源基因在果实以 外的其它组织中的表达不仅是一种浪费 而且可能会影响植株生长并降低外源基因在 果实中的表达效果 因此 果树转基因的开展急需果树组织和 或发育阶段特异的启动 子 1 2 组织特异启动子的研究现状 启动子位于基因转录起始点的上游并对基因转录起调控作用 启动子中含有决定 基因表达频率和特异性的元件 不少植物基因的表达受组织类型及发育阶段的调控 其启动子为特异启动子 在模式植物和一些一年生大田作物上 组织特异性启动子的 张岚岚 番茄果实特异启动子在柑橘中的活性分析及柑橘果实差异表达幕因的分离 分离和鉴定正逐渐取得进展 根 c o n k l i n g 等 1 9 9 0 块茎 维管束 l a w s o n 2 0 0 2 光合组织 p u e n t e 等 1 9 9 6 花药 k o l t u n o w 等 1 9 9 0 花粉 b a t e 和t w e l l 1 9 9 8 种子 d ep a t e r 等 1 9 9 3 和胚乳 w u 等 2 0 0 0 特异启动子均有报道 目前 对 双子叶植物启动子研究最多的是番茄 其中最深入的是e 8 d a i k m a n 等 1 9 9 8 p g 多 聚半乳糖醛酸酶 l e v i n e 和m a n l e y 1 9 8 9 翻j 基n v a nh a a r e n 等 1 9 9 1 1 9 9 3 的启动子 然而 果树转基因最值得关注的果实成熟特异启动子方面的研究少见报道 1 3 组织特异启动子在不同植物间的保守性 不同物种间的特异启动子是否存在通用性 能否将目前研究常用的番茄特异启动 子用于果树基因表达调控研究 还是一个值得探讨的问题 为研究应用转基因技术提 高抗病性基因在草莓韧皮部的表达 z h a o 等 2 0 0 4 研究了拟南芥韧皮部特异启动子 一蔗糖载体蛋白基因 s u c r o s e h s y m p o r t e rg e n e 启动子调控g u s 基因在草莓中的 表达 结果表明在该启动子调控下 g u s 基因在转基因植株叶脉 小叶柄及根部的韧 皮部组织中特异表达 可应用于草莓抗病研究 w a n g 等 2 0 0 0 将猕猴桃三个p g 基因启动子融合g u s 基因转化番茄研究其表达调控 结果发现c k p g c 启动子调控下 的g u s 基因在果实软化及不同发育阶段采后均表达 在果实越过呼吸跃变期达到了 最高水平 为a 妒 和a 妒g 么的5 0 倍 而在根尖及衰老的花瓣表达极低 与p g c 基因在猕猴桃中的果实成熟特异表达一致 曹军等 2 0 0 3 克隆了番茄果实特异性启 动子朋 j 的四个增强子元件 并通过不同组合构建成表达载体转化烟草 发现报告 基因g u s 均在烟草果实 子房 中特异表达 这些研究均表明不同物种之间的启动子存 在一定程度的通用性 但也有研究表明 特异启动子在不同物种中并不具备保守性 如a g i u s 等 2 0 0 5 对外源启动子与内源启动子调控草莓及番茄果实中的基因作瞬时表达研究 利用草莓 果实中维生素c 合成相关的基因 g a l u r 启动子 番茄p g 基因启动子和辣椒纤维 素基因 f i b r i l l i n 启动子调控荧光素酶报告基因 l 结果显示 在草莓果实中 g a l u r 启动子活性最强 f i b r i l l i n 启动子较弱 p g 启动子最弱 而在番茄果实中则刚 好相反 p g 启动子活性最强 f i b r i l l i n 启动子次之 而g a l u r 启动子最弱 1 4 组织特异启动子在柑橘上的应用 目前利用其他物种的果实特异启动子调控柑橘基因表达的研究甚少 同时柑橘自 浙江大学博上学位论文 2 0 0 7 身果实特异启动子的分离也未见报道 本课题组曾构建韧皮部特异启动子驱动柑橘密 码子优化的抗菌肽d 基因表达载体转化柑橘 为利用农杆菌介导的遗传转化技术培育 抵抗由韧皮部传导的毁灭性和检疫性病害柑橘黄龙病的新种质奠定了基础 胡桂兵 等 2 0 0 5 k o l t u n o w 等 1 9 9 8 拟通过转入一种来自芽胞杆菌的r n a 酶基因b a m a s e 使其在柑橘胚组织中特异表达破坏基因诱导无籽 并初步研究了大豆贮藏蛋白基因启 动子在该策略中使用的可行性 但总体而言 果树特异启动子研究尚处于初级阶段 缺乏从果树中分离出的果实成熟特异启动子 果实特异性启动子在不同物种间的通用 性仍不清楚 因而 分离果树果实特异启动子 鉴定其功能 并研究启动子通用性等 相关问题 无疑可为果树转基因研究与实践做出重要贡献 差异基因分离的主要方法 差异表达基因的分离是获得特异启动子的基础 如何筛选不同组织发育时期 不 同条件影响下差异表达的基因 成为研究者最为关心的问题 随着分子生物技术的发 展 筛选差异表达基因的方法越来越多 技术也更加成熟 现在应用的主要方法有 m r n a 差异显示 m r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a y 消减杂交 s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n 基因表达系列分析 s e r i a la n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n s a g e 抑制性消减杂交 s u p p r e s s i o n s u b t r a c t i v e h y b r i d i z a t i o n ss h c d n a 扩增片段长度多态性 c d n a a f l p 基因芯片 g e n ec h i p 等 2 1m r n a 差异显示 m r n a 差异显示方法是19 9 2 年l i a n g 和p a r d e e 在r a p d p c r 和r t p c r 技术 基础上建立的 该技术是根据绝大多数真核生物m r n a 具有多聚腺苷酸 p o l y a 尾 结构的特点 利用含o l i g o d t 的3 锚定引物和57 端的随机引物对m r n a 进行 选择性扩增 扩增产生谱带代表特定的m r n a 通过差异条带的回收和鉴定 可以获 得差异表达基因的片段 r a m i n a 等利用差显技术分析桃幼果脱落相关的差异基因表 达 筛选得到了9 个相关c d n a 片段 其中5 个与丙烯介导的脱落诱导相关 被b o n g h i 等 2 0 0 0 引用 张岚岚 番茄果实特异启动了d i g i t 橘中的活性分析及柑橘果实差异表达桀因的分离 2 2 消减杂交 消减杂交是l e e 等在1 9 9 1 年创立的一种克隆特异表达基因的技术 其基本原理 是 m r n a 通过反转录合成第一链c d n a 与过量的不含该组织或器官特异表达来源 的m r n a 杂交 去除e d n a 和m r n a 杂交复合物 回收单链c d n a 片段 并合成c d n a 的第2 条链 去除e d n a 的发央结构 构建富集特异表达基因的e d n a 文库 再利用 特异表达和不具有特异表达的e d n a 分别作探针 进行差异杂交筛选 从富集e d n a 文库中筛选出特异表达的阳性克隆作序列分析和功能验证 s l a t e r 等 1 8 8 5 利用此 技术分离了包括p g 基因在内的1 4 6 个番茄果实成熟相关基因 m o h a p a t r a 等 1 9 8 9 利用此方法从苜蓿中分离得到了3 个冷胁迫相关的特异基因 2 3 基因表达系列分析 s a g e 是1 9 9 5 年v e l c u l e s c u 等提出的以测序为基础 采用数字化分析手段在转 录水平上研究细胞或组织的基因表达模式 s a g e 分析主要是通过限制性酶切产生非 常短的e d n a 9 1 4b p 标签 然后通过连接和p c r 扩增 随后对连接体进行测序 和分析 b a o 等 2 0 0 5 利用s a g e 方法比较了优良水稻杂交品种l y p 9 与其亲本的 花序 叶片 根中的基因表达差异情况 分离了5 9 2 个上调基因和2 5 个下调基因 分析发现多数上调基因与提高水稻碳 氮等元素代谢相关 而在下调基因中找到了一 个编码光呼吸过程中起关键作用酶的基因 2 4 抑制性消减杂交 抑制性消减杂交是由d i a t c h e n k o 等于1 9 9 6 建立的以消减杂交技术和抑制性p c r 技术为基础的研究基因差异表达的新方法 其基本原理是 利用消减杂交和两次抑制 p c r 使差异表达基因的e d n a 片段得到高度富集 从而实现对差异表达基因的分离 和克隆 k l o o s 等 2 0 0 2 利用该技术分离得到了6 个甜菜直根特异表达的基因 并 分析这些基因在不同组织中表达情况 发现在叶中表达较弱 2 5e d n a a f l p a f l p 技术是b a e h e m 等 1 9 9 6 将r n a 逆转录与a f l p 技术相结合 发展起来 的一种m r n a 指纹图谱技术 是a f l p 在基因筛选上的扩展和应用 由于e d n a a f l p 浙江大学博上学位论文 2 0 0 7 的特殊原理赋予了其具有重复性高 假阳性 低 能较准确地反映基因间的表达量 差异等技术特点 目前 该技术已经广泛应用于植物生长发育过程相关基因分离与表 达特性的研究 2 5 1e d n a a f l p 的原理和方法 该方法结合了r t p c r 和a f l p 技术 其基本原理以r n a 为模板逆转录合成双 链e d n a 两边同时用分别识别6b p 和4b p 序列的限制性内切酶进行酶切 酶切片 段与相应的人工接头连接 然后利用序列同接头互补的引物进行预扩增 再在引物3 末端加2 3 个选择性碱基进行选择性扩增 最后产物在不同的胶上展示 可获得1 0 0 1 0 0 0b p 间重复性好 清晰的条带 b a e h e me ta l 1 9 9 8 基于a f l p 的m r n a 指纹图谱一个限制性条件是依赖于e d n a 上一个6 b p 的限 制性内切酶位点的存在 这样的位点有可能只存在于部分的e d n a 样品中 因此 适 宜的内切酶选择可以最大限度覆盖m r n a 池 且所选的酶切组合可以同时进行酶切 和接头连接 这样可以减少酶切模板分子之间互相连接造成假象 最理想的酶切组合 是识别6 b p 碱基的酶对每个e d n a 样品切1 次 在其一边或两边有一个4 b p 酶切 位点 由于e d n a 较基因组d n a 相对简单 利用2 个甚至1 个选择性碱基即可 2 5 2e d n a a f l p 技术在分离差异表达基因的应用 研究转录水平差异的目的是为了分离差异表达基因并迸一步研究该基因的功能 和对生物个体发育的影响 e d n a a f l p 与d d p c r 相比 更适合差异表达基因的分 离 也是分离组织特异性和发育阶段特异性基因快速 可靠的方法 j o h n e s 等 1 9 9 8 目前已广泛应用于植物发育 逆境胁迫反应甚至植物生理调控等基因的分离 h a b u 等 1 9 9 7 利用该技术研究普通牵牛花红花和白花花芽中差异基因的表达 获得了两个 仅在白花中表达的t d f 用该t d f 筛选花芽的e d n a 文库获得了全长基因 t r i n d a d e 等 2 0 0 3 利用该技术在马铃薯中分离得到了匍匐茎特异表达基因并分离得到了其启 动子 b u r g e r 和b o t h a 2 0 0 4 通过e d n a a f l p 技术分离得到了与葡萄成熟相关的 e d n a 片段 经进一步研究证明这些成熟相关基因在果实发育的过程中分别起着不同 的调控作用 郭丽琼等 2 0 0 5 应用e d n a a f l p 技术分离了5 个草菇冷诱导表达基 因 m a o 等 2 0 0 4 通过研究高地水稻胚根在水分缺少的胁迫下其末端基因表达差异 张岚岚 番茄果实特异启动子任柑橘中的活性分析及柑橘果实差异表达綦闪的分离 结果发现 有1 0 6 个基因被诱导表达 其中有6 0 个己知功能的基因 2 8 个未知功能 的基因和1 8 个新发现的基因 这6 0 个已知功能的基因对植物体内的物质运输 能量 代谢 细胞组织分化和细胞壁生物合成 信号传导等过程有调控作用 这表明胚根末 端在水胁迫下发生一系列复杂的理化变化 2 6e d n a 芯片 e d n a 芯片技术是由s c h e n a 等在1 9 9 5 年首先提出的 其根据分子杂交原理 将 大量的c d n a 片段有序地固定在支持物的表面 再与荧光标记的探针杂交 激光扫描 分析杂交信号而筛选差异表达的基因 与以往研究基因表达的方法相比 表达型基因 芯片可经过一次杂交试验 获知样品中各种不同r n a 的表达情况 a h a r o n i 等 2 0 0 2 利用芯片技术分析了草莓果实发育过程中花托和瘦果的相关基因表达变化 2 7 几种差异基因分离方法的比较 几种差异基因分离方法各有其优缺点 d d r t p c r 具有简单 快速 所需起始材 料少 成本低等优点 但是由于p c r 反应条件不严谨 错配率较高 扩增条带的强 度往往与基因的表达量缺乏相关性 其特异扩增产物条带的强弱既同c d n a 样本最初 浓度有关 也依赖于引物和模板特异配对的程度 消减杂交虽较差异显示优越 但仍 然存在效率较低 假阳性高等问题 s a g e 技术能够快速地获得整个基因组基因表达 的全貌 提供基因定量表达的分布图 灵敏度高 操作相对简便 但s a g e 结果分析 时数据庞大 费用较昂贵 且测序结果的分析依赖g e n b a n k 数据库 特别是e s t 数 据库 基因芯片技术具有大规模 高通量 快速简便等特点 但是其费用昂贵 技术 要求高 因此并不能得到广泛的应用 e d n a a f l p 技术由于其反应条件比较严格 扩增产物水平主要依赖于单个模板 的浓度 因此扩增条带强度通常能准确反映基因表达的强弱 与m r n a 差异显示技 术相比 e d n a a f l p 具有重复性好 假阳性率低 准确反映基因间表达量差别等优 点 与s a g e 技术相比 c d n a a f l p 技术无需基因信息 费用也较低 与基因芯片 技术相比 e d n a a f l p 具有无需预先知道基因序列信息的优点 因此 c d n a a f l p 技术是差异基因分离的理想手段 浙江大学博上学位论文 2 0 0 7 2 8 柑橘差异基因的分离 目前 柑橘上差异基因表达分析的研究还比较少 l a n g 等 2 0 0 5 利用m r n a 差异显示技术结合c d n a a f l p 技术从柑橘中鉴定出8 个在叶片中表达的冷适应基 因 s h i m a d a 等 2 0 0 5 利用m i c r o a r r a y 技术分析了柑橘果实发育过程中的2 2 1 3 个 差异表达基因 p a s e n t s i s 等 2 0 0 7 应用d d r t 技术在柑橘果皮中分离了2 5 个与低 氧诱导相关的基因 本研究采用了c d n a a f l p 技术分离了脐橙果实差异表达的基因 并对该技术进行了改进 基因表达定量分析技术 目前应用于基因表达的定量分析的技术很多 常用的有n o r t h e r n 杂交 半定量 r t p c r 和实时荧光定量r t p c r 3 1n o r t h e r n 杂交 n o r t h e r n 杂交是1 9 7 9 年由j c a l w i n e 等提出的一种与此相类似的 用于分析细 胞总r n a 或含p o l ya 尾的r n a 样品中特定m r n a 分子大小和丰度的分子杂交技术 其原理是利用d n a 可以与r n a 进行分子杂交来检测特异性r n a 的技术 首先将 r n a 混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离 分离出来的r n a 转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上 再与放射性标记的探针杂交 通过杂交结果可以对表 达量进行定性或定量 现已成为分析m r n a 最为常用的经典方法广泛应用于基因表 达的定量研究 3 2 半定量r t p c r 技术 半定量r t p c r 通过m r n a 反转录成c d n a 再进行p c r 扩增目的基因同时扩 增内参照基因 扩增产物在指数增长期内通过电泳测定两者p c r 产物 分析目的基 因相对表达量的方法 扩增内参照与目的基因时要从相同初始量的r n a 进行 电泳 时各个样本上样量也要保证一致 最后利用各个样本扩增内参照与目的基因条带的辉 度值的比值表征目的基因相对表达量 由于p c r 平台期难以预测 内参照与目的基 张岚岚 番茄果实特异启动予往柑橘中的活性分析及柑橘果实差异表达壤闵的分离 因p c r 效率难以保持一致 这就影响该技术的精确性 3 3 实时定量r t p c r 技术 实时荧光定量r t p c r r e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c r 作为新兴的p c r 技术 已被 广泛地应用于分子生物学研究的各个领域 仅2 0 0 0 2 0 0 1 年 收录在m e d l i n e 上的以 r e a l t i m ep c r 为关键词的文章就达一千多篇 其原理是对整个p c r 反应扩增过程进 行实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号 随着反应时间的进行 监测到的荧 光信号的变化可以绘制成一条曲线 在p c r 反应早期 产生荧光的水平不能与背景 明显地区别 而后荧光的产生进入指数期 线性期和最终的平台期 因此可以在p c r 反应处于指数期的某一点上来检测p c r 产物的量 并且由此来推断模板最初的含量 h e i d 1 9 9 6 该技术操作简便 快速高效 具高敏感性和特异性 由于是在封闭 的体系中完成扩增并进行实时测定 大大降低了污染的可能性并且无需在扩增后进行 操作 荧光定量p c r 最普遍的应用是研究基因表达情况 由于其高灵敏性等优点 对 于低丰度表达的基因研究是最有力的手段 随着该项技术在植物研究领域的普及 在 果树上的应用 特别是在基因表达研究与果树病害的病原检测上的应用越来越广泛 王伟杰等 2 0 0 6 3 4 基因表达定量分析技术比较 n o r t h e r n 杂交要求较多的初始材料 而且操作繁琐 条件严格 其特异性和灵敏 度主要取决于标记探针的特异性和标记强度 且需应用同位素或其他生物素标记 半 定量r t p c r 技术结合了p c r 与逆转录技术 实现了p c r 从定性到定量的飞跃 与 n o r t h e m 杂交相比 半定量r t p c r 法以其灵敏度高 快速简便 且对初始总r n a 量要求不很严格 不需已知浓度的标准品等优点而得到广泛的应用 但由于p c r 技 术影响因素诸多 平台期难以控制 因此这一终点p c r 方法在定量上仍不甚准确 且容易交叉污染 产生假阳性 实时荧光定量p c r 通过动态实时连续荧光监测 具有很好的可视性 且提高了 检测的灵敏度 特异性和精确性 操作简便 高效 快速 同时 实时定量p c r 技 术在检测基因家族成员表达方面具有优势 g a c h o n 等 2 0 0 4 通常基因家族各个成 浙江大学博七学位论文 2 0 0 7 员之间具有高度序列同源性 使用n o r t h e r n 杂交容易引发交叉污染 由此影响表达结 果准确性 其次 基因家族个别成员表达水平可能很低 使用n o r t h e r n 杂交或者基因 芯片难以检测 z h a n g 等 2 0 0 6 利用该技术对猕猴桃5 个l o x 家族基因在果实中的 表达进行了系统研究 由于其诸多的优越性 目前已经广泛应用于各种分子生物学研 究领域 3 5 柑橘基因表达分析的应用技术 目前 柑橘基因表达研究多应用传统n o r t h e r n 杂交技术 k a t o 等 2 0 0 4 利用 该技术分析了柑橘果实发育期间类胡萝卜素合成相关的基因表达情况 h a r a 等 1 9 9 9 分析表明冷害相关的基因函c 锹1 9 在叶片中受冷害诱导表达增强 利用相 对定量p c r 技术分析柑橘基因表达的报道较少 l a n g 等 2 0 0 5 利用相对定量p c r 技术验证分析了以m r n a 差显技术分离的与温州蜜柑冷害相关的基因表达 近年来迅速发展的实时荧光定量p c r 以其不可抗拒的优越性逐渐被应用于柑橘 基因表达分析 r o b b i n s 等 2 0 0 5 利用实时荧光定量p c r 分析了三叶甜橙与低温应 答相关的基因家族c l t a 和c l t b 在低温胁迫下的表达特性 此外 实时荧光定量p c r 还应用于柑橘病害的检测 例如 柑橘溃疡病 m a v r o d i e v a 等 2 0 0 4 柑橘黄龙病 胡 浩等 2 0 0 6 本研究采用该技术对利用c d n a a f l p 分离得到的差异表达基因进行了 验证 并分析了多个基因在不同组织和发育时期的表达情况 启动子特异性功能的鉴定技术 应用果实特异启动子结合遗传工程是果树实现品质性状改良的重要途径 但由于 生物间遗传和代谢背景的巨大差异 有些启动子在不同生物中可能有着不同的功能 或强度有所不同 为保障特异启动子在果树中的作用效果 需要对其首先进行功能鉴 定 目前 常用的技术主要包括转基因技术和瞬时表达技术 4 1 转基因技术 转基因技术是指利用分子生物学技术 将外源基因转移到目标物种中 改造生物 的遗传物质 达到改造生物性状的目的 转基因技术不仅广泛应用于生物性状改良 张岚岚 番茄果实特异启动了在柑橘中的活性分析及柑橘果实差异表达皋因的分离 也是研究特异启动子功能的重要手段之一 目前 模式植物成熟转基因体系已经广泛 应用于启动子的表达特异研究 a t k i n s o n 等 1 9 9 8 利用模式植物番茄研究了苹果a c c 氧化酶基因和p g 基因启动子在转基因番茄中的表达调控特性 w a n g 等 2 0 0 0 通 过转基因技术将猕猴桃的三个p g 启动子融合报告基因转化番茄研究其表达调控特 性 袁正强等 2 0 0 2 研究比较了笋瓜三个韧皮部特异启动子在转基因烟草中的表达 z h a o 等 2 0 0 4 利用转基因技术研究拟南芥韧皮部特异启动子调控g u s 基因在转基 因草莓植株中韧皮部组织包括叶脉 小叶柄及根部的特异表达 4 2 瞬时表达 瞬时表达技术将外源基因以非整合形式在宿主细胞中予以表达 由于未整合入宿 主基因组 不能正常遗传 在宿主细胞中可以表达一段时间 如几小时到几十天不等 视外源基因性质而定 瞬时表达研究主要基于农杆菌介导或者基因枪轰击这两种方 法 具有快速 通常仅需一周左右 操作简便 重复性好等特点 其中农杆菌介导 法首创于1 9 9 3 年 通过真空渗透或针管注射等方法导入植物组织 在农杆菌与植物 组织共培养过程中部分植物细胞可被转化 所导入的目的基因在植物细胞中实现表 达 尽管这种表达是暂时的 不持久的 但通常可满足基因功能分析 由于被转化的 细胞无需再生 因此 对于再生通常较难的果树尤其适合 且包括果实在内的各种植 物器官或组织均可用于瞬时表达研究 近年来 影响基因瞬时表达的诸多因素和内在 机制得到了充分研究 操作技术也得到改进 使该技术的应用范围从拟南芥和番茄等 模式植物扩展到包括柑橘和草莓等在内的多种多年生植物 从叶片扩展到果实等其它 器官 4 3 两种研究方法比较 瞬时表达具有快速 操作简便等特点 目的基因的瞬时表达研究体系在拟南芥和 番茄等模式植物上比较成熟 在柑橘上少见应用 其体系有待完善 本课题组曾利用 农杆菌介导将甜橙b 胡萝b 素羟化酶基因 b c h 反义表达载体在脐橙白皮层中进行 瞬时表达研究 本研究利用农杆菌介导的目的基因瞬时表达鉴定番茄果实特异启动子 调控柑橘基因表达强度 然而由于瞬时表达是暂时的 不持久的 而且存在诸多干扰因素 如不带内含子 浙江大学博上学位论文 2 0 0 7 的g u s 基因可在农杆菌中表达 施华中等 1 9 9 5 因此 有必要利用转基因进行稳 定表达研究 对瞬时表达的研究结果进行复核 目前 本研究组已经建立了金柑遗传 转化体系 为特异启动子的研究提供了基础 5 主要研究内容 鉴于柑橘果实特异启动子缺乏的现状 本研究拟分离番茄果实特异启动子2 么 j 并构建此启动子指导g u s 基因表达的适于瞬时表达研究的植物表达载体 建立金柑 瞬时表达研究体系 并利用瞬时表达技术对番茄果实特异启动子刎 j 在金柑不同组 织中的表达调控特性开展研究 初步探讨该启动子在金柑中是否具有果实特异性 利用本课题组已经建立的金柑遗传转化体系 构建适于启动子研究的植物表达载 体 进一步研究刎 启动子对金柑果实的表达调控 以探讨启动子在物种间是否存 在通用性 并对由此途径能否获得可用于柑桔转基因的果实特异启动子作出评价 应用c d n a a f l p 技术分离脐橙成熟果实果皮 果肉中或两者中特异表达的基因 为下一步启动子的分离奠定基础 张岚岚 番茄果实特异启动了矗 柑橘中的活性分析及柑橘果实差异表达摹冈的分离 第二章番茄果实特异启动子别 的克隆及其在金柑中 的瞬时表达 基因的表达和调控已成为植物基因工程的研究重心之一 启动子作为基因调控的 重要因子也随之成为研究热点 在启动子下游融合一个报告基因 依据报告基因在不 同时空或者处理后的表达可研究启动子的功能 在这些研究中 稳定遗传转化和瞬时 表达手段常被使用 尤其是后者由于其快速简单 不受遗传转化难易的影响 广泛地 应用于特异性启动子 特别是果实特异启动子的研究 a g i u s 等 2 0 0 5 对外源启动 子与内源启动子调控草莓及番茄果实中的基因作瞬时表达研究 龚举成等 2 0 0 4 通 过农杆菌介导的瞬时表达法 初步判定了水稻精细胞优势表达基因r s s g 8 的启动子 片段在烟草叶片和花粉中的表达调控功能 张春晓等 2 0 0 7 通过瞬时表达验证了双 向启动子调控的双可视报告基因在毛白杨叶片中的表达 但是 来自植物或植物病毒 的启动子在原核生物中也可能调控目的基因表达 如c a m v3 5 s 启动子是常见的植物 组成型启动子之一 但有研究表明该启动子在农杆菌中也有表达活性 施华中 1 9 9 5 从而导致了对农杆菌介导的瞬时表达调控研究造成干扰 不含内含子的g u s 基因可 在农杆菌细胞中表达出g u s 蛋白 因此可能大大干扰了瞬时表达过程中的基因表达 检测 同时对检测稳定转化的基因表达也造成影响 对于研究十分不利 内含子作为真核与原核生物功能基因的重要差异 在真核生物m r n a 成熟过程 中可被精确地切除 而在原核细胞中则不会 故带内含子的g u s 基因 酊吣 更适 于瞬时表达研究 v a n c a n n e y t 等 1 9 9 0 首次将马铃薯s t l s l 内含子2 插入到g u s 基因的编码区 从而完全抑制了c a m v3 5 s 启动子调控下的i g u s 基因在农杆菌细胞 中的表达 同年 o h t a 等 1 9 9 0 利用一个带内含子的i g u s 基因以避免其在农杆菌 细胞中表达造成的干扰 总而言之 含有内含子的报告基因只能在真核细胞中进行表 达 在农杆菌细胞中几乎不能表达 p b l l 2 1 是最常用的植物表达载体之一 应用十分广泛 龚举成等 2 0 0 4 毛自 朝等 2 0 0 2 李丽等 2 0 0 1 杨予涛等 2 0 0 3 唐琳等 2 0 0 4 该载体的肋m 基因 浙江人学博七学位论文 2 0 0 7 赋予转基因组织抗卡那霉素的能力 且不少植物的卡那霉素筛选体系已较成熟 同时 p b l l 2 1 载体启动子两侧均设计有常用内切酶位点 对启动子研究十分有利 但是该载 体中的g u s 基因不带内含子 对瞬时表达研究不利 p c a m b i a l 3 0 1 是另一种常见的植 物表达载体 汲逢源等 2 0 0 6 刘巧泉等 2 0 0 4 其g u s 基因带内含子 适于瞬时 表达研究 但对转基因研究有诸多不利之处 首先 该载体中启动子两侧缺乏常用内 切酶位点 对更换启动子带来很大不便 此外 该载体以h p t 基因作为筛选基因 而潮霉素比较昂贵 且只有少数植物建立了潮霉素筛选体系 本研究从载体 p c a m b i a l 3 0 1 中酶切获得i g u s 基因 然后替换p b l l 2 1 中的g u s 基因 获得一个既 适于转基因也可用于瞬时表达研究的植物表达载体 番茄2 a 1 l 基因编码一个富多肽 在果实中特异表达 p e a r 等 1 9 8 9 曾报道番 茄果实专一性表达的d n a 序列刎j v a nh a a r e n 等 1 9 9 3 人进一步发现该基因上 游区1 3 k b 或4 o k b 为启动子可指导g u s 基因在番茄果实中的特异表达 曹军 2 0 0 3 研究了2 a 1 1 启动子在烟草中的表达调控发现具有果实特异性 该启动子在柑橘中是 否保留果实特异性尚未报道 为此 本研究从番茄基因组中分离得到了该启动子 就 其在金柑中的瞬时表达开展了工作 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 植物材料 以番茄 l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u ml 金柑 f o r t u n e l l ac r a s s i f o l i as w i n g l e 组 培苗的根 茎 叶 金柑成年树的花瓣 子房 果实作为实验试材 1 1 2 工程菌及质粒 本研究采用实验室保存的工程菌株 大肠杆菌 e s c h p r i c h i ac o l i t g l 根癌农 杆菌 a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s g v 31 0 1 表达载体p b l l 2 1 p c a m b i a l3 0 1 均由实 验室保存 张岚岚 番茄果实特异启动子红柑橘中的活性分析及柑橘果实差异表达基凼的分离 1 1 3 引物 根据文献报道的2 a l l 启动子序列设计引物 委托上海生工生物技术公司合成 上游引物2 a 1 1 u p p 1 4 7 5 一g t a 堡 t t g t t a g a c t c a t c t g 一3 含 h i n d i i i酶切位点 下游引物2 a l l d p p 1 4 8 5 一 t t t g g c a t c t a g a a t g g t t t t g g a t 3 含x b a i 酶切位点 预计长度o 9 k b 根据p b l l 2 1 表达载体序列设计特异引物3 5 s u p l s p 0 1 1 5 一 c a a u r g c c a t c a t t g c g a t a一 3 g u s u p i s p 0 1 2 5 一 a c g c a c a a t c c c a c t a t c c t t一3 3 5 s u p 2 s p 0 2 0 5 一 t a c a c t t t a t g c t t c c g g c t c g t 一3 根据g u s 基因序列设计特异引物 g u s d p i s p 0 0 9 5 一t t t t c g c g a t c c a g a c t g a a 一3 g u s u p 2 s p 0 2 1 5 一c t c a t t a c g g c a a a g t g t g g g t c 一3 g u s d p 2 s p 0 2 2 5 一 a c c a c g a t g c c a t g t t c a t c t g c一3 g u s u p 3 s p 0 1 0 5 g t t g g c g g t a a c a a g a a a g g g a t 3 用于表达载体的p c r 及测序验证 根据酶切识别位点设计接头引物 曰s f e i i 鼬c i u p p 1 6 3 5 一 g t g a c c a g t c a g t c g a g c t 一3 b s t e i i s a c i d p p 1 6 4 5 一c g a c t g a c t g 一 3 x b a l b a m h i n c o i u p p 1 6 5 5 一c t a g a g g a t c c c一 3 x b a i b a m h i n c o i d p p 1 6 6 5 一c a t g g g g a t c c t 一3 1 1 4 其他试剂 t a q 酶及p 如聚合酶购自t a k a r a 生物公司 提取d n a 的试剂 内切酶和连接 酶及t 载体p u c m t 购自上海生工生物工程有限公司 p c r 产物纯化试剂盒购自 赛百盛生物技术公司 1 2 方法 1 2 1 番茄基因组d n a 的提取 番茄d n a 的提取采用c t a b 法 取番茄叶片约1g 液氮研磨后加4m 1 经6 5 c 预 热的c t a b 抽提液 8 0p lp 一巯基乙醇 混匀6 5 c 保温1h