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中氮茚及其类似物的合成和抗肿瘤活性的研究 摘要 中氮茚( i n d o l i z i n e ) 是一类具有1 0 兀电子体系的吲哚异构体，它的母核系统命名为 p y r r o l o 1 ，2 一a p y r i d i n e 。其生物活性主要有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、杀螨虫、抗炎、抗 心律失常、抗高血压等。吡咯 2 ，1 6 】噻唑和吡咯【l ，2 一以】咪唑是与中氮茚有着类似结构 的n 稠合杂环化合物，也是许多具有生物活性天然产物和药物的重要组成结构。本 论文对中氮茚及其类似物的合成和抗肿瘤活性进行了研究。 1 合成了吡啶类化合物的鲦盐，在三乙胺作用下得到叶立德，与缺电子烯烃进 行1 ，3 偶极环加成反应生成四氢中氮茚，在氧化剂t p c d 作用下，芳构化得到中氮茚 衍生物。研究了1 ，3 偶极环加成反应的区域选择性；测定了中氮茚衍生物的抗h e p - g 2 增殖活性，并研究了构效关系。 2 噻唑和n 甲基咪唑的鲦盐在三乙胺和t p c d 作用下，经1 ，3 偶极环加成反应 得到吡咯【2 ，1 b 】噻唑和吡咯【1 ，2 a 咪唑衍生物。初步研究了其中部分化合物的抗 h e p g 2 增殖活性。 、 本论文共合成了3 7 个化合物，其中3 6 个为新化合物，并用f t i r 、n m r 、m s 和e a 进行了结构鉴定。生物活性研究表明，部分化合物具有和5 氟尿嘧啶相当的抗 h e p g 2 增殖活性。 活性 关键词：中氮茚；吡咯【2 ，1 6 】噻唑；吡咯【1 ，2 口】咪唑；1 , 3 一偶极环加成；抗肿瘤 s y n t 髓s i sa n da n t i t u m o ra c t i v i t yo fn 寸d o l i z i n e s a n da n a l o g u e s a bs t r a c t i n d o l i z i n eh a st e np e r i p h e r a l 兀e l e c t r o n sa n di si s o e l e c t r o n i cw i t hi n d o l e i ti sa l s o n a m e dp y r r o l o 1 ，2 一a p y r i d i n e i n d o l i z i n ed e r i v a t i v e sh a v ead i v e r s i t yo fb i o l o g i c a l a c t i v i t y , s u c ha sa n t i t u m o u r , a n t i i n f l a m m a t o r y , a n da n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e s p y r r o l o 2 ，1 一b t h i a z o l e a n d p y r r o l o 1 ，2 一a i m i d a z o l e a r e c o m p o n e n t s o fv a r i o u s b i o l o g i c a l l ya c t i v es u b s t a n c e s ，w h i c ha l s oc o n t a i nn - f u s e dp y r r o l eu n i t i nt h i st h e s i s ，t h e s y n t h e s i sa n da n t i t u m o ra c t i v i t yo fi n d o l i z i n e sa n dt h e i ra n a l o g u e s w e r es t u d i e d 1 i n d o l i z i n e sw e r es y n t h e s i z e db yo n ep o tr e a c t i o n so fp y r i d i n i u my l i d ew i t ha l k e n e i nt h ep r e s e n c eo ft h em i l do x i d a n tt p c d t h e s er e a c t i o n sc o n s i s t e do fa1 , 3 - d i p o l a r c y c l o a d d i t i o no fn y l i d e st oa l k e n e s ，f o l l o w e db ya na r o m a t i z a t i o n r e g i o s e l e c t i v eo f 1 , 3 一d i p o l a rc y c l o a d d i t i o nr e a c t i o nw a ss t u d i e d a n t i p r o l i f e r a t i v ea c t i v i t ya g a i n s th e p 。g 2 c e l ll i n e sw a st e s t e da n d5 - f l u o r o u r a c i lw a su s e da sr e f e r e n c e s t r u c t u r e a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p ( s a r ) w a se x p l o r e d 2 p y r r o l o 2 ，1 一b t h i a z o l e a n dp y r r o l o 1 ，2 - a i m i d a z o l ew e r es y n t h e s i z e db yt h e r e a c t i o n so ft h ec o r r e s p o n d i n gn y l i d e sa n de l e c t r o n - - d e f i c i e n ta l k e n e si nt h ep r e s e n c eo f t h eb a s ee t a na n do x i d a n tt p c dv i a1 , 3 d i p o l a rc y c l o a d d i t i o n t h ea n t i t u m o ra c t i v i t yo f s o m ec o m p o u n d sw a se x a m i n e d t o t a l l yt h i r t y s e v e nc o m p o u n d sw e r es y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db yf t i r , 1 ha n d 1 3 cn m r ，m sa n de a a n dt h i r t y s i xc o m p o u n d so ft h e mw e r en o tr e p o r t e db e f o r e t h e s t u d yo fb i o l o g i c a la c t i v i t ys h o w e dt h a t s o m eo ft h en e w l ys y n t h e s i z e dc o m p o u n d s d i s p l a y e dp o t e n ta n t i p r o l i f e r a t i v ea c t i v i t ya g a i n s th e p g 2c e l ll i n e s k e yw o r d s ：i n d o l i z i n e ；p y r r o l o 2 ，1 - b t h i a z o l e ；p y r r o l o 1 ，2 - a i m i d a z o l e ； 1 , 3 一d i p o l a rc y c l o a d d i t i o n ；a n t i t u m o ra c t i v i t y i i 浙江师范大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其他机构 已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论 文中作了明确的声明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承 担。 作者签名：强朝昧 ， i 吼冲二月；日 学位论文使用授权声明 本人完全了解浙江师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关机关或机构送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可 以采用影印、缩印或扫描等手段保存、汇编学位论文。同意浙江师范大学可以用不同 方式在不同媒体上发表、传播论文的全部或部分内容。 保密的学位论文在解密后遵守此协议。 作者签名：名明波导师签名： 期：干； 日期：沙卅年6 ) 月 乡日 第一章绪论 中氮茚( i n d o l i z i n e ) 最早是由a n g e l i 1 1 于1 8 9 0 年所发现，它是一类具有1 0 n 电子体 系的吲哚异构体圈。它的母核系统命名为p y r r o l o 1 ，2 a p y r i d i n e ，它的结构式及编号如 下： 7 6 图1 1 1 1 中氮茚衍生物的药物活性研究进展 2 同吲哚相比，虽然中氮茚也是一类基本的含氮杂环化合物，但是对它的研究在很 长时间内被人们忽视。直到1 9 5 9 年【拍】，b o e k e l h e i d e 及其同事用中氮茚合成了 c y c l 3 ，2 ，2 a z i n e 之后，人们才逐渐对这类化合物产生了兴趣。随后的研究发现，中氮 茚的生物活性非常广泛，主要有抗肿瘤7 1 、抗菌8 1 、抗病毒、杀螨虫1 9 1 、抗炎【l o 】、抗 心律失常、抗高血压【l l j 等。 从8 0 年代开始，在“天然产物报导”( n a t u r a lp r o d u c tr e p o r t s ) 杂志上，每年都有 关于中氮茚类生物碱的研究进展综述【1 2 , 1 3 】。其中，较为重要的是苦马豆素( s w a i n s o n i n e ) 和栗精胺( c a s t a n o s p e r m i n e ) 这两种羟基氢化中氮茚。 h o h ( - ) - $ w a i n s o n i n e ( + ) 一c a s t a n o s p e r m i n e 图1 2图1 3 苦马豆烈1 4 1 长期以来一直是研究糖蛋白n 一连接寡糖合成的工具药。恶性肿瘤细 胞n 连接的糖蛋白是组成激素、细胞因子、细胞膜受体的低聚糖的重要物质，苦马 豆素对高尔基复合体内0 【甘露糖苷酶i i 抑制作用，从而抑制恶性肿瘤细胞n 连接寡 第一章绪论 糖的合成，增加肿瘤细胞对天然免疫的敏感性。同时苦马豆素还是一种免疫调节剂， 它能刺激淋巴细胞增殖，增强抗原刺激的t 细胞的作用，激活自身抗肿瘤免疫系统。 因此，苦马豆素作为一种新的抗癌药物已经进入临床研究，g o s s 等【1 5 , 1 6 j 将苦马豆素应 用于发展期恶性肿瘤患者。 栗精胺【1 7 】具有双糖酶抑制作用，除作为潜在的治疗糖尿病药物外，由于其可以抑 制h i v 病毒的糖蛋白的合成，进而阻断h i v 引导的多合体的形成，因而可作为抗 a i d s 药物，在体内可以同拮抗h i v 的药物a z t 协同作用，其免疫抑制作用是剂量 依赖型的且不具有相关毒性，因而可以与他克林协同作用降低他克林使用的剂量，具 有良好的临床应用前景。 抗癌药物研究热点喜树碱( c 锄p t o t h e c i n ) 也具有氢化中氮茚结构【1 8 j 。其结构修饰 后开发的拓扑替康( t p t ) 、依立替康( c p t , 1 1 ) 在临床试验上显示了广泛的抗癌活性。 喜树碱衍生物类化合物已成为继紫杉醇之后另一种天然植物来源的重要的抗癌药，喜 树碱结构中的氢化中氮茚部分在其全合成、结构改造和生物活性研究方面都有着极其 重要的地位和作用。 c a m p t o t h e c i n 图1 4 片螺素( l a m e l a r i n ) 是从海洋软体动物中分离的具有较强生理活性且结构复杂的 吡咯生物碱系列化合物，在预防人类癌症( 特别是抗肺癌) 和抗人类免疫缺陷病毒 ( h i v - l y 等方面有良好的前景。f a u l k n e r 等【1 9 1 合成了对癌细胞和h i v 一1 整合酶有抑制作 用的片螺素o r , 2 0 磺酸盐类似物：片螺素a1 3 ，2 0 二磺酸盐和片螺素h 。 r 1 l a m e l l a r i na2 0 s u l f a t e ：r i = s 0 3 n ar 2 = h l a m e l l a r i na13 。2 0 - d i s u l f a t e ：r 1 = r 2 = s 0 3 n a 图1 5 2 第一章绪论 肿瘤坏死因子( t n f a ) 是由激活的巨噬细胞或单核细胞产生，可引起肿瘤组织 出血坏死，也称恶病质素。在多种肿瘤患者血清中均可检测到t n f 0 【升高。法国 r h o n e p o u l e n e 公司申请世界专利，报道中氮茚衍生物( 图1 6 ) 具抗t n f 晓及抗疱疹病 毒作用【2 0 , 2 。 r 2 r 3 p h i l 2 图1 6图1 7 碱性成纤维细胞生长因子( b f g f ) 属于成纤维细胞生长因子，它是一种单链多聚 体，亦具有结合肝素的特性。b f g f 在肿瘤组织中表达增高，不但促进细胞癌变，还 促进癌细胞增长。而且是强有力的促血管生成剂，对肿瘤间质血管新生和侵袭也有重 要作用。b a d o r c 等申请了一项专利，报道中氮茚衍生物( 图1 7 ) 能抑制b f g f 表达 肿瘤细胞株( h u v e c ) 增殖。 b e d j e g u e l a l 研究小组报道了3 一氨基一1 氰基中氮茚是潜在有效的血管内皮生长 因子( v e g f ) 与细胞表面糖蛋白( n r p i ) 协同作用的抑制剂，这种协同作用可导致癌细 胞转移和增殖。其中下列结构化合物( 图1 8 ) 的e l i s a 化验显示i c s o 值为2 p m ，对 前列腺癌p c 3 细胞系的转移影响实验 i c s 0 值为8 p m 。 c nf h 3 图1 8图1 9 应用药物化疗易产生多药耐药性( m d r ) ，而m d r l 基因又是引起多药耐药的主 要原因，因为m d r l 基因编码的p 糖蛋白( p 妒) 可将积聚在细胞内抗癌药物迅速排到 细胞外，降低化疗药物作用效果。j a m e s 等【2 4 】报道了中氮茚乙二酰胺( 如图1 9 ) 对癌 细胞株有体外抗增殖活性，包括m d r 现象。 第一章绪论 磷脂酶a 2 ( s p l a 2 ) n - - f 弓 起脂肪酸和溶血磷酯的释放，例如：前列腺素、白三烯和血 小板活性因子的释放，导致炎症和过敏。日本的s h i o n o g i 公司2 0 0 年1 月和2 月分别申 请两项世界专利【2 5 矧，报道下列三环中氮茚具有s p l a 2 抑制活性，可用于治疗 和预防多种感染性疾病。 h o o c h o o c o n h 2 图1 1 0 g u n d e r s e n 等鲫在“欧洲有机化学杂志上报道1 。取代一7 氰基一2 ，3 二苯基中氮茚 ( 图1 1 1 ) 具抗氧作用及消除自由基作用。因而可以用来治疗由体内自由基所引起的 疾病，例如：肿瘤、中风、心肌梗死以及风湿性关节炎。 c i n c r p h r = o a c ，o if p h 阼国b r 图1 11图1 1 2 s o n n e t 等【2 8 1 报道了芳基取代中氮茚衍生物( 如图1 1 2 结构) 能与人类细胞色素 p 4 5 0 芳香化酶的催化位点键合，因而是一种新型高效的非甾体类芳香化酶抑制剂，其 i c s o 在0 1 州范围，是异丙烟肼的3 - 5 8 倍。 c h a i d x 组【2 9 】合成了具有能抑制组胺h 3 受体的中氮茚衍生物( 图1 1 3 ) 。 o 、n 1 u 图1 1 3图1 1 4 g u n d e r s e n 等 3 0 l 合成一系列中氮茚1 磺酸酯( 图1 1 4 ) ，研究发现其对1 5 脂加氧 酶( 1 5 一l o ) 具有很好的抑制活性，i c 5 0 值为1 5 4 2 1 x m ，活性均优于众所周知的1 5 一l o 抑制剂槲皮素( i c 5 0 值为5 lj _ t m ) 。 4 第一章绪论 k e s s l e r 等【3 l 】报道了3 取代中氮茚一1 腈衍生物是磷酸酶抑制剂。磷酸酶m p t p a j g l m p t p b 从结核菌中获得，在肺结核感染中影响宿主的免疫反应，图1 1 5 结构化合物对 其均有抑制作用。 h o h 图1 1 5 d a w o o d 等【3 2 1 合成了含苯并呋喃的中氮茚，研究表明其具有抗痉挛和消炎的活性。 r r = c n ，c 0 2 c h 32 一( 2 一t h i e n y i ) i n d o l i z i n e 图1 1 6图1 1 7 d a r w i s h 3 3 1 报道了2 ( 2 一噻吩基) 中氮茚具有抗菌活性。 1 2 中氮茚衍生物的合成研究进展 中氮茚衍生物有各种生物活性，因此有关中氮茚衍生物的合成研究引起人们的广 泛关注。合成中氮茚的常用方法包括以下几种： 1 2 1 缩合反应 1 2 1 1s c h o l t z 缩合 s c h o l t z 缩合是指2 甲基吡啶及衍生物和酸酐的反应。 1 9 1 2 年，s c h o l t z 1 1 通过该方法首次合成了中氮茚。 5 第一章绪论 q ? + h 3 ( h 3 c c o ) 2 0 型鸳 1 2 i 2t s c h i t s c h i b a b i n 缩合 c o s c h e m e1 1 c h a u 堂垮回 c o c h 3 t s c h i t s c h i b a b i n 缩合是用2 - 烷基吡啶和a 一卤代羰基化合物成盐，然后在中强碱( 如 n a 2 c 0 3 ) 存在下进行分子内环合，该方法是t s c h i t s c h i b a b i n 于1 9 2 7 年提出的【3 4 】，它是 合成2 位烷基或芳基取代中氮茚的有效方法。 洲：1 孓r 2 一+ x 一 o h - 卜 s c h e m e1 2 c h a i d x 组t 3 5 1 将2 。取代吡啶与仅溴代羰基化合物在丙酮中回流，接着在碱作用下环 化得到了一系列多取代的中氮茚衍生物。随后，他们利用相同的方法合成了具有能抑 制组胺h 3 受体的中氮茚衍生物2 9 1 。 r ，以r 2 + 一 。 4 1 一1 0 0 1 2 21 ，5 偶极环加成 1 ，5 一偶极环加成的反应通式如下： q s c h e m e1 3 【ol r _ - -r s c h e m e1 4 b o n n e a u 等【3 6 1 报道了一种光分解l ，5 偶极环化合成双中氮茚的新方法。首先间苯 6 第一章绪论 基- - ( 氯二氮杂环丙烯) 光分解产生卡宾，与2 一乙烯吡啶进行反应得到2 乙烯吡啶叶立 德，接着发生1 ，5 偶极环化，脱去h c l 得到中氮茚中间体；第二个氯二氮杂环丙烯再 产生卡宾，继续反应得到最终产物双中氮茚化合物。 1 2 31 , 3 偶极环加成 s c h e m e1 5 1 ，3 偶极环加成合成中氮茚的方法被研究的最为广泛，该方法用吡啶叶立德与亲 偶极的炔烃或烯烃发生1 ，3 偶极环加成反应，最后脱氢芳构化得到中氮茚。 1 9 5 7 年，h u i s g e n 3 7 1 提出了1 ，3 一偶极环加成的概念后，很快被应用于中氮茚的合 成中。 1 9 6 1 年，b o e k e l h e i d e 等【3 8 】利用吡啶叶立德和丁炔二酸二甲酯发生l ，3 偶极环加成 反应，再脱氢芳构化合成了中氮茚衍生物。 器叫5 + h r 37pdc,csh5ch3 c o c 6 h 5 s c h e m e1 6 由于炔烃价格昂贵，不容易得到，因此在氧化剂作用下，活泼烯烃作为亲偶极 体合成中氮茚的方法研究得更为广泛。 王炳祥等例报道了吡啶类化合物与丙烯腈反应得到翁盐，再在碱和氧化剂 c o p y 4 ( h c r 0 4 ) 2 】( t p c d ) 作用下与缺电子烯烃进行1 ，3 一偶极环加成反应，可以得到中氮 茚3 酰胺类化合物。 r 擒b i i i 弋n 、c h 2 c n r i h c = c h r 2 t p c d ，p y r i d i n e d m f 。9 0 。3 h 7 1 9 5 r 1 c o n h 2 s c h e m e1 7 胡跃飞等报道了含羧基的吡啶季铵盐在碱的作用下得到吡啶叶立德，再与活 7 第一章绪论 性烯烃发生1 ，3 偶极环加成得到四氢中氮茚，接着被m n 0 2 氧化去氢并脱羧得到3 无 取代的中氮茚、吡咯 1 ，2 - 口】喹啉和吡咯【2 ，1 口】异喹啉的衍生物。 r q 叽咖h r 5 7 9 2 s c h e m e1 8 硝基烯烃是构建含氮杂环化合物常用的中间体。w e a v e r 等4 1 1 首次利用l ，1 二硝 基- 2 ，2 一二碘乙烯与吡啶或异喹啉叶立德发生l ，3 偶极环加成，再立即消去h i 和h n 0 2 、 芳构化形成中氮茚和吡咯 2 ，1 一口 异喹啉，但产率较低。 、 ： b r 、c h 2 r r s c h e m e1 9 陈庆云小组将多氟乙烯溶解在d m f 中，在k 2 c 0 3 e b n 条件下，分别与吡啶、 喹啉、异喹啉的季铵盐通过1 ，3 偶极环加成得到一系列含氟的中氮茚及苯并中氮茚衍 生物。吴永明、朱士正和沈延昌也分别研究了含氟烯烃化合物经1 ，3 偶极环加成合成 含氟中氮茚的方法【4 3 4 5 1 。 f 2 c = c f r 2 k 2 c 0 3 e t 3 n ，d m f r - j 7 0 ，2 4 h ，1 1 一9 1 s c h e m e1 1 0 1 2 4 金属催化炔基或者炔丙基吡啶分子内c n 键的形成 g e v o r g y a n 等h 6 1 利用催化剂c u c lz e l 3 0 下2 炔基吡啶、2 炔基喹啉和1 炔基 异喹啉环异构化分别得到3 一丙基中氮茚( 7 3 - 9 l ) ，3 一丙基吡咯 1 ，2 一日】喹啉( 7 8 ) 禾t 1 3 丙基吡咯 2 ，1 叫异喹啉( 7 4 ) 。该方法适宜制备一般方法很难合成的1 ，2 未取代中氮茚 化合物。 8 弧r 翰巩 第一章绪论 r p 一n c u c i ( 5 0m o l ) 二r n e t 3 d m a ( v ：v = i ：7 ) 13 0 p 卜n s c h e m e1 1 l y a nb i n 等【4 7 1 报道了在无溶剂或者水作溶剂条件下，a u ( i i i ) 作催化剂，杂芳基醛、 胺、炔烃一锅法合成胺基取代中氮茚。 q c h 是n h + 一r 3 一c a t n a a u c l 4 2 h 2 0 i nw a t e r ，6 0 。c r 3 1 3 中氮茚类似物的合成方法简介 成。 3 对于具有下列结构的n 稠合杂环化合物的合成，五元环部分均可用类似的方法形 x = c h 。n ，s p y l 等4 8 1 通过t s c h i t s c h i b a b i n 缩合合成了吡咯 2 ，1 6 噻唑衍生物。 吖8 、c h 2 矿迹父叽点竺辄尸n p h s c h e m e1 1 3 9 国 第一章绪论 吖亭c - c h 2 b r + n ，2 c 。鲁屯 s c h e m e1 1 4 g e v o r g y a n 等酬报道了在a g ( i ) 催化下，炔丙基噻唑分子内形成c n 键，z 1 0 吡 咯【2 ，1 6 】噻唑。 o a c ( c h 2 ) 5 c h 3 ( c h 2 ) 5 c h 3 塑r t 半众a c 弋只 s c h e m e1 1 5 在以上合成方法中，l ，3 偶极环加成合成中氮茚衍生物及类似物，不但方法简单， 而且在氧化剂t p c d 等作用下，中间体较快芳构化，有利于提高产率，还避免了使用 昂贵的炔烃化合物。为了进一步研究中氮茚衍生物及类似物的抗肿瘤活性以及构效关 系，我们利用1 ，3 偶极环加成合成一系列化合物，并进行生物活性测试。 1 0 第二章环丙基取代的中氮茚衍生物的合成 及其抗肿瘤活性的研究 环丙烷类化合物是一类用途广泛的有机合成中间体，环丙烷结构存在于许多重要 的天然产物分子和具有生理活性的药物中。 例如，许多喹诺酮药物中都含有环丙基，构效关系研究表明，n 位若为脂肪环取 代时，在环丙基、环丁基、环戊基中，其抗菌作用最好的为环丙基。研究还发现，某 些沙星类药物对原核细胞的拓扑异构酶i i 有一定的抑制作用，而环丙基能加强这种活 性【5 1 1 ，例如环丙沙星、巴罗沙星等( 图2 1 ) 。 o h o 环丙沙星 c o o h n h c h 3 巴罗沙星 c o o h 另外，环丙烷氨基酸具有很多独特的生物活性，例如，c l e o m y c i n 是一种具有抗 肿瘤活性的抗生素，其重要片段n c l e o n i n t 5 2 l ( 图2 2 ) 。 , n h 2 矿c 。h 鉴于环丙基基团独特的生物活性，我们设计将环丙基引入中氮茚中，并初步研究 该类化合物的抗肿瘤活性。 第二章环丙基取代的中氮茚衍生物的合成及其抗肿瘤活性的研究 2 1 结果与讨论 2 1 1 环丙基取代的中氮茚衍生物的合成 我们用吡啶衍生物和溴代甲基环丙基酮在乙酸乙酯中或无溶剂下反应得到箱盐 ( s c h e m e2 1 ，2 2 ) ，产率较高，并且纯度已经满足继续下一步的要求，无需纯化。 筠盐在三乙胺作用下，t p c d 作氧化剂与活泼烯烃进行1 ，3 偶极环加成反应得到一系 列3 环丙羰基中氮茚( s c h e m e2 3 ，2 4 ) 。 o 1 a r b r + 嗡一 r s c h e m e2 1 o 1 a e r + 一 + n n 表2 1 豁盐2 和3 的熔点和产率 s c h e m e2 2 o 3 r 审酝 q 人 j 2 +r1h c = c h r 2 ! 旦鱼里：堕兰堡业， 9 0 。c 5 - 1 0 h 4 ar 1 = h ，r 2 = c n 4 br 1 = h r 2 = c 0 2 c h 3 4 cr 1 = r 2 = c 0 2 c h 3 4 dr = r 2 = c 0 2 e t 4 e1 2 一n - p h e n y l m a l e i m i d e s c h e m e2 3 1 2 5 第二章环丙基取代的中氮茚衍生物的合成及其抗肿瘤活性的研究 + r 1 h c = c h r 2 ! 旦璺里! 型鱼里塑0 r 2 9 0 。5 1 0 h o 4 ar i = h r 2 = c n 3 4 br 1 - h ：r 2 = c 0 2 c h 3 s c h e m e2 4 表2 2 中氮茚衍生物的产率 从表2 2 可以看出，1 位氰基取代的中氮茚衍生物产率明显高于酯基取代的产物。 由于丙烯酸甲酯、顺丁烯二酸二酯在受热条件下容易发生自身的聚合反应，导致产率 下降。后处理时，固体较难抽滤，有机溶剂萃取乳化严重，可能是聚合物存在的原因。 第二章环丙基取代的中氮茚衍生物的合成及其抗肿瘤活性的研究 在顺丁烯二酸二甲酯的反应体系中，柱层析后得到顺丁烯二酸二甲酯水解脱羧的三聚 体( 图2 3 ) 。 h 3 0 0 2 0 图2 3 另外，1 ，3 一偶极环加成反应涉及偶极体的h o m o 与亲偶极体的l u m o 的相互作 用，偶极体上带吸电子基团不利于反应的进行，因此，当吡啶环上只有b r 取代时产 率相对较低。 我们用g a u s s i a n 2 0 0 3 软件( b 3 l y p 6 3 1 g ) 计算偶极体吡啶叶立德的h o m o 轨 道系数与亲偶极体丙烯腈的l u m o 轨道系数见图2 4 。从图中我们可以看到，亲偶极 体丙烯腈在环加成时的区域选择性是氰基在中氮茚的1 位。我们从图2 5 的晶体结构 图中也可以看出反应的区域选择性。 o h o m o 图2 4 - 0 4 2 0 1 8 0 5 3 7 0 7 夕、n 图2 5 化合物5 e 的晶体结构图 当我们用n 苯基马来酰亚胺与吡啶绘盐反应时，除产物5 d 外，还得到另一结构 1 4 第二章环丙基取代的中氮茚衍生物的合成及其抗肿瘤活性的研究 5 d 。这是5 d 化合物在碱性加热条件下容易发生水解脱羧的原因。中氮茚通常比较难 进行氨解反应，该途径经过进一步的条件摸索，有待成为合成1 氨甲酰中氮茚的有效 方法。 5 d ( 5 1 ) 图2 6 5 d ( 2 6 ) 2 1 2 环丙基取代的中氮茚衍生物的抗肿瘤活性研究 肝细胞癌( h e p a t o c e u u l a rc a r c i n o m a ，h c c ) 是原发性肝癌中最常见组织学类型， 是世界性最高发的癌症之一，在我国肝癌也很常见。寻找毒副作用轻，又能有效抑制 肿瘤细胞增长，成为了研究的重要方向。 氟尿嘧啶( f l u o r o u r a c i l ，f u ) 是治疗肿瘤、预防肿瘤复发和肿瘤复发后化疗最常 用的药物之一【5 3 】。我们以5 氟尿嘧啶作参比，对所合成的其中1 0 个中氮茚衍生物进行 了抗肝癌细胞株( h e p g 2 ) 增殖活性测试。 实验中通过酶标仪测定的各孔光吸收( o d 值) ，计算药物对细胞增殖的抑制率： 抑制率= 1 ( 测试样品o d 值- 空白o d 值) ( 阴性对照o d 值- 空白o d 值) x 1 0 0 按如下公式计算被测样品的i c 5 0 值( 寇式法) ： l g l c s o = x m - i p - ( 3 一p m p n ) 4 其中x m ：设计的最大浓度的对数值；i ：最大剂量比相临剂量的对数值；p ：阳性反 应率之和；p m ：最大阳性反应率；p n 最小阳性反应率。 活性测试结果如下表。 第二章环丙基取代的中氮茚衍生物的合成及其抗肿瘤活性的研究 表2 3 中氮茚衍生物对h e p - g 2 增殖抑制率的影响 c o m p d i c s o ( g m ) 5 f l u o r o u r a c i l 实验表明，化合物5 a 、5 9 、5 j 能明显抑制h e p g 2 的生长，其中化合物5 j 的i c s o ( 半数抑制率) 值为0 2 0 i _ t m ，其抑制活性优于对照组5 氟尿嘧啶( i c 5 0 值为0 2 5 r t m ) 。 同时，从表2 3 可以看出，1 - c n 取代的中氮茚衍生物的抗增殖活性基本优于酯基 取代；由5 a 和5 j 比较，吡啶环上的烷基和卤素的取代对中氮茚衍生物的抗增殖活性 也有一定的影响；而当取代基为7 ，8 。苯并或5 ，6 苯并时，其药物活性明显降低。6 a 、 6 b 也体现了相似的规律。中氮茚上进一步的构效关系以及动物实验研究正在进行当 中。 2 2 实验部分 2 2 1 合成实验操作方法 x - 4 型数字显示显微熔点测定仪( 北京泰克仪器有限公司) ，温度未作校正； a c f 一4 0 0 型核磁共振仪( 瑞士b r u k e 公司) ，c d c l 3 为溶剂，t m s 为内标；f t i r5 d x 型红外光谱仪( 美国n i c o l e t 公司) ，衰减全反射( a t r ) ；z a b h s 型双聚焦质谱 仪( 英国v g 公司) ；2 4 0 c 型元素分析仪( 美国p e 公司) 。 1 6 6 肼 9 6 3 9 9 一 朋 一 一 一 一 一 一 一 融 妨 习 乳 曩 l 磊 如 白 曲 第二章环丙基取代的中氮茚衍生物的合成及其抗肿瘤活性的研究 化合物l a 的合成 在1 l 三口烧瓶中放置l m o l 环丙基甲基酮，5 0 0 m l 甲醇，2 9 无水三氯化铝，5 。c 下滴加溴素( 1 m o l ，预先用浓硫酸干燥) ，先滴入少量溴引发，控温3 7 。c ，0 5 h 滴完， 再1 0 。c 保温1 h 后，加1 l 水搅拌3 0 m i n 。倒入分液漏斗中静置分层，水层用二氯甲烷 萃取2 次，合并有机层，1 0 碳酸钠洗涤，水洗，无水硫酸镁干燥，油泵减压蒸馏， 收集4 0 5 5 。c 馏分，得产物1 0 4 3 6 9 ，产率为6 4 。 t p c d 的合成【5 4 】 3 7 5 9 ( 15 0 m m 0 1 ) c o ( a e ) 2 4 h z o 和3 2 9 ( 3 0 0 m m 0 1 ) c r 0 3 加入2 0 0 m l 水中，加 热至6 0 左右，缓慢滴加4 8 5 m l 吡啶，加快搅拌速度，在1 5 2 0 分钟滴完，继续搅 拌5 分钟，保持温度在6 0 。c 左右，然后冷却至室温，过滤，再用4 x 2 0 m l 丙酮洗涤， 抽干得黑色粉状晶体，烘干。 绘盐2 a 的合成【3 9 】 l a ( 5 0 m m 0 1 ) 和吡啶( 6 0 m m 0 1 ) 在乙酸乙酯( 2 0 r n l ) 中室温搅拌1 2h ，过滤出 沉淀物，少量乙酸乙酯洗涤，干燥得2 a 。筠盐2 b 、2 e 、2 f 和3 用同样的方法合成， 2 c 和2 d 为无溶剂反应。 化合物5 a 的合成【3 9 】 1 0 m m o l 鲦盐溶于4 0 m ld m f 中，加入2 m l 三乙胺，4 0 m m o l 丙烯腈，4 9t p c d ， 在9 0 。c 下反应5 h 后，冷却，反应物倒入1 0 0 m l5 盐酸溶液中，析出沉淀，过滤得 粗产物，经硅胶柱层析 展开剂为：v ( 石油醚) ：v ( 乙酸乙酯) = 5 ：1 】得纯品。5 b 、 5 e 、5 t , 5 1 p 和6 b 用相同方法合成。 化合物5 c 的合成 1 0 m m o l 黠盐溶于4 0 m ld m f 中，加入2 m l 三乙胺，4 0 m m o l 顺丁烯二酸二乙酯， 4 9t p c d ，在9 0 。c 下反应5 h 后，冷却，反应物倒入1 0 0 m l5 盐酸溶液中，乙醚 ( 2 x 1 0 0 m l ) 萃取2 次，合并有机层，水( 2 x 5 0 m l ) 洗，无水硫酸镁干燥，蒸除溶 剂得粗产物，经硅胶柱层析 展开剂为：v ( 石油醚) ：v ( 乙酸乙酯) = 5 ：1 】得纯品。 5 9 k 和6 a 用相同的方法合成。 化合物5 d 的合成 1 0 m m o l 筠盐溶于4 0 m ld m f 中，加入2 m l 三乙胺，1 0 m m o ln 苯基马来酰亚胺， 4 9t p c d ，在9 0 。c 下反应1 0 h 后，冷却，反应物倒入1 0 0 m l5 盐酸溶液中，析出沉 1 7 第二章环丙基取代的中氮茚衍生物的合成及其抗肿瘤活性的研究 淀，过滤得粗产物，经硅胶柱层析 展开剂为：v ( 石油醚) ：v ( 乙酸乙酯) = 5 ：l 】得 纯品。 2 2 2 生物活性实验 2 2 2 1 实验材料 ( 1 ) 细胞株 人肝癌细胞( h u m a nh e p a t o c e l l u l a rl i v e rc a r c i n o m a ，h e p - g 2 ) 。 ( 2 ) 试剂 r p m l l 6 4 0 培养基，g i b c o 公司生产。新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有 限公司。胰蛋白酶，s i g m a 公司生产。m t t ，s i g m a 公司。注射用链霉素，山东瑞阳 制药有限公司，l g ( 1 0 0 万单位) 支。注射用青霉素钠，山东鲁抗医药股份有限公司， 8 0 万单位支。其它常用化学试剂为国产分析纯。 ( 3 ) 仪器 f o r m a3 1 1 0c 0 2 培养箱( u s a ) ，b c n 1 3 6 0 超净工作台( 哈尔滨东联) ，b i o r a d 5 5 0 酶标仪( u s a ) ，倒置显微镜( n i k o n ) ，9 6 孔细胞培养板( c o s t a r , u s a ) 。 2 2 2 2 实验方法 ( 1 ) 培养液等的配制 r p m l l 6 4 0 培养基一袋加水一升，补加2 克碳酸氢钠，1 0 万单位青霉素和1 0 0 m g 链霉素，调节p h 值至7 4 ，用0 2 劫m 除菌滤膜过滤除菌。9 0 m l 培养基加灭活新生 牛血清1 0 m l 即为完全培养液。胰蛋白酶用d h a n k s 缓冲液配成0 2 5 溶液，过滤除 菌后4 c 保存备用。 ( 2 ) 药液配制 准确称取被测样品1 0 m g ，加到灭菌的1 5 m l 离心管中，加入d m s ol m l ，配成 l m g m l 原液，4 0 * ( 2 冷冻保存。临用前融化后用适量d h a n k s 稀释成相应浓度应用。 ( 3 ) 细胞培养及传代 细胞均贴壁培养于含1 0 m l 完全培养液细胞培养瓶中，于3 7 c 、5 c 0 2 、饱和湿 1 8 第二章环丙基取代的中氮茚衍生物的合成及其抗肿瘤活性的研究 度下培养。细胞长满瓶底后用灭菌d h a n k s 液洗两次，加0 2 5 胰蛋白酶消化细胞 2 m i n ，倒掉胰蛋白酶，待轻摇细胞能完全脱落后，加完全培养液3 0 m l 后，用移液管 吹散细胞，分装于3 个新的细胞培养瓶中，继续培养。 ( 4 ) 抗增殖活性测试 取刚刚长成完整单层的细胞一瓶，胰蛋白酶消化后收集细胞，用移液管吹打均匀， 取两滴细胞悬液台盼蓝( t r y p a nb l u e ) 染色，于显微镜下计数活细胞数目( 死细胞数 目不得超过5 ) ，用完全培养液调整细胞数目至lx 1 0 5 个细胞m l 。于9 6 孔细胞培养 板中每孔加入1 0 毗l 细胞悬液，将培养板置于c 0 2 培养箱中培养1 2 h ，取出培养板后 于每孔中加l l g l 含不同浓度被测样品的溶液，使得药物终浓度分别为4 0 o 、2 0 0 、 1 0 0 、5 0 、1 0 和o 1 9 9 m l ，每个浓度设3 个平行孔，另设3 孔细胞不加被测药作正 常对照孔。加完药后培养板于微孔板振荡器上振荡混匀，置于c 0 2 培养箱中继续培养 4 8 h 。取出培养板，每孔加入2 5 比l4 m g m l 的m t t 液，振荡混匀，继续培养6 h 。加 入每孔l o o g ls d s 裂解液( 9 0 m l 三蒸水+ 1 0 9s d s + 5 m l 异丙醇+ 2 m l 浓盐酸) 后 培养1 2 h 。于酶标仪测定各孔光吸收( o d 值) ，测定波长5 7 0 h m ，参考波长6 3 0 n m 。 根据各孔o d 值计算药物对细胞增殖的抑制率。 2 2 3 化合物结构与表征 5 a m p 1 6 3 1 6 4 c i r ( a t r ) v ：3 11 4 ，2 9 2 4 ，2 2 1 3 ，1 6 3 7 ，1 6 2 8 ，9 4 2 ，7 5 8c m 1 hn m r ( c d c l 3 ，4 0 0m h z ) ：61 0 4 ( s ，2 h ) ，1 2 5 ( s ，2 i - i ) ，2 5 1 ( s ，1 h ) ，7 0 6 ( s ，1 i - i ) ， 7 4 2 ( s ，1h ) ，7 7 9 ( s ，li - i ) ，7 9 4 ( s ，11 4 ) ，9 9 0 ( s ，li - i ) 1 3 cn m r ( c o o l 3 ，1 0 0m h z ) ： 61 0 7 ，1 8 2 ，8 4 4 ，11 5 3 ，11 5 6 ，11 7 4 ，1 2 3 8 ，1 2 5 7 ，1 2 7 2 ，1 2 9 5 ，1 4 0 7 ，1 8 9 5 m sm z ( ) = 2 1 0 ( m + ，1 0 0 ) ，1 6 9 ( 4 6 ) ，1 4 1 ( 1 5 ) ，11 4 ( 8 ) c 1 3 h l o n 2 0 ( 2 1 0 2 3 ) ：c a l c d c