（微生物学专业论文）香鳞毛蕨中生物活性物质的筛选.pdf

中文摘要 中文摘要 香鳞毛蕨d r y o p t e r i s f r a g r a n s l s c h o t t 为鳞毛蕨科鳞毛蕨属植物 落叶多年生 草本 生于高寒地区的滑石坡 森林中的碎石坡上和火山周围的岩浆缝隙中 该 植物在黑龙江 辽宁 吉林 内蒙古和河北地区均有分布 在我省主要分布于五 大连池 塔河县白卡兽山 呼中大自山的高山地带及小兴安岭北部地区 香鳞毛 蕨药用历史悠久 生理活性较强 民间应用广泛 为了从香鳞毛蕨中寻找新的药 用活性先导化合物 本文对其进行了系统研究 将香鳞毛蕨乙醇提取物经过a b 一8 大孔吸附树脂吸附 得到水洗脱组分 3 0 乙醇洗脱组分 7 0 乙醇洗脱组分和9 0 乙醇洗脱组分 通过对2 种肿瘤细胞的抗 肿瘤活性筛选 对t 淋巴细胞进行的免疫调节活性筛选 确定3 0 乙醇洗脱组分为 具有抗肿瘤及免疫调节作用的有效部位 在前期有效部位确定的基础上 通过硅胶 o d s 柱色谱和h p l c 等现代提取分 离方法和手段 对3 0 乙醇洗脱组分进行分离 在分离过程中始终贯穿活性跟踪 分别对b e l 7 4 0 2 a 5 4 9 肿瘤细胞株进行了抗肿瘤活性筛选 对t 淋巴细胞进行了 免疫调节活性筛选 其中得到具有抗肿瘤作用的活性组分2 个 具有免疫调节作 用的活性组分2 个 对活性组分进一步分离得到1 0 个化合物 通过1 h n m r 1 3 c n m r h i v i b c 和d e p t 等现代波谱学测试技术 并结合e s i m s 质谱 以及与文献数据对比 对其进行了结构鉴定 当化合物的浓度在5 g m l 时 化合物3 对2 种肿瘤细胞株 均具有极强抑制作用 化合物l o 5 协同c o n a 对t 淋巴细胞具有显著的促进作 用 说明具有非常好的免疫调节活性 本论文对香鳞毛蕨进行了化学成分的活性跟踪分离 最终得到了3 个有活性 的先导化合物 并且此3 个化合物的生物活性为首次确定 为进一步研发新药奠 定了基础 关键词 香鳞毛蕨 活性跟踪分离 抗肿瘤 免疫调节 化学成分 黑龙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t d r y o p t e r i sf r a g r a n s l s c o t t ad e c i d u o u sp e r e n n i a lh e r bi nd r y o p t e r i sf a m i l yo f d r y o p t e r i sg e n u s g r o w si ns l o p i n gl a n dw i t hs t o n e so fh i g hc o l da r e aa n df o r e s to ri n t h ec r a c k so fm a g m an e a rt h ev o l c a n o a n dd i s t r i b u t e si nh e i l o n g j i a n g j i l i n a n dh e b e i p r o v i n c e i nh e i i o n g i i a n g i tm a i n l y d i s t r i b u t e si nw u d a l i a n c h i b a i k a s h o u m o u n t a i no ft a h et o w n a l p i n er e g i o no fd a b a im o u n t a i na n dt h en o r t ha r e ao fx i a o x i n g a 1 1 1 i n gm o u n t a i n d r y o p t e r i sf r a g r a n s l s c o n w i t hs t r o n gb i o l o g i c a la c t i v i t y h a v eal o n gh i s t o r ya n dh a sb e e nw i d e l yu s e d t of i n dt h en e wa c t i v ec o m p o u n d t h i s p a p e rc a r r i e do u tas e r i e so fs y s t e m a t i cr e s e a r c h e s a f t e rt h ee t h a n o le x t r a c t so fd r y o p t e r i sf r a g r a n s l s c o t tw e r ea b s o r b e d i n m a c r o p o r o u sa b s o r p t i o nr e s i na b 一8 3 0 e t h a n o le l u a t e 7 0 e t h a n o le l u a t ea n d 9 0 e t h a n o le l u a t ew e r eg a t h e r e d t h r o u g hs c r e e n i n gt h ea n t i t u m o ra c t i v i t i e so ft w ot u m o r s c e l l sa n dt h ei m m u n o r e g u l a t i o na c t i v i t i e so ftl y m p h a t i cc e l l s 3 0 e t h a n o le l u a t ew a s d e t e r m i n e da st h ea n a l g e s t i ce f f e c t i v ep a r t s o nt h eb a s i so ff o r m e re f f e c t i v ep a r t sd e t e r m i n e d 3 0 e t h a n o le l u t ew a si s o l a t e d b ys i l i c ag e l o d sc h r o m a t o g r a p h ya n dh p l c a c t i v et r a c kw a s f u l l yu s e dd u r i n gt h e i s o l a t i n gp r o c e s s w h i c hp e r f o r m e dt h ea n t i t u m o ra c t i v es c r e e n i n g t ob el 一7 4 0 2 a 5 4 9 a n dt h ei m m u n o r e g u l a t i o na c t i v es c r e e n i n gt otl y m p h a t i cc e l l sr e s p e c t i v e l y d u r i n g t h er e s e a r c h t w oa n t i t u m o ra c t i v ee l u a t e sa n dt w oi m m u n o r e g u l m i o na c t i v ee l u a t e s w e r ef o u n d m o r e o v e r t e nc o m p o u n d sw e r ec o l l e c t e db ym e a n so ff u r t h e ri s o l a t i o nt o e l u a l e b e s i d e s s t r u c t u r ei d e n t i f i c a t i o no ft h ee l u a t e sw a sd o n et h r o u g hh n m r c n m r h m b ca n dd e p tc o m b i n ge s i m sa sw e l la st h ec o m p a r i s o nb a s e do nt h e r e l a t e dl i t e r a t u r ed a t a s w h e nt h ec o m p o u n dw a sa t5 斗g m l c o m p o u n dn u m b e rt h r e e h a df a i r l ys t r o n gi n h i b i t e de f f e c t i v ep a r t st ot w ok i n d so ft u m o rc e l l s w h i l ec o m p o u d n u m b e rt e na n df i v ea l o n gw i t hc o n ah a dp o s i t i v ee f f e c t so ntl y m p h a t i cc e l l s w h i c h i n d i c a t e dt h a tt h e yh a df i n ei m m u n o r e g u l a t i o ne f f e c t i v ep a r t s a saw h o l e t h i sp a p e rr e s e a r c h e do na c t i v i t y g u i d e d i s o l a t i o no fc h e m i c a l c o m p o n e n t sf r o md r y o p t e r f r a g r a n s l s c o t ta n da c q u i r e d t h r e ee f f e c t i v el e a d i n g c o m p o u n d s t h eb i o a c t i v i t i e so ft h et h r e ec o m p o u n d sw e r ec o n f i r m e df o rt h ef i r s tt i m e w h i c hm a d eaf o u n d a t i o nt od e v e l o pn e wm e d i c i n e si nf u t u r e a b s t r a c t k e y w o r d s d r y o p t e r i sf r a g r a n s l s c h o t t a c t i v i t y g u i d e di s o l a t i o n a n t i t u m o r i m m u n o r e g u l a t i o n c h e m i c a lc o m p o n e n t 英汉缩略语对照表 英汉缩略语对照表 黑龙江大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得墨蕴迤盔堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料 学位论文作者签名 掀惹 蓐签字日期 o o g 年岁月 p 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕉堑太堂有关保留 使用学位论文的规定 同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 本 人授权墨蕉延太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或其他复制手段保存 汇编本学位论文 学位论文作者签名 狱基蘸 导师签名 t 一气 签字日期 扣8 年j 月 日签字日期 跏 2 年丁月 o 日 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 电话 邮编 第1 章引言 第1 章引言 随着人类社会的发展 环境的变迁和科学技术的进步 许多疑难病症如心脑 血管疾病 恶性肿瘤 艾滋病 糖尿病 免疫系统疾病 老年痴呆症等正严重威 胁着人类的健康和生存 随着人们对化学药品毒副作用的逐渐认识 目前已经意 识到现有的化学药品毒副作用较大 加之这些严重危害人类生命的疑难病症长期 未能找到理想的治疗药物 传统的药物研究手段和方式很难满足社会需求 目前 从天然产物中寻找疗效高 毒副作用低的创新药物是新药研究的热门课题 早期 天然产物的分离与活性测试多分为两个阶段进行 即在分离得到纯品后 再进行活性测试 由于分离工作的盲目性较大 目前己渐少采用 现在从天然药 物或中药中分离活性化合物时 多在确认供试样品的活性之后 选用简易 灵敏 可靠的活性测试方法作指导 在分离的每一阶段对分离所得各个馏分进行活性评 估 并跟踪其中活性最强部分 这种研究方法得到的活性化合物常常具有很高的 知识产权保护价值 目前已经成为当今天然产物研究的主流 活性跟踪分离 b i o a s s a y g u i d e df r a c t i o n a t i o n 是指活性测试白粗提物开 始 贯穿分离步骤的全过程 活性结果指导分离工作的每一步 只选择有活性的 组分进一步纯化 直至得到活性化合物 1 该方法使活性物质的分离具有明确的目 标 使得到活性化合物的机率极大提高 选择操作简便 检测指标确切的生物活性测试方法是活性跟踪分离的关键 生物活性测试方法是用于证明某种物质具有药理活性 生物活性 治疗作用 的实验方法 应用这些实验方法是寻找和发现药物先导化合物的重要研究手段 用于活性筛选的方法有多种 根据所选用的材料和药物作用的对象 作用的不同 层面以及操作特点 可以将这些测试方法大致分为三类 整体动物水平 组织器官 水平和细胞分子水平 与前两种方法相比 细胞分子水平的测试方法具有样品用 量少 作用机制比较明确 可实现较大规模筛选等特点 己经成为目前药物筛选 的主要方法 从天然药物中筛选 即在生物活性测定体系指导下 确定中药或天然药物中具 黑龙江大学硕士学位论文 有生物活性的有效部位并进行化学成分的研究 具有生物活性的物质的研究越来 越受到人们的关注 1 1 抗肿瘤药物的研究现状 肿瘤 是人类生命的第二杀手 我国是肿瘤病的高发区 在我国患有肿瘤的 病人约有4 5 0 万人 而且每年以2 0 0 万人的速度增加 全球患有肿瘤的病人达7 6 0 0 万人担 j 目前 对肿瘤病的治疗大都采用手术并化学治疗和放射治疗 但是 这 些治疗方案常常因为副作用大而加重患者的痛苦 所以 找到一种副作用小 疗 效高的治疗肿瘤的药品是广大科研工作者的迫切任务 1 1 1 以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物 细胞的活性受外部信号调控 外部信号转导到细胞内部引起细胞内的一系列 反应 这一过程称为信号转导 肿瘤的发生 发展与细胞增殖 凋亡等信号转导 通路中某一个环节异常密切相关 在肿瘤生长 转移过程中起重要作用的一些生 长因子及其受体都是通过促细胞分裂剂激活性蛋白激酶 m a p k m i t g o n e a c t i v a t d e p o r e t n i k i n a s e m a p k 信号转导通路起作用的 细胞信 号转导异常 导致恶性肿瘤快速增殖 无限制生长 针对m a p k 信号转导通路的各 个环节研究m a p k 通路特异性抑制剂 从理论上讲 可以从根本上防治恶性肿瘤 成为了抗癌药物的研究热点之一 这类药物中最活跃 进展较快的药物如 酪氨酸 蛋白激酶抑制剂 法尼基转氨酶 f t a s e 抑制剂等 1 1 2 新生血管生成抑制剂 原发性肿瘤的生长和转移是依赖于新生血管生成的 肿瘤既可通过肿瘤血管 从宿主获得营养 又可通过血管向宿主输送转移细胞 并在机体的其他部位继续 生长和诱导血管形成 导致肿瘤转移 肿瘤的血管系统己成为一个崭新的 有希 望的抗肿瘤治疗靶点 人们正致力于开发和研究能破坏或抑制血管生成 有效地 阻止肿瘤的生长和转移的药物 这类药物称为飞人抑制剂 是当今新型抗肿瘤药 物研究最活跃的领域之一 第1 章引言 1 1 3 端粒酶抑制剂 端粒酶是一种r n a 聚合酶 能以本身r n a 为模板 在染色体末端合成六聚脱 氧核苷酸t t a g g g 的重复序列 以补偿细胞分裂时的染色体末端缩短 解决 末端 复制问题 端粒酶存在于绝大部分正常人体细胞 但在肿瘤细胞中广泛表达 提 示它可能为恶性肿瘤细胞无限增殖所必需 抑制端粒酶的活力 将有可能阻止肿 瘤细胞恶性增殖 因此 端粒酶抑制剂有望成为一种高效低毒的新型抗肿瘤药 1 1 4 反义药物 反义寡核苷酸 n a t s i n e e s o l i g o m i c o c t i d e 具有特异性抑制基因表达的能 力 反义寡核苷酸是一类短的r n a 或d n a 片段 通常是2 1 2 个核苷酸 可以阻止 或封闭m r n a 的翻译或加工 随着快速基因克隆 测序技术及快速自动d n a 化学合 成技术的出现 反义寡核苷酸的研究己进入蓬勃发展时期 由于针对肿瘤的反义 药物的研究较早 迄今为止己有十几种反义寡核苷酸试用于临床 1 1 5 肿瘤耐药逆转剂 临床化疗失败的重要原因是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性 大多数肿瘤患 者的死因与耐药直接或间接相关 因此 寻找耐药逆转剂是抗肿瘤药物研究的重 要策略之一 1 1 6 分化诱导剂 1 9 7 2 年k e r r 等首次提出了细胞凋亡的概念 细胞凋亡或程序化细胞死亡是多 细胞有机体为调控机体发育 维护内环境稳定 由基因控制的细胞主动死亡过程 一旦细胞的增殖异常或细胞凋亡发生异常 均可导致细胞的恶性转化 通过诱导 肿瘤细胞凋亡达到肿瘤缩小 消退的目的已成为当今肿瘤治疗的研究热点 促进 恶性细胞成熟分化的抗癌药物称分化诱导剂 t n f 是主要药物之一 t n f 抗肿瘤作 用主要是由于 o t n f 为激发性细胞因子 可启动广泛的免疫炎性反应 介导天然 细胞毒t 淋巴细胞 单核细胞和巨噬细胞 对癌细胞的杀伤和溶瘤作用 t n f 可 作用于血管内皮细胞 使肿瘤的血管变形受损或形成血栓 导致肿瘤发生出血性 黑龙江大学硕士学位论文 坏死或营养缺乏而消退 t n f 可通过诱导某些肿瘤细胞调亡来抑制癌细胞增生 1 1 7 导向治疗剂 目前治疗恶性肿瘤舱手段主要是抗肿瘤药物的联合化疗 放疗和手术 尽管 起作用无可置疑但存在严重缺陷 即杀伤恶性细胞的同时对正常细胞也不加选择 地造成严重损害 而导向治疗剂免疫毒素稳定性强 渗透性好 具有较好的肿瘤 细胞导向特异性 且制备简单易行 可短期内大量制备 有很好选择性结合与杀 伤肿瘤细胞的作用 显示出较明显的临床应用前景 1 1 8 基因治疗 基因治疗主要是通过基因替换或基因过渡 前者导入的基因可以整合到细胞 染色体上 因此导入的基因能够稳定地长期表达 而后者一般没有这一过程 基 因表达效应的时期短暂 相比之下 后者安全性高 目前研究较为深入 广泛的 是p 5 3 基因治疗 1 1 9 抗癌中草药 合成药物在治疗中易出现明显的副作用 天然药物越来越受到人们的重视和 青睐 利用现代科学技术揭示中草药的作用机制是中药现代化 科学化 国际化 的必然要求 也是抗肿瘤中草药开发领域的重要研究热点 实验研究表明 许多 中药能减少染色体畸变 姊妹染色单体交换和微核的发生率 可用于肿瘤的预防 和治疗 还有一些中药是通过细胞毒作用 即损伤肿瘤细胞的d n a 而发挥效力的 有些中药有抑制肿瘤细胞增殖 诱导其分化的作用 通过提高机体的免疫功能来 达到抑制肿瘤生长的作用 1 2 免疫调节剂的研究 1 2 1 免疫系统的功能 人体的免疫系统是由免疫器官 免疫细胞 免疫分子等构成的有机整体 胸 腺 骨髓 淋巴结 脾脏及外周淋巴组织和免疫生态系统即免疫细胞各子系统 组织细胞子系统 抗体子系统 细胞因子子系统 体液因素子系统 内环境子系 4一 第1 章引言 统共同构成了人体的免疫防御系统 它们在免疫反应中相互依赖 相互制约 以 抗原和靶细胞为攻击目标 免疫活性细胞为主攻力量 产生免疫应答 发挥免疫 防护 免疫稳定 免疫监视三大功能 而且与神经 内分泌系统构成了神经内分 泌免疫网络 神经系统可以通过内分泌系统或直接产生和释放神经递质等因子与 免疫细胞上的相应受体结合发挥免疫调控作用 同时 免疫系统也能产生多种免 疫活性物质 对神经系统进行反馈调节 然后神经系统再通过改变自主神经系统 和内分泌系统活动调节免疫反应 最终使其发生与体内外环境相适应的变化 一旦免疫功能失调 将会导致免疫缺陷病 自身免疫病 变态反应病及恶性 肿瘤的发生 随着现代医学 免疫学 细胞生物学及分子生物学等的发展 使人 们更加认识到免疫系统的紊乱 不仅易发生感染 自身免疫病等多种疾病 而且 与人体衰老及老年人的多发病如肿瘤 高血压 糖尿病 心脑血管病甚至精神病 等多种疾病的发生均有密切联系 许多原因不明的疾病可以用自身免疫理论来解 释 因此有人将免疫性疾病称为难治性疾病 现代医学对其尚无较满意的疗效 1 2 2 中药对免疫系统的调节 中医中药或谓之传统医药学是我国的国宝 扶正固本 扶正祛邪 补肾 健脾 等是中医治疗许多疾病的原则 而 扶正 即相当于现代医学中的提高免 疫功能或提高抵抗力 根据天然药物对机体免疫功能的影响分为上调和下调两类 即能增强免疫功能和降低免疫功能的天然药物 免疫增强药亦称为免疫调节剂 是指具有调节 增强 兴奋和恢复机体免疫功能的一类药物 它们在免疫缺陷病 细菌 病毒和寄生虫感染 自身免疫病 艾滋病及恶性肿瘤的辅助治疗方面有积 极意义 中医药通过调整机体的免疫功能 在治疗这些疾病方面与西药相比具有 明显的特色和优势 不少化学药物和免疫抑制剂毒副作用较大 而免疫调节类中 药绝大多数未发现有毒副作用 从中药中开发和研究免疫调节剂 具有资源广泛 针对性强 成本低 见效快等优点 加之医学模式的转变和人们崇尚回归自然潮 流的兴起 中医药的免疫调节作用及中药免疫调节剂的开发更加受到人们的重视 黑龙江大学硕士学位论文 1 3 香鳞毛蕨的研究进展 香鳞毛蕨d r y o p t e r i sf r a g r a n s l s c h o tf 为鳞毛蕨科鳞毛蕨属植物 落叶 多年生草本 生于高寒地区的滑石坡 森林中的碎石坡上和火山周围的岩浆缝隙 中 图1 i 香鳞毛蕨在我国分布广泛 黑龙江 辽宁 吉林 内蒙古和河北地 区均有分布 在我省主要分布于五大连池 塔河县白卡兽山 呼中大白山的高山 地带及小兴安岭北部地区 据北方民间验方记载 香鳞毛蕨水煎液能治疗各种皮 肤病 如 牛皮癣 皮疹 皮炎 脚气和干癣等 1 3 1 生药性状 香鳞毛蕨b r y o p t e r i sf r a g r a n s 亿 s c h o tt 植株高2 0 3 0 c m 根状茎粗短 直立或斜生 上部密被褐色三角状披针形鳞片 鳞片边缘疏生不整齐的齿 叶簇 生 叶柄长5 8 c m 连同叶轴或羽轴密被卵形至披针形淡黄色鳞片 有光泽 叶 片长1 2 1 8 c m 宽2 一 4 c m 长披针形或倒披针形 中部以上渐尖或短缩为钝尖 向下渐狭至叶柄顶部 草质 二回羽状裂 羽片2 5 3 5 对 互生或少数近对生 宽披针型 长1 5 2 c m 宽0 8 1 c m 先端钝 基部楔形 小羽片5 7 对 矩 圆形 生于侧脉中下部或基部 囊群盖圆肾形 边缘啮蚀状 被多数腺体 膜质 灰白色 宿存 孢子椭圆形 具不规则的小瘤b 刊 植物略具香味 故有香鳞毛蕨 之称 1 3 2 显微组织 1 3 2 1 根横切面 表皮由一列扁长方形细胞组成 皮层由2 3 层薄壁细胞组成 中柱外5 一6 层纤维 棕色 排列成环 原生中柱 图1 2 a 1 3 2 2 茎横切面 表皮为一列扁长方形细胞 被角质 皮层由薄壁细胞组成 周韧维管束4 5 个 呈环状散在 内皮层明显 图卜2 b 第1 章引言 图1 1 香鳞毛蕨的生境图 黑龙江大学硕士学位论文 图1 2 香鳞毛蕨根 茎横切面图 1 3 2 3 叶中部横切面 表皮细胞一列 被角质层 靠近叶柄附近的表皮下有1 0 列左右的栅状细胞 主脉维管束周韧性 内皮层明显 呈扁椭圆形 下表皮细胞一列 可见气孔及非 腺毛 图i 3 i 一 l 童c 2 f j 3 一凡j 芝 i j l 7 9 t o 5 w ti i fn l q 织 一 i l 图卜3 香鳞毛蕨叶横切面图 1 3 2 4 叶柄基部横切面 表皮细胞 图卜4 外壁稍厚 厚壁细胞数列 多角形 棕色 基本组织中有分 体 中柱3 7 个 每 分体中柱具周韧维管束 外围以内皮层 i 2 3 4 5 6 7 第1 章引言 i 一 j 2 7 0 穸 l 1 91 乡 办 4 一 j 正矗 5 一 j f j 芝i i 图1 4 香鳞毛蕨叶柄基部横切面 1 3 3 药材性状 内皮层碎片甚多 黄棕色 孢子囊环带 由1 4 2 0 个增厚细胞组成 气孔环 式 梯纹管胞 可见单个纤维或纤维束 非腺毛由单细胞组成 弯曲或笔直 鳞 片细胞排列紧密 两面型孢子 孢子表面观与赤道面观不易看清楚 孢子大小为 3 3 4 3 3 8l am x5 31 1m 5 0 6 0 裂缝不明显 周壁具有褶皱 褶皱形成瘤状突 起 有时孢子沿褶皱处裂开 外壁厚度约为2 5l am 外层厚于内层 图卜5 7 磊 0 5 6 了 卜非腺毛2 一鳞片3 一孢子4 邑子囊5 一纤维6 梯纤管胞7 一气孔 图卜5 香鳞毛蕨内皮层结构 麟 国爹 纛必扩一 黑龙江大学硕士学位论文 1 3 4 化学成分 香鳞毛蕨属植物化学成分复杂 目前 国内外学者已经从该属植物中分离得 到包括木脂素 间苯三酚和萜类等几大类上百种的化学成分 而对于香鳞毛蕨化 学成分的研究报道很少 1 3 4 1 挥发油成分 黑龙江大学张彦龙副教授曾采用气一质联用的方法对香鳞毛蕨中挥发油的成 分进行了研究 共鉴定出3 4 个化学成分并对各化学成分的含量进行了测定 其中 乙二醇缩一3 一丁烯醛和脂肪酸类化合物分别占 7 1 4 和1 6 1 9 是香鳞毛蕨挥发 油的主要成分盯1 1 3 4 2 问苯三酚及其衍生物 日本早冈大学i t oh id e y u k i 教授和原黑龙江商业大学沈志斌副教授分别从香 鳞毛蕨中分离得到5 卜5 个间苯三酚及其衍生物协叫们 见图卜6 卜7 卜1 1 1 3 4 3 倍半萜类 日本早冈大学i t oh i d e y u k i 教授从香鳞毛蕨中分离得到倍半萜类化合物4 6 9 个 8 1 见图1 8 1 9 1 1 0 图1 6 a s p i d i na b 1 r h a s p i d i nb b 2 r c h i a s p i d i np b 3 r g h 5 o h s c o 图1 7 a s p i d i o n l 4 第1 章引言 图1 8 a l b i c a n o l 6 r h a l b ic a n y la c e t a t e 7 r a c o h 图1 9 图卜1 0图1 1 1 conicamol 9 dryofragin 5 图l 一 1 1 香鳞毛蕨中分离得到的化学成分 1 3 5 药理作用 香鳞毛蕨作为民间用药 它主要用于治疗各种皮肤病和关节炎 目前 国内 外学者研究发现 香鳞毛蕨具有复杂的化学成分和多方面的药理作用 1 3 5 1 抗肿瘤作用 日本早冈大学 t oh id e y u k i 等从香鳞毛蕨正己烷提取物中分离得到单体化合 物 并利用这些单体化合物对1 2 一d 一四酰基大戟二萜醇一1 3 一乙酸脂 t p a 诱导的 艾波斯坦一巴氏病毒早期抗原 e b v e a 的活化进行抑制 结果表明 除a s p i d i o n l 以外 其余单体化合物均比对照没食子酸 一 表焙化茶素的作用强 另外 用 a s p i d i nb b 和a l b i c a n o l 作用于以t p a 为促进剂7 1 2 一二甲基苯并葸 d m b a 诱 发的二期致癌小鼠 结果用药10 周后小鼠肿瘤发病率显著降低2 0 3 0 2 0 周后 黑龙江大学硕士学位论文 发病率则降6 5 8 5 抑制作用非常明显 1 3 5 2 免疫调节作用 张彦龙等用香鳞毛蕨的水煎膏 a b 一8 大孔吸附树脂的水洗脱物 3 0 7 醇沈脱 物 6 0 乙醇洗脱物 9 5 乙醇洗脱物作用于a a 大鼠模型 以雷公藤多甙作为阳性 对照 研究结果表明香鳞毛蕨水煎液对a a 大鼠模型继发性关节肿胀具有抑制作用 其中3 0 乙醇洗脱物对从大鼠模型继发性关节肿胀抑制作用明显优于同剂量的雷 公藤多甙旧3 1 3 5 3 银屑病的治疗作用 采用小鼠尾部鳞片模型 将香鳞毛蕨药材水提液和醇提液制成软膏 涂于小 鼠尾部 对小鼠尾部鳞片表皮的颗粒层形成作用进行评价 实验结果表明 无论 是醇提物软膏还是水提物软膏都能显著促进颗粒层的形成 故对银属病具有治疗 作用 嘲 1 3 5 4 抑制真菌作用 将香鳞毛蕨醇提取液稀释成不同浓度 采用琼脂糖扩散法抑菌 结果发现对 表皮癣菌属 絮状表皮癣菌 小孢子菌属 大小孢子菌 毛癣菌属 红色毛癣菌 许兰氏毛癣菌 石膏样毛癣菌及断发毛癣菌均有不同程度的抑制作用 引 1 3 5 5 其它药理作用 此外 据报道香鳞毛蕨也具有治疗各种体癣 纠嗣等方面的药理作用 1 4 展望 本文对香鳞毛蕨进行活性跟踪分离 利用香鳞毛蕨中提取分离的组分为材料 建立不同的筛选模型 以期得到某种生物活性的物质 而在研究过程中 生物活 性物质的筛选模型是非常重要的 考虑到以整体动物作为实验对象 现象复杂 个体差异不同等因素 选择了细胞水平的实验 其优点是灵敏简便 微量样品就 可测试 以对分离过程中的不同组分进行活性测试为基础 再以活性为指标进行 追踪 运用正相 反相硅胶柱色谱 制备薄层色谱以及高压液相色谱等分离手段 第1 章引言 跟踪分离活性成分 利用理化和波谱学方法鉴定化合物结构 避免了单纯分离过 程中活性化合物的丢失和漏检 以期筛选出能够在较低浓度 微克 毫升 水平就具 有抗肿瘤及免疫调节作用的先导药物 为鳞毛蕨属 乃至蕨类植物的药用研究与 开发提供基础资料 黑龙江大学硕士学位论文 第2 章香鳞毛蕨化学成分的分离与鉴定 2 1 香鳞毛蕨化学成分分离 如图2 1 所示 将香鳞毛蕨用9 5 e t o h 回流提取后 回收e t o h 得到e t o h 提取物 将此提取物溶液吸附于a b 8 型大孔吸附树脂柱色谱 依次分别用h 2 0 3 0 e t o h 7 0 e t 0 h 9 0 e t o h 洗脱 分别得到各自洗脱物 通过活性实验证明 3 0 e t o h 洗脱部分为具有抗肿瘤 免疫调节活性的有效部位 继续采用活性跟踪 分离的方法结合硅胶柱色谱 o d s 反相柱色谱以及h p l c 等现代分离技术与方法 对该部位进行分离 其中又确定了4 个活性组分 并经理化分析及各种波谱学数 据的解析 共分离了1 0 个单体化合物 鉴定了1 个具有抗肿瘤活性 2 个具有免 疫调节活性的单体化合物 此均为己知化合物 工艺流程图 图2 1 s o j l u工 0 0 磊车 矗j 2u 磊 舌 o x 0 工 v o 面芝 k 86 三工 u o qf 兰茜堇 芝工 气r o 一 矿n u j 乱工o 工 工ou芝 q u o o o 工 工oq芝 一u u u u面m醇 兰 u j 乱工 on工 工od芝 u u q o 匝嚣嚣证求蚤裂餐岬蕊收一 乙团 u j l 工 o 工 工od芝 u u q o u j l 工 o 工 工o 乏 u u q o on工 工oq茎k 工u u d 面m 8 三 u j 包工o n 工 工o d 芝 q u o o u j 乱工 工 工od三 q u q o 卜 u 1 山工oh工 工oo芝u u q o h 一 皿 皿 一一 一 i 皿 一 j 皿 d苗砖 c 眦 q o瓮 面工o 山摹 口 卜 oo芝 一u工u u u o 时uli一 o瓮3面工 菡摹 卜 d一时 一 工o 叫摹on o 时3 一o o n 卜 一 op on 一 c一 o i co一 nco们屯砖 o iocio lu心 2 q m 婚 o 七 o工o 山 蛐 价一 1 1 k 一 lu 厶 斗 q 假蜊奸龌尔g尔餐孙尊醛岬替收 料n 锨 黑龙江大学硕士学位论文 2 2 化学结构的鉴定 2 2 1 化合物3 的化学结构鉴定 化合物3 为淡黄色无定形粉末 易溶于甲醇 m o l i s h 反应呈阳性 化合物3 的e s m s 谱在m z5 4 5 处给出 m n a 离子峰 表明化合物3 的分子量为5 2 2 结 合其1 h n m r 谱和1 一n m r 谱等可推测其分子式为c 2 6 h 甜0 计算其不饱和度为1 0 在化合物3 的1 h n m r 谱中 显示有5 个芳香质子信号 分别为6 6 8 9 1 h d j 1 5h z 6 6 6 1 h d j 8 3h z 和6 6 9 1 h d d j 8 3 1 5h z 处的归 属于1 3 4 三取代苯环上的a m x 系统中的3 个质子信号 以及6 6 6 4 1 h s 和6 6 2 1 h s 处的四取代芳环上的2 个质子信号 在6 3 8 2 3 h s 和3 8 5 3 h s 处 可见两个甲氧基质子的信号 在6 5 4 8 i h d j 6 4h z 处可见 一氧代次甲基质子的双重峰信号 在6 2 5 2 2 h b r t j 7 6h z 处清晰表明一组 双三重峰信号 在6 4 0 0 2 h d d j 9 2 8 0h z 处观察到一组四重峰信号 在6 4 2 5 1 h d j 7 6h z 处出现来源于葡萄糖端基质子的信号 根据其偶合常数 可 知该糖为p 构型 在1 3 c n m r 谱中 能观察到2 6 个碳原子 其中有7 个季碳信号 8 1 4 9 0 1 4 7 4 1 4 7 5 1 4 5 2 1 3 6 9 1 3 4 7 1 2 9 7 2 个c h 3 碳信号 8 5 6 4 5 6 7 1 2 个c h 碳信号和5 个c h 2 碳信号 i 1 0 4 2 处的c h 氧代次甲基碳原子信号被归属于端基 碳原子 6 5 6 4 和5 6 7 处的c h 3 碳信号被认定为 o c h 3 碳原子 将化合物3 的1 h n m r 谱 1 3 c n m r 谱数据与已知化合物相比较 发现两者 数据基本 致 故将化合物3 的所有氢质子信号和全部碳原子信号进行了准确归 属 见表2 1 综合以上数据 化合物3 的结构鉴定为 7 s 8 r 一d i h y d r o d e h y d r o d i c o n i f e r y l a l c o h o l 901 3 g l u c o s i d e 结构见图2 2 第2 章香鳞毛蕨化学成分的分离与鉴定 表2 1 化合物3 的1 3 c n m r 和1 h n m r 谱 c d 3 0 d t a b l e2 1 1 ha n d1 3 c n m rd a t ao f c o m p o u n d3 c d 3 0 d 1 7 黑龙江大学硕士学位论文 o o c h 3 图2 2 化合物3 的结构 f i g2 2 s t r u c t u r eo fc o m p o u n d3 2 2 2 化合物10 化学结构的鉴定 化合物1 0 为白色粉末 溶于甲醇 经薄层酸水解检出d 葡萄糖和d 木糖 在e s l 一m s 中m z 4 8 1 1 处给出 m n a 离子峰 m z 9 3 9 9 处给出 2 m n a 十离子峰 表明该化合物分子量为4 5 8 结合1 h n m r 1 3 c n m r 谱等推断化合物10 的分子 式为c 2 0 h 2 6 0 1 2 d 在化合物1 0 的1 h n m r 谱中 显示有对位取代苯的一组芳香质子的信号 即 6 7 4 9 2 h d j 8 6h z 和6 6 8 1 2 h d j 8 6h z 而6 7 7 1 1 h d j l5 9h z 和6 6 3 4 i h d j 1 5 9h z 处的质子信号则表明分子中存在一对反式偶合的烯氢 质子 在化合物1 0 的1 3 c n m r 谱中 显示有一个c d 不饱和酯羰基碳信号 6 1 6 7 3 一组对位二取代的苯环碳信号 一对反式双键的碳信号 5 1 4 7 9 和6 1 1 4 5 在化 合物1 0 的h s q c 谱中 f i l 4 7 9 和6 1 1 4 5 处的碳信号分别与6 7 7 1 和66 3 4 处的反 式双键氢信号相关 在化合物10 的h m b c 谱中 反式双键的两个氢信号与酯羰 基碳信号 6 1 6 7 3 呈远程相关 并且 6 6 3 4 处的反式双键氢信号与6 1 2 6 9 处的 芳香季碳信号呈远程相关 说明反式双键的一侧与酯羰基相连 另一侧与苯环相 第2 章香鳞毛蕨化学成分的分离与鉴定 连 将化合物1 0 的1 h n m r 和1 3 c n m r 谱数据 见t a b l e2 2 与文献数据对照 鉴定化合物1 0 的苷元为反式一s 一反一对羟基桂皮酸 在1 h n m r 谱中 还可观察到6 5 7 0 1 h d j 7 7h z 和8 4 5 0 1 h d j 7 6 h z 处有两个糖的端基质子信号 在6 3 0 0 4 0 0 之问还可见葡萄糖和木糖的其余质 子信号 通过糖的端基质子的偶合常数 可判断两个糖的端基构型均为d 型 化合物10 的乃c n m r 谱显示一组末端b d 一木糖的碳信号 6 10 6 6 7 5 7 7 7 5 7 1 0 6 7 4 在化合物1 0 的h m b c 谱中 6 5 7 0 处的葡萄糖端基质子信号与6 1 6 7 3 处酯羰基碳信号相关 说明葡萄糖直接与酯羰基成苷 6 4 5 0 处的木糖端基质子信 号与8 8 3 5 处葡萄糖的2 位碳信号相关 说明木糖与葡萄糖的2 位成苷 综合以上分析 结合h s q c 和h m b c 谱对化合物1 0 的1 h n m r 的主要数据 和b c n m r 谱的全部数据均进行了归属 见t a b l e 2 2 综上 确定化合物1 0 为 反式一s 一反 对羟基桂皮酸一9 1 3 d s t e 喃木糖 1 叶2 b d 一吡喃葡萄糖酯 t r a n s s t r a n s p h y d r o x yc i n a m i c a c i d 一9 一p d x y l p y r a n o s y l 1 2 一p d g l u c o p y r a n o s y l e s t e r 结构见图2 3 j h o h 图2 3 化合物1 0 的h m b c 谱 f i g2 3 s t r u c t u r eo fc o m p o u n d1 0 o h 黑龙江大学硕士学位论文 表2 2化合物10 的1 3 c n m r 和1 h n m r 谱 c d 3 0 d t a b l e2 21 ha n db c n m rd a t ao fc o m p o u n d10 c d 3 0 d 2 2 3 化合物5 化学结构的鉴定 化合物5 为白色无定形粉末 易溶于甲醇 m o l i s h 反应呈紫色环 酸水解后 薄层检识仅检出d 一葡萄糖 化合物5 的u v 光谱 m e o h 在2 9 3 n m 处出现最大 吸收 表明其分子中可能含有一个苯环 在e s i m s 谱中 m z 3 6 3 处可见 m n a 离子峰 表明化合物5 的分子量为3 4 0 推测其分子式为c 1 6 h 2 0 0 8 计算其不饱和 度为7 化合物5 的1 h n m r 谱 c d 3 0 d 中 在6 7 6 9 ih t j 8 0 h z 6 7 2 5 1 h d d 第2 章 香鳞毛蕨化学成分的分离与鉴定 8 0 2 0 h z 7 1 8 1 h d 8 0 h z 处出现3 个芳香质子的信号 根据其裂分模 式 确定苯环为l 2 3 一三取代 6 0 9 3 3 h t 户7 2 h z 处还能观察到一个甲基信 号 65 5 0 1h m 处有1 个归属于氧代次甲基的质子信号 61 8 0 i h m 和 2 15 1 h m 处还能观察到一对归属于亚甲基的质子信号 此外 6 5 0 9 1 h d j 8 0 h z 处 可见1 个p d 一葡萄糖的端基质子信号 在63 4 1 3 8 6 之间的信号为 葡萄糖基的h 2 h 6 信号 化合物5 的 c n m r d e p t 谱给出1 6 个碳信号 其中包括一组d d 一葡萄 糖基的6 个碳信号 8 1 0 1 8 7 4 4 7 8 4 7 1 2 7 7 5 6 2 4 1 个苯环上的6 个碳信号 6 1 5 5 5 1 1 5 o 1 5 2 2 1 1 6 1 1 3 8 0 1 1 6 5 一个酯羰基碳信号 8 1 7 1 o 一个氧 代次甲基碳信号 8 8 3 3 一个亚甲基碳信号 8 2 8 5 及一个甲基碳信号 8 8 8 化合物5 的1 h 一1 hc o s y 谱中 6 2 15 1 h m 和1 0 8 1 h m 处的2 个同碳 质子 c h 2 信号互为相关 同时这4 个质子信号又都与6 5 5 0 i h m 处的氧代 次甲基质子 以及8 0 9 3 3 h t j 7 2 h z 处的甲基质子相关 说明分子中含有 o c h c h 2 一c h 3 结构片断 以上结构片段可根据化合物5 的h m b c 谱 见图2 4 进行沟通和连接 在 化合物5 的h m b c 谱中 6 7 1 8 1 h d j 8 0 h z 处的质子信号分别与6 11 6 i c 6 1 1 5 0 c 1 处的芳香碳信号 以及8 8 3 3 处的氧代次甲基碳信号相关 8 7 2 5 1 h d d 8 0 2 0 h z 处的质子信号分别与8 1 5 2 2 c 一2 1 1 6 5 c 一4 1 3 8 0 c 5 处的芳香 碳信号相关 8 7 6 9 1h t 8 0 h z 处的质子信号分别与6 15 2 2 c 一2 116 5 c 4 处的芳香碳信号相关 60 9 3 处的甲基质子信号分别与62 8 5 c 一8 和68 3 3 c 一7 处的碳信号相关 65 5 0 处的氧代次甲基质子信号 h 一7 分别与68 8 c 一9 和6 1 5 2 2 c 2 处的碳信号相关 此外 6 5 0 9 1 h d 8 0 h z 处的葡萄糖端基质子信 号与8 1 5 5 5 处的碳信号相关 从而表明苯环的3 位上连接一个葡萄糖基 化合物5 的1 h n m