（发酵工程专业论文）里氏木霉纤维素酶的液态深层发酵生产及其应用的研究.pdf

摘要 摘要 随着能源危机的加剧 天然纤维质原料酶解生产燃料酒精成为当前研究的热点 然而 纤维素酶的使用成本是束缚此项研究的瓶颈所在 本实验旨在通过优化里氏木霉突变株 w x 1 1 2 液态发酵产纤维素酶的培养条件 寻求能更好降低纤维素酶使用成本的有效途径 用经过预处理的蔗渣代替微晶纤维素作为主要碳源用于纤维素酶的生产 既解决了环境污 染问题 又可有效降低生产成本 通过机械粉碎 酸水解 碱水解 微波与碱联合处理 活性乳酸菌处理等方法预处理 蔗渣后用于里氏木霉液态发酵生产纤维素酶 单因素试验结果显示 浓度为1 w v 的 n a o h 溶液水解蔗渣效果较好 在此基础上 结合微波辐射处理 由正交试验得出了最佳 的预处理工艺为 用0 3 0 m o l l 的n a o h 溶液浸泡蔗渣 在微波功率为1 6 0 w 下处理5 m i n 在 此条件下单位能耗的酶活净增值最大 后续发酵结束后 酶活较未经处理的蔗渣发酵后所 得酶活有显著提高 其中 滤纸酶活和c m c 酶活分别由原来的1 7 3 i u m l 和6 0 2 i u m l 提高 到3 5 4 i u m l 和1 3 4 8i u m l 提高了1 0 4 6 和1 2 3 4 利用葡萄糖阻遏效应筛选抗阻遏的高产菌株 在平板上添加4 的葡萄糖筛选得到的 菌株产酶最高 滤纸酶活和c m c 酶活分别可达4 3 i u m l 和16 5 0 i u m l 左右 比原始菌 株的产酶量分别提高了3 3 5 和3 1 0 在此基础上 通过单因素试验和l 1 6 4 5 的正交 试验得到了该菌株摇瓶液态发酵的最佳培养基组成为 g l 蔗渣3 0 麸皮2 5 豆饼粉 4 0 乳清粉1 0 k h 2 p 0 4 2 0 胰蛋白胨3 o 硫酸铵2 0 c a c l 20 5 m g s 0 40 5 对该菌 株摇瓶液态发酵的条件进行了优化 得到的最佳培养条件为 种龄4 8 h 培养基的起始 p h 5 0 5 5 培养温度2 6 2 8 接种量1 0 装液量2 5 m l 2 5 0 m l 摇床转速18 0 r m i n 培养1 4 4 h 在此条件下最有利于菌体产酶 p 一葡萄糖苷酶活 滤纸酶活和c m c 酶活最高 可分别达到4 5 i u m l 1 0 i l u m l 2 9 4 6 i u m l 对酶学性质进行了研究 1 3 葡萄糖苷酶活 滤纸酶活及c m c 酶活的最适p h 值均在 5 0 左右 滤纸酶活和c m c 酶活的最适反应温度为5 5 b 葡萄糖苷酶的最适反应温度 为5 0 当酶液在低于5 0 环境p h 值在5 0 左右时保存可以较好的保持酶活力 z n 2 m g n a c a 2 m n 2 等对酶活有一定的激活作用 不同浓度的酒精可以不同程度的抑 制酶活 且抑制程度随酒精浓度的升高而增加 随温度的升高而加强 蔗渣经碱与微波联合处理后纤维素的相对含量提高了1 1 0 并且比未处理的蔗渣更 易被纤维素酶水解糖化 研究了经过预处理的蔗渣酶解的最佳条件为 纤维素酶用量 8 i o f p u m l 底物浓度2 反应温度5 5 反应体系p h 4 8 并适当添加一定浓度的表 面活性剂t w e e n 8 0 在此条件下 得到的最终糖化率为3 5 左右 酒精对酶解糖化反应的 抑制作用表现为 一方面 随着酒精浓度的升高 抑制作用逐步加强 另一方面 温度越 高 酒精的抑制作用也越显著 关键词纤维素酶 里氏木霉 液态发酵 蔗渣 水解 a b s t r a c t a b s t r a c t c u r r e n t l y t h er e s e a r c ho fu s i n gt h en a t u r a lf i b e rr a wm a t e r i a lt op r o d u c ef u e la l c o h o lh a sb e e np a i d m o r ea n dm o r ea t t e n t i o nb e c a u s eo ft h ea g g r a v a t i n go fe n e r g yc r i s i s a tt h es a m et i m e t h ek e yp o i n t o ft h i sr e s e a r c hi sh o wt or e d u c et h ec o s to fc e l l u l a s e 1 h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n so ft h e s u b m e r g e df e r m e n t a t i o no ft h em u t a n ts t r a i nt r i c h o d e r m ar e e s e i x 112w e r es t u d i e d 1 1 1 e p r e t r e a t e db a g a s s ew a su s e dt op r o d u c ec e l l u l a s ea sm a i nm a t e r i a l sr e p l a c i n gp u r ec e l l u l o s es oa st o a l l e v i a t et h ep o l l u t i o no fe n v i r o m e n ta n dr e d u c et h ec o s to fc e l l u l a s ee f f e c t i v e l y 硼1 eb a g a s s ep r e t r e a t e d 谢mt h em e t h e d ss u c ha ss m a s h a c i d sh y d r o l y s i s a l k a l i sh y d r o l y s i s m i c r o w a v ea n de mw e r eu s e dt op r o d u c ec e l l u l a s db yt h em u t a n ts t r a i nt r i c h o d e r m ar e e s e i 112 s u b m e r g e df e r m e n t a t i o n t h er e s u l to fs i n g l ef a c t o rt e s ts h o w e d b a g a s s ep r e t r e a t e dw i t h n a o h 1 w v w a sb e t t e rf o rp r o d u c i n gc e l l u l a s e b a s e do nt h i s t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so f p r e t r e a t e m e n to fb a g a s s eg a i n e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n tw e r ea sf o l l o w s a l k a l iw i t h0 3 0m o l l n a o h t h em i c r o w a v er a d i a t i o n 航t hp o w e r16 0 w 5m i n u t e s u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s t h ec e l l u l a s e y i e l dc a ng e tt h eh i 曲e s ti n c r e a s ep e ru n i ti nt h ev i e wo fe n e r g yc o n s u m p t i o n 1 1 1 er e s u l t ss h e l w e d t h a tt h em a x i m u mc e l l u l a s ey i e l du s i n gp r e t r e a t e db a g a s s e sa sr a wm a t e r i a lw a sh i g h e rt h a nt h a to f u s i n gn o n p r e t r e a t e db a g a s s e s t h eh i g h e s ty i e l do ff p a s ea n dc m c a s er e a c h e d3 5 4 r u m la n d 13 4 8i u m lf r o m l 7 3 i u m la n d6 0 2 i u m la f t e r5d a y s c u l t u r i n g w h i c hi n c r e a s e db y10 4 6 a n d12 3 4 r e s p e c t i v e l y b a s e do nt h et h e o r yo fg l u c o s er e p r e s s i o n t h ea n t i r e p r e s s i o ns t r a i n sw e r eo b t a i n e db yu s i n ga g a r p l a t es c r e e n i n gt e c h n i q u e s w h i c hc a ns y n t h e r i z ec e l l u l a s ew h e nk 曲c o n c e n t a t i o ng l u c o s ee x i s t s t h es t r a i nc a np r o d u c em o r ec e l l u l a s et h a no t h e r sb ys u b m e r g e df e r m e n t a t i o n w h i c hw a ss c r e e n e d 舶mt h ep l a t ec o n t a i n i n g4 g l u c o s e n l ey i e l do ff p a s ea n dc m c a s er e a c h e d4 3 砌 m la n d 1 6 5 o r u m l w h i c hi n c r e a s e db y3 3 5 a n d31 o r e s p e c t i v e l y t h e n t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n s o f ss c r e e n i n gs t r a i nw e r es t u d i e db ys i n g l ef a c t o rt e s ta n dl 1 6 4 o r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h e o p t i m a lf e r m e n t a t i o nm e d i u mw a sd e t e r m i n e d g l b a g a s s e3 0 w h e a tb r a n2 5 b e a nc a k ef l o u r4 0 w h e yp o w d e r1 0 k h 2 p 0 42 0 t r y p t o n e3 0 n h 4 2 8 0 42 0 c a c l 20 5 m g s 0 40 5 t h es u t i a b l e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s p l a n t sa g ew a s4 8 kt h ei n i t i a lp ho fc u l t u r em e d i u r f lw a s5 0 5 5 t h e c u l t u r et e m p e r a t u r ew a s2 6 2 8 t h ei n o c u l u ms i z ew a s1o v o l u m eo fm e d i u mw a s2 5 m l 2 5 0 m l a n dt h es p e e do fs h a k e rw a s18 0 r m i n c u l t u r i n g14 4 h u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s t h eh i 曲e s ty i e l do f b e t a g l u c o s y le n z y m e f p a s ea n dc m c a s er e a c h e d4 5 l 1 o 1 i u m la n d2 9 4 6 i u 詹正 r e s p e c t i v e l y 1 1 1 ec r u d ee n z y m ep r o p e r t i e sw e r ei n v e s t i g a t e dp r e l i m i n a r i l y t h eo p t i m u mp ho f1 3 g l u c o s i d a s e f p aa n dc m c a s ew e r ea l l5 0a n dt h et e m p e r a t u r ew e r e5 0 5 5 t h es t a b l ep hr a n g e r t h et h e r m a l s t a b i l i t yw e r eo b t a i n e da tt h es a m et i m e i n f l u e n c e so ne n z y m a t i ca c t i v i t yo fm a n yk i n d so fi o n sw e r e s t u d i e d z n 2 m 9 2 十 n a c a 2 m n 2 十a n ds oo nc o u l dp r o m o t e di t sc a t a l y t i ca c t i v i t ys i g n i f i c a n t l y a t l a s t t h ee f f e c t so fa l c o h o lo nc e l l u l a s ep r o d u c t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e d a i c o h 0 1 杌t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nc o u l da l lr e s t r a i n e dt h ea c t i v i t yo fc e l l u l a s e a n dt h i sk i n do fe f f e c tw o u l d b es t r e n g t h e n e dw i t ht h ei n c r e a s i n go ft e m p r e a t u r ea n dt h e c o n c e n t r a t i o no fa l c o h 0 1 1 1 1 ec e l l u l o s ec o n t e n to fb a g a s s ep r e t r e a t e db ya l k a l ia n dm i c r o w a v ei n c r e a s e db y1 1 0 w h i c h c o u l db eh y d r o l y s i s e de a s i e rt h a nn o n p r e t r e a t e db a g a s s e t h eo p t i m a le n z y m a t i ch y d r o l y s i s i i a b s t r a c t c o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d 8 10 f p uc e l l u l a s e m l t h es u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n2 t h er e a c t i o n t e m p e r a t u r e5 5 c p h 4 8 t h e n t h ef i n a lh y d r o l y s i se f f i c i e n c yc o u l dr e a c ht o3 5 a l c o h o lc o u l d r e s t r a i n e dt h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i so fb a g a s s e t h ei n f l u e n c ew o u l db es t r e n g t h e n e dw i t ht h e i n c r e a s i n go ft e m p r e a t u r ea n d t h e c o n c e n t r a t i o no fa l c o h 0 1 k e y w o r d s c e l l u l a s e t r i c h o d e r m ar e e s e i s u b m e r g e df e r m e n t a t i o n b a g a s s e h y d r o l y s i s 1 1 1 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同毒 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名 日 期 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留 使用学位论文的规定 o 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允 许论文被查阅和借阅 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名 导师签名 日 期 渺 孑 柏 第一章绪论 第一章绪论 纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物 同时也是地球上数量最大的可再生 性资源 据估计 地球上纤维素中所蕴藏的能量大约相当于6 4 0 0 亿吨石油所含的能量 1 j 而且纤维素的可再生性是石油等矿物质能源所不可比拟的 目前 自然界中只有很小一部 分纤维素得到了有效的利用 绝大多数不仅被白自浪费 而且还会造成环境污染 纤维素 酶可以有效的处理纤维素 将其水解为可供酵母等微生物利用的小分子糖类 因此 利用 微生物生产的纤维素酶将纤维素转化为人类急需的能源 食物和化工原料 对于人类社会 解决环境污染 食物短缺和能源危机具有重大的现实意义 1 1 纤维素酶的国内外研究动态 纤维素酶是降解纤维素生成短链纤维素分子 纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称 自 从1 9 0 4 年 s e i l l i e r e 在蜗牛的消化液中发现了能分解天然纤维素的纤维素酶后 人类对其 的研究经历了三个发展时期 第一阶段是8 0 年代以前 主要工作是利用生物化学的方法 对纤维素酶进行分离纯化 但由于纤维素酶来源广泛 组分复杂 纯化甚为困难 故进展 缓慢 第二阶段是1 9 8 0 1 9 8 8 年 主要工作是利用基因工程的方法对纤维素酶的基因进行 克隆和一级结构的测定 t r i c h o d e r m ar e e s e i 的内切酶 e gi e g i i i 和外切酶 c b hi c b h i i c e l l u l o m o n a s f i m i 的内切酶 c e n a c e n b c e n c c e n d 和外切酶 c b h a c b h b c e x c l o s t r i d i u nt h e r m o c e l l u m 的内切酶 c e l a c e l b c e l c c e l d 的基因已被克隆和测 序 并在大肠杆菌 酵母茵等菌株中得到表达 第三阶段是利用结构生物学及蛋白质工程 的方法对纤维素酶分子的结构和功能进行研究 包括纤维素酶结构域的拆分 解析 功能 性氨基酸的确定 水解的双置换机制的确定 分子折叠和催化机制关系的探讨等 纤维素酶的应用领域非常广泛 前景很乐观 随着纤维素酶的工业化生产 其应用也 日益扩大 美 日等国家对纤维素酶的利用几乎渗透到一切以植物为原料的加工业 如饲 料 纺织 酿造 果汁与蔬菜汁加工 粮食加工 食品 造纸 中草药有效成分提取 沼 气生产 废水处理 原油开发 燃料酒精生产 环境工程以及植物基因工程 遗传工程和 细胞工程等各个生产领域 因此 纤维素酶的应用几乎无所不在 随着能源危机的加剧 天然纤维质原料酶解生产燃料酒精成为当前研究的热点 国内 外学者开展了很多这方面的研究 试图通过提高纤维素产生菌的产酶能力 利用廉价原料 降低纤维素酶生产成本 改善纤维质原料预处理工艺 提高酶解效率等方法降低燃料酒精 的生产成本 从而解决当前日益紧迫的能源危机问题 我国对纤维素酶的研究起步较晚 方向主要集中在纤维素酶在纺织 饲料 食品和酿 造等领域的应用 并取得了一定的进展 我国是一个纺织生产 消费 出口大国 据纺织 总会测算全国每年约需1 0 0 0 2 0 0 0 吨用于纺织行业 9 0 年代后建成了一些纤维素酶生产 厂 多采用固体发酵方式生产纤维素酶 由于菌种选育和生产技术进展不大 酶活力低 成本高等原因 我国的纤维素酶生产厂家一般规模较小 江南人学硕士学位论文 1 2 纤维素概述 1 2 1 纤维素的结构 纤维素分子是由成千的葡萄糖残基通过d 1 4 糖苷键连结而成的链状聚合体 几十个 纤维素分子平行排列组成小束 几十个小束则组成小纤维 最后由许多小纤维构成一条植 物纤维素 纤维素链之间通过氢键的缔合作用形成纤维素束 在密度大的地方平行排列 定向良好 形成纤维素的结晶区 密度小的地方定向变差 形成纤维素的无定形区 纤维 素的结晶程度对纤维素酶的敏感度有极大的影响 结晶度低 吸水性大 毛细孔大 易被 扭动 对酶的敏感性也就大 纤维素分子的经验式为 c 6 h l 0 0 5 n 其中n 是葡萄糖苷键数 目 通常称为聚合度 d p 纤维素分子的聚合度的变化很大 一般在8 0 0 01 0 0 0 0 个葡萄 糖残基左右 纤维素分子中含碳4 4 4 4 氢6 1 7 和氧4 9 3 9 结构如图1 1 所示 2 图1 1 纤维素分子结构示意图 f i g 1 1t h es t r u c t u r eo fc e l l u l o s em o l e c u l e 许多学者研究了纤维素分子链的构型 第一个典型的纤维素分子模型称为缨状纤维束 模型 该模型假设大分子都是延伸不弯曲的 方向和纤维束平行 在纤维束中会间隔的出 现一些分子间排列高度整齐的区段 称为结晶区 结晶区之间被一些无定形区所分裂 结 晶区的平均长度为5 0 0 a 自然纤维 或1 5 0 a 再生纤维 在一般的纤维素分子中 结晶 区和无定形区要交替1 0 次以上 另一个典型的模型称为折叠链纤维束模型 该模型认为 纤维素大分子折叠起来并沿纤维束轴排列 折叠起来的分子形成一个薄片 是纤维束的基 本单位 d p 约为1 0 0 0 结晶区和前一个模型相似 在纤维素大分子链中有一部分并没有 折叠起来 而是单股松散的依附在相邻两个片状结晶体上 片状组织分子链折叠部位的葡 萄糖苷键与直链上的1 3 葡萄糖苷键在结合强度上不同 折叠处的结合强度弱 纤维素分子 的无定形区在片状组织的两端 而结晶区在片状组织的中心部位u 1 1 2 2 植物纤维质原料的预处理 天然的植物纤维素原料 由于结晶度高 可及性差 直接酶解较为困难 可通过一定 的预处理方法降低其结晶度 增加可及度 从而提高其利用效率 4 1 常用的预处理方法有 物理法 物理一化学法 化学法 生物法以及各种方法的组合 1 2 2 1 物理方法 2 第一章绪论 常用的物理方法有机械破碎 包括粉碎 研磨等 微波处理 高温热水处理等 其 中 机械破碎是最常用的植物纤维素原料预处理方法 不同的机械破碎方式所需要的能量 及预处理效果都不一样 c a d o c h e 和l o p e z 的研究表明1 5 j 不同的机械破碎方式对预处理后不 同的粒径要求及不同的植物纤维素原料都将会影响机械破碎所需要的能量及预处理效果 微波是一种波长在1 0 0 c m 至l m m 范围内的电磁波 微波具有热效率高 易操作 方 便和无污染的特点 人们对于微波用于植物纤维素原料的预处理已经有一些研究 研究发 现微波可以改变植物纤维素原料的超分子结构 使纤维素结晶区尺寸发生变化1 6 j k i t c h a i y a 纠7 在对采用微波对植物纤维素原料进行预处理结果进行分析时认为 高温是微波对植物 纤维素原料进行预处理所必须的 微波对植物纤维素原料进行预处理的实质是高温下的酸 催化的自水解作用 微波对植物纤维素原料进行预处理的自水解产物对下游酒精发酵有抑 制作用 总的来说 单纯微波对植物纤维素原料进行预处理有一定的效果 但必须的高温 会导致有价值部分的损失 有待更进一步的改进 高温热水预处理是在高温高压下使用液态水对植物纤维素原料进行预处理的过程 高 温热水预处理植物纤维素原料可以除去其中部分木质素和几乎全部的半纤维素 增加其可 及度 从而提高其酶水解效率 8 但这种高温热水处理同样会导致有价值部分的损失 预 处理的自水解产物对下游酒精发酵也有一定的抑制作用 1 2 2 2 物理化学方法 物理化学预处理方法主要包括水蒸汽爆破 氨冷冻爆破和二氧化碳爆破等 其中 水 蒸汽爆破是将植物纤维素原料用1 6 0 2 6 0 的饱和水蒸气处理适当时间 然后连同水蒸 气一起从反应器中急速放出降压而爆破 使半纤维素分解为溶于水的低聚物 木质素中的 烯丙醚键断裂而生成溶于有机溶剂或稀碱的低分子物质 从而使纤维素周围的木质素与半 纤维素所构成的结合层遭到破坏 同时增加了纤维素的可及度 降低了结晶度 使得其水 解效率提高p j 氨冷冻爆破是利用液氨在相对较低的压力和温度下 将植物纤维素原料处理一定时 间 然后突然释放压力爆破原料 在此过程中液氨迅速汽化而产生骤冷 使植物纤维素结 构发生变化 增加其可及度 可以避免水蒸汽爆破中的高温引起的糖的变性及酒精发酵抑 制物的生成 氨冷冻爆破是一种较为理想的预处理方法 但液氨需回收利用 使其成本高 于水蒸汽爆破与二氧化碳爆破 1 0 1 1 j 二氧化碳爆破的原理与操作过程类似于前两者 其成本高于水蒸汽爆破 低于氨冷冻 爆破 综合研究者的结果 二氧化碳爆破在超临界状态下进行要明显优于在亚临界状态下 进行 1 2 1 3 1 2 2 3 化学方法 化学方法主要有酸水解 碱水解 氧化剂水解等 稀酸条件下的酸水解是一种常用的 较为有效的植物纤维素原料预处理方法 1 4 1 5 1 一般在较温和的条件下处理植物纤维素原料 不能使其中的木质素发生降解 但在高温下处理时 会导致部分纤维素的水解 另外 酸 处理后的植物纤维素原料需要中和后才能用于菌体生长或酶解 因此处理费用较高 碱水解是另一种常用的较为有效的植物纤维素原料预处理方法 植物纤维素的碱水解 3 江南大学硕士学位论文 可以降低植物纤维素原料中的木质素的含量 通过皂化作用使纤维素 木质素与半纤维素 之间的紧密结构遭到破坏 降低植物纤维素原料的聚合度与结晶度 同时可以使植物纤维 素原料发生溶胀作用 增加可及度 从而提高水解效率 l6 1 7 j 碱水解一般采用稀的氢氧化 钠水溶液 对于氢氧化钠碱处理后的废液必须要做进一步的处理 这样同样会增加预处理 的成本 但碱水解处理可以最大限度的除去植物纤维素原料中的木质素 减少木质素与纤 维素酶的非选择性吸附 从而显著提高酶水解效率 其他常用的植物纤维素原料化学预处理方法还有 氨解和各种氧化剂氧化处理 i y e r 等 l8 通过氨的回收过滤循环工艺可以脱去植物纤维素原料中6 0 8 0 的木质素 使其酶解 效率增加 v i d a l 和m o l i n i e r 1 9 采用臭氧处理麦草 可以除去6 0 的木质素 使水解效率提 高5 倍 沈金龙等用1 的过氧化氢处理杨树叶 使酶解得率提高了5 6 2 1 2 2 4 生物方法 对生物法预处理植物纤维素原料 研究最多的是白腐菌分解植物纤维素原料中的木质 素 进而提高植物纤维素原料的水解效率 2 生物法进行植物纤维素原料预处理具有能耗 低 无污染 条件温和等优点 但同时又具有周期长 菌体会利用部分纤维素与半纤维素 使植物纤维素原料的有用成分损失 随着现代生物技术的发展 特别是基因工程技术的发 展 生物方法预处理植物纤维素的优势会逐渐显现出来 1 2 2 5 上述方法的综合 在实际对植物纤维素原料进行预处理时 单一的处理方法很难达到很好的效果 需要 将上述方法结合起来用于纤维质原料的预处理 已取得更为有效的处理效果 r a h a y u 等 2 2 采用电子辐射与碱水解进行联合预处理植物纤维素原料 可以显著提高水解效率 n i c o l e t t a 等 2 3 j 先对麦草进行机械破碎 然后进行酸水解除去半纤维素 碱处理除去木质素 剩下的 纤维素基本上可以完全水解 同时也有效的回收了半纤维素水解后的木糖 1 3 纤维素酶的概述 1 3 1 纤维素酶的组分 早在1 9 5 0 年r e e s e 等人就提出了c 1 c x 的概念 经过3 0 多年来的研究 特别是近年 来的蛋白质分离及纯化技术的不断改进 分离得到的纤维素酶越来越多 每种酶作用的机 理越来越明确 现在已确认纤维素酶是一套复杂的酶系 从降解纤维素作用来说 它主要存在着三种组成 各具特定的降解功能 2 4 1 c l 酶 e x o 一1 4 1 3 d g l u c a n a s e e c 3 2 1 9 1 简称c b h 它是一种外切酶 作用 于无取代基的还原端 依次水解p 1 4 糖苷键 以二糖形式切断 2 c x 酶 e n d o 1 4 1 3 d g l u c a n a s e e c 3 2 1 4 简称e g 它是一种内切酶 作用 于纤维素分子内部的非结晶区 随机水解b 1 4 糖苷键 将长链纤维分子截断 产生大量非 还原末端的小分子纤维素 3 3 葡萄糖苷酶 b g l u c o s i d a s e e c 3 2 1 2 1 简称1 3 g 它水解纤维二糖和短链的纤 维寡糖 生成葡萄糖 对纤维二糖和纤维三糖的水解速度较快 随着葡萄糖聚合度的增加水 解速度下降 4 第一章绪论 纤维素酶分子大小范围很广 内切酶分子量介于2 3 1 4 6 k d 之间 外切酶为3 8 1 1 8 k d b 一葡萄糖苷酶为9 0 1 0 0 k d 胞内 和4 7 7 6 k d 胞外酶 但纤维粘细菌内切 型酶分子量小至6 3 k d 蚕豆腐皮镰胞的b 一葡萄糖苷酶竞高达4 0 0 k d 多数真菌和少数 细菌的纤维素酶都受糖基化 所含碳水化合物的比例不同在很大程度上决定了酶的多形 性 根本上表现为分子量的差别 1 3 2 纤维素酶的作用机理 纤维素的酶解是一个复杂的生化过程 其作用机制的研究一直受到人们的重视 许多 学者提出了各种假说 2 习 g i l l i g a n 和r e e s e 首先证明真菌纤维素酶在消化纤维素时具有协同 性 他们发现纤维素复合酶对w a l s e t h 纤维素 部分降解的酸化底物 的水解程度大于单 组分酶 m a n d e l s 和l i 等证明内切葡聚糖酶和c l 酶的协同作用能够影响抗性更大的底物 如棉花和微晶纤维素的水解 此后这种内切一外切酶间的协同性在很多菌种的纤维素酶系 中得到证实 w h i t e 和b r o w n 用电子显微镜证明了内切一外切酶组分间在结晶纤维素水解时 的这种协同作用 f a t e r s t a m 等发现两种外切酶 c b hi 和c b hi i 联合降解结晶纤维素 的速度和程度是单组分酶的二倍 w o o d 在研究t r i c h o d e r m ar e e s e i 和p e n i c i l l i u m f u n i c u l o s u m d e 的纤维素酶时 发现培养滤液中的两种外切酶在液化微晶纤维素和棉纤维时具有协同性 对于这种内切一外切协同性 e x o e x o s y n e r g i s m 可能的解释是两种外切酶具有不同的底物 立体特异性 每一种酶都进攻底物中可能存在的两种不同类型的非还原末端中的一种 当 一种外切酶从某种类型的非还原末端切下一个纤维二糖单位后 暴露出另一种类型的非还 原末端 被在邻近链上的第二种立体特异性的外切酶切下纤维二糖单位 这种邻近链上的 两种酶的成功运作就可解释观察到的协同性 目前 人们普遍接受纤维素酶水解纤维素的协同作用理论 即内切葡聚糖酶首先进攻 纤维素的结晶区 形成外切纤维素酶需要的新的游离末端 然后外切纤维素酶从多糖链的 非还原端切下纤维二糖单位 p 葡萄糖苷酶水解纤维二糖单位 形成葡萄糖 协同作用强 度 降解率 大于各单一酶作用强度的总和 同一发酵酶产生的单一酶种往往不能简单叠 加以获得协同效果 由c x 酶作用产生的片段更容易受c l 酶的作用 寡糖片段被d 葡萄糖 苷酶水解成单糖 1 3 3 纤维素酶的来源 纤维素酶来源非常广泛 昆虫 软体动物 原生动物 细菌 放线菌 真菌等都能产 生纤维素酶 细菌产生的纤维素酶的量较低 主要是e g 少数细菌能分泌外切葡聚糖酶 大多数细菌的e g 对结晶纤维素没有活性 而且这些酶主要是胞内酶或吸附于细胞壁上 很 少能分泌到细胞外 增加了提纯的难度 在工业上很少采用 目前研究较多的是纤维素粘 菌属 生孢纤维粘菌属 纤维杆菌和芽孢杆菌属 放线菌中的分枝杆菌和原放线菌几乎不 产纤维素酶或产量极低 产量稍高的主要是黑红旋丝放线菌似c t i n o m y c e sm e l a n o c y c l u s 玫 瑰色放线菌口c t i n o m y c e sr o s e o d i a s t a t i c u s h 纤维放线菌口c t i n o m y c e sc e l l u l o s a e 目前用于 生产纤维素酶的微生物大多属于真菌 研究较多的有木霉属 曲霉属 青霉属 根霉属和 漆斑霉属 2 6 1 其中尤以木霉属的产量居多 里氏木霉 康氏木霉 t r i c h o d e r m ak o n i n g i i 矛n 绿 5 江南大学硕士学位论文 色木霉 t r i c h o d e r m av i r i d e 等是木霉属中酶活性较高的菌种 真菌产生三类纤维素酶 能分 泌到菌体外 一般不聚集形成多酶复合体 但相互发生强烈的协同作用 目前已制成制剂 的有绿色木霉 黑曲霉 a s p e r g i l l i u sn i g e r 镰刀霉 f u s a r i u m 够 拟青霉 p a e c i l o m y c e ss p 和斜卧青霉 p e n i c i l l i u md e c u m b e n s 等的纤维素酶 酵母虽然不产纤维素酶 但可以利用酵 母表达系统表达纤维素酶基因 其产物高度糖基化 经正确加工修饰后可直接分泌到培养 基中 表达水平高 如用酵母表达的c b hi i e gi 的产量可达1 0 0 m g l 以上 并具有正常 的生物学活性 1 3 4 纤维素酶的诱导和分泌 一般认为 纤维素酶是一种诱导酶 j a c o b 和m o n o d 27 j 证明诱导酶的形成是新酶蛋白 分子的合成 而不是原酶的激活 n i s i z a w a 等瞄剐用双标记同位素法令人信服地证明绿色木 霉纤维素酶的诱导形成是酶蛋白新合成的过程 p a r d e 等 2 9 认为静止细胞的诱导培养法是研 究酶的诱导形成的有效方法 在营养源之外 添加适当的诱导剂可以促进酶的生成 从而 提高纤维素酶的产量 m a n d e l s 和r e e s e 等 3 0 3 1 1 人认为 在用纤维素作为碳源培养真菌时 纤维素酶的真正诱导剂是纤维素的可溶性水解产物 尤其是纤维二糖 但纤维二糖的作用 是复杂的 这是由于纤维二糖能迅速为细胞利用 易产生葡萄糖效应 抑制纤维素酶的形 成 3 引 在绿色木霉的纤维素酶形成中 槐糖是目前知道的不含p 1 4 糖苷键的高效诱导物 在培养物中添加1 0 3 1 0 巧m o l l 的槐糖 能显著提高绿色木霉和拟康氏木霉的纤维素酶形 成 但是槐糖的诱导作用又受葡萄糖 甘油及放线菌素d 等物质的抑制 此外 l 山梨糖和乳糖也是纤维素酶形成的良好诱导剂 王冬等1 3 3 报导在0 5 葡萄 糖 m a n d e l s 盐培养液中添加浓度为0 5 的l 山梨糖 可使里氏木霉和拟康氏木霉内切 外 切葡聚糖酶合成速率在2 天内提高4 倍 与此同时b 一葡萄糖苷酶的合成没有明显变化 l 山梨糖能明显抑制菌丝生长 但对葡萄糖的吸收没有影响 对菌丝分泌纤维素酶的机制影 响不大 其对酶合成的促进可能主要是通过降低了菌丝体的生产速率 m a n d e l s 发现 3 0 结 构与纤维二糖类似的三聚糖也是较好的纤维素酶诱导剂 不过这些诱导物只是在阐明纤维 素酶诱导特性的基本研究中有价值 迄今为止 尚未见到用其来获得大量纤维素酶的报道 此外 纤维素酶的分泌与细胞膜透性有密切关系 许多表面活性剂能影响膜的透性 继而影响酶的分泌 r e e s e 矛l l m a g u i r e t 3 4 j 认为表面活性剂的作用之一 是改变细胞膜的透性 使膜失去选择性的透性 或者说 让细胞发生轻微的中毒 他们认为表面活性剂的另一个 作用可能是使纤维二糖易与膜上结合的酶 转移酶 接近 从而形成诱导剂 来刺激酶的合成 1 3 5 纤维素酶的生产 纤维素酶的生产和其它酶制剂一样 主要有固体发酵和液体深层发酵两种 国内外在 这方面做了许多有价值的工作 1 3 5 1 固体发酵生产纤维素酶 固体发酵法是以玉米等农作物秸秆为主要原料 其投资少 工艺简单 产品价格低廉 目前国内绝大部分纤维素酶生产厂家均采用该技术生产纤维素酶 张苓花等 35 以康氏木霉 为菌种进行固体发酵 首先对菌种进行了诱变 并利用酵母菌与康氏木霉间的微生态关系 6 第一章绪论 进行混合发酵 防止了 白毛菌 的污染 提高了酶活力 张礼星 36 j 利用里氏木霉 以啤 酒厂的废糟为原料 添加适量麸皮和稻草粉为培养基进行了固体发酵研究 段金柱等1 3 7 对绿色木霉产纤维素酶固体发酵和液体发酵进行了比较研究 结果显示 固体发酵产率比 液体发酵产率高2 5 且酶组分比例高于液体发酵 丁重阳等 酬利用里氏木霉进行箱式固 态发酵生产纤维素酶 在浅盘固态发酵的研究基础上对固态发酵的规模进行了适当的放 大 并通过控制不同发酵阶段的温度达到较高的酶活 李宏强等 3 圳研究了一种新式固态发 酵反应器 压力脉动固态发酵反应器内环境参数的周期性变化以及这些周期性的环境 刺激对于固态培养的斜卧青霉发酵产纤维素酶的影响 数据显示外界周期刺激不仅能增加 菌体的生物量 同时能增加其代谢活性 使酶活提高了一倍 曾莹等1 4 0 j 采用固态发酵方式 培养木霉t 5 研究以油菜籽壳为主要原料生产饲用纤维素酶的最佳工艺条件 有望为畜牧 业 养殖业发展做出贡献 也为综合开发利用油菜籽壳这一可再生资源开辟新途径 还可 降低纤维素酶生产成本 t a os u n 等 4 l j 以绿色木霉s l 为菌种 采用固体发酵 通过调节气 压使发酵的c m c 酶活达到了1 4 0 0 i u g 而浅盘发酵的对照组 其酶活只有4 5 0i u g 发 现通过气压调节 可以使纤维素酶产量提高 这可能与气压调节可以改变菌株膜的运动 进而有利于产酶有关 g u t i e r r e z c o r r e a 等1 4 2 j 以经碱处理的甘蔗渣为主要碳源 研究了里氏 木霉l m u c 4 e 1 和黑益霉a t c c l 0 8 6 4 共同发酵产纤维素酶的条件 王振宇等1 4 3 j 采用固态 发酵试验 以c m c 酶活力和滤纸酶活力为指标 筛选组建二元混菌体系 并通过正交试 验 对混菌体系纤维素酶固态发酵条件进行了研究 研究发现二元混菌体系黑曲霉和绿色 木霉混合发酵时纤维素酶活力较单菌发酵大幅度提高 并在此基础上确定了最佳产酶条件 1 3 5 2 液态深层发酵生产纤维素酶 固体发酵法存在着根本上的缺陷 以秸秆为原料的固体发酵法生产的纤维素酶很难提 取 精制 目前我国纤维素酶生产厂家只能采用直接干燥粉碎得到固体酶制剂或用水浸泡 后压滤得到液体酶制剂 其产品外观粗糙且质量不稳定 杂质含量高 因此 随着液体发 酵酶工艺的发展及菌种性能的提高 采用液体发酵法生产纤维酶素是必然趋势 国内外许 多学者在这方面做了大量的工作 崔凌飞m j 等选用青霉菌研究了纤维素酶二级和三级液体 培养的条件 确定了种子液和发酵液的配方 为纤维素酶三级液体深层发酵的工业生产提 供了工艺路线和参数 邓毛程等 45 j 研究了1 0 l 的通气机械搅拌发酵罐中p h 值 温度和溶 解氧对一株绿色木霉液态深层发酵产纤维素酶的影响及其控制 通过优化这些参数 最终 的酶活力提高了3 倍左右 余晓斌等 4 6 j 利用响应面法对里氏木霉w x 1 1 2 液体发酵产纤维 素酶的培养基进行了优化 首先用快速等高路径逼近最大产酶区域 然后根据快速登高法 的实验结果进行响应面试验 运用逐步回归分析法获得各因子的最优回归方程 并分析了 各因子间的交互效应 最后通过岭脊分析确定了滤纸酶活达最大值时的最优培养基 d o m i n g u e s 等 47 研究了里氏木霉r u t c 3 0 在液体摇瓶培养时的形态 也探讨了培养基组成 和接种量对菌丝形态和纤维素酶产量的影响 1 3 5 3 固定化酶和细胞 除固体发酵和液体深层发酵外 有人还对纤维素酶的固定化进行了研究 王亚林等 4 驯 用海藻酸钙凝胶包埋法制备木霉固定化细胞 研究了固定化条件和培养条件对固定化细胞 7 江南