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类黄酮抗氧化剂构效关系的电化学研究 摘要 类黄酮化合物大多是天然抗氧化剂，能够消除体内过剩的超氧自由基，具 有定的抗病毒、抗肿瘤，抗炎，抗衰老活性，近年来得到了国内外研究者的 广泛关注。本文以石墨一石蜡碳糊电极( g w e ) 为工作电极，采用循环伏安法、微 分脉冲伏安法和现场紫外可见薄层光谱电化学方法研究了桑色素的电氧化机理 及与d n a 的相互作用；通过对桑色素及芦丁等多种类黄酮化合物电化学氧化 与h 2 0 2 引发的化学氧化的动态薄层u v - v i s 光谱的比较，探讨了抗氧化活性的 效构关系；以木犀草素和槲皮素为例，采用循环伏安法和紫外可见光谱电化学 方法，从分子结构上，揭示了c 环3 - o h 对抗氧化活性的促进作用。 电化学测试结果表明，桑色素在石墨石蜡碳糊电极上有较强的吸附。在较 低电势下有一对准可逆的氧化还原峰，在更正电势范围( 析氧前) 出现第二个 氧化电流峰。第一步电氧化过程遵循e c 机理，是在桑色素b 环4 - o h 位置上 失去1 e - 1 h 十产生苯氧自由基中间体，通过随后不可逆反应转化为稳定的最终产 物。对桑色素与d n a 的相互作用进行电化学测试的结果表明d n a 的加入引起 了桑色素的氧化还原峰电流降低，但峰电位却没有发生变化，说明二者可能生 成了一种非电活性的超分子化合物，使得溶液中游离的桑色素量减少。 通过比较桑色素及芦丁等多种类黄酮化合物电化学氧化和h 2 0 2 引发的化 学氧化动态薄层u v - v i s 光谱，发现在电化学氧化时特征吸收带发生“二带合 一 变化的类黄酮化合物，都能够被h 2 0 2 氧化，并发生同样的光谱变化；而 其它被测试的类黄酮化合物，不同于电氧化时的光谱变化，用h 2 0 2 氧化时光 谱变化不明显，尤其在酸性介质中，几乎没有发生氧化作用。前一类化合物具 有结构上的共同特征，包括3 - o h ，2 3 双键，4 羰基和b 环4 位上的酚羟基等， 这些结构特征是发生“二带合”光谱变化所必须的，对促进抗氧化活性有明 显作用。 以木犀草素和槲皮素这一对典型的黄酮和黄酮醇化合物为例，采用循环伏 安法和紫外可见光谱电化学方法，从反应机理探讨了这两个亚类化合物抗氧化 活性差异的内在原因。结果表明，木犀草素发生准可逆的等电子质子氧化还原 反应，而槲皮素遵循等电子质子氧化一不可逆化学转化机理，形成稳定的大共轭 结构，带动了氧化步骤的进行，从而增强了抗氧化活性。 关键词：类黄酮；抗氧化活性；h 2 0 2 ；光谱电化学；构效关系 e l e c t r o c h e m i c a ls t u d yo fs t r u c t u r e - a c t i v i t y r e l a t i o n s h i po f f l a v o n o i da n t i o x i d a n t s a b s t r a c t n a t u r a lf l a v o n o i da n t i o x i d a n t sh a v eg o tg r e a ta t t e n t i o ni nt h ep a s td e c a d ey e a r s ， b e c a u s et h e yc a ns c a v e n g es u p e r f l u o u ss u p e r o x i d ef r e er a d i c a l si nh u m a nb o d ya n d s h o wp h a r m a c o l o g i c a le f f e c t si na n t i v i r u s ，a n t i t u m o u r ，a n t i i n f l a m m a t i o na n d a n t i - s e n i l i t y , e t c i nt h i st h e s i s ，c y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) ，d i f f e r e n t i a lp u l s e v o l t a m m e t r y ( d p v ) a n di ns i t us p e c t r o e l e c t r o c h e m i c a lt e c h n i q u e sw e r e u s e dt o i n v e s t i g a t et h ee l e c t r o - o x i d a t i o nm e c h a n i s ma n dt h es t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p o fs o m ef l a v o n o i d s ，i n c l u d i n gt h ee l e c t r o o x i d a t i o no fm o r i na n di n t e r a c t i o nw i t h d n a ，c o m p a r i s o no ft h ee l e c t r o o x i d a t i o na n dc h e m i c a lo x i d a t i o nb yh 2 0 2f o rt w o g r o u p so ff l a v o n i o d s ，a n dc o m p a r i s o ni ne l e c t r o o x i d a t i o nm e c h a n i s mo fl u t e o l i n a n dq u e r c e t i n ns i t uu v - v i ss p e c t r o e l e c t r o c h e m i c a lm e a s u r e m e n t sw e r ec a r r i e d o u ti nal o n g - o p t i c a l p a t ht h i n l a y e re l e c t r o l y t i cc e l l ， t h ev o l t a m m e t r i cd a t af o rm o r i ni n d i c a t e dt h a tt h e g r a p h i t e w a xp a s t e e l e c t r o d e ( g w e ) d i s p l a y e dg r e a tp o w e rt oa d s o r bm o r i n aw e l l s h a p e do x i d a t i o n p e a ko f4 - h y d r o x ya tb r i n go c c u r r e df i r s t l yi nt h el o w e rp o t e n t i a l sa n das e c o n d o x i d a t i o ni n r e l a t i v e l yp o s i t i v ep o t e n t i a l s t h e f i r s to x i d a t i o nw a s a q u s a s i - r e v e r s i b l er e a c t i o ni n v o l v i n g1 一e l e c t r o na n d1 一p r o t o n ，p r o b a b l yg e n e r a t i n ga p h e n o x yr a d i c a li n t e r m e d i a t e t h el a t t e rf u r t h e rt r a n s f o r m e di n t ot h ef i n a ls t a b l e p r o d u c t s a d d i t i o no fd n a i nt h em o r i ns o l u t i o nc a u s e dt h ed e r e a s ei nt h ec u r r e n t o fr e d o xp e a k s ，w i t h o u tt h ec h a n g ei nt h ep e a kp o t e n t i a l t h i se f f e c to fd n a s u g g e s t e dt h ef o r m a t i o no fs u p e r m o l e c u l a rc o m p o u n d sw i t h o u te l e c t r o c h e m i c a l a c t i v i t y ，l e a d i n gt ot h ed e c r e a s ei nt h ea m o u n to fm o r i ni nf r e es o l u t i o n s o m ef l a v o n i o da n t i o x i d a n t sw e r e c o m p a r a t i v e l yi n v e s t i g a t e d f o rt h e s t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i pb yr e c o r d i n g t h ed y n a m i c t h i n l a y e r u v - v i s s p e c t r o s c o p yd u r i n gt h e i re l e c t r o o x i d a t i o no rc h e m i c a lo x i d a t i o nb yh 2 0 2 o n e g r o u po ff l a v o n i o d ss u c ha sm o r i nc o u l db ee a s i l yo x i d i z e db yh 2 0 2a n ds h o w e dt h e s a m es p e c t r a lc h a n g ea si ne l e c t r o o x i d a t i o n ；b o t ht h ee l e c t r o o x i d a t i o na n dt h e c h e m i c a lo x i d a t i o nl e dt ot h em e r g e n c eo ft h et w oc o n ju g a t e ds y s t e m sp r e s e n ti nt h e p a r e n tc o m p o u n d si n t o am o r es t a b l ea b c r i n gu n i t e dc o n j l u g a t e ds y s t e m h o w e v e r ，t h eo t h e r ss u c ha sr u t i nw e r eh a r d l yo x i d i z e db yh 2 0 2w i t hl i t t l es p e c t r a l c h a n g ed i f f e r e n tf r o mt h a ti ne l e c t r o o x i d a t i o n ，e s p e c i a l l yi na c i d i cm e d i u m t h e f o r m e rc o m p o u n d sh a v ec o m m o ns t r u c t u r ef e a t u r e s ，i n c l u d i n g4 o h ，3 一o h ，2 - 3 d o u b l eb o n da n d 4 - c a r b o n y l ，a l l o fw h i c ha r e i n d i s p e n s a b l e f o r t h es t a b l e a bcr i n gu n i t e dc o n j u g a t e ds y s t e mi nt h eo x i d a t i o np r o d u c t s a so n eo ff l a v o n o l sw i t h3 - o hg r o u pi nt h e i rc h e m i c a ls t r u c t u r e s ，q u e r c e t i n ( 3 , 5 ，7 ，3 ，4 - p e n t a h y d r o x y f l a v o n e ) s h o w sm u c hs t r o n g e ra n t i o x i d a n ta c t i v i t yt h a n d o e si t s c o r r e s p o n d i n gf l a v o n el u t e o l i n ( 5 , 7 ，3 ，4 - t e t r a h y d r o x y f l a v o n e ) c y c l i c v o l t a m m e t r ya n di n s i t uu v - v i ss p e c t r o e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o dw e r eu s e dt o i n v e s t i g a t et h ee l e c t r o o x i d a t i o np r o c e s s e so fb o t hf l a v o n o i d s ，f o rt h e ，p u r p o s eo f d i s c o v e r i n gt h er e a c t i o nm e c h a n i s mb yw h i c ht h e3 - o hg r o u pp r o m o t e st h e a n t i o x i d a n ta c t i v i t y t h er e s u l t si n d i c a t e st h a tb o t hc o m p o u n d sw e r eo x i d i z e dt ot h e c o r r e s p o n d i n go r t h o q u i n o n e sv i a2 e 一2 h + r e a c t i o n s ，a n dt h e no n l yt h eq u e r c e t i n o - q u i n o n ew a sf u r t h e ri s o m e r i z e dt ot h em o r es t a b l eu n i t e dc o n j u g a t e ds t r u c t u r e ，i n t h ep r e s e n c eo ft h e3 一o hg r o u p t h i ss u b s e q u e n tc h e m i c a lt r a n s f o r m a t i o ng i v e sa n a d d i t i o n a lc o n t r i b u t i o nt ot h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t y k e yw o r d s ：f l a v o n o i d ；a n t i o x i d a n ta c t i v i t y ；h 2 0 2 ；s p e c t r o e l e c t r o c h e m i s t r y ； s t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p v 碳糊电极 循环伏安法 微分脉冲伏安法 富集时间 富集电势 符号清单 g w e c v d p v f e c 插图清单 图1 1 类黄酮化合物的基本结构1 图2 1g w e 电极示意图10 图2 2 桑色素在g w e 电极上的c v 曲线1 1 图2 3 不同扫速下桑色素在g w e 电极上的c v 曲线一1 2 图2 4 不同p h 值下桑色素在g w e 电极上的c v 曲线1 3 图2 5 桑色素氧化反应机理14 图2 6 不同富集时间下桑色素在g w e 电极上的c v 曲线1 4 图2 7 不同富集电势下桑色素在g w e 电极上的c v 曲线1 5 图2 8 不同浓度桑色素在g w e 电极上的c v 曲线1 6 图2 9 不同富集时间下桑色素在g w e 电极上的d p v 曲线1 6 图2 1 0 不同富集电势下桑色素在g w e 电极上的d p v 曲线1 7 图3 1d n a 的标准曲线2 0 图3 2 不同p h 条件下加d n a 与不加d n a 的c v 曲线比较2 1 图3 3 峰电位与扫速对数的线性关系2 2 图3 4 不同p h 值桑色素和d n a 相互作用的紫外光谱图2 3 图3 5 加入不同比例d n a 的桑色素c v 曲线2 4 图3 6 加入不同比例的d n a 后桑色素溶液的d p v 曲线2 5 图4 11 0 种类黄酮化合物的结构式2 9 图4 2 光谱电化学分析系统实验示意图2 9 图4 3 桑色素恒电势氧化的动态薄层u v v i s 光谱3 1 图4 4 杨梅素恒电势氧化的动态薄层u v - v i s 光谱一3 2 图4 5 槲皮素恒电势氧化的动态薄层u v - v i s 光谱3 2 图4 6 山奈酚恒电势氧化的动态薄层u v - v i s 光谱3 3 图4 7 桑色素h 2 0 2 化学氧化的动态薄层u v - v i s 光谱3 3 图4 8 杨梅素h 2 0 2 化学氧化的动态薄层u v - v i s 光谱3 4 图4 9 槲皮素h 2 0 2 化学氧化的动态薄层u v v i s 光谱3 4 图4 1 0 山奈酚h 2 0 2 化学氧化的动态薄层u v - v i s 光谱3 5 图4 1 1 漆黄素h 2 0 2 化学氧化的动态薄层u v - v i s 光谱3 5 图4 1 2 芦丁恒电势氧化的动态薄层u v s 光谱3 6 图4 1 3 木犀草素恒电势氧化的动态薄层u v - v i s 光谱3 7 图4 1 4 芦丁h 2 0 2 化学氧化的动态薄层u v - v i s 光谱3 7 图4 1 5 木犀草素h 2 0 2 化学氧化的动态薄层u v v i s 光谱3 8 图4 1 6 儿茶素h 2 0 2 化学氧化的动态薄层u v v i s 光谱3 8 图4 1 7 染料木素h 2 0 2 化学氧化的动态薄层u v v i s 光谱3 9 图4 1 8 黄豆甘元h 2 0 2 化学氧化的动态薄层u v - v i s 光谱3 9 图5 1 不同p h 下木犀草素( a ) 和槲皮素( b ) 的循环伏安图4 2 图5 2 不同扫速下木犀草素( a ) 和槲皮素( b ) 的循环伏安曲线4 3 图5 3 木犀草素( a ) 和槲皮素( b ) 的阴极阳极峰电流比与扫速的关系4 4 图5 4 木犀草素( a ) 和槲皮素( b ) 恒电势氧化的动态薄层u v - v i s 光谱4 4 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及所取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得合肥工业大学或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示感谢。 oj乏 学位论文作者签名：纫胁承劣签字日期旁。j 尸年。伊月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金月巴王些太堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和借阅。本人授权盒目墨王些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复印手段保存、编入学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：绨织豸乞房 导师签名： 签字日期山，尸年。乍月。f 日 签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 佑遗吹 吓年r 月刁日 电话： 邮编： 致谢 在三年的研究生学习期间，我的导师何建波教授给予了我细致入微的指导。 在何老师的辛勤指导下，才有了本论文的完成。何老师深厚的学术修养、严谨 治学的态度、开拓创新的精神不仅在读研期间深深地影响着我，更将是我以后 的生活和工作的学习榜样。在此谨向何老师表示我由衷的感谢! 同时感谢本实验室的周园、贡晓洁、周虎林、袁圣杰、孟凡顺、f f l 晶晶、 祁方、陈俊聪、胡欣然、韦玮等同学，感谢你们在我完成课题实验期间给予的 帮助。感谢我的父母，长期以来对我的关心、理解与支持。 感谢国家自然科学基金( n o 2 0 7 7 6 0 3 3 ) 对研究工作的经费支持。 感谢精心评阅、评议论文的各位老师! 作者：独家启 2 0 0 9 年4 月17 第一章绪论 1 1 类黄酮化合物的概述 现代医学研究表明，内源性抗氧化体系出现故障或机体处在一些病理或恶 劣的生理环境下( 吸烟，紫外辐射，高脂肪摄取等) ，氧自由基大量产生在错误 的时间及部位，其代谢就会出现失衡，导致细胞损伤，引起心脏疾病、癌症和 衰老。因此摄取一些抗氧化物质协助体内维持氧代谢的平衡对防止疾病的发生 和减少生命过程中不断积累起来的氧化损伤是十分有益的。出于目前使用的 合成抗氧化剂如丁基甲氧基苯酚( b h a ) 、丁基甲基苯酚( b h t ) 等已被发现有一定 的毒性，人们把注意力转移到天然抗氧化剂上。其中类黄酮化合物便是以纯天 然、活性高和功能多等特点倍受人们的关注，它们广泛的存在于人类食物中如 绿色蔬菜、水果、橄榄油、豆油、红酒、巧克力和茶中 2 - 5 。 1 1 1 类黄酮化合物的理化性质 类黄酮化合物多数为晶体、有色，少数( 如黄酮苷类) 为无定形粉末。游 离的苷元中，除二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄豆苷元烷及黄豆苷元烷醇有旋光性 外，其余则无。苷类由于在结构中引入糖的分子，故具有旋光性，且多为左旋。 其具有较好的水溶性，因具有酚羟基团，故显一定酸性，较易溶于碱液中。类 黄酮化合物的基本结构为c 6 c 3 c 6 ( 如图1 1 ) 。 3 o 图1 】类黄酮化合物的基本结构 在自然界中既存在游离苷元的形式，也有与不同糖结合形成的苷。由于类 黄酮化合物的分子结构中具有数量不等的酚羟基而有较强的还原性，因此可以 作为氢供体来还原自由基。这样，类黄酮化合物便成为很有潜力的抗氧化剂 6 - 9 j 。 1 1 2 类黄酮化合物的药理性质 类黄酮化合物具有扩张血管的作用，可以降低血管内皮细胞羟脯酸代谢， 使内壁的胶原或胶原纤维含量相对减少，利于防止血小板粘附凝集和血栓形成， 有利于防治动脉粥样硬化，对冠心病有良好的预防和抑制作用叽坦j 。类黄酮化 合物抗癌、防癌的作用，主要是通过其抗自由基作用、直接抑制癌细胞生长、 抗致癌因子、抑制血管生长、提高机体免疫力而实现【i3 j ；类黄酮物质能产生抗 癌作用的生物活性包括对酪氨酸激酶的抑制作用、类激素作用、抗增生效应、 抗扩散效应、抗氧化作用和免疫功能等。由于生物类黄酮的抗氧化和清除自由 基能力，它能有效地阻止脂质过氧化引起的细胞破坏1 1 4 ”j ；生物类黄酮能够促 进胰岛b 细胞的恢复，降低血糖和血清胆固醇，改善糖耐量，对抗肾上腺素的 升血糖作用【l6 i ，同时它还能够抑制醛糖还原酶作用，因此可以治疗糖尿病及其并 发症。除此之外，类黄酮还具有保护神经系统【1 7j ，免疫激活，抗菌抗病毒，保 护氧化损伤的神经管畸形细胞作用f 1 引，抗化学性肝损伤【1 引，调节脂质代谢【2 0 1 ， 抗白血病，吸收紫外辐射，抗过敏，活血化淤1 2 2 】等作用。类黄酮化合物的药 理作用极其广泛，且每一种药理作用都有多种机制参与，很多学者都在致力于 这方面的研究。 1 1 3 类黄酮化合物的抗氧化剂构效关系 在类黄酮化合物作为抗氧化剂的作用中，通过酚羟基与自由基反应生成较 稳定的半醌式自由基，从而终止自由基链式反应是其最主要的机制。抗氧化能 力与其结构，特别是与芳香环得失电子有关。事实上，当这些物质与自由基反 应失电子或供氢时，它们产生一种新的基团，此基团通过芳香核的自旋作用被 稳定下来，因此氧化链式反应的传导过程被中断，物质的氧化被延缓，因而类 黄酮化合物抗氧化能力的强弱与它们形成基团的稳定性正相关。 ( 1 ) c 2 ，3 双键的作用 h u s a i n 2 3 j 研究表明，类黄酮物质抗氧化活性不依赖于c 2 ，3 间的双键，但 m o r a 2 4 】研究指出，芹菜素c 2 ，3 双键氢化为柑桔素后，抗氧化活性从7 4 5 下 降到4 4 ，双键对活性影响较大。w a n g ”】研究槲皮素结构活性关系时也指出 c 2 ，3 双键对保护细胞抵抗h 2 0 2 诱导氧化及c a 2 十功能紊乱有重要作用。从理论 分析，c 2 ，3 双键延长了共轭体系，有利于b 环失电子后自旋形成更稳定的自 由基，中断链式反应。而一旦c 2 ，3 双键被氢化后，缩短了共轭体系，改变了分 子的平面结构，降低了羟基的作用，不利于类黄酮物质的抗氧化活性。 ( 2 ) a 环的作用。 类黄酮化合物a 环也常被羟基化，部位多在c 5 和c 7 位。a 环可与过渡金 属络合，从而在抗氧化活动中发挥作用。以前人们普遍认为a 环是不易氧化的， 因此不可能直接参与抗氧化反应。但近来的一些研究表明，a 坏在抗氧化、清 除自由基过程中可能也起一定的作用。z h u 等1 2 6 j 分别用e g c g 和e g c 与h 2 0 2 反应并分离纯化出2 种新的产物，是儿茶素分子a 环氧化和脱羧作用开环而形 成的。该研究提出e g c g 和e g c 的a 环也可能是抗氧化活性的位点。高中洪 等【2 7 1 采用e s r 和自旋捕获技术研究了中药黄苓中的黄苓素、黄苓苷、汉黄苓苷 和汉黄苓素等4 种主要黄酮的自由基清除作用及可能的作用机理。4 种黄酮结 构的主要差别在a 环酚羟基数目及位置不同。结果表明，4 种黄苓黄酮的自由 基清除活性为黄苓素 黄苓苷 汉黄苓素 汉黄苓苷。黄苓素、黄苓苷的酚羟基 比后两者多且a 环含有邻二酚羟基结构，因而具有更强的自由基清除活性。 f 3 ) b 环酚羟基的作用。 大量研究表明，b 环是类黄酮物质抗氧化、清除自由基的主要活性部位。 h u s a i nsr 等1 2 8 1 选取众多类黄酮物质研究它们抗氧化、清除自由基的能力。通 过各物质清除h 2 0 2 在紫外光照射下光解产生的羟自由基的结果显示所选类黄 酮化合物清除自由基能力依次为：杨梅素( m y r i c e t i n ) 槲皮素( q u e r c e t i n ) 鼠 李素( r h a m n e t i n ) 桑色素( m o r i n ) 柚皮素( n a r i n g e n i n ) 芹菜素( a p i g e n i n ) 儿茶素( c a t e c h i n ) 5 , 7 二羟基 3 4 5 三甲氧基黄酮( 5 ，7 d i h y d r o x y 3 4 5 - t r i m e t h o x y f l a v o n e ) 刺槐素( r o b i n i n ) 山奈酚( k a e m p f e r 0 1 ) 黄酮( f l a v o n e ) 。清除自由基活性与b 环上羟基数目直接相关，随b 环上羟基数 目的增加而增加，特别是c 3 o h 尤为重要。当羟基数目下降，清除o h 能力 迅速下降。如杨梅素羟自由基清除率为5 0 ，而山奈酚仅为2 0 。其他众多研 究也证明了这一点1 2 9 ，3 0 】。但当b 环酚羟基数目增加到一定的量时，抗氧化活 性不再随酚羟基数目的增加而增大1 3 。当b 环酚羟基数目相同时，含邻二酚羟 基的黄酮抗氧化活性明显优于b 环含间二酚羟基的黄酮，如槲皮素活性大于桑 色素 3 2 】。理论上类黄酮化合物a 环、b 环和c 环形成大的p 7 【共扼体系，具有 强烈的斥电子作用，b 环上酚羟基处于共扼体系之中，易脱氢提供电子，与自 由基结合，从而达到清除自由基的作用。酚羟基的电离取决于酚羟基的极性。 显然，氧上的电子密度越小，则对共价键的电子吸引力越强，则氢就越易电离。 有计算结果表明，c 3 o h 上的氧的电子密度最小，故其发生电离的能力最强 【3 3 1 。b 环的4 - o h 的存在可以延长黄酮体的共扼体系，使整个分子的电子云 分布离域，有助于黄酮体化合物形成相对稳定的自由基中间体。同时，4 - o h 供氢后易与3 位的氧共享3 - o h 的氢而形成分子内氢键，从而进一步提高3 ，4 一 邻二羟基黄酮自由基的稳定性。除了寻找一些模式单体进行研究以阐明抗氧化 活性与结构的关系外，也有一些研究试图采用先进的技术从分子水平说明类黄 酮化合物抗氧化反应机理。s a w a i1 3 4 1 将几种儿茶素单体与d p p h 反应，反应混 合物用n m r 分析瞬间产物，并用1 ，2 苯二胺加合瞬间产物来证明，以此研究 儿茶素抗氧化分子机理。结果显示，e c ，( + ) c 与d p p h 反应n m r 检测到瞬间 产生邻醌结构( 有两个羰基信号) ，而e g c ，e g c g 则未检测到该信号，表明简单 儿茶素抗氧化机理是由于b 环酚羟基氧化形成邻醒结构，而没食子儿茶素抗氧 化形成相互稳定的自由基，而不是邻醌，故可推测，由于5 羟基的作用，没食 子儿茶素b 环3 - o h 脱氢后与4 一o h 共享氢而形成分子内氢键，自旋更稳定， 抗氧化能力更强。 ( 4 ) c 4 羰基、酚羟基成苷、c 3 羟基及没食子酞基的作用。 h u s a i n 等研究认为，c 4 羰基的存在可增强类黄酮抗氧化活性，如槲皮素清 除- o h 的活性 儿茶素。c 4 羰基的存在可延长共轭体系，应有利于黄酮形成更 稳定的自由基中间体，从而有利于抗氧化活性。c a i 3 5 1 脉冲辐解研究水合电子 与1 1 种黄酮和4 种酚酸的相互作用，结果显示c 4 羰基对于清除e ( a q ) 对黄酮及 酚酸的冲击是活性部位，而其他通常的抗氧化关键部位如b 环酚羟基等却对 e ( a p ) 清除活性作用较小。另c h o l b i 等研究表明【36 | ，一般c 7 位氧苷和c 6 ，c 8 位碳苷对类黄酮抗氧化活性不利。说明在酚羟基旁连接较大体积的羰基取代基， 会有空间位阻效应，导致酚羟基抗氧化能力下降。m o r a 2 4 实验研究指出，c 3 羟 基对抗氧化活性影响不大，但g a n d o w p 研究表明，c 3 羟基也相当重要，槲皮 素、芦丁清除自由基d p p h 活性依次下降证明糖苷的存在导致了抗氧化活性的 降低。不同的研究结果可能是由于研究者所采用的不同反应体系引起。c 3 羟基 糖苷化，会增加类黄酮的水溶性而减少脂溶性，从而影响它在不同反应体系中 的作用效果。 除此之外，国内外一些学者也借助理论化学的方法阐述了类黄酮化合物的 抗氧化构效关系【3 8 ，3 9 1 。如张红雨【4 0 1 用a m i 方法对若干类黄酮抗氧化剂分子的 不同状态( 基态、自由基、形成或不形成分子内氢键等) 进行了量子化学计算。 结果表明： ( 1 ) 类黄酮化合物邻二酚羟基清除自由基的活性强于间二酚羟基，原因一 是前者半醌式自由基与邻位酚羟基形成分子内氢键，从而更稳定：二是前者半 醌式自由基共振形成邻苯醌，这使其未成对电子密度在邻位氧上有较多分布， 内能更低。 ( 2 ) 色原酮类黄酮化合物c 环的吸电子性质使它对a 环酚羟基有钝化作 用，使其更不活泼。由于b 环受c 环影响较小，而且大多数类黄酮抗氧化剂b 环为邻二酚羟基取代，因此实验总结出的b 坏酚羟基活性高的规律得以解释。 1 2 类黄酮化合物的电化学研究现状及展望 电化学分析技术研究天然抗氧化剂抗氧化活性的理论基础是：氧自由基清 除剂的抗氧化作用是通过电子转移清除氧自由基，其在电极上的氧化反应与其 在体内的抗氧化反应类似。由此，氧自由基清除剂的电化学特性，如氧化电位， 电子转移数等，应与其抗氧化活性密切相关，氧化电位值是其最基本的抗氧化 活性的指标，氧自由基清除剂的电极反应行为有助于解释和推测其抗氧化机理。 1 2 1 国内外类黄酮化合物的电化学研究 近年来国内外有很多关于黄酮类天然抗氧化剂性能的研究，用于检测抗氧 化剂的电化学方法又很多种h 1 - 4 3 1 ，而用于天然抗氧化剂的抗氧化活性评估以 及天然抗氧化剂与d n a 的相互作用也有报导1 4 l ，44 1 。其中循环伏安法作为 一种简便快速的电化学方法被许多研究者用于检测抗氧化剂4 引。j a n e i r o 等f 4 7 1 用循环伏安法和微分脉冲伏安法研究了儿茶素的抗氧化机理，讨论了第一个氧 化峰发生了由3 ，4 o h 转变为邻醌基的过程，且为可逆过程。华俊等 4 8 1 用方波 溶出伏安法对芦丁片中的芦丁含量进行检测，得出了满意的测量结果。沈生荣 等( 49 j 用脉冲辐解技术研究了儿茶素与羟自由基作用的动力学，结果表明：酚羟 基越多，反应速率越大，没食子酸基是稳定酚氧自由基的重要结构因子。l e e 等【5o j 高效毛细管电泳检测茶叶中的儿茶酚和茶黄素，对c e 和h p l c 两种方法 进行比较，证明了c e 的分析效果高于h p l c ，其检测极限可达到0 0 5 微克。 检测类黄酮化合物用的电化学方法还有旋转圆盘伏安法、方波伏安法i 47 j 等。 1 2 2 类黄酮化合物的电化学研究展望 现代社会各种疾病困扰着人民大众的生活，如癌症、冠心病、糖尿病、高 血压等。因此，人们将关注的重点放在了身体的健康上。类黄酮化合物作为一 类天然抗氧化剂必然引起大众的广泛关注，所以对该类化合物的检测必将是今 后研究的重点之一，而电化学检测作为是一种简单、便捷、灵敏、快速的方法， 也将会成为类黄酮化合物的主要检测方法。 在今后的研究中，应该着重注意以下几个方向的研究丌发： ( 1 ) 基于类类黄酮化合物的抗氧化作用，用电化学方法对该类物质与d n a 、 氨基酸、蛋白质、激素、维生素等物质之间的相互作用的研究，应是今后加强 的方向之一。 ( 2 ) 光谱电化学是把光谱技术和电化学方法结合起来，在一个电解池内同 时进行电化学信号和光学信号的测量。这种方法对类黄酮化合物抗氧化的机理 和药理作用机制研究有重要作用，所以这种方法也将是电化学检测的发展方向。 ( 3 ) 毛细管电泳作为一种经典电泳技术与现代微柱分离有机结合的新兴分 离技术，近年来发展迅猛并得到广泛应用t ”，5 2 1 。但是它主要用于物质的分离， 今后应该将它与光谱电化学联用，这样有助于对类黄酮化合物氧化后的产物进 行及时分离检测。 ( 4 ) 微型生物传感器的研究开发。在已有的电化学检测天然抗氧化剂的研 究基础上，加强微电极和超微电极技术的运用，开发具有应用价值的微型生物 传感器，实现天然抗氧化剂的活体检测，促进天然抗氧化剂的体内代谢过程的 药理动力学的研究。 此外，电化学方法在抗氧化分子基团结构的化学修饰，有效成分的分离等 方面都有潜在的作用。对于阐明类黄酮化合物的抗氧化作用机理、药理作用机 制，进一步开发类黄酮药物有重大的作用。 1 3 紫外可见薄层光谱电化学方法简介 单纯的电化学测量技术仅能获得电极溶液界面结构和反应历程的间接信 息。其主要缺点是只有纯粹的电学测量而缺乏电极反应分子的特性，没有关于 反应产物或中间体的有用的信息，而光谱电化学把波谱技术和电化学方法相结 合，在一个电解池内同时进行电化学和光谱测量，从而获得多种有用信息，因 此，它已成为人们研究化学和生物化学体系的重要工具。薄层光谱电化学是近 代光谱技术与电化学技术结合、在一个电化学池内同时获得多种信息的方法， 为研究电极过程机理、测量电化学参数等提供了十分有力的手段1 5 i5 4 1 。 1 3 1 紫外可见光谱电化学方法的发展 光谱电化学是6 0 年代初发展起来的交叉学科。1 9 6 0 年a d a m srn 教授在指 导他的研究生k u w a n at 进行邻苯二胺衍生物电氧化反应研究时，他观察到电极 反应伴随有溶液颜色的变化，从而提出这样的设想“能不能设计出一种能看 穿的电极，以光谱方法来识别形成的有色物质昵? ”这个创造性思想终于在 1 9 6 4 年由k u w a n at 【55 j 实现了。光谱电化学从此发展壮大，现已成为电化学分析 领域中的一个重要分支。 为此，设计出性能良好的薄层电化学池是必要的，多年来，人们设计和制 作了多种类型的薄层电化学池，以适应不同体系研究的需要。最初的长光程光 谱电化学池多为组合式，构造复杂，有的存在体积大，需要特殊装置，安装困 难等缺点1 5 6 ，y 7 1 。一般的光透薄层电解池的研究工作，多数利用金网、铂网制作 夹心式薄层电解池归戡 j 。 经过了3 0 多年的发展历程，紫外可见光谱电化学方法己成为光谱电化学方 法中最经典、最成熟的方法。紫外可见光谱电化学方法在研究无机物、有机物 和生物体系方面都得到了广泛的应用。它不仅适用于研究可逆反应1 6 0 、准可逆 反应【6 1 】及不可逆反应【62 | ，还可以借助于媒介体，研究某些生物反应，配合示波 显示，可研究某些特殊反应，追踪瞬变状态的生成与变化，紫外可见光电化学 方法应用广泛，对水溶液、非水溶液【8 】以及熔融盐体系1 2 ，无论低温或高温条 件下均能进行动力学和热力学的研究，特别是有利于研究电极溶液界面现象。 1 3 2 紫外可见薄层光谱电化学的优点 紫外可见薄层光谱电化学同常规的电化学方法相比，具有其独特的优点。 其一，能提供电极反应产物和中间体的分子信息，通过施加电位信号改变物质 6 存在形式的同时，可以记录溶液或电极表面物质吸光度的变化，采用快扫描分 光光度法还可以监测到反应中间体分子光谱的有用信息。其二，具有较高的选 择性，光谱电化学既利用电化学上各种物质具有不同的氧化还原电位加以控制， 也利用了各种物质具有不同的分子光谱特性，因此有较高的选择性。其三，不 受充电电流和残余电流等的影响，光谱电化学监测的是电化学活性物质的光谱 变化，只要共存的其它物质在光谱上不产生干扰，则对测定的光信号不产生影 响。其四，可以研究非常缓慢的异相电子转移和均相化学反应，对于缓慢的化 学反应通常电化学方法得到的电流非常小，但采用光谱电化学方法可很方便地 进行研究。其五，可以研究非电活性物质在电极表面的吸附定向，只要该物质 在紫外可见光范围内具有光谱吸收，根据吸附前后溶液中光吸收物质吸光度的 变化，即可以求得物质在电极表面的吸附量并得出其吸附定向。 此外，紫外可见光谱电化学方法，所用仪器价格便宜，所用光谱电化学池 易于制造和表征，方法操作简便，所获得的反应中间体和产物分子的信息较多， 这些优点都赋予了紫外可见光谱电化学强大的生命力。 1 4 桑色素的研究概况及其意义 桑色素是桑枝中的主要成分之一，属类黄酮化合物，学名为3 ，5 ，7 ，2 ，4 五 羟基黄酮，是一种五元酸( h s r ) ，结构式为： 分子式为c l5 h i 0 0 7 2 h 2 0 ，通常为黄色或灰黄色针状结晶，久置空气中易 氧化为棕色，微溶于水，可溶于乙酸、浓硫酸、碱，易溶于乙醇、丙酮、氯仿 等。在分析化学方面，它可以作为荧光试剂用于金属离子 6 3 1 和非金属离子1 6 4 j 的灵敏测定；亦可用于修饰电极测定金属离子1 63 6 5 j ，利用桑色素与蛋白质的作 用也可进行蛋白质的分析测定1 6 圳。 此外，桑色素也是一种有效的中药成分，是一种天然抗氧化剂，具有一定 的抗病毒、抗肿瘤活性1 67 i 。因而，对桑色素的研究就有其重要的意义。 1 5 本课题的目的、意义和研究思路 本课题旨在通过自制电极增强桑色素在电极上的吸附和电催化活性；采用 7 现场紫外一可见薄层光谱电化学方法，研究桑色素的电化学行为，探讨其电氧 化机理；采用循环伏安结合紫外吸收光谱的方法，研究桑色素与d n a 的相互 作用；通过对几种代表性的类黄酮化合物的电化学氧化和h 2 0 2 化学氧化结果 的比较，得出类黄酮化合物抗氧化性的构效关系；采用循环伏安法和紫外可见 光谱电化学方法对木犀草素和槲皮素的氧化过程进行了测试，研究结构上的差 异对抗氧化能力的影响。 本课题的研究思路可归纳为如下三个方面： ( 1 ) 选择和制作合适的工作电极，使桑色素在其表面有较高的电化学活性， 提高电极反应的灵敏度，以期对桑色素分子中全部羟基的电氧化机理