（中医临床基础专业论文）猪苓汤加补益肾气药治疗系膜增生性肾炎的实验研究.pdf

j 1 卜 目录 中文摘要 1 英文摘要 2 l l j 刖舌 4 正文 实验材料 5 实验方法 7 结果 1 1 分析与讨论 1 4 结语 2 1 参考文献 2 2 致谢 2 5 附勇匙 2 6 文献综述 2 9 作者简历 3 3 j 鼻 猪苓汤加补益肾气药治疗系膜增生性肾炎的实验研究 尹燕飞 中文摘要 目的 本课题通过建立改良的慢性血清病系膜增生性肾炎 m s p g n 动物模型 观 察猪苓汤加补益肾气药治疗系膜增生性肾炎的疗效 并初步探讨其作用机理 运用猪苓 汤加补益肾气药与猪苓汤对m s p g n 大鼠疗效优劣之比较 探索治疗m s p g n 阴虚水热 互结证更为有效的治法及方药 进而为临床提供实验依据 方法 w i s t a r 大鼠4 0 只 雌雄各半 随机分为空白对照组 病理模型组 猪苓汤 对照组 猪苓汤加补益肾气药治疗组 每组各1 0 只 空白对照组切开腹腔后缝合 不 切除肾脏 其余三组切除左肾后缝合 采用双后足垫皮下注射完全弗式试剂 c f a 的 方法进行预免疫后 腹腔注射牛血清白蛋白 b s a 并尾静脉注射大肠杆菌内毒素 l p s 进行免疫 复制m s p g n 大鼠模型 并给予不同的药物治疗 观察治疗后四组大鼠的一 般情况 尿中红细胞 尿蛋白 血清肌酐 血清尿素氮 光镜下观察右肾肾组织常规病 理 通过免疫组化法检测q s m a t g f 1 31 的表达水平 结果 1 病理模型组与空白对照组比较 尿中红细胞 尿蛋白显著增高 血清肌酐 尿素氮显著升高 右肾肾组织q s m a t g f 1 3i 的表达水平明显增高 p o 0 1 光镜 下肾小球系膜区明显增宽 系膜细胞增生和系膜基质增多 2 猪苓汤和猪苓汤加补益肾 气药与病理模型组比较 均能降低尿中红细胞 尿蛋白 血清肌酐和尿素氮含量 降低 右肾肾组织 一s m a t g f 1 3l 的表达水平 p 0 0 1 光镜下病理改变提示两方均能明 显减小肾小球系膜区的宽度 减轻系膜细胞增生和系膜基质积聚 3 猪苓汤治疗组和猪 苓汤加补益肾气药治疗组两组间各项数据有显著性差异 p 0 0 5 结论 1 猪苓汤及猪苓汤加补益肾气药均能有效地降低m s p g n 大鼠尿中红细胞 尿蛋白 血肌酐和尿素氦 促进m s p g n 大鼠肾小球病理损害的修复 2 猪苓汤及猪苓 汤加补益肾气药均可抑制m s p g n 大鼠肾组织q s m a 的表达 具有抑制肾小球系膜细 胞增殖的作用 3 猪苓汤及猪苓汤加补益肾气药均可抑制m s p g n 大鼠肾小球系膜区 t g f 一1 3l 的表达 减轻系膜基质积聚 进而阻断肾小球疾病的进展 这可能是其治疗的 作用机理之一 4 猪苓汤加补益肾气药组治疗m s p g n 大鼠效果优于猪苓汤组 主题词 肾小球肾炎 系膜增生性 中医药疗法 肾硬化症 中医药疗法 猪苓汤 治疗应用 补益肾气药 转化生长因子 1 弋谢 肌动蛋白类 代谢 肌酸酐 血液 尿素氮 血液 l d e c o r i o na d di n v i g o r a t i n gk i d n e yq id r u g sa n dp o l y p o r u sd e c o t i o nc a l li n h i b i tt h ee x p r e s s i o n o fa s m ai nn e p h r i d i a lt i s s u e r e t r a i nm s f g nr a t sm cp r o l i f e r a t i o n 3 p o l y p o r u sd e c o r i o n a d di n v i g o r a t i n gk i d n e yq id r u g sa n dp o l y p o r u sd e c o t i o n 啪i n h i b i tt h ee x p r e s s i o no f t g f p l 2 l i nn e p h r i d i a lt i s s u e r e d u c ee c m d e p o s i t i o na n dd e l a yp r o c e s so fm s p g n p o s s i b l yi ti st h e m e c h a n i s mo fp o l y p o r u sd e c o t i o na d di n v i g o r a t i n gk i d n e yq id r u g so nm s p g n 4 p o l y p o r u s d e c o t i o na d di n v i g o r a t i n gk i d n e yq id r u g si ss u p e r i o rt op o l y p o m sd e c o r i o n k e yw o r d s g l o m e r u l o n e p h r i t i s m s p g n t r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n et h e r a p y n e p h r o s e l e r o s i s t r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n et h e r a p y z h u l i n gt a n g t h e r a p e u t i cu s e s 瞄d n e yq ir e i n f o r c i n gd r u g s b e t a l t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rb e t a l m e t a b o l i s m a c t i n s m e t a b o l i s m c r e a t i n i n c b l o o d u r e an i 2 0 9 e n b l o o d 3 福建中医药大学硕士学位论文 日玎吾 系膜增生性肾炎 m s p g n 是以弥漫性肾小球系膜细胞 g m c 增生及不同程度系膜基 质增多为主要特征的病理类型n 1 是我国最常见的原发性肾小球疾病 约占原发性肾小 球肾炎病理类型的5 0 口1 目前 由于肾穿刺活检的广泛开展及电子显微镜 免疫荧光 技术等的应用 现代医学对m s p g n 的病因 病理演变过程 病理形态等研究已达到较高 水平 但其病因及发病机制尚未明确 多数学者认为本病的发病机制与遗传 黏膜免疫 异常 免疫调节紊乱 细胞凋亡 免疫复合物清除障碍及凝血机制异常等有关 在m s p g n 的治疗方面 现代医学主要采用抑制肾脏的免疫炎症反应 调节免疫紊乱 减轻g m c 的 增生及细胞外基质 e c m 的积聚 改善全身 局部细胞因子失衡等方法 临床疗效不高 且存在一定的不确定性 毒性及不良反应 近年来 中医药治疗m s p g n 有较大进展 众多中医学者从不同角度论治m s p g n 均取 良效 充分体现了中医学辨证论治的优越性 如杜雨茂教授提出 肾病详阴虚 口1 之论 认为慢性肾小球肾炎的病变过程中 阴虚内热水停者并非少见 许多学者临床报道采用 猪苓汤加减治疗慢性肾炎有效率均达8 0 以上h 7 1 且有许多学者通过动物实验探索猪 苓汤及加味猪苓汤治疗m s p g n 的作用机理 取得一定的进展 我们在临床亦发现 阴虚 水热互结确属m s p g n 的常见病机之一 据此 我们确立了滋阴清热利水之法 选用经方 猪苓汤为主方治疗m s p g n 阴虚水热互结证 取效较好 后在临床长期应用猪苓汤治疗系 膜增生性肾炎阴虚水热互结证时 发现亦存在不足之处 主要表现在远期疗效较差 如 该方补益之力不足 肾阴恢复较慢 蛋白尿等实验室指标改善较差 我们尝试在原方基 础上佐入补益肾气药治疗 取效较猪苓汤更为显著 由此 我们推测m s p g n 阴虚水热互 结证存在肾气虚这一病机 为验证以上推测 我们拟经方猪苓汤为对照组 选用经方猪苓汤加补益肾气药治疗 m s p g n 大鼠动物模型 以期证明m s p g n 大鼠动物模型阴虚水热互结证中存在肾气虚这一 病机 为临床提供实验依据 为经方化裁治疗今病提供借鉴 故开展本项实验研究工作 4 猪苓汤加补益 肾气药治疗系膜增生性肾炎的实验研究 实验材料 1 实验动物 清洁级w i s t a r 大鼠4 0 只 雌雄各半 7 周龄 体重1 6 0 一 2 0 0 9 来源于上海斯莱克 实验动物有限责任公司 合格证书 s y x k 闽 2 0 0 5 0 0 0 4 分笼饲养于清洁级鼠类 实验室 人工光照环境 明1 2 小时 暗1 2 小时 空调调节室温1 8 2 c 湿度5 0 6 0 通风良好 自由进食与饮水 饲料为全价颗粒饲料 2 实验用药 2 1 实验药品 2 1 1 猪苓汤 猪苓9 9 茯苓9 9 泽泻9 9 滑石 包勤9 9 阿胶 烊彻9 9 以上方药于福 建中医学院国医堂一次购进 药材经鉴定均属药典药用品种 剂量按照方剂学 2 1 2 猪苓汤加补益肾气药 猪苓9 9 茯苓9 9 泽泻9 9 滑石 包舶9 9 阿胶 烊化 9 9 桑 寄生1 2g 芡实1 2 昏菟丝子1 2g 以上方药于福建中医学院国医堂一次购进 药材 经鉴定均属药典药用品种 剂量按照方剂学 中药学 2 2 药物配制 人与大鼠用药量换算参考文献方法 引 即大鼠单位体重用量是人体单位体重用量的 6 倍 大鼠灌胃量1 0 m l k g m 猪苓汤和猪苓汤加补益肾气药煎煮方法 将生药加5 0 0 m l 自来水浸泡3 0 分钟 用 武火煮沸药物 改用文火煎煮3 0 分钟 阿胶烊化 滤出药液 再加自来水3 0 0 m l 用 武火煮沸后改用文火煎煮3 0 分钟 然后滤出药液 合并两次药液 猪苓汤浓缩成4 5 煎剂 即每1 0 0 m l 含生药4 5g 猪苓汤加味浓缩成8 l 煎剂 即每1 0 0 m l 含生药8 1g 置4 冰箱保存备用 3 实验试剂 3 1 牛血清白蛋白 b s a s i g m a 公司 批号 7 3 8 3 2 8 3 2 大肠杆菌内毒素 l p s s i g m a 公司 批号 l 2 8 8 0 3 3 弗氏完全佐剂 c f a s i g m a 公司 批号 9 0 0 7 8 1 2 3 42 4 小时尿蛋白定量试剂盒 南京建成生物工程研究所 批号 2 0 0 9 0 5 1 2 3 5 血肌酐试剂盒和尿素氮试剂盒 南京建成生物工程研究所 批号 2 0 0 9 0 6 1 9 3 6q s m a 免疫组化试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司 批号 2 0 0 9 0 7 0 0 3 7t g f bl 免疫组化试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司 批号 2 0 0 9 0 7 0 0 4 主要仪器设备 4 17 2 2 s 可见分光光度计 上海金鹏分析仪器有限公司生产 4 2c u t 4 0 6 2 石蜡切片机 德国s l e e 公司生产 4 3y s 1 0 0 生物显微镜 日本尼康 n i k o n 公司生产 4 4m o t i c a m5 0 0 0 c 数码成像系统 德国麦克奥迪 m o t i c 公司生产 4 5m o t i cm e d6 0 数码医学图像分析系统 德国麦克奥迪 m o t i c 公司生产 4 6k d c 2 0 4 6 低温离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司生产 5 福建中医药大学硕士学位论文 4 7d n p 一9 0 8 2 电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司生产 4 8z t 1 4 s 生物组织自动脱水机 孝感市亚光医用电子技术有限公司生产 4 9y b 一6 l f 生物组织石蜡包埋机 孝感市亚光医用电子技术有限公司生产 6 猪苓汤加补益肾气药治疗系膜增生性肾炎的实验研究 实验方法 1 动物分组与造模方法 实验动物于适应性喂养一周后 随机分为空白对照组 i 组 1 0 只 病理模型组 i i 组 1 0 只 猪苓汤对照组 i i i 组 1 0 只 猪苓汤加补益肾气药治疗组 i v 组 1 0 只 参照张五星报道的方法聆1 复制m s p g n 模型 其中i 组的1 0 只用1 0 水合氯醛麻醉切开 腹腔后缝合 但不切除肾脏 i i 组 组 组按文献法用1 0 水合氯醛麻醉切除左侧 肾脏后缝合 一周后3 m g b s a 与完全弗氏佐剂混匀双后足垫注射 然后每隔2 周重复皮 下多点注射一次 足垫注射b s a 后2 周开始隔日饮饲含0 i b s a 的6 m m o l l 盐酸酸化水 b s a 免疫注射3 次后内眦取血 双向免疫扩散法测血清抗b s a 抗体滴度 抗体滴度达到 1 1 6 后 开始每日腹腔注射3 m g 的b s a 3 周后 腹腔注射1 0 0ug 的l p s 一次 4 周后 造模结束 2 治疗方法 造模4 周后 开始为期4 周的治疗 各组大鼠每天灌胃给药一次 每日上午8 点 组 组分别灌服猪苓汤煎液和猪苓汤加补益肾气药煎液 大鼠灌胃量l o n k g d i 组 i i 组则每天分别予等量生理盐水灌胃 3 标本的采集与制备 3 1 尿液标本 将大鼠放入代谢笼内 从早8 点至次日早8 点 收取2 4 小时尿液 在大鼠处死前 采集尿液标本一次 3 2 血液标本 给药4 周后次日上午采用1 0 水合氯醛 给药量为每公斤体重0 3 0 4 5g 腹腔注 射麻醉 腹主动脉采血5 n i l 非抗凝血 静置l h 3 0 0 0 f r a i n 离心1 5 分钟 取出血清 用以检测肾功能 3 3 病理标本 给药4 周后次日上午大鼠腹主动脉采血后处死大鼠 立即剖取右肾 大体观察后 从肾门将肾脏纵切成两瓣 用4 甲醛溶液固定 取固定后的肾脏 石蜡包埋 切片机 切4 i i m 薄片 常规脱蜡脱水 h e 染色 制成光镜切片 光镜下观察肾脏病理变化 4 观测指标及检测方法 4 1 体征观测 精神状态 被毛外观 二便情况 体重变化等 精神状态 被毛外观 二便情况每 天观察 体重变化每周观察一次 4 2 实验室检测指标 4 2 1 血清肌酐的检测 测定方法 碱性苦味酸法 在碱性溶液中 苦味酸盐与肌配作用生成黄红色的苦味 酸肌酐复合物 实验材料 试剂盒由南京建成生物工程研究所提供 批号 2 0 0 9 1 1 1 1 7 l f 福建中医药大学硕士学位论文 检测仪器 选用可见7 2 1 型分光光度计 波长5 1 0 h m 检测步骤 1 试剂组成及配制 1 0um o l l 肌配标准品应用液l o m lx 2 瓶 钨酸蛋白沉淀剂l o o m l x1 瓶 苦味酸溶液6 0 m lx1 瓶 7 5 m o 儿氢氧化钠6 0 m l 1 瓶 2 样品测试前处理 血清0 2 m l 加入钨酸蛋白沉淀剂2 m l 或者取血清o 1 m l 加钨酸蛋白沉淀剂l m l 充分 混匀 3 0 0 0 转 分 离心1 0 分钟 取上清按下表进行测定 测定管标准管空白管 血清 浆 蛋白滤液或稀释尿液 m 1 1 6 肌酐标准应用液 m 1 1 6 蒸馏水 m 1 1 6 苦味酸溶液 m 1 0 5 0 50 5 氢氧化钠 m 1 0 5 0 50 5 混匀后 3 7 水浴1 0 分钟 自来水冷却后 l c m 光径 5 1 0 r a n 波长 空白管或水 调零 读取各管吸光度 4 2 2 血尿素氮的检测 测定原理 血液中的尿素在强酸的条件下与二乙酰共热反应 生成红色复合物即 f e a r o n 氏反应 和经同样处理的标准液比色 即可求出血液中尿素氮的含量 r 混酸 二乙酰一肟 h 2 0 一乙酰 羟胺 旷 二乙酰 尿素 一嗪衍生物 红色 实验材料 试剂盒由南京建成生物工程研究所提供 批号 2 0 0 9 1 1 1 1 检测仪器 选用分光光度计7 2 1 型 波长5 2 0 h m 检测步骤 1 试剂组成及配制 l g l 的乙二肟溶液l o o m l 3 瓶 酸溶液l o o m l 用时加蒸馏水2 0 0 m l 配成酸应用液 l o n u n o l l 尿素标准液1 瓶 8 猪苓汤加补益 肾气药治疗系膜增生性肾炎的实验研究 测定管 标准管 空白管 蒸馏水 m 1 0 0 5 1 0 m m o l l b u n 标准液 m 1 0 0 5 血清 浆 m1 0 05 l g l 溶液 m 1 2 5 2 5 2 5 酸应用液 m 1 2 5 2 5 2 5 混匀 置沸水中水浴1 5 分钟 立即用自来水冷却 用波长5 2 0 n m 以空白管调零 读取各管吸光度 4 3 肾组织光镜学检查 于治疗结束后取右侧肾组织 1 0 甲醛溶液固定 7 5 1 0 0 乙醇逐步脱水 二甲 苯透明 浸蜡 石蜡包埋 切片 厚度4i lm 常规h e 染色 光学显微镜下观察并拍 片 4 4 肾组织免疫组化法检测 4 4 1 肾组织q s m a 检测 1 石蜡切片常规脱蜡至水 石蜡切片一二甲苯1 0 分钟 2 次一无水乙醇5 分钟 2 次一9 5 乙醇3 分钟 8 5 7 醇3 分钟一7 5 乙醇2 分钟一自来水冲洗1 0 分钟 一 2 3 0 h 2 0 2 1 份 蒸馏水1 0 份混合 室温5 1 0 分钟以灭活内源性酶 蒸馏水洗3 次 3 热修复抗原 将切片浸入0 0 1 m 枸椽酸盐缓冲液 p h 6 o 中 电炉或微波炉加热 至沸腾后断电 间隔5 1 0 分钟后 反复1 2 次 冷却后p b s p h 7 2 7 6 洗涤1 2 次 4 滴加5 b s a 封闭液 室温2 0 分钟 甩去多余液体 不洗 5 滴加适当稀释的一抗 1 1 0 0 3 7 1 2 1 小时左右 p b s p h 7 2 7 6 洗2 分钟 3 次 6 滴加生物素化山羊抗小鼠i g g 2 0 3 7 c 2 0 分钟 p b s p h 7 2 7 6 洗5 分钟 3 次 7 滴加试剂s a b c 2 0 3 7 c 2 0 分钟 p b s p h 7 2 7 6 洗5 分钟 3 次 8 d a b 显色 使用d a b 显色试剂盒 a r l 0 2 2 取i m l 蒸馏水 加试剂盒中a b c 试剂各l 滴 混匀后加至切片 室温显色 镜下控制反应时间 一般在3 分钟 左右 2 每张切片滴加5 0ul 一抗 1 t o o 阴性对照以p b s p h 7 2 7 6 代替一抗 4 c 过夜 3 p b s p h 7 2 7 6 洗5 分钟x 3 次 4 每张切片滴加5 0 ul 二抗 3 7 2 孵育2 0 分钟 5 p b s p h 7 2 7 6 洗5 分钟 3 次 9 福建中医药大学硕士学位论文 6 d a b 复染 脱水 透明 封片步骤同上 4 4 3 免疫组化染色半定量分析 采用m o t i cm e d6 0 数码医学图像分析系统 在4 0 0 倍光镜下测量每个肾小球的面 积及阳性染色面积 每组选择6 个标本 每个标本测量l o 个肾小球 进行半定量分析 用阳性染色面积与肾小球的面积的比值表示该成分的相对含量 5 实验结果处理方法 采用s p s s l 3 0 统计软件进行数据分析 所有数据均采用均数士标准差表示 组间 比较采用单因素方差分析 氏0 0 5 认为有统计学意义 1 0 猪苓汤加补益肾气药治疗系膜增生性肾炎的实验研究 结果 1 一般情况观察 空白对照组大鼠体形丰满 反应敏捷 体重日增 动作迅速 两眼有神 皮毛致密 有光泽 摄食 饮水 二便正常 病理模型组大鼠均出现精神萎靡 反应迟缓 毛色无 光泽 生长相对缓慢 摄食减少 大便稀溏 猪苓汤治疗组及猪苓汤加补益肾气药治疗 组大鼠精神 毛色 活动 摄食 大便均出现不同程度的好转 2 实验室检查 2 1 尿中红细胞计数 病理模型组与空白对照组比较 尿中红细胞明显升高 差异非常显著 尺0 0 1 猪苓汤组及猪苓汤加味组与病理模型组比较 尿中红细胞明显降低 差异非常显著 k 0 0 1 猪苓汤组与猪苓汤加味组比较 无显著性差异 乃0 0 5 见表1 表l 各组大鼠尿中红细胞计数 个 视野 变化 x l a 注 与正常组比较 尺o 0 1 1 与病理模型组比较 尺o 0 1 与猪苓汤比较 d 0 0 5 2 22 4 小时尿蛋白 病理模型组与正常组比较 尿中蛋白明显增高 差异非常显著 k 0 0 1 猪苓汤 组及猪苓汤补益肾气药组与病理模型组比较 尿蛋白明显降低 差异非常显著 只o 0 1 猪苓汤组与猪苓汤加味组比较 有显著性差异 k 0 0 5 提示猪苓汤 猪苓汤加补益 肾气药可以降低m s p g n 大鼠尿蛋白 且猪苓汤加味效果优于单纯猪苓汤 见表2 表2 各组大鼠尿蛋白变化 g l 注 与正常组比较 尺o 0 i t 与模型组比较 只o 0 1 与猪苓汤比较 尺0 0 5 2 3 肾功能 b u n s c r 检查 病理模型组与正常组比较 尿素氮含量增高 差异非常显著 尸 0 0 1 猪苓汤组 和猪苓汤加味组与病理模型组比较 尿素氮含量明显降低 差异非常显著 k 0 0 1 猪苓汤组与猪苓汤加味组比较有显著性差异 尺o 0 5 提示猪苓汤 猪苓汤加补益肾 气药均可以降低m s p g n 大鼠血尿素氮 且猪苓汤加味组效果优于猪苓汤组 福建中医药大学硕士学位论文 病理模型组与正常组比较 血肌酐增高 差异非常显著 只0 0 1 猪苓汤组和猪 苓汤加味组与病理模型组比较 血肌酐明显降低 差异非常显著 p 0 0 1 猪苓汤组 与猪苓汤加味组比较有显著性差异 只0 0 5 提示猪苓汤 猪苓汤加补益肾气药可以 降低m s p g n 大鼠血肌酐 且猪苓汤加味组效果优于猪苓汤组 见表3 表3 l 各组大鼠b u n 和s e x 的变化 x 士o 注l 与正常组i f 较 代o 0 i t 与梗型组比歌 k 0 0 1 q 插辱汤组i f 段 p 0 0 5 2 4 肾脏组织光镜学检查 图片见附录 空白对照组肾小球结构基本正常 系膜细胞和系膜基质未见增生 毛细血管管腔通 畅 见图l 2 病理造模组呈弥漫性程度不等的肾小球病变 肾小球系膜区明显增宽 肾小球细胞增生明显 且以系膜细胞增生为主 并伴有系膜基质中重度增宽 部分肾小 球增大 部分肾小球球囊蚴粘连 有炎性细胞浸润 见图3 4 猪苓汤治疗组肾小球 系膜区宽度小于模型组 肾小球系膜增生及系膜基质减少 见图5 6 猪苓汤加味治 疗组肾小球系膜区宽度明显小于模型组 肾小球系膜增生及系膜基质明显减少 见图7 8 2 5 免疫组化检测结果 2 5 1 肾组织中q s m a 的表达 正常组肾小球q s m a 有极微弱阳性表达 见图9 模型组肾小球系膜区可见大量 a s m a 阳性表达 尤以肾小球血管极多见 同时在肾间质也有表达 见图1 0 猪苓 汤治疗组及猪苓汤加味治疗组 一s m a 在肾小球的表达明显少于模型组 但猪苓汤加味组 优于猪苓汤组 见图1 1 1 2 免疫组化半定量分析表明 病理模型组的肾小球q s m a 相对含量与正常组相比显著 增高 尺o 0 1 两治疗组的肾小球a s m a 相对含量与病理模型组相比显著降低 尺o 0 1 提示猪苓汤及猪苓汤加补益肾气药均能减少m s p g n 大鼠肾组织中a s m a 的表达 但猪苓汤组与猪苓汤加味组比较有显著性差异 只0 0 5 猪苓汤加补益肾气 药疗效优于猪苓汤 见表4 表4 各组大鼠肾组织中a s m a 相对含量的比较 1 2 猪苓汤加补益肾气药治疗系膜增生性 肾炎的实验研究 注 与正常组比较 只o o ls 与模型组比较 尺0 0 1 与猪苓汤组比较 尺0 0 5 2 5 2 肾组织中t g f b 的表达 正常组肾小球内t g f b 呈极微弱的表达 而在肾间质的分布较肾小球多 见图t 3 模型组肾小球内可以见到t g f d 大量表达在肾小球系膜区及毛细血管袢 同时在肾间 质的表达亦明显增多 部分呈团块状 见图1 4 猪苓汤治疗组及猪苓汤加味治疗组 t g f 0 在肾小球内及肾间质的表达皆减少 但猪苓汤加味治疗组更为明显 见图1 5 1 6 免疫组化半定量分析表明 模型组的肾小球a s m a 相对含量与正常组相比显著增高 尺o 0 1 两治疗组的肾小球q s m a 相对含量与模型组相比显著降低 尺o 0 1 提 示猪苓汤及猪苓汤加补益肾气药均能减少m s p g n 大鼠肾组织中q s m a 的表达 但猪苓汤 组与猪苓汤加味组比较有显著性差异 只0 0 5 猪苓汤加补益肾气药疗效优于猪苓汤 表5 各组大鼠肾组织中t g f s 相对含量的比较 注 与正常组比较 尺0 o l 与模型组比较 只o o l 与猪苓汤组比较 尺o 0 5 福建中医药大学硕士学位论文 分析与讨论 1 现代医学对系膜增生性肾炎发病机理的认识 m s p g n 是我国最常见的原发性肾小球疾病 其发病机制尚未完全阐明 目前 已知 与以下几种机制有关 细胞凋亡 过度增生的系膜细胞及渗出的炎症细胞可通过细胞 凋亡得以清除 使多种类型的肾小球损伤 如链球菌感染后肾小球肾炎及t h y 1 大鼠肾炎 具有自限过程 维持自身细胞数的稳定 而肾小球细胞的过度凋亡 则可使细胞数进行 性下降 肾功能逐渐丧失u 们 祝葆华等n 1 1 研究表明肾小球内凋亡抑制基因b c l 2 表达增 高 抑制了m c 和浸润的白细胞的凋亡 结果导致肾小球系膜严重增生 细胞因子 近 年来研究证明 许多细胞因子如t n 卜a i l l i l 6 t g f b 等均在m s p g n 的病理过程 中起着重要作用 t n f q 是一个重要的炎症细胞因子 肾脏炎症病变时 单核巨噬细胞 浸润 可表达和分泌大量的t n f q m c 是肾小球中最活跃的固有细胞成分 在各种增殖 性肾小球疾病中 都有系膜细胞增生和系膜基质增多 增生的肾小球系膜细胞可自分泌 t n f q 它又可促进系膜细胞分泌i l 6 n 刳 i l 一6 通过自分泌和旁分泌刺激肾小球系膜细 胞增殖n 引 j e n n i f e r 等n 们用敲除i l 1 基因的大鼠研究i l 1 在增生性肾小球肾炎中的表达 情况 发现缺少i l 一1 基因的肾小球肾炎大鼠模型肾小球损伤的炎性细胞介质也会减少 t g f 8 水平与肾脏疾病活动性病变的标志 系膜增生 间质炎症细胞浸润及蛋白尿 程 度相关 t g f b 作为一种炎性细胞因子 促进m c 增生和细胞外基质 e c m 聚集 是引 起m s p g n 病理改变发生发展中重要的细胞因子之一口5 1 蛋白尿 大量蛋白尿除了对肾 小管上皮细胞有直接的损害作用外 还间接引起肾小管间质内单核巨噬细胞浸润 产生 大量趋化因子 促进i c a m 1 等黏附分子的表达及单核细胞向系膜区迁移 引起迟发性超 敏反应 导致肾小球系膜细胞及基质增殖n 引 肾小管间质病变 肾小球疾病往往始于 肾小球损害 之后引起肾小管间质损害 肾小球疾病引起小管间质病变的机制主要有血 管环节 肾小管环节 肾小球的滤过及尿蛋白因素 炎症硬化介质环节 而肾小管间质 的病变反过来对肾小球病变的发展和预后有极为重要的影响n 7 1 粘附因子 细胞粘附 分子通过介导白细胞间 白细胞和内皮细胞 血小板和内皮细胞及细胞和细胞外基质等 相互间的作用 在炎症 血栓形成 组织损伤等过程中起重要作用 张曦等n 羽研究表明 c 队 c d 6 c d b 作为血小板活化标志和分子 参与了m s p g n 肾内血小板聚集活化及血栓形 成 在肾小球内细胞增生 炎细胞浸润以及纤维化发生中可能具有重要介导作用 凝 血功能 张曦等n 阳对原发性m s p g n 患者治疗前后凝血功能检测 发现血小板在以细胞增 生为主的肾小球肾炎中明显聚集活化且释放炎症介质 m s p g n 的发病与多种机制有关 其病变可导致肾小球硬化和纤维化 最终出现肾功能衰竭 2 祖国医学对系膜增生性肾炎的认识 2 1 系膜增生性肾炎在中医文献中的记载 系膜增生性肾炎在中医文献中无名 根据其临床表现 当隶属于中医 水肿 尿 血 虚劳一 腰痛 尿浊 等病的范畴 关于水肿之病名 在 内经 中称之为 水 并根据不同症状分为 风水 石水 涌水 肾风一 云 其性可代石膏 并指出其清降的途径是 引其热自小便出也一 1 6 猪苓汤加补益肾气药治疗系膜增生性肾炎的实验研究 阿胶质膏味厚 本草求真 云 得阿井纯阴之济水 又得纯黑补阴之驴皮 气味俱阴 既入肝经养血 复人肾经滋水 为补益之佳品 由上可见 猪苓汤用二苓 泽泻利水 滑石清热 复用阿胶滋阴 集清 利 滋数功于一炉 用于阴虚水热互结证正为适宜 2 5 1 2 猪苓汤的现代研究 现代诸多医家通过临床研究证明猪苓汤加减治疗慢性肾炎疗效显著 如张玉贤等h 1 采用加味猪苓汤 原方加茜草 白茅根 当归 治疗慢性肾炎阴虚湿热证3 3 例 完全缓 解5 例 基本缓解9 例 好转1 5 例 无效4 例 总有效率为8 8 朱中骥等 1 采用猪苓汤加 减 生地 山萸 白茅根 僵蚕 丹皮 甘草 治疗慢性肾小球肾炎5 7 例 总有效率9 3 赵萌嘲采用猪苓汤加味 生地 山茱萸 山药 党参 黄芪 肝阳上亢者加钩藤 天麻 血瘀者加丹参 川芎 赤芍 血虚者加赤芍 当归 治疗慢性肾炎6 2 例临床观察 治疗显效3 3 例 有效2 4 例 无效5 例 恶化o 例 总有效率为9 1 9 廖锦芳盯1 采用猪苓 汤为基本方 辨证加减治疗服用激素治疗的慢性肾炎3 5 例 显效2 9 例 占8 3 有效5 例 占1 4 无效1 例 占2 现代药理研究表明 猪苓汤有明显的利尿作用 其机制可能与抑制肾小管对电解质 和水的重吸收 调节肾素一血管紧张素一醛固酮系统有关啪1 猪苓具有利尿作用啪1 猪 苓中的p o l y p o r o i d 多孔菌属 a b c 具有抗炎作用嗍 茯苓具有利水消肿作用 茯 苓多糖具有增强免疫系统功能的作用m 1 阿胶具有增强免疫作用口羽 全世建 熊曼琪等 1 采用猪苓汤对t h y 1 大鼠肾炎模型相关细胞因子及基因表达作 用进行研究 实验发现 猪苓汤能有效抑制系膜细胞增生 降低血肌酐 尿素氮 减轻 血尿和蛋白尿症状 减缓肾功能的损害 通过抑制i l 16 i l 6 t n f q 三种细胞因子 的活性可能是它作用的靶点之一 进一步研究发现 猪苓汤可以显著抑制i l 一6 m r n a 的表 达 提示其可能是通过基因调控层次发挥作用 即抑制相关细胞因子的基因表达从而达 到抑制细胞因子活性的目的 i l l1 3 t n f q 有待进一步研究证实 全世建 李政木等 嗍又进行了加昧猪苓汤治疗原发性m s p g n 的实验研究 结果显示猪苓汤能有效抑制系膜 细胞增生 降低血肌酐 尿素氮 减轻血尿和蛋白尿症状 减缓肾功能的损害 能减低 i l l p i l 6 t n f a 的活性 表明猪苓汤可能是通过降低这3 种细胞因子的活性来达到 抑制肾小球病变 改善肾功能的目的 2 5 2 补益肾气药的选定 我们在临床应用中发现 猪苓汤治疗m s p g n 亦存在不足 该方补益之力不足 肾 阴恢复较慢 该方虽在短期内可减缓或消除临床症状 但对某些实验室指标如蛋白尿 治疗效果较差 据此 我们推测m s p g n 阴虚水热互结证在其发展过程中出现病机偏移 即存在肾气虚这一潜在病机 导师在猪苓汤原方的基础上 加入补益肾气药治疗该病 疗效显著 在补肾益气药的选定方面 注意 补益肾气而不伤阴助热 治疗m s p g n 效 佳 在众多补益肾气药中选择了芡实 菟丝子 桑寄生三昧药 芡实昧甘涩 性平 本 经 中记载 主湿痹腰脊膝痛 补中除暴疾 益精气 强志 令耳目聪明 本草 纲目 称其 止渴益肾 治小便不禁 遗精白浊带下 现代药理研究表明 芡实能明 显地消除慢性肾炎所致蛋白尿瞄1 菟丝子味甘 性温 本草纲目 称其 久服明目轻 1 7 肾气药有提高肾小球滤过率 保护肾功能的作用 3 4 修复病变肾组织 m s p g n 是基于光镜观察的一种病理形态学诊断 以弥漫性g m c 增生及不同程度系 膜基质增多为主要特征 实验发现模型组大鼠肾小球系膜区呈弥漫性程度不等的系膜组 织增生 肾小球系膜区增宽 以系膜细胞增生为主 系膜基质亦有增生 因此 本模型 的复制获得成功 猪苓汤组中 肾小球系膜区宽度小于模型组 系膜细胞及系膜基质增 1 2 猪苓汤加补益 肾气药治疗系膜增生性肾炎的实验研究 生也有一定程度的减少 而猪苓汤加补益肾气药组大鼠肾小球系膜区变窄 明显小于模 型组 系膜细胞增生明显减少 提示猪苓汤和猪苓汤加补益肾气药可明显改善肾小球的 病理损害 阻止m s p g n 的病理进程 从而起到延缓肾小球硬化 增进肾功能的作用 3 5 猪苓汤加补益肾气药对m s p g n 大鼠q s m a 表达的影响 近年许多研究提示了q s m a 的分布及强度与肾脏疾病的发生 发展及预后有密切关 系旧 g m c 是肾小球固有细胞之一 正常时处于静止表型 更替缓慢 细胞外基质分泌 与降解相对恒定 肾小球疾病的发展与活化的系膜细胞增殖和细胞外基质的积聚密切相 关 在t h y l 1 抗体所致的m s p g n 模型中 当系膜细胞增殖活跃时 细胞内出现q s m a 的表达 并与细胞增殖呈正相关 a s m a 表达量与细胞外基质量也呈正相关 但q s m a 与细胞外基质变化间的关系 目前尚不清楚 1 a s m a 是系膜细胞在病理状态下受损激 活 由静止表型向增殖 分泌表型转化的标志 它作为系膜细胞受损激活和表型转化的标 志 反映了系膜细胞的机能状态和增殖情况h 钔 肾小管间质a s m a 表达是疾病进展的重 要指标 也是预测预后的组织学指标m 1 因此 我们可以推论 q s m a 的表达提示系膜 细胞由静止表型转化为增殖 分泌表型 并且可以作为预测预后的组织学指标 本实验发现 正常组大鼠肾小球内q s m a 未见明显的阳性表达 模型组大鼠肾小球 系膜区可见大量q s m a 阳性表达 同时在肾间质也有表达 提示系膜增生性肾炎模型大 鼠g m c 由静止表型转化为增殖 分泌表型 猪苓汤治疗后q s m a 在肾小球系膜的表达与模 型组相比相对减少 猪苓汤加补益肾气药治疗后q s m a 在肾小球系膜的表达与模型组相 比明显减少 表明猪苓汤加补益肾气药可明显抑制g m c 的增殖和e c m 的增多 抑制系膜细 胞的转型 从而减轻炎症反应 阻断疾病进展 为临床治疗更好地系膜增生性肾炎提供 实验依据 3 6 猪苓汤加补益肾气药对m s p g n 大鼠t g f bl 表达的影响 g m c 是肾小球内最活跃的固有细胞 g m c 增殖及e c m 增生是m s p g n 的常见病理特征 同 时也是多种肾小球疾病的共同病理改变 g m c 可产生多种炎症因子 通过自分泌和旁分 泌途径影响其他细胞m 1 参与肾小球的炎症反应 t g f bl 是最活跃的炎症因子之一 t g f b 是肾小球疾病进展的重要介导因子 对e c m 合成起重要的促进作用m 1 h u m e s 等嗍研究表明 t g f b 刺激培养的鼠g m c 肾小管上皮细胞合成e c m 成份增加 t g f b 是 具有多种生物学活性的细胞因子 与e c m 的沉积密切相关 是肾小球硬化 肾小管间质 纤维化疾病中的重要调节因子嘞1 y a m a m o t o 等用免疫染色和原位杂交技术检测人肾小球 疾病t g f b 及其m r n a 表达 发现基质增多不明显的肾小球疾病中t g f b 及m r n a 表达与正 常肾无明显区别 基质增多明显肾小球疾病中t g f d 表达明显增强 另外还见t g f b 的 三个亚型中以t g f bl 型表达加强为主璐h 锄 表明t g f bl 表达增强与系膜基质的增加程 度密切相关 t g f 6l 是最重要的促肾脏纤维化因子之一 其与g i c 表面的t g f b1 受体结合后 可 激活由s m a d s 蛋白家族介导的信号转导通路 导致e c m 合成增多 e c m 降解减少 整合素 基质黏附分子的上调等嘲 魏林等旧1 体外实验表明在人m s p g n q 口 t g f pi 可以刺激g m c 内皮细胞及上皮细胞合成e c m t g 卜bl 与系膜基质增生密切相关 1 9 福建中医药大学硕士学位论文 本实验发现 正常组大鼠肾组织中t g f 1 3l 未见明显的阳性表达 模型组大鼠肾肾 组织中t g f 一1 3l 的表达明显增多 猪苓汤治疗后 肾组织中t g f 一1 3l 的表达与模型组相比 相对减少 猪苓汤加补益肾气药治疗后 t g f bl 的表达在肾小球的表达与模型组相比 显著减少 提示猪苓汤加补益肾气药可以明显抑制m s p g n 大鼠肾小球系膜区t g f 1 3l 的 表达 减少e c m 的积聚 进而阻断肾小球疾病的进展 3 7 猪苓汤与猪苓汤加补益肾气药疗效比较 从本实验各项数据分析 猪苓汤与猪苓汤加补益肾气药均可减少m s p g n 大鼠尿中红 细胞 降低尿蛋白 改善肾功能 修复病变肾组织 抑制m s p g n 大鼠0 s m a t g f 1 3l 的表达 两治疗组在减少m s p g n 大鼠尿中红细胞方面无显著性差异 p o 0 5 但在降 低尿蛋白 改善肾功能 修复病变肾组织 抑制m s p g n 大鼠a s m a t g f 1 3l 的表达方 面 两治疗组有显著性差异 尸 0 0 5 猪苓汤加补益肾气药明显优于猪苓汤 由上可 见 猪苓汤加补益肾气药治疗大鼠m s p g n 更为有效 猪苓汤加补益肾气药治疗系膜增生性肾炎的实验研究 结语 一 本课题通过实验研究 初步得出以下结论 1 猪苓汤及猪苓汤加补益肾气药能够明显地改善m s p g n 大鼠尿中红细胞 尿蛋白 和肾功能的各项指标 各组大鼠尿红细胞测量结果表明 猪苓汤治疗组与猪苓汤加味 组比较 两组无显著性差异 f b o 0 5 各组大鼠尿蛋白 肾功能测量结果表明 猪苓 汤组与猪苓汤加补益肾气药组比较 有显著性差异 k o 0 5 2 猪苓汤和猪苓汤加味均可以抑制m s p g n 大鼠肾组织q s m a 的表达 具有抑制 g m c 增殖的作用 猪苓汤和猪苓汤加味均可以抑制m s p g n 大鼠肾小球系膜区t g f 1 31 的 表达 减轻系膜基质积聚 进而阻断肾小球疾病的进展 这可能是其治疗m s p g n 的作 用机理之一 3 猪苓汤加补益肾气药治疗m s p g n 大鼠效果优于猪苓汤 似系膜增生性肾炎阴虚 水热互结证中暗伏肾气虚之机 二 存在问题 m s p g n 病程缠绵 本实验由于时间所限 无法对m s p g n 大鼠进行长期 观察 在补益肾气药的选择上只选择了芡实 菟丝子 桑寄生三味 其它药物因本 研究所限未能大量筛选 本课题仅从q s m a t g f bl 初步探讨猪苓汤加补益肾 气药治h q l s p g n 可能的作用机理 深度不够 在今后的研究中尚须进一步探讨 2 1 福建中医药大学硕士学位论文 参考文献 1 王海燕 肾脏病学 m 北京 人民卫生出版社 1 9 9 8 6 4 8 2 孙林 叶任高 李幼姬 等 系膜增生性肾炎患者肾生存率的研究 j 中华肾脏病杂志 1 9 9 6 1 2 6 3 5 9 3 6 1 3 毛炜 杜雨茂教授运用猪苓汤治疗肾脏疾病的经验 j 陕西中医函授 1 9 9 3 3 卜3 4 张玉贤 廉向阳 加味猪苓汤治疗慢性肾炎3 3 例临床观察 j 中华临床防治医学杂志 2 0 0 7 2 3 9 0 9 1 5 朱中骥 猪苓汤加减治疗慢性肾小球肾炎5 7 例 j 湖南中医杂志 2 0 0 3 1 9 2 4 5 6 赵萌 猪苓汤加味治疗慢性肾炎6 2 例临床观察 j 天津中医药 2 0 0 9 2 6 1 5 1 7 廖锦芳 猪苓汤加味在激素治疗慢性肾炎中的临床应用 j 海峡药学 2 0 0 5 4 1 4 7 1 4 8 8 陈奇 中药药理研究方法学 m 北京 中国人民卫生出版社 1 9 9 3 1 0 3 9 张五星 陈香美 魏日胞 等 大鼠慢性血清病肾炎模型的改进研究 中国比较医学杂志 2 0 0 3 1 3 3 1 3 9 1 4 1 1 0 叶小玲 黄庆元 郑法雷 肾小球肾炎转归与细胞凋亡 j 国外医学 泌尿系统分册 1 9 9 8 1 8 1 1 1 1 1 祝葆华 陈孝文 江黎明 等 c m y c 与b c l 一2 在大鼠抗t h y l 1 系膜增生性肾炎肾小球内的表达 j 现代中西医结合杂志 2 0 0 1 1 0 1 6 1 5 2 0 1 5 2 2 1 2 t i m o s h a n k oj r s e d g w i c kj d h o l d s w o r t hs r e ta 1 i n t r i n s i cr e n a lc e l l sa r et h em a j o r s o u r c eo ft u m o rn e c r o s i sf a c t o rc o n t r i b u t i n gt or e n a li n j u r yi nm u r i n ec r e s c e n t i c g l o m e r u l o n e p h r i t i s j a ms o cn e p h r o l 2 0 0 3 1 4 7 1 7 8 5 1 7 9 3 1 3 h o r i iy m u r a g u c h ia 1 w a n o le ta 1 i n v o l e m e n to fi l 6i nm e s a m g i a lp r o l i f e r a t i v e g l o m e r u o n e j ji m m u n a l 1 9 9 8 1 4 3 1 2 3 9 4 9 3 9 5 4 1 4 j e n n i f e rl l t i m o s h a n k oa r i c h a r dk i t c h i n g e ta 1 c o n t r i b u t i o n so fi 卜lba n di l lq t oc r e s c e n t i cg l o m e r u l o n e p h r i t i si nm i c e j ms o cn e p h r o l 2 0 0 4 1 6 9 1 0 9 1 8 1 5 邹敏书 吴莉 何威逊 系膜增生性肾小球肾炎患 l t g f 1 3 检测的临床意义 j 临床儿科杂志 2 0 0 5 2 3 1 4 4 4 6 1 6 陈孝文 江黎明 叶锋 等 系膜增生性肾炎患者肾组织白