（中医骨伤科学专业论文）补肾活血方对实验性骨关节炎中硫酸软骨素影响的研究.pdf

贵阳中医学院硕士学位论文相关声明 原创性声明 本文声明 所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果 尽我所知 除了论文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含 其他人已经发表论文中撰写过的研究成果 也不包含为获得贵阳中医学院或其他 单位的学位或证书而使用过的材料 与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均 已在论文中作了明确说明 能拙彳 作者 参肛俐 日期 矿p 矿年r 月 夕e t 关于学位论文使用授权说明 本文了解贵阳中医学院有关保留 使用学位论文的规定 l l l j 学校有权保留 学位论文 允许学位论文被查阅和借阅 学校可以公布学位论文的全部或部分内 容 可以采用复印 缩印或其他手段保存学位论文 学校可根据国家或贵州省有 关部门规定送交学位论文 坎甲徘鹏 日期洲蛑妇7 日 目录 中文摘要 1 英文摘要 2 1 前言 4 日u茜 4 2 正文 8 2 1 实验材料和方法 8 2 2 实验结果 1 0 2 3 实验讨论 1 2 2 4 实验结论 1 9 3 全文总结与展望 2 1 4 参考文献 2 3 附录一综述 一 2 6 附录二图片或病例收集资料等 3 7 附录三致谢 3 9 附录四个人简介 一 4 0 贵阳中医学院硕士学位论文 中文摘要 目的 通过观察补肾活血方对兔膝骨性关节炎模型中硫酸软骨素的影响 探 讨补肾活血方与骨性关节炎软骨基质中硫酸软骨素之间的关系 方法 选用日本大耳白兔2 4 只 由贵阳医学院动物实验所提供 雌雄不限 2 5 3 5 k g 分成3 组 正常组6 只 实验9 只 对照组9 只 以兔右膝关节腔 内注入木瓜蛋白酶造成骨关节炎模型 正常组不造模 正常喂养 对照组造模成 功后 予以o 9 生理盐水灌胃 正常喂养 实验组造模成功后 予以补肾活血 方中药汤剂灌胃 正常喂养 于灌胃的3 5 7 周后分批宰杀 测定硫酸软骨 素的含量 结果 由于我们提取的硫酸软骨素样品太少 离心干燥后无法收集 导致实 验组 用药组 中硫酸软骨素的含量于对照组 o 9 生理盐水 含量有无明显变 化无法检测 3 周5 周7 周实验组中硫酸软骨素的含量与对照组亦无法检测 结论 补肾活血方对实验性骨关节炎中硫酸软骨素含量的是否有影响 由于 我们操作上的失误 以及技术原因导致我们最终未检测出来 关键词 骨性关节炎硫酸软骨素补肾活血方 贵阳中医学院硕 l 学位论文 a b s t r a c t o b j e c t i v e t oo b s e r v et h ee f f e c t o fb u s h e n h u o u e f a n go nc h o n d r o i t i n s u l f a t ei nc a r t i l a g ema t r i xo fr a b b i t sk n e eo s t e o a r t h r i t i s a tt h es a met i me t o e l u c i d a t et h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n b u s h e n h u o x u e f a n ga n d c h o n d r o i t i ns u l f a t ei na r t i c u l a rc a r t i l a g ema t r i xo fo s t e o a r t h r i t i s m e t h o d s t w e n t y f o u rj a p a n sw h i t er a b b i t sw i t hb i ge a r sw e r ed i v i d e di n t o t h r e eg r o u p s i n t a c tg r o u pw i t hs i xr a b b i t s t h ef i r s t e x p e r i me n t a lg r o u p w i t hn i n er a b b i t sa n dt h es e c o n d e x p e r i me n t a lg r o u pw i t hn i n er a b b i t s i n t a c tg r o u pw e r en o r m a l l yr e a r e d t h ef i r s t e x p e r i me n t a lg r o u pa n dt h e s e c o n d e x p e r i me n t a lg r o u pw e r ei n j e c t e dp a p a i ni n t ot h er a b b i t sk n e e j o i n tc a v i t y a f t e rt h ef i r s t e x p e r i m e n t a lg r o u pa n dt h es e c o n d e x p e r i me n t a lg r o u pw e r es u c c e s s f u l l yr e mo d e do s t e o a r t h r i t i s t h ef i r s t e x p e r i m e n t a lg r o u pw e r ep o u r e di n t os t o m a c hw i t h0 9 n sa n dt h es e c o n d e x p e r i me n t a lg r o u pw e r ep o u r e di n t os t o ma c hw i t hd e c o c t i o no f b u s h e n h u o u e f a n g a t3 5 7w e e k st h r e er a b b i t so fe a c hg r o u p w e r ek i l l e di no r d e rt od e t e r mi n et h ec o n t e n to fc h o n d r o i t i ns u l f a t e i n a r t i c u l a rc a r t i l a g ema t r i x r e s u l t a sw ea r et o os ma l lc h o n d r o i t i ns u l f a t ee x t r a c t i o n c e n t r i f u g a ld r y i n g i su n a b l et oc o l l e c t r e s u l t i n gi nt h ee x p e r i me n t a lg r o u p t r e a t me n tg r o u p i n t h ec h o n d r o i t i ns u l f a t ec o n t e n ti nt h ec o n t r o lg r o u p o 9 n o r ma ls a l i n e w h e t h e rs i g n i f i c a n t c h a n g e i nc o n c e n t r a t i o nc a nn o tb e d e t e c t e d 3 5 w e e k sa f t e rt h ee x p e r i me n t a lg r o u p t h ec o n t e n to fc h o n d r o i t i ns u l f a t e i nt h ec o n t r o lg r o u pi sa l s oi mp o s s i b l et od e t e c t 2 一 贵阳中医学院硕士学位论文 c o n c l u s i o n b us h e nh u ox u ef a n go ne x p e r i m e n t a lo s t e o a r t h r i t i si nt h e e f f e c t so fc h o n d r o i t i ns u l f a t ec o n t e n ti na c c o r d a n c ew i t ht h ed e s i g no ft h e s u b j e c tc a nn o tb ed e t e c t e di n b e c a u s et h ed e s i g no ft h es u b j e c tt h e r ei s as e r i o u sp r o b l e m k e y w o r d s o s t e o a r t h r i t i s c h o n d r o i t i ns u l f a t e b u s h e n h u o u e f a n g 3 栅 p p 一4 贵阳中医学院硕 j 二学位论文 1 前言 骨关节炎 o s t e o a r t h r i t i s o a 是临床中的常见病 多发病 又称退行性 关节炎 肥大性关节炎 退行性骨关节病等 乜1 据w h o 统计 在全世界5 0 岁以 上的人口中 骨关节炎 o a 发病率为5 0 5 5 岁以上的人群中 发病率为8 0 因此 骨关节炎 又被称为 下半生疾病 在我国骨关节炎发病率已占到总人 口的1 0 约1 3 亿 5 0 岁以上的人口中发病率更高达6 0 卜7 0 h 舭 骨关节 炎 o s t e o a r t h r i t i s o a 是1 8 9 0 年由g a r r o d 首先提出来 它易被人们误解为 一个 炎症 过程 1 9 0 9 年n i c h o l s 和r i c h a r d s o n 提出了退行性关节病 d e g e n e r a t i v ej o i n td i s e a s e 则说明了该病的病理特征 是进行性关节软 骨变性 软骨下及软骨周围有新生骨形成 从严格意义上讲并不是单一的疾病 而是由多种不同的前置因素通过相同或不同的发病机理所造成的一组临床表现 相同或相近的关节内紊乱综合症 j o i n td i s o r d e rs y n d o m 骨性关节炎的病变 是由于机械性外伤或炎症的多种因素造成关节软骨损伤 而使软骨成分产生自身 免疫反应 造成继发性的关节软骨破坏性骨关节炎 对于骨性关节炎关节软骨的 损伤 修复与重建的研究现状及今后仍是骨科医生关注的问题 宁志杰主编 骨 科临床新进展 2 0 0 7 年7 月第2 版 概括为6 个方面 软骨细胞或组织移植 生长因子对软骨细胞的作用 激素对关节软骨修复的影响 运动对关节软 骨修复的影响 刺激关节软骨修复与再生技术 组织工程软骨构建 近年随着 对o a 研究不断深人 o a 的最基本的病理改变是关节软骨的损伤退变 针对o a 的 发病机理形成了如下一些不同的学说和观点 1 慢性炎症学说 该学说认为 o a 病人滑膜细胞和软骨细胞中的炎症刺激因子及炎症介质产物的水平增高 包括有 降解作用的酶类嘲 2 关节疼痛综合征学说 该学说认为 0 a 是滑膜关节在各 种刺激下 包括衰老 所进行的修复过程 在o a 中几乎所有的病人中都可见关节 疼痛 结构异常和关节功能丧失等改变 但o a 关节疼痛的原因很难确定 3 关 节应力平衡失调学说 研究表明 当关节超负荷时 软骨变形 拱形纤维结构承受 沿胶原纤维方向传导的压力分散到软骨下骨 卸载时 压力消失 纤维恢复到原状 在这一过程中 软骨细胞始终在纤维网格内受到保护嘲 但当负荷传导紊乱时 软 骨基质的拱形结构将遭到破坏 软骨细胞失去保护作用而受损 4 骨内静脉瘀 滞及骨内高压学说 现代医学研究提示 以骨内静脉瘀滞为特征的骨血流动力学 异常及由此所致的骨内高压 可能是导致骨性关节炎的发生 发展的重要因素之 4 贵阳中医学院硕 仁学位论文 一 5 细胞因子及生长因子的作用 细胞因子与生长因子广泛存在于各种组织 中 它们从分子水平上对多种疾病发生 发展起着重要的调节作用 同样细胞因 子在o a 的发病过程中亦起着重要的作用 它可加速软骨基质的分解代谢 加速软 骨退变嘲 现主要介绍如下几种 1 白介素一1 i l 1 i l 一1 可促进滑膜细胞 的软骨细胞合成并释放前列腺素e 2 p g e 2 和胶原酶产生强大的促炎症作用 从 而引起滑膜炎症和骨的吸收 而且形成的p g e 反过来又进一步加强i l 一1 对软骨的 分解作用 使滑膜细胞与浸润性炎性细胞反应性增强啪1 从而造成关节软骨生存 的恶劣微环境 2 肿瘤坏死因子一a t n f q t n f a 可激活多型棱细胞 刺激 滑膜细胞的p g e 产生 增加骨 软骨的破坏 邓廉夫等口铂通过对t n f q 的研究指 出 t n f q 以促滑膜成纤维细胞样细胞增殖作用为主 并因其增强滑膜细胞r n a 的表达功能 而使滑膜组织纤维性变及滑液中细胞因子水平异常升高 从而改变 关节的力学特征和软骨细胞的生活微环境 而成为参与o a 关节软骨退变的途径 之一 3 白细胞介素6 i l 6 又称b 细胞分化因子 其作用与b 细胞功能相关 联 i l 一6 可激活b 细胞和t 细胞 通过其自分泌形式作用于软骨细胞 促进软骨 细胞的增殖 嘲 4 胰岛素样生长因子 i g f o a 病理表现中关节软骨表面粗糙 不平 软骨基质的原纤维性变 软骨细胞肿胀 崩解 增生 导致这种表现的基本 原因之一就是异常增加的胰岛素样生长因子结合蛋白阻碍了i g f l 和受体之间 的结合 而使o a 软骨细胞对i g f 1 不敏感 并且o a 骨赘形成与血清i g f 一1 水平 呈正相关 5 一氧化氮 n o 与一氧化氮合酶 n o s n o 是一种细胞间信使分子 可介导许多生物学现象 n o s 可导致重要炎性介质n o 的产生 n o 可引起软骨代谢 的紊乱 同时可抑制软骨细胞增殖 促使软骨细胞消亡 抑制软骨细胞p g 胶原的 合成 促进其分解 这些变化均可导致关节软骨修复能力下降 软骨破坏增加 加 速软骨退变拍1 6 其他因素 蛋白酶 内皮素 自由基 性激素 内皮素 e t 免疫反应 骨质疏松在o a 的发病过程中也起着重要的作用 本病属祖国医学 痹证 腰腿痛 范畴 中医无骨性关节炎的病名 根 据其临床特点的相关描述 本病最早见于 素问 痹论 风寒湿三气当至 合 而为痹也 其风气胜者为行痹 寒气胜者为痛痹 湿气胜者为着痹 并对本病 的病因 病机 证侯 分类 预后作了叙述 j 下气虚弱是产生痹证的内在因素 内经 云 丈夫 七八天癸竭 精少 肾脏衰惫 形体皆极 肾主骨 瞄1 中医学认为 o a 多因体虚受邪 在内责于气血肝肾亏虚 外源于风 寒 湿之 5 贵阳中医学院硕 j 学位论文 外邪 内外相互影响 互为因果 目前我们对o a 的评估主要是通过放射学资料 因为它可以在较大范围内展 示一个关节的生物力学状态 又可以显示软骨破坏缺失及软骨下骨质的改变程 度 而o a 最早改变是关节软骨 因此早期诊断就必须显示关节软骨 x 线平片虽 然便宜 但只能根据关节间隙的改变来间接判断软骨的受损情况 在检查早期 o a 的影像学方法中 m r i 最有前途 m r i 对软组织分辨率高 可任意面成像及多参 数 多序列成像 可以直接显示软骨 有助于早期诊断o a 在实验室诊断方面 我 们已经发现o a 患者关节滑液层黏蛋白水平比血清明显增高 且与病变范围和病 变程度呈正相关 在o a 的发病过程中 病变的局部分泌一些细胞因子对关节软骨 和滑膜具有明显的破坏作用 在已知的这些因子中 i l i t n f q i l 6 t g f b 是参与o a 病理过程的主要炎症介质 其中i l i 和t n f q 的作用尤为重要 因 此对患者关节液测定发现其滴度明显增高 具有一定的临床指导意义 目前治疗 骨性关节炎的方法有药物治疗 包括 镇痛剂 非甾体类抗炎止痛药 关节内注 射激素 关节内注射透明质酸钠 维骨力 双醋瑞因等 与手术治疗 包括 关 节冲洗术 关节镜清理术 截骨术 软骨 软骨膜或骨膜移植 关节置换术 等 但在临床中具有一定的使用局限性 要么是副作用大 要么是价贵且对症治疗并 不能消除病因 镇痛剂只改善症状 不能消除病因 非甾体类抗炎止痛药其中有 一部份 如吲哚美辛 阿司匹林 保太松等 对软骨基质的合成有抑制作用 长 期应用虽然关节疼痛改善 但是骨性关节炎的基本病变反而会加重 糖皮质激素 具有较强的抗炎作用 并可阻断基质金属蛋白酶的合成和激活 对软骨代谢有一 定的作用 但若大剂量反复多次使用 则阻碍软骨修复过程 使蛋白多糖和透明 质酸生物合成下降 加上糖皮激素的止痛作用 使疼痛消失 可导致关节过度使 用而加重软骨损失 维骨力 又名氨基葡萄糖 有轻度恶心 便秘 嗜睡等不良 反应 对糖尿病或糖耐量异常者可能出现潜在影响 双醋瑞因可出现短暂行的腹 泻 关节冲洗和关节镜清理虽然效果均是理想的 但并不是对所有患者都有效 截骨术只适用于膝关节的内翻与外翻的病人 目前用于骨软骨移植产生生物学关 节软骨用的移植材料有骨膜 软骨膜 骨软骨 同种异体移植物以及含有软骨细 胞的葡萄糖膜糖胶原凝胶等 张继春等啪1 应用关节镜下自体骨软骨镶嵌式移植修 复股骨关节面软骨缺损取得了较好且确切的治疗效果 此手术的适应证 适用于 局灶性软骨病损 年龄4 5 岁以下的患者 软骨缺损范围较小 一般不超过2 3 个移 6 贵阳中医学院硕十学位论文 植物 关节置换术对于关节软骨破坏较多 疼痛严重 经其他治疗疗效甚微者 可建议行关节置换术 但是采用该术式的患者年龄不易过小 本文通过对补肾活 血方与硫酸软骨素之间关系的研究 意在为今后的临床治疗用药提供初步理论依 据 便于进一步开发中药的优势 造福于民 7 贵阳中医学院硕 i 学位论文 2 1 材料与方法 2 1 1 实验动物 2 正文 6 1 0 月龄健康日本大耳白兔2 4 只 体重2 5 3 5 k g 雌雄不限 由贵阳医学 院动物中心提供 饲料由该中心提供标准饲料 按照组间均衡一致的原则 将 2 4 只日本大耳白兔随机分成3 组 正常组6 只 对照组 造模成功后用o 9 生理盐水灌胃 9 只 实验组 造模成功后用补肾活血方中药汤剂灌胃 9 只 2 1 2 实验主要试剂与仪器 木瓜蛋白酶 p a p a i n 上海蓝季科技发展有限公司 硫酸软骨素标准品 曲阜市海听生物制品厂批号 0 9 0 4 0 5 胰蛋白酶 上海蓝季科技发展有限公司 胃蛋白酶 上海蓝季科技发展有限公司 h c l 成都科龙化工试剂厂 n a o h 成都科龙化工试剂厂 高岭土 上海蓝季科技发展有限公司 活性炭 9 5 乙醇 乙醚 骨科常用手术器械 温度计 滤纸 分液漏斗 离心机 干燥器 试管 恒温水浴箱 冷冻库 g b c 紫外可见分光光度计 8 贵阳中跃学院硕士学位论文 间苯三酚 湘中精细化学品厂 冰醋酸 上海化学试剂有限公司 超声波清洗机 全自动电子分析天平 2 1 3 实验药物 补肾活血方由熟地1 0g 牛膝1 0g 仙灵脾1 0g 独活1 2 g 木瓜1 0g 山药2 0g 当归1 0 g 川断1 0g 威灵仙6g 红花1 0g 制乳香3g 制没 药3g 骨碎补6g 玄胡1 0 组成 中药捣碎按原方以蒸馏水2 0 0 0 毫升煎煮1 小时 过滤后取滤液装入袋中 贵阳中医学院中药方已煎好 贮于冰箱中备用 2 1 4 造模方法 按照日本鬼头康彦等阳1 的兔膝关节腔内注入木瓜蛋白酶造成骨关节炎病变 模型方法 将日本大耳白兔右膝关节腔内注入1 6 木瓜蛋白酶生理盐水溶液 0 5 m l 隔2 天后再注射第二次 再隔2 天后注射第三次 共注射3 次 2 1 5 实验方法 2 4 只健康日本大耳白兔正常饲养1 周后 对照组与实验组按上述造模方法 造模 于末次造模注射后的第2 8 天开始 对照组给予0 9 n s 8 4 m l k g d 灌胃每 天一次 实验组给予的补肾活血方中药汤剂8 4 m l k g d 灌胃每天一次 正常组 正常饲养 3 5 7 周后 对照组 实验组每次取3 只宰杀后取软骨 正常组 每次取2 只宰杀后取软骨 留取标本 2 1 6 硫酸软骨素的提取 参照邬开朗曲1 等与罗曼等n 的方法并作改进 高温蒸煮与碱解 将软骨投入恒温蒸煮器内于8 0 c 煮4 6 小时 蒸馏水 洗净 放入冷库于 2 5 c 速冻6 8 小时后立即绞碎 称重后按原料与2 n a o h 的比 例为1 6 2 5 的量加入2 n a o h 室温提取1 5 小时 然后用2 m o l l h c l 调p h 到 6 6 5 定量滤纸 漏斗过滤 留下滤液 滤渣再以l o 1 2 的比例加2 n a o h 于4 0 c 下提取l 小时 再用定量滤纸过滤 弃滤渣 取滤液 合并两次滤液 并测量体积待用 酶解 滤液用2 m 0 1 几h c l 调p h 到8 o 一9 0 按滤液与胰蛋白酶1 0 0 0 o 5 的比例加入胰酶 于4 0 5 0 c 水解l 小时后 再按1 0 0 0 0 5 的比例加入胃蛋白 酶 4 0 5 0 t 2 水解1 5 小时 水解完毕后定量滤纸过滤并加入高岭土和活性炭 使 9 贵阳中医学院硕 学位论文 其浓度为0 5 进行吸附 同时慢速间歇搅拌4 小时 置4 下自然澄清 取上 清液 弃沉淀 反萃取 按体积比1 1 向上清液中加入氯仿充分混合 静置待分层后弃 去氯仿层 留水层 沉淀 将上述水层 调p h 到6 8 7 2 再加入2 5 体积9 5 以上乙醇沉淀 待澄清后 弃清液 以1 5 0 0 r m i n 离心7 1 0 分钟 收集沉淀 其沉淀物即为硫 酸软骨素 干燥 将上述沉淀于盛有五氧化二磷的干燥器中即得成品 2 1 7 硫酸软骨素含量的测定 参照高华等n 订与齐敬总等口幻的硫酸软骨素含量测定的方法 原理 利用硫酸软骨素 c s 与含有间苯三酚的无机酸在1 0 0 反应3 0 分 钟 生成有色物质在波长5 5 8 n m 处有最大吸收 通过比色测定硫酸软骨素的含量 硫酸软骨素标准溶液的配制 准确称取己干燥至恒重的硫酸软骨素0 2 5 克 于2 5 毫升量瓶中 加蒸馏水使其溶解稀释至刻度并摇匀 间苯三酚溶液 反应试剂 的配制 取冰醋酸3 0 毫升 盐酸4 0 毫升和 5 0 毫克 毫升间苯三酚乙醇溶液1 0 毫升混合 临用时配制 吸收光谱的测定 准确吸取硫酸软骨素标准溶液0 4 毫升 置于1 0 毫升 量瓶中 用蒸馏水稀释至1 o 毫升 加入间苯三酚溶液3 毫升 盖塞后混匀 将 量瓶置于沸水浴中加热3 0 分钟后取出 立即置于冰水浴中冷却5 分钟 用冰醋 酸稀释至刻度 混匀 以试剂空白为参比 在4 0 0 8 0 0 n m 波长范围内扫描 见 在波长5 5 8 n m 处有最大吸收 选择波长5 5 8 n m 作为测定波长 绘制标准曲线 吸取硫酸软骨素标准溶液 分别配制浓度为o 1 0 2 o 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 1 o o 毫克 毫升溶液 同 步操作 在 波长5 5 8 n m 处测定吸收度 以吸收度为纵坐标 浓度为横坐标 绘制标准曲线 得其回归方程 硫酸软骨素 c s 的样品测定 取1 0 5 干燥至恒重的硫酸软骨素 c s 的样品 精密称定其质量 置i 0 0 毫升量瓶中 加蒸馏水适量溶解 并加蒸馏水 至刻度 摇匀 取l 毫升溶液 按上述方法测定 2 2 结果吸收度测定 1 0 贵阳中医学院硕士学位论文 0 7 5 a b s 0 7 0 6 5 0 6 0 与5 0 5 0 4 5 0 4 0 3 5 0 3 0 2 5 一 一 一一 7 j 弋 7 x 1 j j 一彳 川 j 3 9 0 0 4 0 0 04 1 0 04 2 0 0 4 3 0 0 4 4 0 0 4 5 0 0 4 6 0 04 7 0 0 柏0 04 9 0 05 0 0 0 nm 我测定的硫酸软骨素标准溶液在4 4 2 n m 处有最大吸收 故该实验的的标准 曲线与回归方程都是在4 4 2 n m 处测定的 标准曲线与回归方程 吸光度0 1 9 7 10 2 6 7 90 3 3 1 4 0 4 1 0 60 4 7 1 1 0 5 3 4 90 6 1 3 4 0 6 7 8 90 7 3 5 7 0 8 1 0 2 回归方程 y 0 6 7 0 9 x 0 1 3 4 5 r 0 9 9 9 5 y 吸光度ax 浓度m g m l 贵阳中医学院硕 i 学位论文 r 线性关系 造模后日本大耳白兔均有跛行 右下肢不着地 自发活动减少 触摸右膝关 节时出现挣扎和弹腿 但无明显肿胀 未扪及骨赘 对照组造模时第一次木瓜蛋 白酶注射后死亡一只 实验组用药2 周灌胃后死亡一只 取材时各调整各组数量 死亡数不计 但遗憾的是我们每次提取硫酸软骨素时析出的白色沉淀物很少 如 图1 再经过五氧化二磷干燥后无法测定其质量 所以导致无法采用紫外分光 光度计测定其含量 2 3 实验讨论 骨性关节炎是一种慢性 渐近性 退行性关节病变 女性多于男性 骨性 关节炎的定义是 可动关节由于关节软骨退行性变和关节表面边缘形成新骨为 特征的内在的非炎症性疾病 日本人称之为变形关节炎 肥大性关节炎 美国 人称之为退行性关节炎 欧州人称之为骨关节病 近年来许多学者一般统称其 为骨性关节炎 骨性关节炎常累及一个或多个关节 影响关节软骨 其特征为 关节软骨的进行性退变 剥脱 消失及关节边缘和软骨下骨组织发生反应性改 变为主 关节边缘有新骨形成 有不同程度骨质增生 退变的速度超个修复及 再生的速度 最终导致功能的丧失 最早期的骨性关节炎的病理表现是 软骨 的改变一破损 疾病进展致软骨下改变一骨赘 骨刺 形成 临床表现为进行 性 慢性发展的关节肿痛 僵硬 活动受限并伴有继发性滑膜炎m 嘲州 其病 的严重程度与关节软骨的损害程度密切相关n 引 骨性关节炎的发病原因有以下 几个方面 1 年龄 5 0 岁发病率为5 0 5 5 岁以上发病率为8 0 6 0 岁为9 0 7 0 岁以上为9 8 1 0 0 2 性别 男女均可发病 女多于男 特别是绝经后的女 性 3 体重 肥胖易发病 4 应力 膝内 外翻使膝关节内 外侧受力不均匀 5 营养 影响软骨细胞的功能 6 气候 潮湿 寒冷导致骨内循环功能障碍使骨 内压与关节内压升高 7 遗传 8 肌肉无力 9 钙代谢紊乱 继发于其它疾病 关节的创伤性疾病 关节内骨折或脱位 关节创伤或关节附近的创伤有时会产 生骨性关节炎 关节的感染性疾病 各种化脓性关节炎症 关节感染可能改变 软骨的化学成分而导致骨性关节炎 关节的病理性疾病 关节软骨瘤等 先 天性关节疾病 先天性髋关节脱位 股骨头软骨病等 糖尿病等内分泌代谢紊 乱所致疾病 痛风 四肢骨干骨折畸形愈合 它造成关节面应力的生物力学 改变 关节受力不平衡 导致负荷增加 软骨面发生损害 1 2 贵阳中医学院硕士学位论文 肾虚血瘀是中医的主要病机之一 可以从诸多方面影响o a 的发病 如 辨证 论 痿证门 中指出 肾空干涸 何能充足于骨中之髓耶 素问 生气通天论 有云 肾气乃伤 高骨乃坏 即将骨骼的退变和肾气 精 衰退联系起来 素问 上古天真论 日 丈夫 五八 肾气衰 发堕齿槁 七八 肝气衰 筋不能 动 说明肾气充 肝血旺 方能骨坚筋强 而肾精不足 肝血亏损 则骨髓失其 充养 筋脉濡养不足 表现为骨骼脆弱或异常增生 筋纵弛缓 或筋挛拘急 风寒湿 邪侵于骨关节 则引起气血运行不畅 局部经络痹阻 筋挛拘急不伸 骨骼受到牵 拉损伤 久之形成增生退变 关节软骨可分四层 1 表层或叫切线层 占关节软骨厚度的5 一1 0 细胞 呈盘状 与胶原纤维均呈水平排列 与软骨表面平行 具有对抗关节软骨的磨损 作用 2 中间层或称移行层 占关节软骨厚度的4 0 4 5 胶原纤维随机排列 相互交织成网状 细胞较大呈球形或卵圆形 分布均匀但不规则 3 深层或称 放射层 占关节软骨厚度的4 0 4 5 胶原纤维自下而上呈放射状排列 向上垂 直于软骨表面 向下深入固定于软骨盘下 细胞呈球形 常为串状分布 与关节面 垂直 呈放射状排列 4 钙化层 占软骨厚度的5 1 0 紧邻骨质 细胞少 有大量钙盐沉积 中间层及深层主要承担生理性压缩 其纤维呈不同方向的网状 支架排列 软骨的生长主要靠中间层 软骨借钙化层牢固地附着于骨质 关节软 骨的营养主要来自关节液 当关节运动时 软骨承受生理性压缩 呈现压缩变形卜 压力解除或移行至另一部软骨时 则借助软骨的弹性而复原 因而产生 唧筒 作用 使滑膜营养成分进入软骨 正常软骨呈光滑 发亮 微蓝色 且有弹性 衰退时呈微黄 不透明 弹性减退 甚至出现了龟裂及剥脱n 幻 关节软骨由维持功能的细胞外基质 e x t e r a c e l l u l a rm a t r i x e c m 及软骨 细胞组成 厚约i r a 7 咖 基质占了软骨绝大部分体积 而软骨细胞仅占软骨容 积的l 关节软骨 软骨基质 软骨细胞 也就是说 关节软骨内只有一种 细胞一软骨细胞 其余都是细胞外基质 e c m 没有神经及血管分布 软骨基质 由胶原 蛋白多糖 水三种物质组成 软骨基质 胶原 蛋白多糖 水 胶原 是一种纤维蛋白 维持软骨的构造与形状 蛋白多糖是填充材料 在胶原纤维之 间提供软骨的韧性与弹性 水占软骨湿重的8 0 用作充盈组织 给软骨正常的 性质 胶原占基质的6 0 关节软骨是透明软骨 透明软骨是i i 型胶原 蛋白多 糖占基质的4 0 这些大的水化了的蛋白多糖分子包绕所有的部位 并松散地附 1 3 贵阳中医学院硕 j 学位论文 着在胶原纤维上 蛋白多糖被酶降解后 软骨仍然保持外形 但已失去了 弹性 蛋白多糖是一种发粘的胶冻分子 是极端亲水分子 这也是关节软骨高 含水量的原因 产生高度的张力使软骨具有弹性来对抗压力 蛋白多糖由核心 蛋白共价结合多糖链 糖胺聚糖 组成 用钢筋混泥土模型结构可以形象地把 蛋白多糖与胶原之间的关系弄清楚 蛋白多糖 混泥土 胶原 钢筋 软骨的 蛋白多糖主要有4 一与6 一硫酸软骨素同分异构体 硫酸皮肤素 硫酸角质素 三种类型跚删 软骨中的硫酸软骨素是最主要的糖胺聚糖 约占总量的5 5 9 0 它的每一条链由2 5 3 0 个重复二糖单位组成 关节中的硫酸角质素主要存在蛋 白多糖聚合体中 不像硫酸软骨素一样定义明确 透明质酸钠也是一种糖胺聚糖 它是非硫酸化的 而且不与核心蛋白共价结合 因此不是蛋白多糖的组成n 司n 引 蛋白多糖的合成中硫酸软骨素在s e r q l y 口1 序列中通过独特的四糖与特定 的丝氨酸残基相连 蛋白多糖的分解 核心蛋白的裂解部位位于g 1 结构域 透 明质酸结合区域 和g 2 结构域 富含硫酸软骨素 富含硫酸角质素区域 把蛋 白多糖上的聚合部份与含糖胺聚糖链的部份分解开 这些裂解片区域从软骨中排 出 这些片断可以在关节液中找到 并可通过滑膜进入淋巴系统 沿淋巴系统至 血液循环 甚至在尿中被发现 在体液 至少在关节液中可以定量分析蛋白多糖 片断 硫酸软骨素 的水平 此值可以测定关节软骨的活性与代谢n 司n 毗n 7 1 当关 节软骨退变时蛋白多糖的分解加快 故我们可以测定关节软骨中硫酸软骨素的含 量以了解关节软骨的退变情况 骨性关节炎的治疗多采取综合治疗 目前治疗药物有控制症状的药物如 1 镇痛药 百服宁 可待因 辣椒素 曲马多 2 非甾体消炎镇痛药 布洛芬又 叫新解通 芬必得 吲哚美辛又叫消炎痛 萘普生 萘普酮 舒林酸 双氯灭痛 奥湿克 舒林酸等 3 糖皮质激素 康尼克通 醋酸泼尼松龙 4 外用药物 扶 他林 伤痛一喷灵等 目前治疗药物还有改变病情的药物和软骨保护剂如 玻 璃酸钠 又叫透明质酸钠 施沛特 有润滑关节 改善炎症反应 缓解疼痛之作 用 维骨力 又叫硫酸氨基葡萄糖为治疗骨性关节炎的特异性药物 四环 素族抗生素 硫酸软骨素 它能外源性补充葡糖胺聚糖 以减少软骨损失 恢 复软骨的功能 目前国内已有自己生产的硫酸软骨素片剂 针剂 过氧化物岐 化酶 欧美用得多 其它 骨重吸收剂 细胞因子等 骨关节炎i l 一1 的抑制 剂双醋瑞因 上述药物在临床中具有一定的使用局限性 要么副作用大要么价 1 4 贵阳中医学院硕士学位论文 格昂贵 镇痛剂只改善症状 不能消除病因 对乙酰氨基酚被认为是用药物控制 疼痛最有效的方法 为了缓解o a 的疼痛 国外推荐首选对乙酰氨基酚 扑热息痛 因该品止痛效果好 不良反应少 及费用低 通常总量不超过3g d 但长期大剂 量使用有引起肝或肾损伤的报告 伴有膝关节积液或持续疼痛的患者 宜选用其 他药物 非甾体类抗炎止痛药这类药物具有抗炎 止痛和解热作用 适于治疗o a 国外研究显示如阿司匹林 水杨酸 保泰松 吲哚美辛和萘普生等 对关节软骨 基质蛋白聚糖合成有抑制作用 不利于o a 故不宜选用 至少不应长期使用 另一 些药物如双氯芬酸 美洛昔康 萘丁美酮 依托度酸 舒林酸和阿西美辛等 对 软骨基质蛋白聚糖的合成无不良影响 甚至有促进合成作用 而适于选用 而且 作为选择性环氧合酶一2 抑制剂的美洛昔康 依托度酸和萘丁美酮等都有与特异性 环氧合酶一2 抑制剂具有相当的胃肠安全性 以及对心血管和肾的不良影响少 国 外有长期用于治疗o a 的报告 糖皮质激素具有较强的抗炎作用 并可阻断基质金 属蛋白酶的合成和激活 对软骨代谢有一定的作用 但若大剂量反复多次使用 则阻碍软骨修复过程 使蛋白多糖和透明质酸生物合成下降 加上糖皮激素的止 痛作用 使疼痛消失 可导致关节过度使用而加重软骨损伤 透明质酸对关节运 动可提供几乎无摩擦的表面 因而对正常关节功能十分有利 o a 时 透明质酸被破 霉 坏 滑液黏性降低 润滑作用消失 及关节表面的光滑运动丧失 从而导致进一步 关节破坏 有资料证实 关节腔内大分子量透明质酸补充治疗有利于缓解关节疼 一 痛 增加活动度 消除滑膜炎症及延缓疾病进展 该品主要用于膝关节o a 适于对 常规治疗疗效不佳 或不能耐受止痛剂或非甾体抗炎药治疗者 但是该产品价格 昂贵 经过我们临床观察 并非对所有病人都有效 多年来人们一直都在探索控 制o a 发展以及改变病情药物 自1 9 6 9 年德国首次临床验证硫酸氨基葡萄糖 g l u c o s a m i n es u l f a t e 6 s 治疗o a 之后 尤其近2 0 年 无数短程和长程随机双盲 对照观察g s 治疗膝o a 的结果都提示 该产品既能抗炎止痛 又有延缓膝o a 发展的 作用 g s 被认为是第一个改变o a 病情的药物或慢作用药 又因体外实验证实其对 软骨代谢的良好作用 也称其为软骨保护剂 氨基葡萄糖 为一氨基单糖 是形成 所有结缔组织包括软骨基质葡糖胺聚糖的基本成分 硫酸氨基葡萄糖是氨基葡萄 糖的硫酸盐 口服后 至少9 0 被吸收 吸收后4h 达到关节软骨 g s 对软骨有特殊 的趋向性 并由软骨细胞结合到蛋白聚糖 再分泌到软骨细胞外基质 该品的硫酸 部分在蛋白聚糖的合成中起重要作用 因为构成葡糖胺聚糖需要高度硫酸化 体 1 5 贵阳中医学院硕j 学位论文 内无机硫酸减少可导致葡糖胺聚糖合成减少 外源性硫酸的补充可抵消硫酸减少 的不良影响 可见 其他品种如盐酸氨基葡萄糖则不可能满足这种生理过程的需 要 g s 对o a 的作用机制可能与刺激软骨蛋白聚糖生物合成 减少分解代谢酶活性 逆转白细胞介素 i l 一l 对软骨代谢的不良影响 及降低超氧化基团的产生有关 以及g s 可增加软骨特异性i i 型胶原合成 g s 有和布洛芬相当的抗炎止痛作用 但 与抑制前列腺素无关 而与刺激蛋白聚糖生物合成有关 据称 新合成的蛋白聚糖 可稳定细胞膜 减少超氧自由基及抑制溶酶体酶 但是硫酸氨基葡萄糖有轻度恶 心 便秘 嗜睡等不良反应 对糖尿病或糖耐量异常者可能出现潜在影响 硫酸 软骨素作为骨关节炎的治疗辅助药物 疗效显著 副作用小 近年来其作用机制 得到了确认 在鼠尾静脉注射弗氏完全佐剂诱发骨关节炎 口服硫酸软骨素可以 减轻炎症区域的肿胀度 减轻关节炎对软骨的损害 如果联合使用硫酸氨基葡萄 糖 还能明显降低关节炎的临床指标 如发病率 关节温度 痛觉增敏 白细胞 介素 i l 一1 7 k 平 双醋瑞因 d i a c e r e i n 安必丁 是近几年在国内开始使用的一种 新的治疗骨性关节炎的药物 该品为大黄提取物 活性成分为二乙酰大黄酸 实 验研究证明 该品通过抑 i i l ib 和氧自由基的产生和释放 抑制金属蛋白酶的 活性及稳定溶酶体膜而发挥抗炎及对关节软骨的保护作用 改善o a 病程 用于治 疗o a 并被列入治疗o a 的慢作用药 双醋瑞因1 0 0m g d 为最佳剂量 能明显改善患 者症状 其副反应仅为短暂腹泻 其前 欧洲报告用该品连续3 年治疗髋o a 的结果 提示 该品对软骨有保护作用 在中医临床实践中应用补肾活血方治疗骨性关节 炎取得了较好的疗效 本课题旨在通过补肾活血方对骨性关节炎中硫酸软骨素的 影响 为今后的临床治疗用药提供初步理论依据 便于迸一步开发中药的优势 活体内软骨处在不断代谢之中 蛋白多糖 胶原均由软骨细胞合成 分解与 合成代谢在正常软骨中维持平衡 骨性关节炎时 分解加强 以致基质丢失 薛 延等n 引研究证明 随着年龄的增长软骨基质中蛋白多糖的主要改变表现在 大分子降解成小分子 糖醛的含量减少 硫酸软骨素和半乳糖胺的比例降低 而硫酸角质素和蛋白质的比例增高 汪晓丹等n 引通过对关节软骨生化成份的 研究 认为年幼者关节软骨硫酸软骨素含量较高 故软骨的刚性与弹性较高 而年长者硫酸角质素和蛋白质的含量及纤维化程度增高 可能是软骨退变的 一种重要原因 郭建刚等乜阳研究认为补肾活血中药能使软骨糖醛酸 代表蛋白多 糖含量 的含量增加 从而促进软骨基质的合成代谢 而对基质的分解代谢的 1 6 贵阳中医学院硕士学位论文 抑制作用则较弱 o a 以虚证为主 但虚久必瘀 故很多学者采用补肾的同时加以 活血化瘀 许学猛等乜订用补肾活血汤治疗兔膝o a 显示该方能有效防治膝o a 骨 内高压的发生发展 延缓o a 的进展 翁金花乜2 1 采用补肝肾 益气活血同重治疗 o a 共1 1 8 例 收效良好 贾明述等乜3 1 自拟强筋壮骨丸治疗o a 方由熟地黄 盐炙 狗脊 山茱萸 骨碎补 肉苁蓉 牡丹皮 牛膝 鸡血藤等药组成 具有补肝肾 强筋骨 养血活血之功效 王和鸣等口钔认为膝o a 是由肝肾不足或外力损伤等因 素引起 因气血 经脉受损 以致瘀阻脉络 造成骨关节病损 治当滋补肝肾 活血 祛瘀 通络止痛 补肾活血方由熟地i 0g 牛膝1 0g 仙灵脾1 0g 独活1 2g 木瓜1 0g 山药2 0g 当归1 0g 川断1 0g 威灵仙6g 红花l og 制乳香3g 制没 药3g 骨碎补6g 玄胡1 0 组成 本实验中所用的补肾活血方正是补肾活血以 治其本 熟地为甘 微温之品 有补血滋阴 益精填髓之功 牛膝味苦酸 性平 有祛风湿活血祛瘀之功 淫羊藿又叫仙灵脾为辛 甘 温之品 有补肾阳 强筋 骨 祛风湿之功 独活性温味辛苦 能去风湿 通痹止痛 木瓜平肝舒筋 和胃 化湿 用于湿痹拘挛 腰膝关节酸重疼痛 当归可补血活血 川断补肝肾 续筋 骨 调血脉 威灵仙祛风除湿 通络止痛 主治痛风顽痹 风湿痹痛 肢体麻 木 红花活血祛瘀止痛 乳香 没药散血祛瘀 消肿定痛 骨碎补补肾强骨 续 伤止痛 玄胡活血散瘀 利气止痛 所选补肾活血药中 淫羊藿 骨碎补有很强 的滋补强壮作用 可增强机体免疫功能 山药水提液的体外实验表明 具有促进 干扰素生成和增加t 细胞数的作用 在实验性关节炎大鼠的研究中 山药水提 液能显著抑制c u 2 对y 球蛋白的变性作用 表明具有抗关节炎的作用 目前大多数学者认为 肾虚是o a 发病的根本 而瘀血阻络是发病的关键因 素 故治疗应以补肾活血为主 现代药理学也证明具有补肝肾 益气血作用的复 方中药能抑制软骨退变 促进软骨细胞的基质合成 抑制胶原分子的变性 提高 s o d 活性 这对延缓软骨退变 促进软骨修复极为有利乜湖1 高文香等啪1 制造出兔o a 模型 分别以补肾中药 鹿角胶 肉苁蓉 骨碎补等 和活血中药 桃仁 红花 川 芎等 进行治疗 证实在o a 发病初期活血中药治疗作用较佳 随着病程进展 则以 补肾中药治疗作用占优势 肾主骨为中医基础理论之一 其主要精华为肾藏精 生髓 养骨 肾含 有部分内分泌功能 特别是下丘脑 垂体一性腺轴 对维持骨的正常状态有 1 7 贵阳中医学院硕 学位论文 密切关系 性腺对骨组织的发育 生长 及其代谢活动具有重要作用 性激素水 平下降 可致关节软骨变性 中医认为肾虚为整体功能低下的失调 表现为免疫 功能低下 下丘脑 垂体所辖的靶腺如性腺 肾上腺皮质 甲状腺等 在结构 与功能上均有异常改变 补肾中药其作用可能为 调整了体内性激素水平 对 骨的生长产生了间接的影响 直接影响了骨组织的代谢活动 从而促进了骨形 成速度 骨性关节炎的实质是软骨的退行性改变 其中包括软骨结构及成分的改变 一系列的研究证明 无论是人还是动物模型的骨性关节炎病变软骨 软骨基质所 含的蛋白多糖渐进性减少 含水率渐进性增加 与水亲和力增加 而胶原的含量 则相对稳定不变 本实验采用木瓜蛋白酶所致骨性关节炎模型 测定正常组 对 照组 实验组家兔右膝关节中关节软骨中硫酸软骨素的含量 通过实验所得的数 据来分析硫酸软骨素的含量 但是遗憾的是本实验没有达到预期的效果 1 8 贵阳中医学院硕 t 学位论文 2 4 实验结论 通过本实验我们虽然没有得出预期结论 但是已经基本掌握了硫酸软骨素的 在关节软骨中的作用以及硫酸软骨素的提取方法 现总结出一些我们失败的经验 教训以及对该课题提出的疑惑 以供以后继续研究 1 我认为该课题的设计存在一些问题 紫外分光光度计的工作原理是先确 定某种化合物的紫外吸收光谱 确定最大吸收波长 在选定的波长下 作出化合 物溶液的工作曲线和回归方程 根据在相同条件下测得待测液的吸光度值来确定 待测液中该化合物的浓度 所以说我们采用紫外分光光度计测定的只是化合物的 浓度而不是质量 而我们参照邬开朗阳1 等与罗曼等n 帕方法并改进 在相同的条件 下提取了正常组 对照组 实验组的硫酸软骨素 因为我们采用同样的提纯方法 故提取的硫酸软骨素的浓度应该大致相同 我们来做个假设 未提纯之前 正常 组中硫酸软骨素的含量为0 8 对照组由于造模 灌生理盐水含量降为0 6 实验组造模 灌中药汤浓度变为0 7 经过同样的方法提纯 正常组溶解掉的 杂质最少 实验组溶解掉个杂质次之 对照组溶解掉的杂质最多 最终三个组浓 度应该大致相同 因此 再采用紫外分光光度计测定浓度只是测定出提纯后的硫 酸软骨素的浓度 既然都已经提纯了 浓度应该相同 所以再测定就毫无意义 2 该试验中发现 因该法需要