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生物化学与生化药品教案下载.doc 高职课件教案下载引入新课蛋白质(protein)是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子,并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此,研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题。可以说没有蛋白质就没有生命。第一章 蛋白质的化学第一节蛋白质是生命的物质基础pro在生命活动中的重要性主要表现在两个方面。一、蛋白质是构成生物体的基本成分蛋白质在生物体中普遍存在，从简单的低等生物到复杂的高等生物，都含有蛋白质。人体中pro种类达10万种以上，按重量计算占人体干重的45%，在各组织中的含量为17%-20%，微生物中pro含量较高，细菌中一般含5080%，病毒中除遗传物质外，其余成分几乎为蛋白质，高等植物细胞原生质和种子中蛋白质含量也较高。二、蛋白质具有多样性的生物学功能 pro在生物体内占特殊地位，pro和核酸是构成cell原生质的主要成分，原生质是生命的物质基础。pro在生命活动过程的作用主要表现为： 1、生物催化作用：生命的基本特征是新陈代谢，新陈代谢包括物质代谢和能量代谢，在物质代谢过程中的化学反应都需要酶的作为催化剂，而绝大多数的酶的本质是pro。2、代谢调节作用：生命活动中参与代谢调节的许多激素是pro或多肽。eg：胰岛素，调节提人血糖浓度。3、免疫保护作用：具有机体免疫功能的抗体是一类特殊的球状pro，它能识别入侵体内的异物，如细菌、病毒。4、转运与贮存的作用：体内小分子物质的转运和贮存可通过一些特殊的蛋白质来完成。eg：血红蛋白运输氧和二氧化碳。5、运动与支持作用：负责运用的肌肉收缩系统是蛋白质。eg：肌动蛋白、肌球蛋白等。6、控制生长和分化作用：主要是指生物体在自我复制、遗传信息传递过程中发挥的作用，eg：核蛋白；还有些蛋白在基因表达过程中起到调节作用，eg：阻遏蛋白。7、接受和传递信息的作用：我们通常把这类蛋白称为受体蛋白，在cell与cell之间传递信息。8、生物膜功能：cell生物膜的基本成分是pro和脂类。主要与体内物质的转运和能量的转换有密切关系。另外，近来还发现有些蛋白质具有记忆和识别功能等。综上所述，蛋白质具有广泛的生物学功能，参与生命的各种活动。生命活动不可能离开蛋白质，蛋白质是生命活动的基础。 第二节蛋白质的化学组成一、蛋白质的元素组成元素分析结果表明，蛋白质主要含碳、氢、氧、氮、四种元素，此外有些蛋白质含有硫或磷，少量pro还含有金属元素。蛋白质种类繁多，但各种蛋白质的含氮量十分接近而且恒定，平均含氮量为16%，即100gpro中含有16g氮，也就是说每克氮相当6.25gpro。因此只要测出样品中含氮量，就可以计算出生物样品中蛋白质的大致含量,这是凯氏定氮法测定蛋白质含量的依据。计算公式：每克样品中蛋白质的含量=每克样品中含氮量6.25二、蛋白质的基本结构单位氨基酸（一）氨基酸的概念氨基酸是羧酸分子中-碳原子上的一个氢原子被氨基取代而生成的化合物，又称为-氨基酸。其结构通式为：其中r代表氨基酸侧链基团，r不同代表不同氨基酸天然pro经酸、碱或酶彻底水解的最终产物为氨基酸，所以氨基酸是蛋白质的基本结构单位。（二）氨基酸的结构特点参与组成蛋白质的20种氨基酸,除脯氨酸是一种-亚氨基酸外,其余的都是-氨基酸。这些氨基酸结构不同，但具有一些共同的特性：1、既有酸性的羧基（-cooh），也有碱性的氨基（-nh2），故称为两性电解质。2、除甘氨酸外，其它氨基酸的-碳原子都是手性碳原子，具有旋光异构现象。凡氨基在-碳原子右侧者为d型，在左侧者为l型，天然氨基酸大多数为l型。3、各种氨基酸的侧链r基团的结构和性质不同，是氨基酸分类的基础，它们在决定蛋白质性质、结构和功能上起重要的作用。氨基酸的名称通常用三字或英文开头的三个字母表示。如图表3-3（三）氨基酸的分类根据氨基酸侧链r基团的结构和性质可将20种氨基酸分为四类，1、酸性氨基酸r基团含羧基，在ph7时，羧基完全解离，分子带负电荷。如谷氨酸（glu）、天门冬氨酸（asp）。2、碱性氨基酸r基团含碱性基团，在ph7时，这些基团基质子化而带正点荷。如赖氨酸（lys）r基中含氨基、精氨酸（arg）r基中含胍基、组氨酸（his）r基中含咪唑基。3、极性非电离氨基酸r基有极性，但在中性溶液中不解离。如甘氨酸（gly）七种等。4、非极性氨基酸r基有疏水性。主要是脂肪族、芳香族以及杂环氨基酸。（四）氨基酸在蛋白质分子中的连接方式1、肽键一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合形成的共价键称肽键或酰胺键。pro分子中各个氨基酸分子通过肽键彼此相连2、肽氨基酸通过肽键连接形成的化合物称为肽。最简单的肽由两个氨基酸通过一个肽键连接而成,称为二肽;随着所含氨基酸数目的增加,依次称为三肽、四肽、五肽等。在生物体内,氨基酸通过肽键连接,除了合成蛋白质多肽链外,还能合成一些具有调节功能的小分子肽,称为生物活性肽。这些物质在调节代谢、生长，繁殖等生命活动起重要作用。重要的有谷胱甘肽、神经肽、肽类激素等。谷胱甘肽：全称为谷胱甘肽（gsh），它是由谷氨酸、半胱胺酸和甘氨酸组成的三肽，全称为谷氨酰半胱胺酰甘氨酸，其中半胱胺酸中的-sh（巯基）可氧化、可还原。其生理作用包括：1）解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性。2）参与氧化还原反应：作为体内重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应。3）保护巯基酶活性，使巯基酶的活性基团-sh维持还原状态。4）维持红细胞结构稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏3、氨基酸残基由于形成肽键的-羧基与-氨基之间缩合释放出一分子水,肽链中的氨基酸已不是完整的分子,因而称为氨基酸残基。4、多肽链由多个aa借助肽键连接而成的链状化合物，基本结构为：多肽链中，每一个aa残基上都有一个侧链r基团，不同的侧链r基团有不同的功能。在多肽链两端，有自由的-氨基，称氨基末端（或n-末端），通常写在多肽链的左端，另一端有-羧基（或c-末端），通常写在多肽链的右端。多肽链的方向从nc端，因此肽链的命名也从nc。生物体内具有一定生物学活性的肽类第三节蛋白质的分子结构pro是生物大分子，分子量在6000dal1000000dal之间或更大，种类繁多，达10101012级。pro结构复杂，功能多样。研究pro分子结构，就是要清楚pro的一级结构和空间结构，其中空间结构包括pro分子的二级、三级、四级结构，即三维结构。一、pro的一级结构pro的一级结构指构成pro的各种aa在多肽链中的排列顺序。多肽链中aa的排列顺序是由dna分子中有遗传密码的核苷酸的排列顺序决定的。pro的一级结构是最基本的结构，是空间结构的基础。在多肽链中连接个氨基酸残基之间的共价键除了肽键外（主要），还有两个半胱氨酸（glu）残基之间形成的二硫键（-s-s），它在稳定蛋白质的空间结构中起重要作用。多肽链中以胰岛素为例介绍蛋白质的一级结构：胰岛素分子量为5700dal，1953年英国生化学家sang首次发表了对牛胰岛素aa排列顺序的研究成果，它是由胰脏胰岛-细胞分泌的一种激素，整个分子由a、b两条多肽链组成，a链由21个aa残基，b链由30个aa残基，a、b两条链通过两个二硫键连接起来。a链本身还有一个链内二硫键。胰岛素的一级结构如图3-2所示：二、蛋白质的三维结构 天然蛋白质都有一定的三维结构，它决定着蛋白质的分子形状、理化特性和生物活性。蛋白质三维结构破坏，其生物学功能丧失。蛋白质的三维结构又称构象，指蛋白质分子内各原子各基团围绕某些共价键旋转，而形成各种空间排布及相互关系。（一）维持蛋白质构象的化学键 维持蛋白质构象的化学键主要是一些次级键，也称副键，包括氢键、疏水键、盐键、配位键和范德华力等。这些键键能小，稳定性较差，但蛋白质分子中次级键数量较多，它们在维持蛋白质分子的三维结构中起决定性作作用。各种蛋白质的分子形状、理化性质和生物学活性，主要取决于蛋白质分子特定的构向。一旦空间构象发生改变，蛋白质生物学功能随之丧失。（二）肽平面定义：肽键中c、h、o、n四个原子和与它们相邻的两个-碳原子即都处于同一平面上，即称肽平面。c=o双键中的电子云与n原子上的未共用电子对发生“电子共振”，使肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。但在肽平面上与-碳原子形成的单键可以自由旋转，因此，肽平面围绕-碳原子可以相对旋转，牵动多肽链形成各种主链与侧链构象，构成蛋白质的三维结构。因此肽平面是蛋白质构象的基本结构单位，是蛋白质三维结构的基础。(三)蛋白质的二级结构 定义：指多肽链中主链沿中心轴螺旋盘绕，折叠成有规则的主链构象。天然蛋白质的二级结构有以下几种：1、-螺旋（-helix）1951年pauling等科学家通过对人头发-角蛋白进行x-衍射分析研究后，提出-螺旋的结构模型，后来发现，这是普遍存在于pro中的一种二级结构。定义：-螺旋指pro分子中多个肽平面通过氨基酸的-碳原子旋转，沿长轴方向按一定规律盘绕形成的稳定的-螺旋构象。-螺旋结构特点如下：（1）有l-aa构成的多肽链旋转、折叠，绝大多数形成稳定的右手螺旋，仅在极个别pro中存在左手螺旋。（2）-螺旋一周（旋转360为一周）含3.6个aa残基，每个aa残基高度为0.15nm，螺旋上升一圈高度（螺距）为0.54 nm（3.60.15 nm）。（3）相邻两个螺旋中的aa残基之间形成链内氢键（即一位肽平面氨基上的氢与第四个肽平面羧基上的氧形成氢键）。这些氢键的方向大体与中心轴平行，氢键是维持-螺旋的主要次级键。（4）肽链中aa残基的r侧链基团均伸向螺旋外侧，其空间形状大小及电荷对-螺旋的形成和稳定有重要影响。酸性或碱性氨基酸集中的区域，由于同性电荷相斥，不利于-螺旋的形成；较大侧链集中（苯丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸）的区域，产生空间位阻，也防碍-螺旋的形成；脯氨酸是亚氨基酸，不能参与氢键的形成，因此也不易形成-螺旋。在各种蛋白质中，纤维状蛋白质主要由-螺旋组成，球状蛋白质具有较多的-螺旋，如血红蛋白和肌红蛋白。有些球状pro含少量的-螺旋结构，如溶菌酶。-螺旋结构是烫发的生化原理：人体的毛发主要成分是角蛋白，它是外胚层细胞的结构蛋白，可分为两类，一类是-角蛋白，另一类是-角蛋白，其中以-角蛋白居多。-角蛋白主要是-螺旋构象的多肽链构成。烫发时，把头发卷成一定的形状，然后涂上还原剂（含巯基的化合物）并加热，还原剂可拆开链间的二硫键。湿热破坏氢键使头发-角蛋白的螺旋结构展开伸直，过一些时候，除去还原剂，涂上氧化剂以便在相邻的多肽链的半胱氨酸残基对，但不是处理前存在的残基建立新的二硫键，当洗涤并冷却时，多肽链回到原来的-螺旋构象。这时头发以所希望的形式卷曲，因为新的二硫键的形成使得头发纤维的-螺旋束发生扭曲。2、-折叠定义：又称-片层结构，指pro多肽链主链中肽平面折叠成锯齿状的结构。其结构特点是：（1）肽链延伸，肽平面之间折叠成锯齿状。（2）若干条多肽链或一条多肽链迂回，形成的若干肽段相互靠拢，平行排列，通过氢键连接，氢键与主链互相垂直，是维持-折叠的主要次级键。（3）侧链基团较小，分布在片层的上下。（4）相邻排列的两条-折叠结构的走向相同时，称顺向平行，反之称逆向平行。丝心蛋白具有典型的-折叠，所以蚕丝具有十分柔软的特性。3、-转角它是第一个氨基酸残基的co第四个残基的亚氨基之间形成氢键，使蛋白质分子中出现180度的回折。 4、无规线团定义：多肽链主链没有确定规律的折叠。多项研究表明，一种蛋白质的二级结构并非单纯的某一种构象，而是几种构象的组合，只是不同蛋白质各占比例不同而已。蛋白质中存在由若干相邻的二级结构单元按一定规律组合在一起，形成空间上可彼此区分的结构单元，称为超二级结构。 （四）蛋白质的三级结构定义：多肽链在二级结构的基础上，由于aa侧链基团相互作用，进一步卷曲折迭成不规则，但是有一定规律的特定构象，包括主链和侧链构象。肽链中各种aa残基侧链上的功能基团相互作用生成的各种次级键是维持三级结构的主要化学键，包括疏水键、盐键、氢键和分子力等。疏水基团转向内侧，亲水基团转向外侧在二级结构或超二级结构的基础上肽链中的某些局部的二级结构汇集在一起，形成发挥生物功能的特定区域 ，即结构域。（五）蛋白质的四级结构定义：由两个或两个以上具有独立三级结构的多肽链借次级键缔合而成的复杂结构。1、亚基或亚单位：蛋白质分子中四级结构中每条具有独立三级结构的多肽链。亚基一般由一条多肽链组成，少数由两条或更多多肽链组成。由2-10个亚基构成的蛋白质称寡聚体，10个以上亚基构成的pro则称为多聚体。由相同类型亚基构成的四级结构，称均一四级结构，如过氧化氢酶由四个相同的亚基组成；由不同类型亚基构成的四级结构称非均一四级结构，如血红蛋白由两个-亚基和两个-亚基组成，四级结构的蛋白质具有复杂的生物学功能，一旦四级结构的蛋白质解聚成亚基，蛋白质就不能执行正常功能。一些只具有三级结构（无四级结构）的蛋白质如胰岛素当其三级结构遭受破坏时，其生物学功能随之丧失。2、亚基间的结合力：维持蛋白质四级结构的化学键主要是疏水键。多肽链在形成三级结构时，部分疏水基团位于亚基分子表面，亚基表面的疏水基团侧链为了避开水而相互聚集形成疏水键，导致亚基的聚合。此外，氢键、盐键等对维持四级结构的稳定也有一定的作用。第四节蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能有着密切的关系，研究两者之间的关系，可从分子水平上去认识各种生命现象，为药物的研制、疾病的预防和治疗提供重要的理论依据。一、蛋白质的一级结构与功能的关系一级结构决定蛋白质的三维结构，而三维与蛋白质的生物学功能密切相关。因此，蛋白质一级结构不同，表现出的生物学功能也不同。举例说明蛋白质的一级结构与功能的关系：1、正常人血红蛋白（hba）是由两条-肽链和两条-肽链与血红素组成，其生理功能是运输氧气和二氧化碳，镰刀型贫血症病人的红血球呈镰刀状，易溶血，是因为血红蛋白（hbs）分子中的-链有一个氨基酸残基与正常人的hb不同，从而严重的影响了hb与氧气的结合能力，致使病人产生贫血。这种由于蛋白质一级结构中个别氨基酸的改变而导致机体疾病，称为分子病。2、胰岛素：不同来源的胰岛素，其氨基酸顺序和种类不完全相同，但其功能都是降低血糖浓度，原因是不同动物来源的胰岛素的51个氨基酸中有24个氨基酸残基恒定不变，分子中半胱氨酸残基的数量（6个）及其排列位置恒定不变，它们在决定胰岛素三维结构中起关键作用，因此它们具有相同的生物功能。如果将这个部位中甘氨酸残基去掉，胰岛素的活性会降低90%以上。现已发现有上百种遗传病都源于遗传物质缺失，突变，致使蛋白质一级结构发生改变所致。二、蛋白质的三维结构与功能的关系蛋白质的三维结构决定其生物学功能。举例：anfinsen用蛋白变性剂尿素和二硫键还原剂巯基乙醇处理核糖核酸酶，由于核糖核酸酶氢键遭到破坏，二硫键断裂，致使其正常三维构象发生改变，酶蛋白变性，生物活性丧失。如果采用透析法除去尿素和巯基乙醇，酶活性几乎恢复到变性前的水平，经测定证明，此时核糖核酸酶的构象已经恢复，说明了三维结构与生物功能之间的直接关系。别构效应：蛋白质分子因与某种小分子物质相互作用，致使构象发生轻度改变，生物活性发生显著改变的现象称为蛋白质的别构效应。体内许多酶的别构效应在物质代谢调节中具有十分重要的意义。体内还存在一些无活性的酶原，或其它无活性的蛋白质前体，当它们在某种条件的作用下，形成了特定的三维构象时，它们便具有了生物活性。第五节蛋白质的性质一、 蛋白质的两性解离及等电点 （一）两性解离 1、蛋白质与氨基酸一样也是两性电解质。氨基酸是两性电解质，氨基酸分子中有-nh2和-cooh，既能给出质子，又能接受质子。pro是由氨基酸组成，也是两性电解质，pro分子中每条肽链两个末端的自由-nh2和-cooh可解离出正离子或负离子，其侧链上的不少基团，也可以解离出正离子和负离子，如赖氨酸残基上的-nh2、精氨酸残基上的胍基和组氨酸残基上的咪唑基都能解离成正离子；谷氨酸和天冬氨酸残基上的羧基可解离成负离子。2、和氨基酸一样，蛋白质的带电状况受溶液ph的影响。 不同的ph环境下，蛋白质的电荷性质不同。当溶液的phpi时，蛋白质粒子带负电荷，当溶液的phpi时，蛋白质粒子带正电荷。 （二）蛋白质的等电点 当蛋白质在某一ph溶液中,酸性基团带的负电荷恰好等于碱性基团带的正电荷,蛋白质分子净电荷为零,此时溶液的ph值称为该蛋白质的等电点(pi)。pro在等电点时，s最小，易从溶液中析出，利用这一特点，即可测出某种蛋白质的等电点，也可将pro从溶液中沉淀出来。因此，在生化制药工业上，常用此法分离提纯pro类药物。电泳也是根据pro两性电离的原理，它是指带电离子在电场中向电性相反的电极移动的现象。不同的pro在偏离等电点的溶液中带上不同的电荷，在电场中会发生移动，其移动的速度由蛋白质分子中所含的电荷性质、数量以及分子形状大小所决定。同样，利用电泳的方法，可对蛋白质进行分离、纯化和鉴定。二、蛋白质的高分子性质由于相对分子质量很大,蛋白质在水溶液中形成直径1100nm的颗粒,因而具有胶体溶液的特征,如布朗运动、丁达尔效应(tyndalleffect)以及不能透过半透膜等性质。利用蛋白质不能透过半透膜的性质,常将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋中,置于流水中进行透析,逐渐除去小分子杂质,以达到纯化蛋白质的目的,这种方法称为透析。生物膜也具有半透膜的性质,从而保证了蛋白质在细胞内的不同分布。 pro是亲水胶体，形成亲水胶体的稳定因素有：1、 pro分子表面有大量的亲水基团（ pro在形成三级结构时，大部分疏水基团进入分子内部），能与水产生水合作用，水分子受pro极性基团影响，定向排列在pro分子的周围，形成较厚的水化层，将pro颗粒分开，不致相聚而沉淀。2、在偏离等电点的溶液中，pro分子表面带上电荷，形成电荷层，因同种电荷相互排斥，防止了pro颗粒相聚而沉淀。一旦pro表面的水化层和电荷遭到破坏，则pro分子间引力增加而聚集沉淀。因此，可通过透析（pro颗粒不易透过半透膜）、等电点沉淀、有机溶剂法分离沉淀来纯化pro。三、蛋白质的变性 定义：pro分子在某些理化因素作用下，其特定的三维构象破坏而导致理化性质及生物学活性丧失，这种现象称为pro的变性作用。变性后的pro称变性蛋白。 变性的实质是变性因素使维系pro三维结构的次级键断裂，三维结构遭到破坏，多肽链伸展，形成随机卷曲的无规线团，原来隐藏在pro分子内部的疏水基团暴露，蛋白质亲水性丧失，溶解度下降而发生沉淀。值得注意的是变性pro肽链没有断裂，一级结构完好无缺。1、引起pro变性的因素：1）物理因素：加热、紫外线、x射线、震动、高压、超声波等。2）化学因素：强酸、强碱、重金属、高浓度尿素、丙酮、乙醇等2、变性作用的特性：1）生物活性部分或全部丧失。如酶的催化作用，pro类激素的调节作用，血红蛋白运输氧和二氧化碳的功能均可丧失。2）理化特性的改变：粘度增加，失去结晶能力，易被蛋白酶水解（食用煮熟的鸡蛋易消化）。3、蛋白质变性的意义 既有理论意义，又有实用价值。1）生产和保存酶、激素、抗体、疫苗等生物活性蛋白质时，应保持低温，避免强酸、强碱、重金属污染；防止剧烈震荡起泡。有时为防止蛋白质变性，在蛋白质溶液中添加另一种蛋白质作为保护剂，以增强蛋白质的抗变性能力。2）在卫生医药卫生上的应用：如高温、高压、酒精的消毒作用。3）在制药过程中，用于药物的分离提取（去除杂蛋白）。四、蛋白质的沉淀定义：pro分子聚集而从溶液中析出的现象。沉淀pro的主要方法有：（一）盐析定义：向蛋白质溶液中加入高浓度的中式盐，致使pro的溶解度降低而从溶液中析出的现象。常用盐析的中式盐有：硫酸铵、硫酸钠及硫酸镁等。引起pro盐析的原因（主要从稳定pro溶液的两个因素考虑）：1、中式盐在水中溶解度大，亲水性强，与pro胶粒争夺与水的结合，破坏pro分子表面水化层。2、中式盐是强电解质，解离作用强，能中和pro分子表面的电荷，破坏电荷层。 盐析并不破坏蛋白质空间结构，析出的蛋白质经过透析除去盐，即得活性蛋白质。盐析在制药工业中是常用的生化分离方法。（二）有机溶剂沉淀法与水互溶的有机溶剂，如酒精、甲醇等破坏pro水化层，使得pro沉淀。（在等电点下效果更好）但是常温下，有机溶剂会引起蛋白质的变性，如酒精灭菌，而在低温下pro变性减慢。因此利用有机溶剂沉淀pro，为防止pro变性，可在低温下进行，严格控制引起变性的各种因素。（三）重金属沉淀法 pro分子在ph大于其等电点时，带负电，易与重金属离子如hg+、pb2+、cu2+等结合生成不溶于水的pro盐沉淀，引起pro变性。人误食重金属盐中毒是因为重金属盐与pro沉淀变性有关，临床上采用口服大量新鲜牛奶、豆浆抢救重金属中毒的病人，就是根据牛奶、豆浆等蛋白质能与重金属盐结成不溶沉淀物，可阻止机体对重金属盐的吸收。然后用催吐剂将结合的重金属呕吐出来，达到抢救目的。（四）生物碱试剂沉淀法pro分子在ph小于其等电点时，带正电，易于生物碱（苦味酸、三氯乙酸、磺基水杨酸等）结合，生成不溶性盐，引起pro变性。临床上用三氯乙酸作尿蛋白的检测试剂。五、pro的颜色反应pro的颜色反应就是氨基酸某些基团及肽键与一定试剂所产生的化学反应。利用这些反应，可对蛋白质进行定量测定。但是这些化合反应不是蛋白质的特征反应，在鉴定pro时，除利用这些方法外，还必须结合pro的其它性质考虑。（一）茚三酮反应在ph5.7时，pro与茚三酮可产生颜色反应。可用于pro的定性和定量。（二）双缩脲反应pro与碱性cu2+形成紫红色络合物反应这是pro分子中肽链的反应。肽链越多，反应颜色越深。氨基酸无此反应。可用于pro定量、定性，也可用于pro水解程度的测定。（三）酚试剂反应pro分子中酪氨酸在碱性条件在与酚时机作用生成兰色化合物，此反应灵敏度高。六、蛋白质的紫外吸收性质大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收（含有共轭双键，其中色氨酸最多）。因此，大多数蛋白质在280nm 附近较强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。六、蛋白质的免疫学性质抗原：指能刺激机体免疫系统产生免疫应答，并能与相应的抗体特异性结合的物质。抗体：由相应抗原刺激机体的免疫系统而由-淋巴细胞新产生的免疫球蛋白。换句话说，抗体是动物针对外来物质的出现而合成的一种蛋白质。免疫反应：指抗原与抗体所引起的反应。过敏反应：免疫反应拌有组织损伤或生理功能紊乱。（一）抗原的特性1、异源性：指抗原与机体本身正常组织成分不同的异体物质。生物血缘关系越远，其组织成分的抗原性越强。如马血清、牛痘疫苗等对人体来说是异体物质，进入人体可产生免疫反应。某些同种异体组织也有抗原性，如不同人的皮肤或器官移植可产生免疫反应。2、大分子性：具有抗原性的物质，其分子量常在1万以上。一般分子量越大，抗原性越强。但不同的大分子物质，抗原性强弱亦有差别，如蛋白质、多糖、核酸等大分子物质，以蛋白质的抗原性最强。有些小分子物质单独不具有抗原性，但在体内可与蛋白质结合变为有抗原性，这种小分子物质称为半抗原，如脂类、某些药物（青霉素）。3、特异性：抗原只能与它所刺激产生的特异性抗体发生反应，而与其他抗原刺激产生的抗体不起反应。抗原的特异性决定于抗原分子表面的特殊化学基团，称抗原决定簇。（二）抗体的性质抗体也具有特异性，它只能与相应的抗原发生反应。抗原与抗体反应的特异性具有重要的理论和实践意义。它可以用于特异性蛋白质的鉴定、肿瘤的早期诊断（如-甲胎蛋白诊断肝癌），以及一些疾病的预防和治疗。但是蛋白质的抗原性有时也可带来严重危害，如异体蛋白几进入体内可产生过敏性反应，甚至可危机生命。因此在生物制品的生产过程要严格控制杂质的污染。第六节蛋白质的分子分离与纯化的基本原理蛋白质的分离纯化是研究其结构与功能的基础。在生物制药工业中，pro、酶、多肽类激素等药物生产制备都涉及到pro分离纯化的问题。pro分离纯化的工艺过程，既要考虑尽可能的除去杂蛋白，又要保持目的蛋白的产量，也就是要提高回收率。一、蛋白质的提取1、材料的选择：选择材料的原则是选取新鲜、富含所需pro的材料。2、组织细胞的破碎：不同来源的组织细胞、其批破碎方法不同。动物来源：可用电动捣碎机、匀浆器、超声波处理。植物来源：植物组织或细胞（具有纤维素、半纤维素和果胶等物质），在研磨过程中加入一定量的石英沙或用纤维素酶处理。细菌来源：细菌的细胞壁含肽聚糖，较为坚韧。破碎方法有：超声波震荡、压榨、溶菌酶处理（分解肽聚糖）或用表面活性剂处理。 例如：三角酵母提取d-氨基酸氧化酶，用tritonx-100作用细胞壁，改变细胞膜通透性，使酶释放出来。3、提取：组织细胞破碎后，选择适当的介质（一般用缓冲液）把所要的提出出来，在提取过程中应尽量防止细胞内蛋白酶对目的pro的降解。二、蛋白质的分离与提取 从组织细胞中提取的pro溶液，含有许多不同分子量的pro，要获取目的蛋白，须进一步分离纯化，将目的pro与其它pro分开。这里介绍几种根据pro在溶液中的性质进行分离混合蛋白的方法。（一）根据溶解度不同的分离纯化利用各种pro的溶解度差异进行分离。影响pro溶解度的因素有ph值、离子强度、溶液的介电常数等，各种pro的溶解度取决于它们的分子结构，如：氨基酸组成、极性和非极性基团的多少等。1、等电点沉淀：pro在pi使溶解度最小，此方法常与其它分离方法配合使用。2、盐析沉淀：不同pro可通过加入不同饱和度的中式盐分别沉淀出来（即分级沉淀）。常用饱和硫酸铵来沉淀pro。此法可用于工业大规模分离。3、有机溶剂沉淀：利用有机溶剂能降低在pro水中的溶解度，使pro沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、甲醇、丙酮等。在低温下操作，有机溶剂一般需预冷（-40），缓慢加入。4、温度对pro溶解度的影响：在一定范围内，040之间，大部分球状pro随温度升高而溶解度增大（血红蛋白除外，025随随温度升高而溶解度降低）；在4050以上，大部分pro不稳定，开始变性。所以大多数pro的分离在低温下操作。（二）根据分子量大小不同的分离方法1、透析和超滤：利用pro分子不能透过半透膜的性质，使pro与其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。 透析是将待提纯的pro溶液在装在半透膜的透析袋里，放入 蒸馏水中进行的，透析液可以进行更换，直至透析袋内无机小分子物质降到最低点为止。超滤是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子物质通过半透膜。而蛋白质截留在膜上。市场上有各种规格的半透膜出售，可根据目的蛋白的分子量选择不同孔径的膜。 2、凝胶过滤又称分子筛层析、分子排阻层析，它是根据分子量大小分离混合物最有效的方法之一。凝胶过滤所用的介质是凝胶珠，内部是多孔的网状结构。凝胶的胶联度或孔度（网孔大小）决定凝胶的分级范围，即能被该凝胶分离开来的pro混合物的分子量范围。例sephadexg-50分级范围在150030000之间。常用的凝胶有胶联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。凝胶过滤的原理：当不同分子大小的蛋白质混合物凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻爱凝胶珠外，随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度进入凝胶珠内部。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离，大分子物质先被洗脱下来，小分子物质后被洗脱。凝胶过滤的基本原理可如图表示：（投影膜）3、密度梯度离心pro颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且还决定于它的密度。pro颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒较质量小的颗粒沉降得快，并且各种pro颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停止不前，最后各种pro颗粒在离心管中被分离成各自独立的区带。分成区带的pro在管底刺一小孔逐滴放出，分部收集。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度等。密度梯度在管内分布是管底的密度大，向上逐渐减少，待分离混合物平铺在梯度的顶端，离心采用水平转头高速进行。（三）根据电荷性质不同的分离方法在一定ph下，不同pro所带的电荷数量和性质不同。1、电泳法：在外电场作用下，带电颗粒向与其电性相反的电极移动。带电颗粒在电场中的泳动速度取决于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。常用电泳的方法有：1）醋酸纤维薄膜电泳：以醋酸纤维薄膜为支持物，操作方便，电泳时间短，临床上常用于血浆pro的分离，可分离出主要的四种血浆pro。2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺为支持物，分辨率高（可分辨出20多种血浆pro）。3）等电点聚焦电泳：以两性电解质为支持物，电泳时形成一个由正极到负极逐渐增加的ph梯度，pro在此梯度中各自集中在与其等电点相同的ph区域。这种电泳分辨率很高，能将血清分成40多个条带，特别适用于同功酶的鉴定，只要其等电点有0.02ph差异即可分开。4）免疫电泳：将电泳技术与抗原抗体反应的特异性相结合，以琼脂糖为支持介质，将抗原中的各组分分开，然后加入特异性抗体经扩散可产生免疫沉淀反应。2、离子交换层析指一个溶液中的某一种离子与另一种具有相同电荷的离子相互调换位置，即溶液中的离子跑到固体上，把固体上的离子替换下来。这里的溶液称流动相，固体称固定相。在离子交换层析中，pro对离子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷的静电吸引，而pro的带电情况则与溶液中ph有关，盐的存在可降低离子交换剂的离子基团与pro相反电荷基团之间的静电吸引，因此，pro混合物的分离，可用改变溶液中的盐离子强度和ph进行洗脱。(图见投影膜)用于分离pro和核酸等大分子物质的支持介质主要是离子交换纤维素和离子交换胶联葡聚糖。（四）根据配基特异性的分离方法亲和层析