（动物学专业论文）利用cyt+b基因对未知鲸骨进行物种的鉴定.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 丕毖 日期： 涩2 ：世 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：墨扯导师签名：社日 期：盘窜j 【5 山东人学硕上学位论文 中文摘要 由于鲸类是经济价值巨大的海洋资源，历史上人类对其进行了大 规模的商业猎杀，同时也由于栖息地的破坏、减少以及环境的恶化， 一度使得某些物种濒于灭绝。鲸类数量的急剧减少引起了科学界的广 泛关注，开展了一系列例如鲸类种群数量的调查和监测、鲸类搁浅网 络的建立、鲸类误捕和偶然死亡原因的调查以及鲸类体内有毒物质的 研究。8 0 年代以来，随着分子生物学的迅猛发展，涌现出一批分子进 化和种群遗传分析方法和技术，而这些技术也很快地被引入到鲸类保 护生物学领域。 本实验选用c y tb 基因序列作为分子标记，从分子生物学的角度对 未知的鲸类骨骼样品进行物种的鉴定。提取基因组d n a 时采用蛋白酶 k 消化法和苯酚氯仿有机抽提法，并做了下述改进：1 ) 骨粉在消化前 用灭菌的纯水浸泡；2 ) 消化液中蛋白酶k 的终浓度提高至0 3 m g m l ； 3 ) 有机抽提过程中苯酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽提两遍，氯仿： 异戊醇( 2 4 ：1 ) 抽提两遍。实验结果如下： 1 ) 获得了样品v 1 、v 2 、v 3 、v 5 、r 、z 1 的基因组d n a ，电泳检测呈 现轻微片断化的迹象： 2 ) 获得了样品v 1 、v 2 、v 5 、z 1 的p c r 扩增产物，电泳检测显示产 物大小约为5 5 0 b p ； 3 ) 测序获得样品v 1 、v 2 、v 5 、z 1 的c y tb 基因部分序列，并且样品 v 2 、v 5 、z l 的序列完全相同，为同一单倍型： 4 ) g e n b a n k 比对结果如下：样品v 1 与大村鲸的相似度最高，达9 9 ； 样品v 2 、v 5 、z 1 与大西洋小须鲸的相似度最高，达9 8 。初步推 断样品v 1 为大村鲸，样品v 2 、v 5 、z 1 为大西洋小须鲸； 5 1 基于u p g m a 法和n j 法构建的系统发育树均表明样品v 1 的c y tb 序列与大村鲸的同源序列聚类，置信度达1 0 0 ；样品v 2 、v 5 、z 1 的c y tb 序列与大西洋小须鲸的同源序列聚类，置信度为1 0 0 。支 山东人学硕上学位论文 持g e n b a n k 的比对结果； 6 1m e g a 软件分析结果表明样品v 1 的c y tb 序列与相似度最高的大 村鲸单倍型( 登录号a b 2 0 1 2 5 7 、a b 2 0 1 2 5 6 ) 存在1 2 个核苷酸差 异，成为一个新的单倍型，这是我国南海的首次记录；样品v 2 、 v 5 、z 1 的c y tb 序列完全一样，为同一单倍型，但与相似度最高的 大西洋小须鲸单倍型( 登录号a j 5 5 4 0 5 4 ) 存在7 个核苷酸差异，成 为一个新的单倍型。 关键字：鲸类骨骼；细胞色素b 基因；分子进化树；物种鉴定 山东大学硕上学位论文 a bs t r a c t c e t a c e ai sak i n do fm a r i n em a m m a l s t h u s ，h u m a nh u n tt h e mf o rc e n t u r i e s i n w i t hg r e a te c o n o m i cv a l u e ， a d d i t i o n ，t h e i rh a b i t a t sa r e d e s t r o y e da n dt h ee n v i r o n m e n td e t e r i o r a t e s ，s ot h ep o p u l a t i o no fc e t a c e a d e c l i n e s r a p i d l y ，a n ds o m es p e c i e sb e c o m ee n d a n g e r e d t h ec h a n g e c a u s e ss c i e n t i s t s a t t e n t i o na n dt h e yb e g i nt od os o m er e s e a r c h e ss u c ha s i n v e s t i g a t i o no fc e t a c e a sp o p u l a t i o n ，e s t a b l i s h m e n to fs t r a n d i n gn e t w o r k ， b y c a t c ha n dp o i s o n o u ss u b s t a n c e si nc e t a c e a s i n c e1 9 8 0 s ，m o l e c u l a r b i o l o g yh a sd e v e l o p e dq u i c k l ya n dm o l e c u l a rt e c h n i q u e sf o re v o l u t i o n a n dp o p u l a t i o ng e n e t i c sa p p e a r e d a l lt h et e c h n i q u e sh a v eb e e nu s e di n c e t a c e ar e s e a r c hs t e pb ys t e p g e n o m ed n ai se x t r a c t e db yp r o t e i n a s eka n dp h e n o l c h l o r o f o r m s o m ei m p r o v e m e n t sa r em a d e ：1 ) b o n ep o w d e ri s d i p p e di ns t e r i l i z e d w a t e rb e f o r e b e i n gd i g e s t e d ；2 ) c o n c e n t r a t i o no fp r o t e i n a s eki s i n c r e a s e dt oo 3 m g m l ；3 1t w o t i m e se x t r a c t i o nw i t hp h e n o l c h l o r o f o r m i s o a m y la l c o h o l ( 2 5 ：2 4 ：1 ) i sf o l l o w e db yt w o t i m e se x t r a c t i o nw i t h c h l o r o f o r m i s o a m y la l c o h o l ( 2 4 ：1 ) t h er e s u l t so ft h i se x p e r i m e n ta r e ： 1 ) g e n o m ed n ai s e x t r a c t e df r o ms a m p l e sv 1 ，v 2 ，v 3 ，v 5 ，r ，z 1 r e s p e c t i v e l ya n dt h er e s u l tr e v e a l sg e n o m i cd n ai ss l i g h t l yd e g r a d e d ； 2 ) a m p l i f i c a t i o np r o d u c t so fs a m p l e sv 1 ，v 2 ，v 5 ，z 1a r eg o tb yp e ra n d a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i ss h o w st h a t t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h e a m p l i f i c a t i o np r o d u c t sa r ea b o u t5 5 0 b p ； 3 ) t h ea m p l i f i c a t i o np r o d u c t sa r es e n to u tf o rs e q u e n c e s t h es e q u e n c e s o fs a m p l e sv 2 ，v 5 ，z 1a r et h es a m e ，s ot h e ya r et h es a m eh a p l o t y p e ； 4 1t h eb l a s t i n gr e s u l ti ng e n b a n ks h o w st h a ts a m p l ev 1h a sm a x i m a l s i m i l a r i t yw i t hb a l a e n o p t e r ao m u r a i ，i ti s9 9 ；s a m p l e sv 2 ，v 5 ，z 1h a v e 山东大学硕l ：学位论文 m a x i m a l s i m i l a r i t y w i t h b a l a e n o p t e r a a c u t o r o s t r a t a ，i ti s9 8 i t i n d i c a t e st h a ts a m p l ev 1i sb a l a e n o p t e r ao m u r a ia n ds a m p l e sv 2 ，v 5 ，z 1 a r eb a l a e n o p t e r aa c u t o r o s t r a t a ； 5 ) t h ep h y l o g e n e t i ct r e e sb a s e do nu p g m a a n dn ja r ec o n s i s t e n tw i t h t h eb l a s t i n gr e s u l t s ； 6 ) a n a l y s i so fs o f t w a r em e g a s h o w st h a tt h ec y tbg e n es e q u e n c eo ft h e s a m p l ev 1h a s1 - 2n u c l e o t i d e sw h i c ha r ed i f f e r e n tf r o mt h eh o m o l o g o u s s e q u e n c e o fb o m u r a i ( a c c e s s i o na b 2 0 1 2 5 7 ，a b 2 0 1 2 5 6 ) ，s ot h e s e q u e n c ei s an e wh a p l o t y p e s a m p l e sv 2 ，v 5 ，z 1h a v et h es a m ec y tb g e n es e q u e n c ea n dt h es e q u e n c eh a s7n u c l e o t i d e sw h i c ha r ed i f f e r e n t f r o mt h eh o m o l o g o u ss e q u e n c eo fb a c u t o r o s t r a t a ( a c c e s s i o na j 5 5 4 0 5 4 ) ， s oi ti san e wh a p l o t y p et o o k e yw o r d s ：w h a l eb o n e s ，c y t o c h r o m eb ，p h y l o g e n e t i ct r e e ，s p e c i e si d e n t i f i c a t i o n 8 山东大学硕上学位论文 1 1 引言 第1 章综述 鲸类广泛分布于全世界的海洋和部分江河之中，长期以来由于非 法捕猎、栖息地生境的持续性恶化( 如环境污染) 以及渔业误捕等众 多因素的影响，种群数量大幅度下降 1 - 3 1 。鲸类是经济价值十分巨大的 海洋资源，表现在鲸类浑身是宝：鲸类的脂肪可以炼油，用于人造奶 油、甘油等食品、油脂和化工工业的原料：鲸肉营养价值极高，且美 味可口；下脚料和骨骼可制成动物饲料和富含氮磷的农作物肥料；皮 可制革；肝、胰脏、肾脏、胎盘、脑下垂体、生殖腺等器官可制造各 种激素制剂和维生素a ；抹香鲸肠内的分泌物可制做高级香料，并且具 有很好的医疗功用，价格十分昂贵；鲸须、牙齿、骨骼等可用于制作 工艺品和雕刻制品。几个世纪以来，人类在巨大利益的驱使下大规模 地捕杀鲸类，致使鲸类数量急剧下降，甚至有的物种濒于灭绝1 1 ，引。2 0 0 3 年，国际捕鲸委员会( i w c ) 根据其4 3 个成员国所提供的普查资料， 公布了全球现存大型鲸类的资源量：抹香鲸( p h y s e t e r m a c r o c e p h a l u 5 ) 1 0 0 - 2 0 0 万头；南极洲小须鲸( b a l a e n o p t e r ab o n a e r e n s i $ ) 7 6 万头；北 大西洋小须鲸( b a l a e n o p t e r aa c u t o r o s t r a t a ) 1 0 3 2 0 4 万头；长须鲸 ( b a l a e n o p t e r a p h y s a l u s ) 5 - 9 万头；须鲸( b a l a e n o p t e r ab o r e a l i s ) 5 万 头左右；布氏鲸( b a l a e n o p t e r ab r y d e i ) 4 - 8 万头：灰鲸( e s c h r i c h t i u j r o b u s t u s ) 2 2 - 3 2 万头；大翅鲸( b a l a e n o p t e r an o v a e a n g l i a e ) 2 8 万头 左右；北极露脊鲸( b a l a e n am y s t i c e t u s ) 2 8 5 万头；露脊鲸( e u b a l a e n a g l a c i a l i s ) o 8 5 万头；蓝鲸( b a l a e n o p t e r am u s c u l u s ) 0 5 万头以下1 5 1 。 我国的白疑豚( l i p o t e sv e x i l l 澹，) 和江豚( n e o p h o c a e n ap h o c a e n o i d e s ) 在近几年的野外数量调查中也呈现剧减的趋势 6 - 7 】，尤其是白瑟豚在野 外基本难以观察到。 9 山东人学硕j 学位论文 1 2 分子生物学技术在鲸类保护学中的应用 随着鲸类数量的急剧下降，对于鲸类的保护工作引起了科学界的 广泛关注。目前世界鲸类研究的热点包括鲸类种群数量的调查和监测、 鲸类搁浅网络的建立、鲸类误捕和偶然死亡原因的调查以及鲸类体内 有毒物质的研究【”。但鲸类生活在水中，数量少，密度低，活动范围 广，用传统方法发现和追踪它们相当困难i2 1 。8 0 年代以来，随着分子 生物学的迅猛发展，涌现出一批分子进化和种群遗传分析方法和技术。 如同工酶( i s o e n z y m e ) 分析、分子杂交( m o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o n ) 、 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ， r f l p ) 等。而聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 技术 的诞生则给分子生物学及其相关学科带来了一场革命。以p c r 技术为 基础，发展出随机扩增多态d n a ( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i c d n a ，r a p d ) 、扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 、微卫星( m i c r o s a t e l l i t e ，m s ) 等分析方法和技 术。这些方法和技术与传统方法相比具有一些独特的优势，因而很快 便在生物学各个领域特别是种群遗传研究中得到广泛应用。随着不同 研究领域的交叉和渗透，它们很快被引入到鲸类学的有关研究中l l , s 】。 目前鲸类学研究中应用到的分子生物学技术主要是p c r 产物直接 测序分析和微卫星标记法。p c r 产物直接测序技术最能充分展示所测 基因片段的多态性，且操作方便，对材料要求低，在鲸类保护遗传学 研究中有着广泛的应用1 9 1 。特别是近年来随着非损伤取样( n o n i n v a s i v e o rn o n d e s t r u c t i v es a m p l i n g ) 技术的建立，已能从馆藏标本、脱落的鲸 须、剥脱的皮肤组织、甚至粪便等中提取d n a 用于研究【1 0 l ，解决了鲸 类研究受样品来源限制的问题。p c r 产物的直接测序技术主要在线粒 体d n a ( m i t o c h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) 分析中得到应用。通过测定一 定数量个体m t d n a 变异程度较高的控制区( c o n t r o lr e g i o n 或d l o o p ) 序列，可以揭示种群的遗传变异及多样性程度，为种群管理单元的划 1 0 山东大学硕上学位论文 分提供依据。而m t d n a 细胞色素b ( c y t o c h r o m eb ，c y tb ) 以及1 2 sr r n a 和1 6 sr r n a 及一些核d n a 基因进化速率适中，适用于探讨鲸类的起源 进化和系统发生d i - 1 3 。d n a 序列分析是对疑似濒危物种的样品进行鉴 定的有力工具 1 4 - 1 5 】。杨光等通过测定m t d n a 控制区和c y tb 基因的部分 序列，对搁浅的鲸类进行种类鉴定【1 5 1 ；b a k e r 等利用m t d n a 控制区对日 本、韩国市场上出售的鲸类肉制品进行物种鉴定 1 6 。1 8 1 ：h c n s h a w 等对 喙鲸科z i p h i i d a e 进行种类鉴定1 1 9 1 ；b a k e r 等以m t d n a 控制区序列作为遗 传标记，对世界范围内的大翅鲸进行遗传多样性分析，发现其丰富的 遗传多样性得自于祖先大翅鲸，而不是由于不同海域之问大翅鲸的迁 移造成的f 2 0 】；驼背豚( c e p h a l o r h y n c h u sh e c t o r i ) 作为新西兰的特有物 种，其分布具有很强的地域性，p i c h l e r 等扩增了3 4 个驼背豚样品的 m t d n a 控制区一段长为3 6 0 b p 的序列，发现了1 1 个单倍型，单倍型之间 的差异显著( 0 2 8 1 6 7 ) ，并且与其地理分布相一致。在如此小的地 理范围内，出现如此大的种族隔离，在鲸类中很少见。因此，雌性驼 背豚的低分布率将会成为仅次于渔业误捕的导致该种群灭绝的因素 【2 。 微卫星d n a 是基因组中一些包含不同数量的简单串联重复序列， 重复单元的长度一般为1 - 6 b p 。由于微卫星重复序列的两侧序列保守， 故而可以据此设计引物并应用p c r 技术进行分型。微卫星标记以其丰 0 富的多态性，分析技术的简便性以及对实验样品和仪器设备的要求较 低等特点，已成为保护遗传学和分子生态学领域使用最广泛的分子遗 传标记技术之一，在研究遗传多样性、种群结构、个体识别、亲子鉴 定等方面都有应用 2 2 - 2 4 】。u l f u r 等人选用微卫星d n a 作为分子标记，分 析探讨了须鲸各个种之间的关系1 2 卯。夏军红等采用已发表的来自6 个鲸 种的2 3 对微卫星引物对一个长江江豚群体d n a 样本进行了微卫星扩 增，结果表明其中有7 对引物在此群体中的扩增产物是稳定且多态的， 并为长江天鹅洲自然保护区内的江豚种群绘制了指纹图谱1 2 引。 山东大学硕l 学位论文 1 3 线粒体d n a 和细胞色素b 基因简介 1 9 0 0 年，植物学家和遗传学家c o r r e n s 等重新论证孟德尔定律后， 于1 9 0 9 年在紫茉莉( m i r a b i l i sj a l a p a ) 中发现不符合孟德尔定律的遗 传现象1 2 ”。此后，陆续有报道在其他高等植物、酵母、草履虫等生物 中存在类似的遗传现象，人们推测细胞中可能存在其他的遗传物质。 1 9 6 2 年n a s s 等发现了m t d n a ，从此以后核外遗传系统的研究逐渐成 为分子遗传学的重要研究领域之一。迄今，m t d n a 已被广泛应用于遗 传变异、生物进化、发病机理、临床诊断等方面的研究，并取得了许 多有价值的结果【2 引。 在绝大多数动物中，线粒体基因组的结构为环状，根据碱性氯化 铯密度梯度离心中双链密度不同分为重链( h 链) 和轻链( l 链) ； 编码区内含有3 7 个基因：1 个1 6 sr r n a 和1 个1 2 sr r n a 、2 2 个t r n a 基因、1 3 个蛋白质基因分别为细胞色素c 氧化酶亚基i 、i i i 基因 ( c oi 、c o i i 、c o l i i ) 、细胞色素b 脱氢酶基因( c y tb ) 、a t p 合成 酶6 和8 ( a t p a s e 6 和a t p a s e 8 ) 、n a d h 脱氢酶亚基1 - 6 ( n d l - 6 ) 和4 l ( n d 4 l ) 。非编码区是线粒体基因组的调控区，又称为d 环 ( d 1 0 0 p ) 。c y tb 、1 2 sr r n a 、1 6 sr r n a 、a t p 8 等基因多用于研究 物种间系统发育和基因的进化；d 1 0 0 p 区序列多用于研究物种的遗传 多样性、群体遗传结构及亚种的分化；c y tb 还用于物种识别研究等。 线粒体基因为非孟德尔式的遗传，在杂交后代中的表现不符合遗 传学的三个基本规律，既不出现分离和自由组合现象，也不存在连锁 与交换的关系。同时正反交结果也是不一样，杂种后代通常只表现母 本的特征，而与父本性状无关，具有明显的核质基因互作关系。线粒 体基因的遗传不是独立的遗传行为，常常表现为与核基因的相互作用。 在微生物中线粒体基因本身还依赖于核基因，有核基因的协助才能发 挥作用。线粒体基因组的遗传特征还表现在：( 1 ) 进化速度快，其进化 速度是单拷贝d n a 的5 。1 0 倍；( 2 ) 进化特征以碱基替换为主，包括转换 山东大学硕上学位论文 和颠换，碱基插入和缺失较少，很少有基因重排。这是因为动物m t d n a 复制酶不具备校对能力，碱基误配率高，并且缺乏修复机制；( 3 ) 代增 时间短，快速增殖为突变提供了更多的机会；( 4 ) 无核蛋白保护，易受 代谢中间物诱变而发生突变：( 5 ) 选择压力小，因而突变容易固定下来。 群体内变异大，边缘种间、种内遗传分析的灵敏度高 2 9 - 3 0 l 。 m t d n a 的研究方法主要有r f l p 分析和测序法。其中测序法无需提 取m t d n a ，按常规方法提取基因组d n a ，设计引物对目的d n a 片断扩 增、纯化，进行序列测定，比较不同物种或个体间的相关序列，以探 求它们之间的进化关系。这种方法可获得大量直接、可靠的数据，但 受技术条件和经费限制，不适合大群体和大样本的遗传和进化研究。 目前，由于p c r 技术的发展应用，可以扩增线粒体上特定基因片段用 以测序比较分析1 3 。 c y t h 是线粒体呼吸链上电子转移的细胞色素之一，包含8 个横跨 膜的螺旋，通过膜内或膜间区域相连接。 c y tb 在不同的氧化还原过程中有着不同的特性和功能。c y tb 的 主要功能有：1 ) 在呼吸链中传递电子：2 1 与核心蛋白( 由蛋白i 、蛋 白i i 组成的) 对复合体i 中心成员的正确装配和集聚起重要调控作用。 在m t d n a 的1 3 个蛋白质编码基因中，c y tb 基因的结构是被了解 得最为清楚的。它的期望分子量为4 2 7 k d 3 扪，长度约为1 1 4 0 b p ，编 码一条含有约3 9 7 个氨基酸的多肽链，该基因的m r n a 以一个含有4 对核苷酸、5 - p r i m e 的非编码区开头，紧接着是启动子a u g ，末端是 终止子u a a 的u 碱基，侧面与t r n a g l n 和t r n a 7 “。相接。这些t r n a 在转录过程中被解除掉【3 3 1 。 c y tb 基因一般不发生缺失和( 或) 插入，碱基置换多数是沉默的， 很大程度上倾向于转换( t r a n s i t i o n ) 或颠换( t r a n s v e r s i o n ) ，并且编 码蛋白质的密码子位点进化速度不恒定，在沉默位点进化速度较快， 如密码子第二位点最保守；而且，密码子的使用存在偏倚性( b i a s ) ， 首先，密码子的第三位碱基为a 和c 的比例明显高于g 和t ，其中a 的比例最高，在3 3 4 4 2 o 之间，g 最低，在3 8 一8 9 之间。其 山东人学硕 学位论文 次，密码子的第二位碱基为嘧啶的比例( t + c = 6 8 + - - 0 3 ) 明显高于嘌 呤：同时，相应的基因组内保守区与可变区共存。由于功能约束，它 的一部分基因比其余基因更加保守，因此也承受着较强的功能约束； 而大多数可变基因似乎都位于编码跨膜区或氨基和羧基末端的编码区 1 2 9 1 。 整个c y tb 基因进化速率适中，其变异程度足以阐明种间的系统发 育关系，又有一定保守性，可进行种上阶元水平的研究。在一定的进 化尺度内，c y tb 基因不受饱和效应的严重影响。一般线粒体蛋白质编 码基因是在1 5 0 0 万年前分化的，其种间序列差异小于2 ，当大于2 5 0 0 万年时碱基因置换达到饱和，从而使其基因与单拷贝的核基因在突变 律上趋于一致，不包括碱基平行突变( 如g a g ) 和回复突变( a g - - a ) 等诸多引起歧义的可能因素，绝大多数脊椎动物转换与颠换的 发生率也一致。因此，c y tb 基因所提供的系统发育信息和遗传分化水 平非常适合于分析种间或属间差异 3 4 - 3 7 1 。 1 4 立题依据、研究内容及意义 鲸类作为一类分布广、数量少、密度低且迁移范围大的濒危动物， 样品采集往往十分困难，特别是难以获得新鲜的组织样品。因此，通 过一些陈旧的标本，如保存多年的骨骼及一些非创伤性取样所得的样 品( 如体表脱落的皮屑、粪便等) 来获得样本进行遗传学分析，已越 来越多地成为进化生物学家和保护生物学家的选择 3 8 “3 9 。另外，在自 然界长期的埋藏或暴露过程中，受环境因素和微生物作用，动物体软 组织在短期内很快分解，进而导致其d n a 分子迅速降解，造成软组织 中d n a 提取困难及扩增成功率较低。骨骼、牙齿等坚硬组织为d n a 保存提供了较理想的场所。一方面致密结构大大减弱了环境因素和微 生物对组织结构的破坏作用，延缓了古d n a 的降解过程；另一方面骨 骼羟基磷灰石对d n a 片段具有吸附作用，这种作用使d n a 分子保存 时间延长。因此，动物体骨骼和牙齿已被广泛地选作提取d n a 分子的 1 4 山东大学硕l 学位论文 组织样品1 4 0 1 。 目前，分子考古研究主要集中于核d n a 和m t d n a 方面。m t d n a 属细胞核外遗传物质，在细胞内有几千个拷贝，片段较小，受酶解及 外界因素作用位点少，因而降解速度相对较慢；核d n a 分子相对较大， 降解速度快。相比较而言，m t d n a 片段比核d n a 片段提取的成功率 略大1 4 0 。 本实验选用m t d n a 上的c y tb 基因序列作为分子遗传标记，对实 验室内现有的8 个骨骼样品进行种类鉴定。首先，采蛋白酶k 消化法 对骨骼样品进行消化；然后采用苯酚氯仿有机抽提法提取基因组 d n a ，经琼脂糖胶检测后，以此为模板进行p c r 特异性扩增；扩增产 物经琼脂糖胶检测，如果有特异性的亮带则送至上海生物工程技术公 司进行测序；测序结果除了经过b i o e d i t 软件进行剪切、拼接以外，还 要经过人工校对，以确保序列的准确性：将获得的序列提交至g e n b a n k 进行比对，初步确定其所属的鲸类种类。然后再用d n a s t a r 、c l u s t a l 、 m e g a 等软件进行核苷酸多样性分析，统计变异位点，并利用u p g m a 法和邻接法( n e i g h b o u rj o i n i n g 。n j ) 法构建系统发育树。 生物多样性包括生态系统多样性、物种多样性和遗传多样性。部 分遗传多样性信息的获取是以d n a 序列为基础的。因此，取得样品的 d n a 就是比较关键的一步。动物体的各个组织器官均能提供其基因组 d n a ，比较常用的是新鲜的或福尔马林( 或酒精) 保存的肌肉、皮肤、 肝脏样品，相对于上述组织器官，骨骼具有保存时间长、保存形式多 样( 如骨骼化石、骨骼标本、野外散落的骨骼) 的特点；但是骨骼本 身的特点( 细胞间质中有大量骨盐，因此非常坚硬且不易消化) 和其 保存方法的不同，又使得从骨骼中提取d n a 十分困难。尽管如此，国 内外的专家学者们已经对多种动物的骨骼进行了d n a 的提取实验，并 取得了成功，这其中就包括鲸类的骨骼。有学者曾从未知的须鲸肋骨 和耳骨中提取出基因组d n a ，并特异性扩增了m t d n a 的序列，测序 结果表明肋骨属于抹香鲸而耳骨属于蓝鲸1 4 。r a s t o g i 也曾以北极露脊 鲸和黑露脊鲸的肱部骨骼为实验材料进行遗传学研究，探讨1 6 世纪魁 山东人学硕士学位论文 北克捕鲸业对北大西洋海域这两种鲸类种群数量的影响【42 1 。 本实验将以收集到的骨骼为对象，进行基因组d n a 的提取，一方 面探寻鲸类骨骼d n a 的提取方法；另一方面，在提取出基因组d n a 的前提下，对这些骨骼进行物种鉴定和遗传学信息的收集。 1 6 山东大学硕士学位论文 第2 章利用c y tb 基因对未知鲸骨进行物种的鉴定 实验中所用的8 块骨骼样本据其形态学特征和采样时收集到的信 息可初步推断为须鲸，所以p c r 扩增时所选用的引物是适用于所有须 鲸物种的。 2 1 材料和方法 2 1 1 实验材料 本实验所用8 块骨骼分别为2 0 0 5 年2 月从广州采集的4 块脊椎骨 和1 块肋骨；2 0 0 6 年8 月从浙江采集的2 块骨骼；保存于本实验室的 1 块经过蒸煮处理的脊椎骨。以上实验材料一直处于室温下保存。样品 的采集信息见表1 。 1 7 坐查盔兰堕! ：耋竺笙苎 表1 骨骼样本的采集信息 t a b 1i n f o r m a t i o no fb o n es a m p l e s 骨骼样本采样地点 采样时问备注 b o n es a m p e s l o c a t i o n s a m p l i n gt i m e i n s tr u c t i o n 广东省硇洲岛 脊椎骨 v 1 2 0 0 5 0 2 ( n a o z h o ui s l a n d ，g u a n g d o n gp r o v i a c e ) 获得c y tb 基因序列 v 3 v 4 v 5 r z l 广东省 ( g u a n g d o n gp r o v i n c e ) 广东省 ( g u a n g d o n gp r o v i n c e ) 广东省 ( g u a n g d o n gp r o v i n c e ) 山东省栖霞市 ( q i x i ac i t y 。s h a n d o n gp r o v i n c e ) 广东省 ( g n a n g d o n gp f o v i n c e ) 浙江省杭州市 ( h a n g z h o uc i t y ，z b c n j i a n gp r o v i n c e ) 2 0 0 5 0 2 2 0 0 5 0 2 2 0 0 5 0 2 2 0 0 50 2 2 0 0 6 0 8 脊椎骨 获得c y th 基因序剜 脊椎骨 获得基因组d n a 脊椎骨 无任何实验结果 脊推骨 获得c y tb 基因序列 肋骨 获得基因组d n a 鳝肢尺骨 获得c y tb 基因序列 浙江省杭州市 脊椎骨 z 2 2 0 0 6 0 s ( h a n g z h o uc i t y ，z h e n j i a n gp r o v i n c e ) 无任何实验结果 _ _ - _ h _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ h - _ _ _ - _ _ 一_ - _ _ h - - - - ，_ _ - _ 一 2 1 2 仪器 l i f ee x p r e s s 基因扩增仪( 杭州博日) m i l l i q 超纯水机( m i l l i p o r e 公司) s a r t o r i u sa c c u l a b 电子天平( 德国s a r t o r i u s 公司) t g l - 1 6 b 高速台式离心机( 上海安亭公司) s w c j i f 洁净工作台( 江苏苏州安泰公司) 1 8 山东大学硕j ：学位论文 二列六孔电热恒温水浴锅( 龙口先科) d y y 1 2 型电泳仪( 北京六一仪器厂) 琼脂糖水平电泳槽( 北京六一仪器厂) w d 9 4 0 3 b 紫外透射检测仪( 北京六一仪器厂) e z 1 0s p i nc o l u m np c rp r o d u c tp u r i f i c a t i o nk i t ( 上海生物工程技术服 务有限公司) a g 9 2 0 4 电钻：武义优力特工具制造有限公司 2 1 3 试剂 2 1 3 1 基因组d n a 提取试剂 l m o l l t r i s - c i ：称取1 2 1 4 9t r i s 碱溶于8 0 0 m d q y , 蒸水中，加浓盐酸调至 p h = 8 0 ，加水定容至1 0 0 0 m l ，高压蒸汽灭菌，室温保存# 0 5 m o l l e d t a ：称取1 8 6 2 9e d t a - n a 2 - 2 h 2 0 ，溶于8 0 0 m l y 汉蒸水中， 加n a o h ( 约2 0 9 ) 调至p h = 8 0 ，加水定容至1 0 0 0 m l ，高压蒸汽灭菌，室 温保存； 1 0 s d s ：称取5 0 9s d s 溶于4 0 0 m l 灭菌的双蒸水中，加热至6 7 1 3 ，加 水5 0 0 m l ，不用高压蒸汽灭菌，室温保存； 蛋白酶k ：2 5 r a g 蛋白酶k 溶于2 m l 灭菌的双蒸水中，使保存浓度为 2 5 m g m l ，一2 0 冷冻保存； 消化液：1 0 0 m m o l l t r i s c 1 ( p h 8 o ) ，1 5 0 m m o l l n a c i ，5 0 m m o l l e d t a ( p h8 o ) ，l s d s ，0 5 m g m l 蛋白酶k ，保存于一2 0 0 ； 3 m o l ln a a c ：称取2 0 4 1 9n a a c 3 h 2 0 溶于4 0 0 m l 双蒸水，用冰醋酸调 z 举p h = 5 2 ，加水定容葺；5 0 0 m l ，高压蒸汽灭菌，室温保存； 7 0 乙醇；7 0 m l 乙醇加3 0 m l 灭菌纯水，分装，保存于- 2 0 。c ； 平衡酚：p h 8 0 ，上海生工生物工程技术服务有限公司； 氯仿异戊醇溶液：以体积比2 4 ：1 配置。 2 1 3 2p c r 扩增试剂 山东人学硕l 学位论文 t a qd n a 聚合酶：5 u 胁l ，上海生工生物工程技术服务有限公司； 1 0 x b u f f e r ：上海生工生物工程技术服务有限公司； c b m y s t f i ：5 c a c a t g g a c t t c a a c c a t g 一3 ； c b m y s t r ：5 c c t c a g a t t c a t t c g a c t a 3 ( 由特伦特大学n a t u r a l r e s o u r c e sd n a p r o f i l i n ga n df o r e n s i cc e n t r e 提供，上海生工生物工程 技术服务有限公司合成) ； d n t p ：l o m m ，上海生工生物工程技术服务有限公司； b s a ：l o m g m l ，上海生工生物工程技术服务有限公司： m g “：2 5 m m ，上海生工生物工程技术服务有限公司。 2 1 3 3 电泳试剂 i x t a e 缓冲液：称取2 4 2 9 t r i s 碱溶于4 0 0 m l 双蒸水， 酸和l m l 0 5 m o l l e d t a ( p h 8 0 ) ，加水定容至5 0 0 m l ； 6 x 载样液：0 2 5 溴酚兰，0 2 5 一- - 甲苯氰，4 0 ( m v ) 存于4 ： 代e b ：g o l d v i e w t m ，北京赛百盛基因技术有限公司。 加5 7 l u l 冰乙 蔗糖溶液，保 2 1 3 4p c r 产物纯化试剂 b i n d i n gb u f f e ri ：e z 一1 0s p i nc o l u m np c rp r o d u c tp u r i f i c a t i o nk i t 试 剂盒自带； w a s hs o l u t i o n ：e z 一1 0s p i nc o l u m np c rp r o d u c tp u r i f i c a t i o nk i t 试剂 盒自带。 2 1 4 实验方法 2 1 4 1 提取基因组d n a 1 将骨骼置于超净工作台中，紫外灯照射约1 h 。钻取骨粉，表层深约 o 5 c m 的骨粉弃之不用，钻取深层骨粉约0 5 0 ，8 9 ，将骨粉放入灭菌的 2 m le p p e n d o r f 管内，并用灭菌纯水浸泡。 山东大学颂j 。学位论文 2 向骨粉中加入l m l 消化液，将骨粉置于5 6 c 水浴锅中温育，消化过 夜。 3 将消化的骨粉样品取出，5 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，取上清l m l 置于灭 菌的2 m le p p c n d o r f 管内。 4 向管内加入5 0 0 a 平衡酚和5 0 0 l 氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 溶液，颠倒 混匀；1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，取上清9 5 0 “l 置于灭菌的2 m le p p e n d o r f 管内。 5 向管内加入4 7 5 ! 平衡酚和4 7 5 z l 氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 溶液，颠倒 混匀；1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，取上清9 0 吮l 置于灭菌的2 m le p p e n d o r f 管内。 6 向管内加入9 0 叽1 氯仿，异戊醇( 2 4 ；1 ) 溶液，颠倒混匀；1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n t 取上清8 0 0 # 2 置于灭菌的2 m le p p e n d o r f 管内。 7 向管内加入8 0 蛳1 氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 溶液，颠倒揭匀；1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，取上清6 0 0 1 置于灭菌的2 m le p p e n d o r f 管内。 8 向管内加入2 v 的冰乙醇和0 2 v 的n a a c ，颠倒混匀，放入一2 0 的 冰箱内约2 4 h ，以促进d n a 沉淀。 9 将冰箱中的样品取出，1 3 0 0 0 r p m 离心1 0 r a i n ，弃上清；加入l m l7 0 冰乙醇，1 3 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃上滴；再加入l m l7 0 冰乙醇，1 3 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃上清；室温下晾干d n a ，加入5 0 # 1 灭菌纯水溶解。 1 0 取5 t ld n a