（植物学专业论文）番茄dr8基因启动子的克隆及其调控初探.pdf

重庆大学硕士学位论文 中文摘要 摘要 番茄d r 8 d e v e l o p m e n tr e g u l a t i o n8 基因是一个与果实成熟相关的新基因 与拟南芥的生长素反应基因家族 a u x l a a 具有很高的同源性 d r 8 基因作为 个生长素诱导表达的基因 其表达水平却受到乙烯的负调控和生长素的正调控 预示着该基因不仅对果实成熟过程具有重要的调控作用 并且可能和生长素与乙 烯的相互作用密切相关 目前 d r 8 全长基因已构建到植物表达载体p g a 6 4 3 通 过农杆菌介导的基因转化方法将其转入番茄基因组中 获得了d r 8 超表达和抑制 表达的转基因植株 为了深入阐明该基因的表达调控机制及其对乙烯 生长素的 反应 十分必要分离d r 8 基因的启动子 分析并确定其激素调控区域及精确调控 位点 为该基因的功能研究及启动子的应用奠定基础 本研究利用d n a 步移p c r 法进行启动子扩增 并从中设计构建了3 个5 端缺失片段的p g r e e n g f p 荧光表达 载体 转化烟草原生质体 经2 4 一d 处理后的荧光表达分析发现在2 5 0b p 区域内 存在1 个生长素的正调控位点 另外 在本研究中还构建了7 个p b l l 2 1 植物表达 载体 为d r 8 基因启动子的番茄转化研究奠定了很好的基础 主要研究结果如下 利用d n a 步移p c r 技术从番茄基因组d n a 中分离了d r 8 基因的部分启 动子 1 0 3 1b p 启动子序列分析表明 启动子序列中含有大量a t 丰富区域 t a t a b o x c a a t b o x g b o x 此区域为启动子的基本功能区 在该启动子序列中还 存在其它调控区域 如e r e 是乙烯响应元件 h s e 是热激响应元件 3 a f l b i n d i n gs i t e 是光响应元件 t c a e l e m e n t 是水杨酸响应元件 构建了3 个5 端缺失片段的p g r e e n g f p 荧光表达载体 其缺失片段大小 分别为2 5 0b p 5 0 0b p 1 0 3 1b p 通过p e g 法将荧光表达载体转化烟草原生质体 经2 4 一d 处理后发现启 动子中存在生长素的正调控区域 位于3 端2 5 0b p 范围内 构建了7 个p b l l 2 1 植物表达载体 关键词 d r 8 基因 启动子 构建 表达载体 p g r e e n g f p i 重庆大学硕士学位论文中文摘要 a b s t r a c t d r 8 d e v e l o p m e n tr e g u l a t i o n8 一an e wg e n ea b o u tf r u i tr i p e n i n g h a sh i g h e r h o m o l o g yw i m a u x i a ai nt h ea r a b i d o p s i s d r 8g e n ea 8a na u x i n i n d u c eg e n e i sa l s o n e g a t i v e l yr e g u l a t e db ye t h y l e n ea n dp o s i t i v e l yr e g u l a t e db ya u x i n i ts u g g e s t sd r 8 g e n eh a si m p o r t a n tr e g u l a t i o ne f f e c to nf r u i tr i p e n i n ga n dt h er e l a t i o nb e t w e e na u x i n a n de t h y l e n ep r o b a b l y a tp r e s e n t d r 8g e n e sf u l ll o n gs e q u e n c ew a si n s e r t e di n t o v e c t o r p g a 6 4 3 a n dw a st r a n s f o r m e di n t ot o m a t og e n o m eb ya g r o b a c t e r at r a n s f o r m t e c h n o l o g y d r 8o v e r e x p r e s s i o na n du n d e r e x p r e s s i o nt r a n s g e n i cp l a n t sw e r eo b t a i n e d i no r d e rt oc l a l i f yt h ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o nm e c h a n i s ma b o u td r 8g e n ea n dt h e r e s p o n s eo fe t h y l e n ea n da u x i n i nt h er e s e a r c hi n t e n d i n gt oa m p l i 母d r 8g e n e s p r o m o t e r a c c o r d i n gt oa n a l y s i st h ef u n c t i o no fd r 8g e n ep r o m o t e r c o n f i r m i n gt h e r e g u l a t e dr e g i o na n de x a c tr e g u l a t e ds i t e e s t a b l i s h i n gt h eb a s ef o rr e s e a r c h i n gd r 8 g e n e sf u n c t i o na n dp r o m o t e r sa p p l i c a t i o n u s i n gg e n o m ew a l k i n gp c rt e c h n o l o g y a m p l i f i e dp r o m o t e r d e s i g n e da n dc o n s t r u c t e dt h r e e5 d e l e t ep g r e e n g f pf l u o r e s c e n t e x p r e s s i o nv e c t o r s a n dt r a n s f o r m e di n t ot o b a c c op r o t o p l a s t a r e rt r e a t e dw i t h2 4 一d a n df l u o r e s c e n td e t e c t i n g t h er e s u l t ss h o w e dm a tt h e r ew a go n ea u x i np o s i t i v e l y r e g u l a t e ds i t ei n2 5 0b po f3 e n d m e a n w h i l e t h es e v e np b l l 2 1p l a n te x p r e s s i o nv e c t o r s w e r ec o n s t r u c e d p r e p a r i n gf o rt h et r a n s f o r m a t i o nw o r ko f d r 8p r o m o t e ri nt o m a t o t h e m a i nr e s u l t so f r e s e a r c hi nt h i st h e s i sa l ef o l l o w e d t h e1 0 3 1b pp r o m o t e rr e g i o no fd r 8g e n ef r o mt o m a t ow a sa m p l i f i e db y g e n o m ew a l k i n gp c rt e c h n o l o g y p r o m o t e rs e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h i sc l o n e df r a g m e n th a sl o t so fa t r i c h r e g i o n s t a t a b o x c a a t b o x g b o x t h e ya r et h eb a s ef u n c t i o nr e g i o n i na l lp r o m o t e r s m e a n w h i l e t h e r ea r es o m eo t h e rr e g u l a t i o nr e g i o n si nt h i s p r o m o t e rs e q u e n c e s u c ha se r ei se t h y l e n er e s p o n s ee l e m e n t h s ei sh o t r e s p o n s ee l e m e n t 3 a f lb i n d i n gs i t ei sl i g h tr e s p o n s ee l e m e n t t c a e l e m e n t i ss a l i c y l i cr e s p o n s ee l e m e n t c o n s t r u c t i n gt h r e ef l u o r e s c e n c ev e c t o r s t h ec o n s t r u c t e df r a g m e n tw e r e2 5 0b p 5 0 0 b p 1 0 3 1b p t h ee x p r e s s i o nv e c t o r sw e r et r a n s f o r m e di n t ot o b a c c op r o t o p l a s tb yp e g t e c h n o l o g ya n dw e r et r e a t e dw i m2 4 一d f l u o r e s c e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a t t h ea u x i n p o s i t i v er e g u l a t i o nr e g i o n l i k e l y i n t h e2 5 0b p o f 3 e n d 重庆大学硕七学位论文 英文摘要 c o n s t r u c t i n gs e v e np b l l 2 1p l a n te x p r e s s i o nv e c t o r s k e y w o r d s d r 8g e n e p r o m o t e r c o n s t r u c t i o n e x p r e s s i o nv e c t o r p g r e e n g f p h 重庆大学硕士学位论文 英文缩略词 2 4 d e r e h s e p c r d r p e g 英文缩略词 2 4 d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d e t h y l e n er e s p o n s ee l e m e n t h o ts h o c ke l e m e n t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n d e v e l o p m e n tr e g u l a t i o n p o l y e t h y l e n eg l y c o l v 2 4 二氯苯氧乙酸 乙烯响应元件 热激响应元件 聚合酶链式反应 发育调控 聚乙二醇 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得重麽太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 学位论文作者签名 霉钇翮 签字日期 唧年l 月1 1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解重庆太堂有关保留 使用学位论文的 规定 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许 论文被查阅和借阅 本人授权重废太堂可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段 保存 汇编学位论文 保密 在年解密后适用本授权书 本学位论文属于 不保密 请只在上述一个括号内打 4 学位论文作者签名 宋红同 签字日期 a 呻年 月 j 日 导师签名 仞 签字日期 c 2 群 月 f 日 重庆大学硕士学位论文l 绪论 1 绪论 1 1 启动子的概念及其结构特征 1 1 1 启动子的概念 启动子是一段位于结构基因5 端上游区的d n a 序列 能活化r n a 聚合酶 使之与模板d n a 准确地结合并具有转录起始的特异性 含有与基因表达相关的三 个重要调控元件 即 富含a t 序列 某些a t 丰富的区段是转录因子结合的 重要部位 这些区段对下游基因的高效转录和表达具有重要意义 t a t a b o x c a a t b o x 启动子的结构影响它与r n a 聚合酶的亲和力 直接关系到转录的 效率 一些r n a 聚合酶需要启动子特异性地起始转录 从而影响了基因的表达水 平 是基因表达调控的重要顺式元件 l 2 1 1 1 2 启动子的结构特征 启动子区域存在多种特征元件 参与r n a 聚合酶的识别 结合 诱导转录等 过程 目前 在真核生物中己鉴定了多种特定的启动子序列 常常位于基因转录 起始位点5 近端的核苷酸序列上游 2 0 一2 2 0b p 区域内 包括位于转录起始位点上 游 2 0 一3 0b p 处的t a t a 框及 8 肚一2 2 0b p 处的上游启动子元件 转录起始位点 基因的转录起始位点通常位于翻译起始密码子 a t g 上游 4 0 一7 0b p 处 j o s h i 通过对7 9 个高等植物基因启动子区d n a 序列的比较研究推衍出 植物a t g 密码旁侧的序列较为保守 常为t a a a c a a t g g c t 基因转录起始的保守顺序为 c t c a t c a 中间的a 为转录的起始点 编号 1 3 j 从基因转录起始点到翻译起始 密码子之间的序列被称为5 端非翻译区 该区的5 端是m r n a 前体加帽的位点 5 端非翻译区对翻译效率具有调控作用 此外在一些植物基因的5 端非翻译区中有 内含子存在 这些内含子有增强基因表达的作用 再者 转录起始位点发生突变 或缺失都会影响转录 t a t a 框 t a t a 框是第一个被确定的r n a 聚合酶i i 的启动子元件 也是一些反式作用 因子与d n a 相互作用的位点之一 植物启动子t a t a 框是位于转录起始位点上游 3 2 t 7 处的一段富含a t 碱基对的序列 与动物启动子略有不同 其保守序列为 5 t c a c t a t a t a t a g 3 t a t a 框依靠与转录因子t f i id 的识别结合而发挥功能 选择并决定r n a 聚合酶的正确起始转录位点 以及介导前转录复合物的形成 保 证精确起始 另外 在一些启动子中该元件还决定转录的方向 或者介导上下游 元件对转录的调控作用 t a t a 框是绝大多数植物启动子正确启动转录所必需的 重庆大学硕士学位论文1 绪论 而启动子中不含t a t a 框的基因的精确转录受起始因子介导 一般上游启动子元件 在真核基因启动子中普遍存在c a a t 框和g c 框两种元件 它们或者同时存 在 或者只存在其中之一 有时还是多拷贝的 但并非所有真核基因的启动子都 存在着一般上游启动子元件 例如在有些植物细胞中几乎不存在c a a t 框1 4 1 c a a t 框即在t a t a 框上游约5 0b p 处的一段5 g c t c c a a t c t 3 序列 其转录激活因子是n f l 和c t f 等多种蛋白 c a a t 框具有增强基因转录起始活性 的作用 对两个方向都可激活 而且作用距离不定 从转录起始位点到c a a t 框 附近这一区域通常被称为基础启动子 2 g c 框g c 框通常位于转录起始位点上游约 9 0b p 处 它可以处于t a t a 框与c a a t 框之间 也可位于c a a t 框上游 位置因基因而异 其保守序列为 5 g g g c g g 3 可有多个拷贝 并能以任何方向存在而不影响其功能 g c 框须与 另一种特异的转录因子s p l 结合才能促进基因转录 1 2 启动子克隆方法 1 2 1 利用启动子探针载体筛选启动子 这是一种高效 经济 快速分离基因启动子的方法 它是利用缺失启动子控 制易检测的报告基因表达 构建启动子探针质粒载体来克隆有启动功能的d n a 片 段 其一般程序是 先选用一种适当的核酸内切酶 消化切割染色体d n a 接着 将切割产生的d n a 限制片段群体与无启动子的质粒载体重组 并按照设计的要求 使克隆的片断恰好在紧邻报告基因的上游位置 随后再把重组混合物转化到寄主 细胞 构成质粒载体基因文库 并检测报告基因的表达活性 报告基因若有活性 则其上游的d n a 片段即具有启动子活性 卯 r a c h a e l 等在大肠杆菌中以四环素抗性基因作为报告基因构建了启动子探针质 粒p b r h 3 b 并克隆了一些原核和真核启动子片段 6 f o d o r 等以大肠杆菌l a c z 为 报告基因 构建了酵母启动子探针质粒并克隆了一些启动子片段 7 1 m a r k 等以邻 苯二酚双加氧酶基因为报告基因 在枯草杆菌中构建了启动子探针质粒并克隆了 一些启动子片段 8 该方法不需要知道具体的基因序列 可随机筛选启动子 这样 避免了设计引物 并能获得大量的启动子片段 但是这种方法需要构建一个穿梭 载体 建库 转化 筛选 工作量较大 1 2 2 利用常规p c r 技术克隆启动子 近年来p c r 技术因其简便快捷的特点 从而得到人们的广泛运用 该方法是 根据已知的基因序列 设计引物 采用p c r 技术克隆基因的启动子 如 蒋浩等 用p c r 方法从美洲黑杨基因组d n a 中扩增出b s a 基因启动子片段 9 李强等分 2 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 别从欧洲黑杨和美洲黑杨中扩增出w i n 3 基因启动子w i n p 7 5 0 b p 和w i d p 7 9 1 b p 1 0 苏宁等根据己报道的水稻叶绿体1 6 s r r n a 基因启动子序列设计5 端启动子序列的引物 以水稻叶绿体d n a 为模板 p c r 扩增出1 6 s r r n a 基因5 端启动子区的片段 1 彭仁旺等根据已报道的序列设计引物 通过p c r 扩增 从 烟草中克隆了花药特异表达基因劢 2 9 的启动子 1 这种启动子克隆方法是建立 在基因序列已知的基础上 只有知道了基因序列 才能根据已知序列设计出引物 对该基因的启动子进行扩增 且只能扩增两端已知序列之间的区域 有一定的局 限性 1 2 3t a l l p c r t h e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp c r t a l l p c r t e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e ap c r 又叫热不对称交错p c r 该 方法可以从突变体中克隆获得外源插入基因的旁侧序列 从而为启动子的克隆提 供了一种有效的新方法 该方法的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计三 个嵌套的特异引物 用它们分别与一个随机简并引物 a r b i t r a r yd e g e n e r a t ep r i m e r a d 相结合 以基因组d n a 为模板 根据引物的长短和特异性的差异设计不对 称的温度循环 通过分级反应来扩增特异产物 该方法一般可以扩增到0 2 2k b 的片段 t a l l p c r 方法具有以下优点 方法简单 只要设计好引物 即可用 基因组d n a 为模板直接进行p c r 扩增 特异性高 用简并引物和特异性嵌套 引物相组合 通过不对称的温度循环和分级反应 使最终的目的片段占绝对优势 高效灵敏 使用任何一个a d 引物 在6 0 8 0 的反应中能产生特异性产物 快速 整个反应可在l 天内完成 避免了d n a 的环化和连接 反应产物准 确可靠 重复性好 t a l d p c r 的创新之处在于其热不对称的分级反应 有效防 止了非特异产物的扩增 虽然t a l l p c r 有着众多的优点 它仍然存在着很多不 尽人意的地方 t a l l p c r 反应需要较多的引物组合 此外 由于随机简并引物 存在有限的结合位点 对个别侧翼序列 即使使用不同的简并引物也难以扩增到 阳性结果 整个反应需要一系列连续反应 条件设置要求精细 另外 还要求引 物和模板有较高的纯度 如果有降解或纯度不够 也很难扩增出特异性条带 t a l l p c r 还很有可能扩增的是高度重复序列 因而无法步行 t a l l p c r 技术适合于分离获得克隆载体上的d n a 序列 达到克隆相关基因 的启动子的目的 如小麦的己知序列两侧翼的d n a 序列的分离 财音青格乐等 用t a l l p c r 法从大豆基因组中扩增得到启动子片段b c s p 6 6 6 虽然延伸的片段 较短 但可以通过增加随机简并引物的数量使其延长的片段更长 l 1 2 4 利用载体或接头的染色体步移技术 c h r o m o s o m ew a l k i n g 染色体步移又称反向p c r i n v e r s e p c r 该法只要有一端序列是已知的 就 可以对未知d n a 片段进行扩增 该方法的第一步是酶切基因组d n a 连接载体 3 重庆大学硕士学位论文1 绪论 或接头 根据实验需要 接头既可以是双链也可以是单链 然后根据基因组d n a 序列设计的特异引物和载体的通用引物或接头序列进行扩增 它的基本程序是 选择己知序列内部没有切点的限制性内切酶对此段d n a 进行酶切 然后在d n a 连接酶的作用下自连 形成环状d n a 分子 设计合适方向并与已知序列两端互补 的引物 以连接成环的d n a 为模板 经p c r 扩增后 可以得到已知序列的旁侧 d n a 片段 反向p c r 方法直接克隆已知序列外的未知d n a 区域依赖于酶切d n a 的环化 效率 由于环化连接过程中常常产生多联体 使闭环双链d n a 的p c r 扩增效率 差 常得不到满意的结果 因此出现了许多改进的反向p c r 方法 韩志勇等以反 向p c r 为基础 通过设计两对引物 结合热启动p c r 和降落p c r 技术 从水稻 总d n a 中克隆了转基因水稻的外源基因旁侧序y j t l 具体操作为 先用小量法提 取转基因水稻的总d n a 总d n a 用1 0 倍过量的限制性内切酶进行过夜酶切 酶 切片段进行自连接 然后根据工程质粒的t d n a 区设计2 对反向引物 进行套式 p c r 扩增旁侧序列 建立了适合于处理大量材料的克隆转基因水稻中外源基因旁 侧序列的技术体系 在l 周内克隆了3 5 个转基因水稻株系中外源基因的旁侧序列 长度在3 0 0 7 5 0b p 之间 实验结果表明这个方法具有快速 稳定和高效 操作相 对简单的优点 袁烁等利用该方法克隆得到了水稻花粉p r o f i l i n 基因的启动子序列 l6 1 杨满业等人利用该方法成功地从苦瓜中分离出b a g 启动子 并进行了表达载 体构建等工作 1 本实验中就是采用的该扩增方法 根据只有一端序列已知的d n a 片段设计了两个后引物 由染色体步移试剂盒提供两个接头引物 以内切酶消化 的基因组d n a 为模板进行未知片段的扩增 一8 19 1 王新国等对胡萝b 基因组d n a 进行酶切 将酶切后的片段与一特殊的衔接头 连接作为模板进行p c r 扩增 成功地克隆得到一个新的s i i 基因启动子片段 2 0 l 这种方法利用特殊的衔接头 避免了d n a 环化 是寻找已知序列旁侧未知启动子 或其它调控区域的有效方法 另外 由j o n e s 2 i 等提出的p a n h a n d l ep c r 技术是利用末端反向重复序列与已 知序列互补配对形成环状单链模板 有效增强了引物与模板结合 具有非常高的 特异性 多用于扩增人类的基因组d n a 反应需要3 个根据己知序列设计的引物 3 个引物在已知序列内呈线性排列 其中第三个引物可以作为接头使用 可与已知 序列互补配对形成锅柄状单链模板 其过程为 首先酶切基因组d n a 产生5 或 3 粘末端 然后连接上合适的接头 连接好后最好用核酸外切酶除去多余的接头 由于连接上的接头与已知序列是反向重复序列 变性后的d n a 单链可退火形成锅 柄状单链模板 之后分别用3 个单引物3 次p c r 扩增 能有效扩增2 9k b p 的大 片段未知序列 黄君健等用此技术成功地获得了人体外周血单核细胞基因组d n a 4 重庆大学硕士学位论文l 绪论 中h t e r t 基因翻译起始位点上游2 0 9 0b p 的基因组d n a 序列 2 2 目前 启动子克隆方法种类繁多 发展迅速 启动子克隆方法绝大多数是利 用建立在p c r 基础上的染色体步移技术 利用启动子克隆的方法不仅可以克隆到 基因的启动子 同时还可以用于克隆e d n a 的全长 分子生物学的一个重要问题 是如何利用大量积累的基因部分序列进一步克隆全长基因及其调控序列 而启动 子克隆方法为这一问题提供了简便有效的手段 另外 随着基因工程的发展 越 来越多的转基因动植物 常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体 启动子对外源基因的表达水平影响很大 是基因工程表达载体的重要元件 因此 研究启动子的克隆方法 对研究基因表达调控和构建表达载体至关重要d g 将会 大大扩展植物基因工程的发展空间 更能有效的利用启动子来调控植物的生长发 育和生命周期 随着p c r 技术的不断进步 一定会有更多 更好的克隆启动子的方法产生 而它们最后也将会成为克隆基因全长或突变体 特别是转座子插入突变体 中目 的基因的简便高效的新方法 1 3 启动子的分类 根据控制转录水平的高低 启动子可以分为强启动子和弱启动子 按其作用 方式及功能 可将植物基因工程中常用的启动子分为3 类 即组成型启动子 组 织特异型启动子和诱导型启动子 这种分类大体上反映了它们各自的特点 但在 某些情况下 一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性 1 3 1 组成型启动子 迄今为止 在绝大多数高等植物转基因工作中 都是使用组成型的启动子 组成型启动子即基因的表达不受时空限制和某种物质的诱导而在植物中表达出 来 具有持续性 r n a 和蛋白质表达量也相对恒定 过去 在转基因植物研究中 一个组成型高效强启动子花椰菜花叶病毒c a m v3 5 s 启动子应用较广 能在大部 分植物中对基因进行启动表达 由于c a m v3 5 s 启动子是从病毒中克隆得到的 将其基因启动子序列应用到植物基因工程中就可能存在着潜在的生物不安全性 为此 人们从植物自身克隆组成型启动子以进行应用 并初见成效 例如从水稻 和玉米中分别克隆了肌动蛋白和泛素基因的启动子 并用这些启动子代替 c a m v 3 5 s 启动子 可以更有效地在单子叶植物中驱动外源基因的表达 n a o m i 等 分别从拟南芥的色氨酸合酶b 亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应的启动 子 用其代替c a m v 3 5 s 启动子 在转基因烟草中也取得了很好的表达效果 2 3 1 但是由于组成型启动子会使驱动的目的基因在植物各组织中恒定而持续地表达 过度消耗细胞内的物质和能量 不能从时间和空间上有效地调控目的基因的表达 5 重庆大学硕士学位论文1 绪论 因此在应用中存在一定的缺陷1 2 如利用组成型启动子表达病毒衣壳蛋白 就可 能会引起病毒衣壳转移 从而导致植物病毒新株系的产生 2 另外 重复使用同 一种组成型启动子驱动2 个或2 个以上的外源基因表达可能会引起基因沉默或共 抑制现象m o j 1 3 2 诱导型启动子 植物的生长发育受到来自植物内部 如激素 以及植物所处环境的共同调控 植物在不同信号的刺激下 诱导某些基因表达以使植物能够对某些信号产生响应 以适应体内外环境的变化 达到正常生长的目的 诱导型启动子能控制基因在特 定时期 特定部位表达 这既避免了目的基因在寄主细胞内高表达对寄主细胞生 长的影响 又可使寄主细胞对诸如热激 光照 创伤等特定的环境信号作出反应 因此 强诱导型启动子对于建立一个高效 实用的表达系统是非常重要的 近年来 高等植物基因表达调控的研究不断深入 主要集中在光调控基因 激素诱导基因 逆境胁迫诱导基因及其它一些相关基因上 近来 诱导型r d 2 9 a 启 动子不仅应用于拟南芥 烟草中 还有研究者已应用r d 2 9 a 启动子连接g u s 报告 基因导入水稻 在逆境胁迫条件下 也观察到转基因水稻植株中的g u s 活性 i 逆境胁迫诱导表达基因r d 2 9 a 的启动子作为一种诱导型启动子在植物抗逆性研究 中应用越来越广泛 国内外已利用r d 2 9 a 启动子调控一些转录因子在转化烟草 拟南芥等植物中的表达 并获得了转基因植物的高度抗逆性 因此 r d 2 9 a 启动 子有可能成为目前在植物抗逆性研究中适用性很强的一种逆境诱导型启动子 2 光诱导表达启动子t a d a 等把l h c p 基因与g u s 连接形成嵌合载体转化 水稻 组织化学检测表明 g u s 只在绿色组织中得到表达 黑暗中生长的植株检 测不到表达活性 但在光照下可以检测到表达活性 2 8 1 刘巧泉等从武运粳8 号水 稻中克隆了柏岱基因的5 上游调控区 构建了由 6 岱启动子引导的g u s 融合基 因 并经农杆菌介导导入到水稻中 2 卵 对转基因水稻植株中 g u s 活性的定量测 定结果表明 光诱导处理可明显提高r b c s 启动子启动的外源基因的表达量 热诱导表达启动子王雅琴将热休克基因d n a k 启动子的d n a 片段d n a k p 亚克隆到报道载体质粒p u c d 6 1 5 携带的费氏弧菌荧光酶基因l u x c d a b e 上游 重 组成质粒融合体p u e d 6 15 p 并转化大肠杆菌 3 们 结果表明d n a k 启动子对热诱导 有响应 通过来自西红柿的2 个热胁迫转录因子 h s f l p h s f a l 和l p h s f a 2 的比 较发现 高温胁迫顺式元件的一段特异序列对于h s f 启动子的选择度是至关重要的 3 l l 创伤诱导表达启动子许多植物都能对人为创伤或害虫造成的机械损伤 作出反应 使某些创伤诱导基因启动表达发挥抗性作用 形成创伤诱导表达启动 子 这些创伤诱导的基因编码多种蛋白产物 如几丁质酶和b 2 1 3 2 葡萄糖酶等 6 重庆大学硕士学位论文1 绪论 水解酶类 木质素 蛋白酶抑制剂等 c l a r k e 等利用w i n 6 基因上游区和g u s 报告 基因融合 转化烟草 得到的转基因植株叶组织显示其受到近侧和远端创伤诱导 3 2 李强等从欧洲黑杨和美洲黑杨中扩增出晰订基因启动子w i n p 7 0 s b p 和 w i d p 7 9 1 b p 与来自大肠杆菌的g u s 基因融合 通过根癌农杆菌t i 质粒转化系统 转入烟草中 证实了w i n p 和w i d p 控制的g u s 基因不仅在损伤部位表达 而且 具有系统的因伤诱导效应 l 此外 泛素核糖体蛋白融合基因u b i 3 马铃薯p i n 2 基因启动子同样也受到创伤诱导f 3 3 1 激素诱导表达启动子激素在植物生长发育中起着重要作用 涉及许多生 理生化过程 其本身不能直接作用于d n a 必须首先与其受体结合 使受体蛋白 激活再启动特定基因的表达 从而引起一系列生理反应 作为一种研究方法 植 物激素如生长素 脱落酸 乙烯等 可广泛用到诱导基因的分离和研究中 从分 子水平上阐明激素引起的植物生理反应的分子机制就显得很重要 y o o n 等克隆了 绿豆的生长素诱导基因v r 2 a c s 6 并分析了转化烟草植株中该启动子在各种激素 作用下的活性 有些可被生长素诱导的启动子还含有g 盒结构或t g a h e x 盒m3 5 樊荣等利用基因组d n a 步移p c r 法从番茄中克隆了3 8 1 0b p 的 正4 c s 6 基因的 启动子片段 5 端系列缺失结合基因枪法进行番茄果实上的瞬时表达实验证实 该 基因a t g 上游1 3k b 左右的启动子片段 包括5 u t r 区 就可以驱动l u c 报告 基因在番茄果实中的瞬时表达 表现出受乙烯和果实成熟负调控的特点 3 6 1 真菌和共生菌诱导表达启动子高等植物具有严密的抗病防御体系 病原 菌感染可诱导许多基因的表达 形成多种防卫机制 马铃薯p 6 9 b 和p 6 9 c 基因编 码2 个密切相关的枯草杆菌蛋白酶 并与它们的抗菌反应相关联 l u c i a 等把这2 个基因的启动子分别与g u s 和l u c 基因相连后转入拟南芥 比较它们的基因调控 模式 表明p 6 9 b 和p 6 9 c 启动子受水杨酸诱导以及在假单胞菌的侵染下启始抗性 作用 34 b e l b a h r i 等将来自烟草的病原菌诱导基因h s r 2 0 3 d 的启动子与来自青枯菌 的p o p a 诱导子基因相连 转入烟草植株 发现诱导表达的p o p a 基因定位在h r 且转基因植株对卵菌病原体具有高度抗性 3 1 3 3 组织特异型启动子 组织或器官特异性启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组 织中 并往往表现出发育调节的特性 目前对组织特异性启动子的调控机制已进 行了深入的研究 发现这类启动子除具有一般的启动子结构外 同时还存在几种 控制组织特异性表达的元件 通常还有增强子和沉默子的一般特性 其表达特异 性由这些元件的种类 数目及相对位置等共同决定 因此深入研究这类启动子不 仅有助于阐明植物形态 发育 代谢途径等基础理论 而且具有广泛的应用价值 目前 组织或器官特异性启动子的研究和应用已成为植物基因工程研究的热点之 7 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 o m a r i a n i 等将烟草花药绒毡层特异表达基因启动子t a 2 9 与核酸酶b a r n a s e r n a s e t l 基因融合后转化植物 核酸酶基因在花药中特异表达 破坏绒毡层 获得 雄性不育烟草和油菜 3 9 f 删 开创了基因工程创造雄性不育系的先河 至今已在烟 草 油菜 4 2 水稻 1 拟南芥 4 4 1 等植物上获得成功 毛自朝等用p c r 方法获得 了番茄果实专一性启动子2 a 1 2 和农杆菌c 5 8 t i 质粒上的妒f 基因 经农杆菌介导 转入番茄品种 中蔬4 号 的基因组中 g u s 组织化学活性分析表明 刎 2 启动予 具有严格的果实表达专一性1 4 5 1 1 4 启动子克隆的意义 基因表达的产物是r n a 和蛋白质 这两大类物质及其次级产物维持着整个机 体的生命活动 任何基因表达调控程序上的缺陷或紊乱 均会对生物体造成严重 后果 因此 基因表达调控的机理是分子生物学研究的热点和前沿 蛋白质编码 基因的表达需经过转录和翻译两大环节 且每个环节都存在着不同的基因表达调 控位点 不论是原核生物还是真核生物 在基因表达调控的细节上尽管差异很大 但两者的调控模式却具有极大相似性和可比性一转录环节是最主要的调控过程 习 而启动子的调控在转录环节中又占有十分重要的地位 因此 研究启动子的功能 序列对于基因表达调控机制的研究具有十分重要的意义 启动子是基因表达所必需的 启动子上任何一个碱基的变化都可以引起基因 表达的改变 从而引起生物机体的生理生化性质 表型等出现差异 如人体中 a p o c 1 1 基因启动子 1 9 0 处一个t 突变为a 直接导致a p o c l i 启动子转录活性变 化 a p o c l l 基因表达量降低 从而引起人体的贫血 肺部感染死亡等临床症状 4 6 同时 启动子对外源基因的表达水平影响很大 要使克隆的基因能够在宿主细胞 中顺利表达 其编码结构应该处于宿主启动子的有效控制之下 且启动予与受体 细胞之间的合理匹配对异源基因在宿主细胞中的表达有着重要的作用 香菇成功 转化r a g 基因启动予证明了 缎启动子具有较强的调控外源基因表达的作用 h i r a n o 等分离了香菇的g p d 基因启动子 并构建了一个转化载体p l g h p t 标记基因是潮 霉素抗性基因 用它来转化香菇 得到了潮霉素抗性转化子 其转化率比用p l g h p t 转化时更高 说明g p d 基因启动子比r a s 基因启动子具有更强的调控外源基因表达 的能力h 7 4 引 随着植物基因工程的发展 为了更经济 更有效地发挥外源基因的作用 或 避免基因产物对受体生物及环境产生副作用 需使外源基因只在特定的组织或器 官中表达 目前此类运用仅有少数成功的报道 主要原因是外源基因在目标植物 中的表达水平不够高 为了使有价值的外源基因在植物中高效专一表达 寻找具 8 重庆大学硕七学位论文 1 绪论 有特异性表达的启动子或者相关调控序列具有重要意义 王利军在研究拟南芥 a t s l a 基因启动子时发现将该启动子与g u s 基因相连后转入烟草中 可特异驱动 g u s 基因在烟草中高效表达 这说明a t s l a 基因启动子在烟草中同样具有启动外 源基因表达的功能 a t s l a 基因启动子从而也就可以成为植物基因工程中一个良好 的候选启动子 4 9 1 刘大文等在对拟南芥花药绒毡层启动子克隆的实验中发现将a 9 启动子转入玉米花药中可用于构建雄性不育基因 创造雄性不育个体 说明该外 源启动子对玉米体内相关基因的表达仍然起作用 4 4 1 9 重庆大学硕士学位论文2 研究意义 目的和主要内容 2 研究的目的意义和主要内容 2 1 研究的目的意义 果实的生长发育和成熟是一个非常复杂的生理生化过程 受到植物激素 环 境条件和基因表达等多方面因素的影响和调控 伴随着大量的程序化基因表达过 程 5 5 1 o 据已有的研究结果表明 生长素在果实的发育前期起着主要的调控作用 1 5 2 乙烯主要对果实成熟 衰老起主要调控例 虽然目前对这两类激素与果实成 熟的关系有了一定认识 但对于这两种植物激素如何在果实成熟过程中相互作用 及其作用机制研究很少 目前只有零星的研究报道 尚未获得突破性的研究成果 非常缺乏必要的基础研究 5 所以 开展生长素和乙烯的相互作用及其机理研究 具有重要的理论价值 d r d e v e l o p m e n tr e g u l a t i o n 基因是通过差异显示p c r 法从番茄果实中分离 的果实发育相关基因 研究该基因的目的在于寻找与乙烯协同调控果实发育的因 子 通过同源序列分析得出 d r l 3 4 8 属于a u x i a a 基因家族 d r l 2 属于 a r f 基因家族 5 习 研究结果表明 在果实中 d r l 3 4 8 的表达受到乙烯的调 控 而在叶片中则没有这种情况 表明这些基因在特定组织 果实 中的表达受到乙 烯的调控 它们可能与果实发育相关 如图2 1 和2 2 到目前为止 研究得比较清 楚的是d r l 2 和d r 4 a c 2 h 4f r u 毂 b c 2 h 4l e a v e s d r l d r 3 o 只4 o r 8 u b 3 o1 5 5 h0 1 髫s h 图2 i 利用r t p c r 技术分析番茄果实和叶片d r 基因的表达量 引自 5 6 f i g2 1t h er t p c ra n a l y s i so ne x p r e s s i o no f t o m a t od rg e n ei nf r u i ta n dl e a v e s m g m a t u r eg r e e n 果实 用5 0p 几的乙烯处理1 5 分钟 5 小时和未处理三种情况下d r 基因的表达情况 叶片用5 0p l 见的乙烯处理1 5 分钟 5 小时和未处理三种情况下d r 基因的表达情况 1 0 重庆大学硕士学位论文2 研究意义 目的和主要内容 a r i p e n i n g e l gl l gm g 芝转 b 2 4d o2 h d a y sp o s ta n t h e s 诲 图2 2 利用r t p c r 技术分析番茄果实各发育时期d r 基因的表达量 引自f 5 6 f i g2 2t h er t p c ra n a l y s i so ne x p r e s s i o no f t o m a t od rg e n ei na l ld e v e l o p m e n t a lp e r i o d s 不同时期的果实e i g e a r l yi m m a t u r eg r e e n l i g 1 a t ei m m a t u r eg r e e n m g m a t u r eg r e e n e r e a r l yr e d 中 d 矗 王t8 基因的表达量的变化情况 绿熟果实 用1 0u m 的2 4 d 处理2 小时和未处理两种情况下d r 基因的表达情况 番茄果实成熟过程中内源乙烯的产量 经表达分析发现 d r 8 在果实发育过程中稳定表达 但在果实成熟过程中 转 色期 其表达水平迅速下降 该基因的表达水平受到乙烯的负调控和生长素的正 调控 绿熟期果实经5 0 l l 乙烯处理后表达水平迅速降低 果实经1 0p m2 4 一d 处理后 表达增强 见图2 3 1 5 d r 8 作为一个生长素诱导表达的基因 但却强 烈地受到乙烯和果实成熟的调节 预示着该基因不仅对果实成熟过程具有重