（生物化学与分子生物学专业论文）松杉灵芝子实体多糖fa的分离纯化与结构研究.pdf

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m e d u s a eo f6 a n o d e r m at s u g a e g u r r t h ec r u d ep 0 1 y s a c c h a r i d eh a sb e e n f r a n t i o n a t e d b ys m e l t i n g a f t e r f r e e z i n g a n de t h a n o l ，s of a 2w a sa b t a i n e d f a 2 w a s d e a m y l u m i z e d a n de x a m i n e db yg e lf i l t r a t i o no n s e p h a d e x g - 10 0 t h er e s u lt si n d i c a t e dt h a tf 也w a sh o m o g e n o u s f a 2h a s b e e np u r i f i e db yg e lf i l t r a t i o no ns e p h a d e xg - 1 0 0 g c a n a l y s i si n d i c a t e dt h a tf a 2 w a sc o m p o s e do fg a la n d g l ci nt h em o l a rr a t i oo f8 0 9 ：1 o o f a 2 w a sf u r t h e rs t u d i e d i nt h es t r u c t u r e a n a l y s i s o f f a 2 ，h y d r o l y s i s w i t h h y d r o l y s i s w i t h a m y l a s e a n dh y d r o l y s i s 耵it hf i b r i ne n z y m e p a r t i a lh y d r o l y s i s w i t h a c i d ，p e r i o d a t eo x i d a t i o n ，s m i t h d e g r a d a t i o n ，i r ，g c ，m e t h y l a t i o n ，a n d g c 一m sa n a l y s i s w e r et h ep r i n c i p a lm e t h o d su s e d t h er e s u l t sr e v e a l e df a 。i sak i n d o fh i g h b r a n c h e d s t r u c t u r e t h em a i n c h a i ni sm a d e u p o fg a la n dg l c ，t h e i n n e ri s ( 1 3 ) 一l i n k e d g a l ，t h eb o r d e ri s ( 1 6 ) 一l i n k e d - g a l ( 1 6 ) 一l i n k e d - g a la n d( 1 3 ) 一l i n k e d - g l c r e s i d u e sa r e s u b s t i t u t e da t6 0 o na v e r a g e t h e r e i s4b r a n c ha m o n gi 0 岫i nc h a i nr e s i d u e s t h es i d e c h a i ni s c o m p o s e do f ( 1 6 ) 一 l i n k e d g a l ，( 1 3 ，6 ) - li n k e d - g a l ，( 1 3 ) 一l i n k e d - g l c ，( 1 3 ，6 ) 一1i n k e d - g l c t h en o n r e d u c e d e n disc o m p o s e do fg a l k e y w o r d ：g a n o d e z 盔at s u g a e ，c a p u t - m e d u s a e ，p o l y s a c c h a r i d e s t r u c t u r e s t u d y 2 引言 一、多糖研究的意义 多糖又称多聚糖( p o l y s a c c h a r i d e ) ，由单糖聚合而成，是聚合度大于 1 0 的极性复杂大分子，其分子量一般为数万甚至达数百万，是构成生命 活动的4 大基本物质之，同维持生物功能密切相关。 其实，1 0 0 多年前德国著名科学家e f i s c h e r 就开始了糖类研究， 1 9 2 3 年m h e i d e l b e r g e r 和t o s w a l d 提出细菌的抗原部分是多糖而不 是蛋白质，因此，糖类的生命科学几乎与蛋白质的生命科学同时诞生。 但是，糖类研究远远落后于蛋白质和核酸研究的飞跃发展【i - 4 。本世纪 6 0 年代以后，人们逐渐发现多糖具有许多方面生物活性，多数无毒，是比 较理想的药物，如昆布多糖和肝素有抗凝血作用，硫酸软骨素可防止血 管硬化，香菇多糖、银耳多糖、刺五加多糖、黄芪多糖、灵芝多糖、 酵母葡聚糖、茯苓多糖、地黄多糖、枸杞多糖等具有增强免疫功能和 抗癌作用等 5 。近十几年来，糖类结构测定和生物活性研究取得了明 显进展，大量实验事实揭示糖类是重要的信息分子、参与许多生理和 病理过程，有关研究渗透到生物学各个领域，1 9 8 8 年，英国几位多年从事 糖类研究者首次提出“糖生物学”这个名词口】，继之国际上发行了 o l y c o b i o l o g y 和t r e n d i ng l y c o s c i e n c ea n dg l y c o t e c l m o l o g y 等杂志h 。 1 9 9 3 年在美国召开的第一届糖工程年会上，会议主席称“糖生物学” 是生物学领域的最后一个重大前沿1 4 j 。 为什么经1 0 0 多年的漫长道路，人们才开始认识到糖类在生命过程 中的重要作用? 主要原因有两点：理论上简单化：人们过低地估计了糖 类对生命过程的贡献。过去，药理学家们认为糖类只不过是一种能源 和细胞的内支撑物；在药物化学家考虑糖类合成时只涉及到一个基本 反应，碳氧键的形成，觉得化学反应是简单的。方法上困难重重：由于 糖类的纯化处理和结构鉴定都令人十分烦恼，因此没有人肯在方法上 花很多工夫，许多人绕着走【1 1 。 4 随着现代医学研究的进步、糖类合成化学和结构鉴定技术的发展， 人们逐步认识到寡糖和多糖的结构涉及到许多f 主体) 生命历程【9 】。糖 类作为信息分子已经得到普遍承认 1 , 4 j o j 。现代科学研究发现，在细胞 发展过程中，糖类分子决定两个相反的基本细胞操作过程：正确地保 持自身免疫防御体系( 抗细菌、病毒感染) ；当细胞脱轨、出现自身免 疫疾病或癌症时，细胞表面的糖分子就改变结构和组成。当代主流化 学家们正在认识到这样的事实：糖类是天才、绝妙的简明信息箱1 1 , 2 1 0 多糖这一类天然大分子物质，广泛存在于动物细胞膜、植物和微 生物细胞壁中，是生命有机体不可缺少的组成部分并履行一系列不同 的生理功能。目前已发现的活性多糖有几百种，按其来源不同，可分为 真菌多糖、高等植物多糖、藻类地衣多糖、动物多糖、细菌多糖5 大 类。其中研究得较早且最多的，是从细菌中得到的各种荚膜多糖，它 在医药上主要用于疫苗【i ”。尔后，有关真菌多糖的研究既深又广， 如酵母菌多糖、食用菌多糖，特别是食用菌多糖的研究，报道的频率 是相当的高，其中以香菇多糖研究得较清楚。另外，植物多糖的开发 也倍受人们的青睐，由于我国是中药的起源之地，而糖类是中药材中 普遍存在的成分【1 2 、，在对各种中药材的化学成分研究的过程中，人们 都少不了对其中多糖的关注。 二、多糖的生物活性 1 、调节免疫功能，具有抗肿瘤、抗病毒、抗衰老作用 多糖对免疫系统有重要的调节作用，不仅能激活巨噬细胞( m 士) 、 t 淋巴细胞、b 淋巴细胞、自然杀伤细胞( n k ) 、细胞毒t 细胞 ( c r l ) 、淋巴因子激活的杀伤细胞( l a k ) 等免疫细胞，还能促进细胞因 子生成，活化补体，从而在抗肿瘤、抗病毒以及抗衰老等的防治上具有 独特的功效。 ( 1 ) 抗肿瘤有些多糖能提高m 巾的吞噬功能，诱导白细胞介素 i ( i l t ) 和肿瘤坏死因子( 1 n f ) 的生成，激活l a k 细胞，在抗肿瘤中发挥 直接的细胞毒作用。例如，灵芝多糖【1 3 】可使t 淋巴细胞增多，加强网状 内皮系统功能，并升高正常人和自细胞减少者的白细胞数。另外，多糖 是细胞膜成分，能强化正常细胞抵御致癌物侵袭，提高机体抗病能力。 5 冬虫夏草多糖能与肝腹水癌细胞膜结合，抑制胞外葡萄糖进入癌细胞， 使癌细胞缺乏能量而致死。 ( 2 ) 抗病毒多糖类可通过类似的免疫调节机制增强宿主免疫功能， 以抵抗病原体的侵袭。许多研究证明，多糖对多种病毒，如艾滋病毒 ( h w l ) 、单纯孢疹病毒f s s v l ，h s v 2 ) 、巨细胞病毒( c m v ) 、流感病 毒、囊状胃炎病毒( v s v ) 、劳斯肉瘤病毒f r s v ) 、反转录病毒和鸟肉 瘤病毒( a s v ) 等l j 有抑制作用。 ( 3 ) 抗衰老多糖能从整体上提高机体免疫功能，从一定程度延缓 衰老，防治老年病。已发现许多真菌多糖具有清除自由基、提高抗氧 化酶活性和抑制脂质过氧化的活性，起到保护生物膜和延缓衰老的作 用。 2 、抗凝血作用 由六糖或八糖重复单位组成的肝素，可抑制凝蛋白酶原转变为凝 血酶，有抗凝血作用【阍。肝素用于凝血性疾病的治疗和预防已有数十 年，它主要通过增强抗凝血酶( 肝素辅助因子, h c ) 的作用来抗凝血。 3 、抗突变作用 多种真菌多糖表现出较强的抗突变作用i 幡1 9 1 。 4 、降血糖作用 从人参中提取的多糖具有降血糖作用1 2 0 l 。现己发现具有降血糖活 性的真菌多糖有灵芝多糖、虫草多糖、云芝多糖、银耳多糖、毛木耳 多糖、猴头多糖和木耳多糖2 1 1 。 5 、降血脂作用 类肝素结构与肝素类似，能促进脂蛋白脂肪酶释放，使血液中大分 子的脂质分解成小分子，因而对血脂过多引起的血清浑浊有澄清作用， 也能明显降低血胆固醇】。甲壳聚多糖具有明显的降低由蛋黄乳及高 脂饲料引起的动物高胆固醇、高甘油三酯及低密度脂蛋白胆周醇作用， 并能升高降低的高密度脂蛋白胆固醇1 2 3 。实验证明，海带多糖、褐藻 多糖、甘蔗多糖等均有降脂活性刚。 6 、其它活性 6 银杏多糖具有抗炎活性 2 5 】；灵芝多糖和猴头多糖具有抗辐射作 用，猴头多糖和香菇多糖具有抗溃疡活性【2 1 1 。 三、多糖生物活性的构效关系 1 、主链、支连及分支度 多糖的主链组成对抗肿瘤活性的影响较大，对于葡聚糖，大多活性 多糖都是具有8 一l ，3 苷键主链的葡聚糖。多糖主链上相邻糖基的连 接方式( 即糖苷键的类型) 也是决定多糖活性的重要因素。研究表明， 多数具有突出生物学活性的葡聚多糖都以( 1 ，3 ) 糖苷键连接说明( 1 ，3 ) 键型比( 1 ，4 ) 键型在葡聚多糖及其衍生物的抗肿瘤活性中作用更大 ”1 。抗肿瘤多糖结构研究表明：从菌体中提得的活性多糖一般由葡萄 糖组成，而且葡聚糖主链上的b 1 , 3 苷键和支链上的口1 , 6 苷键为生物 活性所必须1 2 7 】。具有生物活性的f 1 ，3 ) b d 葡聚糖的分支度范围很广： 在0 0 1 5 0 7 5 0 之间都有分布。但其主要分布在0 2 0 0 3 3 之间，该段 的多糖活性也相对更强1 2 ”。 多糖主链的柔韧性在一定程度上决定其活性大小。多糖主链的柔 韧性由多糖分子内氢键和取代基的静电排斥作用共同形成。对硫酸化 高山红景天多糖的结构分折显示，经硫酸化修饰后，多糖的主链变得高 度伸展，链的韧性增强，抗肿瘤活性提高 2 9 1 可见，多糖主链的柔韧性在增 强多糖生物学活性中的作用不容忽视。 2 、分子量 研究发现，分子的大小是多糖具备生物活性的必要条件，这可能同 多糖分子形成的高级构型有关。对于水溶性( 1 ，3 ) b d 葡聚糖，只有相 对分子质量在9 0 0 0 0 以上才能形成3 股螺旋结构，具有3 股螺旋结构 的葡聚糖大多都具有多糖的免疫活性【3 田。其中相对分子质量在 1 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 之间的多糖活性最强。 3 、化学修饰 连接在1 3 - d 葡聚糖骨架上的一些基团如聚羟基、聚醛基、羧甲 基、乙酰基、甲酰基、硫酸基等对其抗肿瘤活性发挥重要作用。一些 含蛋白质或肽键的糖蛋白或多糖肽有比多糖本身更强的抗肿瘤活性。 目前此类多糖有：云芝多糖、从香菇中分离的甘露聚糖肽等。梁忠岩 7 】对树舌多糖进行衍生化研究后得出结论：当糖链相同时。与蛋白相连 者活性高，分枝短的糖链活性高 实验证明，硫酸盐阴离子对硫酸化多糖抑制h i v 是必须的离子结 构。如许多多糖的硫酸化衍生物，其活性增强，而且其在艾滋病治疗上 的应用已经得到证实，因而硫酸酯化多糖的研究已经成为当今多糖研 究的又一个“生长点”p 2 - 3 7 1 四、多糖的结构研究方法 1 、化学方法 ( 1 ) 水解法：将多糖链通过完全水解分解为各个单糖，是分析多糖 链组成成分的主要手段。水解之后的多糖经中和、过滤，可采用纸层 析( p c ) 、薄层层析( t l c ) 、气相色谱法( g c ) 、液相色谱法( h p l c ) 1 3 8 】 和离子色谱法p 9 j 进行分析。高效液相色谱法则克服了g c 需衍生化 的缺陷，它可直接进样测定。同样离子色谱法不需要衍生处理，而且检 测灵敏度甚至比h p l c 法更高。( 2 ) 高碘酸氧化法，判断糖苷键的位 置、直链多糖的聚合度、支链多糖的分支数目等；( 3 ) s m i t h 降解，由降 解产物来获取有关多糖的结构信息：( 4 ) 甲基化反应，也是分析糖链结构 的有效途径；( 5 ) 旋光度法1 4 0 3 ：( 6 ) b 一消除反应来判断糖肽之间是否存 在0 一糖肤键1 4 “。 2 、酶学方法利用a 一糖苷酶和b 一糖苷酶对多糖底物的催化反 应来确认多糖链中糖苷键类型，利用酶学方法分析糖肽连接方式。试 剂阵列分析方法将酶解方法的操作简化 4 2 1 3 、免疫学方法1 4 0 ：抗原和抗体会相互结合，一定结构的多糖( 寡 糖) 会抑制抗体一抗原的相互结合，不同的糖( 半抗原) 有不同的抑制常 数。当某种未知结构的糖链对抗原和抗体的结合产生了抑制，通过测 定其抑制常数，再与已知结构的糖链相比较，有相近抑制常数的多糖， 其结构也相似，这就是利用免疫方法分析糖链结构的原理。 4 、仪器分析法用于糖链结构分析的仪器主要有比旋光仪叫、紫 外分光光度计嗍、红外光谱仪柚，叫和拉曼( r 啪n ) 光谱 4 0 , 4 5 1 、液相色 谱仪、质谱、核磁共振等。除了传统的分析技术，现代分析技术的出 现和发展以及仪器之间的联用，大大推动了精链结构的研究工作。 暑 质谱( m s ) ：质谱灵敏度高，结构信息直观，尤其是8 0 年代出现的快 速原子轰击质谱，使得高极性、难挥发且热不稳定的糖及其混合物的 直接分析成为可能，气相色谱一质谱联用已应用于甲基化产物的鉴别。 近年发展了各种软电离技术，如化学电离、场致电离、场解析电离、 化学解析或称直接化学电离、快速原子轰击法m ：因而，在糖分析中的 质谱技术又有了新的发展，如电喷雾电离质谱、基质辅助的激光解吸 电离质谱，基质辅助的激光解吸电离质谱电离出的离子常用飞行时间 来检测它是一种飞行时间质谱仪m 】。 核磁共振o 哪i r ) ：n m r 主要解决多糖结构中糖苷键的构型以及重 复结构中单糖的数目。尤其是1 3 cn m r , 可以给出诸如取代糖单元序 列、糖苷键的构型等信息近年来，由于n m r 技术的发展和不断完善，用 分辨1 3 c n m r 、二维n m r 和多维n m r 可确定杂多糖的一级结构、 二级结构以及多糖之间的相互作用 4 ，4 舯。 电泳技术 4 2 】：毛细管电泳技术不仅仅是一种分离手段，还可用于寡 糖链的纯度和结构分析，又可对寡糖的酶解产物进行定性和定量分析， 从而得到寡糖链的完整结构。 原子力光谱( a e v d 是在近几年发展起来的，是研究生物高分子构象 的有力工具它在多糖的构象研究方面，已成功地研究了线型刚性链的 三螺旋b 一( 1 - , - 3 ) - d 菌核葡聚糖经1 5 0 1 2 高温处理后转变为弯曲构 象；g d l a n 在凝胶化过程中的构象变化；果胶支化情况和侧链长度等 【4 9 】。 x - 射线衍射分析是较好地满足生物太分子空问构象分析的方法和 技术【5 0 1 ，可用于分析多糖的晶态结构 五、灵芝多糖的研究 灵芝隶属于担子菌亚门、层菌纲、无隔担子菌亚纲、非褶菌日 ( 或称多孔菌目) 灵芝菌科、灵芝属吼。灵芝是我国传统的扶正固本、 滋补强壮的中药，历代医书中将之列为中药中的上品。我国传统的中 医药学称灵芝为：“性温、味甘、能益精气、强筋骨，主治心悸、失 眠、健忘、神疲乏力等症。”1 5 2 利用化学分析方法及现代新型科学 仪器测定，已证明灵芝子实体及菌丝体中所含有的主要成分达1 5 0 多 9 种，可分为十大类：多糖类、核苷类、呋喃类、生物碱类、氨基酸及 蛋白质类、三萜类、油脂类、甾醇类、无机离子、有机锗。有关灵芝 化学成分的最新研究主要集中在多糖、三萜类及蛋白质上 5 3 】。 多糖类是灵芝中除三萜类外研究最深入最广泛的一类化合物。7 0 年代对灵芝多糖的研究主要集中在多糖和多糖复合物组分的分离、制 备及药理作用方面；8 0 和9 0 年代则主要集中在灵芝多糖及多糖复合 物的结构及其与功能的关系方面【5 4 1 。从前人的研究结果表明，多糖的 分枝度、多糖中单糖组成、分子量、( 1 3 ) 及( 卜6 ) 甙键含量，空问 结构以及与之结合的蛋白质及脂类组分等均影响着多糖的生物活性胪 5 9 1 。 国内外学者对灵芝多糖的结构和功能进行了大量的研究工作，取 得了许多新的进展，结果表明。灵芝多糖是由肽多糖、葡聚糖、杂多 糖等多搪均一体组成的混合物；具有广泛的药理活性：能提高肌体免 疫力，增强肌体耐缺氧能力，消除自由基，抑制肿瘤，能使人体产生 抗体及干扰素，可治疗高血压、高血脂、乙型肝炎等多种现代医学中 的疑难病症f 5 蜥】。 林志彬等从免疫学角度进行研究，认为灵芝多糖可能是“扶正固 本”的有效成分嗍。灵芝多糖不仅能增强正常小鼠的体液免疫和细胞 免疫的功能，还能拮抗免疫抑制药，抗肿瘤药，应激和衰老所致的免 疫功能抑制，使之恢复正常或接近正常水平【6 刀。灵芝多糖通过对免疫 系统的直接和间接影响，维持着机体的免疫调节平衡，提高机体的抗 病能力i o m 。 灵芝属真菌有2 0 多种，松杉灵芝( g a n o d e r at s u g a em u r r ) 是目前市上有灵芝浆等滋补品出售，这种滋补品具有滋补、强壮、保 肝、镇静、镇咳、祛痰、平喘、降血脂、健胃、健脑、消炎和利尿等 功效。 其中一种，也叫松杉树芝、铁杉灵芝，分布在我国的寒温带，一 般腐生在针树树桩上嘲。松杉灵芝兼为食、药两用大型真菌，据文献 记载：松杉灵芝在中药上用于活血、追风、驱湿；民间以其泡酒，对 风湿性关节炎疗效较好：子实体含多糖，以小自鼠实验，所含多糖有 1 0 抑癌作用【7 0 】。松杉灵芝在我省长白山带有广泛的分布，生于红松、 落叶松的树干部、基部、枯立木、倒伐木或伐桩上”“。 据现有资料看，对松杉灵芝多糖的结构及功能的研究报道目前并 不多见。确定松杉灵芝多糖的结构，对于了解松杉灵芝的功能、药用 价值、作用机理以及开发和利用我省天然资源重要的理论意义和实际 意义 a l , z z - t q 。故此，本人拟选取松杉灵芝为工作对象，对其子实体粗 多糖加以分离、纯化，进行结构研究。 注：本文所用缩写符号 g a l 一半乳糖、g l c 一葡萄糖、g l y - 甘油、e r y 一赤藓醇 结果与讨论 一、实验材料 实验所用松杉灵芝子实体粗多糖( f a ) 由长春中医学院提供。 原材料为松杉灵芝子实体，经浸泡、煮提、浓缩、醇沉、干燥 后，得f a 。 二、粗多糖的分级纯化和纯度鉴定 ( 一) 冻融 将均匀的5 糖溶液在一2 0 冷冻，在室温缓慢融化，高速离心 ( 1 0 0 0 0 r p m ) ，除去聚沉物。 ( 二) 租多糖的乙醇分级 将2 粗多糖f a ( 图1 ) 溶液与9 5 乙醇溶液按体积比为1 ：1 、 1 ：l - 5 、l ：2 、1 ：2 5 的比例逐级分离，分别过夜离心，收集沉淀，得 到三个级份，分别为f a l 、f a 2 和f a 3 。 ( 三) f a 。f a 。和f 如纯度鉴定 l 、s e p h a d e xg - 10 0 柱层析检查 苯酚一硫酸法 4 0 嘲测糖分布，f a 2 呈单一狭窄对称峰( 图2 ) ； f a l 和f a 3 收集量少且峰型多。 2 、醋酸纤维素薄膜电泳检查 f a 2 图谱呈单一谱带。 以上纯度鉴定结果表明，f a 。为纯度较好的多糖样品，可以进行 结构研究。本文选取f a 。作为进一步研究的对象。 ( 四) 脱蛋白 将用链蛋白酶与s e v a g e 法联合脱蛋白，透析，醇沉，得白色粉 末状多糖( 图3 ) 。 三、f ：的研究 ( 一) 物理性状 1 、f a 。为白色粉末，易溶于水。碘反应呈阳性，不为淀粉酶和 1 2 纤维素酶所水解。 2 、比旋光度为 n p = + 1 2 6 7 0 。 3 、分子量约为6 3 7 万。 ( 二) 糖含量及组成分析 1 、经苯酚一硫酸法测定，查标准曲线，得糖含量为8 7 5 7 。 2 、气相色谱( g c ) 分析表明，其单糖组成为g a l 、g l c ，摩尔比 为8 0 9 ：1 ( 图4 ) 。 ( - - - ) 红外光谱分析( i r ) 【帅】 在1 0 0 0 1 l o o c m - ，1 4 0 0 1 5 3 0 c m - 1 ，2 8 0 0 2 9 0 0 c m 一，3 1 0 0 3 5 0 0 c m - 均有多糖的特征吸收峰( 图5 ) 。 ( 四) 酶解 2 5 m g 糖样，适量唾液淀粉酶及2 3 m g 纤维素酶分别保温4 8 、2 7 小时，经醇析，均无沉淀：经苯酚一硫酸法测定，均无糖。表明f a 。无a l ，4 糖苷键和口- 1 ，4 糖苷键0 l ” ( 五) 部分酸水解 部分酸水解结果见表1 和图7 一1 0 表1f a 。部分酸水解产物分析 g a lg l c 直接沉淀 + 袋外部分 + 袋内上清 3 4 3l - 0 0 袋内沉淀 + 结果分析： 1 、f a 。主要6 a l 和g l c 组成， 2 、部分酸水解后，对水解液直接离心所获得的沉淀中只检出 g a l ，说明f a 2 主链主要由g a l 构成： 3 、在袋外透析液中只检出6 a l ，说明f 如支链或主链末端含有 6 a l ： 4 、袋内醇沉、离心后，在上清液中检出g a l 和g l c ，说明f a 2 支 链或主链边缘含有g a l 和g 1 c ； 5 、在袋内沉淀中只检出g a l ，说明f a 2 核心结构是g a l 。 1 3 ( 六) 高碘酸氧化和s m i t h 降解 原理部分 ： 高碘酸氧化是一种选择性的氧化反应，它只能作用于多糖分子中 连二羟基及连三羟基处。当连二羟基的c - c 键被断开后，产生相应的 醛；当断裂连三羟基的c c 键时，产生甲酸及相应的醛。此反应定量 进行，每断开l m o lc c 键，消耗l m o l 高碘酸，由此也可知，每生成 l m o l 甲酸必然对应消耗2 m o l 高碘酸。因此，通过测定高碘酸消耗量 及甲酸生成量，便可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度及支链 多糖的分枝数目等。 高碘酸氧化产物经n a b h 。还原，得到的多糖醇用稀酸在温和条件 下水解，可发生特异性降解，即s m i t h 降解。s m i t h 降解的特点是只 打断被高碘酸破坏的糖苷键，而未被高碘酸氧化的糖残基仍连在糖链 上。这样，多糖醇经s m i t h 降解，就可以得到小分子的多元醇和未被 破坏的多糖或寡糖片段，对这些产物进行分析，便可以推断出糖苷键 的键型及其位置。 下面以葡聚糖为例，反应式如下： 1 、以l 一位键合：( 1 6 类似) c l 2 叫e 琏o 抖c i l 、o hc h j 0 1 l 。窿一墨磐黟磐麓砖一瞄 虻o 甜i ( 擎酸)( h + 油) 2 、以l 一2 位键合：( 1 2 ，6 类似) 8 0 l q f h o t l q i 啪u 。o i 辎耍耻嚷窖毯罐0 二- 胁扣 一u - 一ko一4=一0一 、 c h o h 3 、以l 一4 位键合：( 1 4 ，6 类似) i c k 0 1 i c他dl掩讲 o i 搀。守净矿。毋未c 严f b o l l i ：c l i oc l i o c h , 2 0 l i ( 1 鞋l 4 、以l 一3 位键合：( 1 3 ，6 、1 2 ，3 ，、l 一2 ，4 、1 3 ，4 、1 2 ，3 ，4 类似) 。耸c i - o h 黔熟蛾蚤， ( 钸萄$ 岢) 小结： ( 1 ) 1 一、l 一6 己糖残基键型消耗2 m o 高碘酸，生成l m o l 甲酸：1 2 、1 2 ，6 、1 4 、1 4 ，6 键型只消耗高碘酸，不生成甲酸； ( 2 ) 不被高碘酸氧化的己糖残基键型为：l 一3 、l 一2 ，3 、l 一 2 ，4 、1 3 ，4 、t 一3 ，6 、1 2 ，3 ，4 ： ( 3 ) 产生甘油的己糖残基键型为：1 一、l 一2 、l 一6 、l 一2 、6 ： ( 4 ) 产生赤藓醇己糖残基键型为：1 4 、1 - 4 、6 实验部分 ： f a ：高碘酸氧化及s m i t h 降解结果见表2 、表3 及图1 l 1 4 表2f a 2 高碘酸氧化及s m i t h 降解产物分析 e r yg t yg a lg 1 c 完全酸水解2 2 0 42 0 7 61 0 0 袋外部分1 6 6o 7 21 o o s m j t h 降解 袋内上清0 7 00 2 01 0 0 袋内沉淀2 8 7 81 0 0 由表2 可知： 1 g a l 可以被高碘酸氧化。另外，未检出赤藓醇，说明g a l 中不 存在1 4 或l 一4 ，6 键型； 2 g a l 中存在不被高碘酸氧化的键型，即可为1 3 、1 2 ，3 、1 2 ，4 、l 一3 ，4 、1 3 ，6 、l 一2 ，3 ，4 ； 3 袋外部分检出g a l ，说明不被高碘酸氧化的g a l 有位于主侧链 的边缘或末端； 4 由于g a l 在袋外部分检出，因此c a l 中不被高碘酸氧化的键型 中有不是连续排列的，而是间隔排列在能被高碘酸氧化的键型之间； 5 袋外部分还检出定量的甘油，说明g a l 存在l 一、1 6 键 型i 6 袋内部分醇析有大量沉淀，说明主链中有连续排列的不被高 碘酸氧化的g a l 键型，即1 3 键型。 表3f a 2 高碘酸氧化结果分析 反应进行时称样量高碘酸总耗量高碘酸耗量己箨甲酸生成量 酸生成量己糖 间( h )( m 0 1 )( t 0 0 1 )( o l m 0 1 )( m m 0 1 )( 坩o i m o i ) f a 21 0 20 1 5 4 3 20 1 5 3 7 50 9 9 6 30 0 7 5 1 10 4 8 6 7 由表3 可知： 1 产生甲酸，说明存在1 一或1 6 键型； 2 高碘酸消耗量相当于甲酸生成量的二倍，说明不存在只消耗高 碘酸而不产生甲酸的键型，即1 2 、1 2 ，6 或l 一4 、1 4 ，6 键 型： 3 ，可氧化己糖残基占总糖比例为5 0 3 5 ； 4 平均每摩尔己糖残基释放0 4 8 6 7 m 0 1 甲酸，说明平均每2 0 个 己糖残基中，有9 个非还原性末端或1 6 糖苷键； 5 从甲酸生成量可以推测此多糖为分枝较多的结构。 ( - h ) 甲基化分析 原理部分 ：甲基化分析是确定糖链连接次序所必不可少的实验 手段。其基本原理是先将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基 化，进而将多糖中的糖苷键水解，水解后得到的化合物，其羟基所在 的位置，即为原来单糖残基的连接点。同时根据不同甲基化单糖的比 例，可咀推测出此种连接键型在多糖重复结构中所占的比例。 用此种方法得到的羟基及n a b h 4 还原醛基后产生的羟基，经乙酰 化可得到甲基化的糖醇乙酸酯( 此产物易挥发，可进行g c 分析) 。 再经g c 与g c 惦联机分析，通过气相色谱的出峰顺序和对质谱 谱图的主要离子碎片的分析便可以较准确地确定糖的连接键型。 1 6 反应通式如下： ，po ，c h 广红c h 3 + n a o h c h 。红c h & 。 1 ， h f s c h 3 +”3 _ 若c h j 。二：“a 一 ( d m s o ( 二甲基亚磺酰阴离子) oo 2 、c h 广红c p 。n a 。+ r 一。h r 一。味a 。+ c h 广2 c h 3 ( 撼) ( 糖羟基醇锄) 3 、r 一繇a qc h 3 i ( 碘甲烷) 以( 1 4 ) 葡聚糖为例： h 斟。 r o c h 3 + n a ( 甲醚甲基化糖) 另外，甲基化衍生物的裂解规律为： ( 1 ) 各种单糖甲基化衍生物的基峰均为4 3 ，为c h 3 c 0 + ： ( 2 ) 被甲基化，乙酰化的单糖分子中，带有甲氧基的碳原予容易 与相邻碳原子问发生断键，形成正离子。 1 7 嚣训 了龟 q 下面以1 , 5 d i a c c t y l 2 ，3 ，4 ，6 t e t r a 0 一m e t h y l - d g l c 为例，表示断裂 方式如下： 早h 2 一。一c o c h ， e 117 9 h o e h 。 ，一 2 0 厅+ 。，一一一扭一_ o i 三翱l 一- r 1 61 2 0 厅+ 9 h cv 卜1 ，一。 _ ，一“一一一。t _ 一_ | ，一“一一一， 16 1 ， 幸h a c h 3，2 0 5 一一1 一。一一一。一一一一一。 早h 一o 一c o c h ， 4 5 一一一一叫c h 2 一o 。c 泛一： 主要碎片( m e ) 为；4 5 、1 1 7 、1 6 l 、2 0 5 由1 6 1 、2 0 5 进一步裂解为7 1 、8 7 、1 0 1 、1 2 9 、1 4 5 。图示如下 c h 3 c 0 0 h 学一。帆z 烯耐i 4 2 1 7 h o c h 3 r o 川融蕊矿膏哪h c h 2 ( r o l e 12 9 )c h 2 r o l e8 7 ) 7 h o e h l 3 1 璺竺l e hh c o h 8 f h 一。 - - - c h 3 伽一。一h 3 t 节一q 心兰兰出一钒 h o - - c o c h j 鲫秽删c h e 冀沁c h 3g h _ o 锅 m ，e2 0 5 ) ( 舶1 4 酽 ? h o c h 3 c h 8 c h 2 ( r o l e7 1 ) 由此可知，实际所得碎片为：4 5 、7 1 、8 7 、1 0 1 、1 1 7 、1 2 9 、 1 4 5 、1 6 1 、2 0 5 实验部分 ：本实验中f a 。分别经甲基化 i r 检查甲基化完全，见图 6 、水解、还原、乙酰化后得到甲基化糖醇乙酰酯，g c 一m s 气质联 1 8 机分析。 根据文献f 7 1 1 的相对保留时间和不同单糖的主要离子碎片 ( m e ) ，得甲基化分析结果，见表4 及图1 5 2 4 。 表4f a 2 甲基化产物分析 峰号甲基化单糖 t 摩尔比链型主要离子碎片( m e ) l 2 ，3 4 ，6 - g a l 1 0 01 5 6 91 _ 4 3 ，4 5 ，7 1 ，8 7 ，1 0 1 1 1 7 ，1 2 9 1 4 5 1 6 1 ，2 0 5 2 2 ，4 ，6 书l c 1 0 6l _ 9 7l _ 3 4 3 4 5 8 7 ，1 0 1 ，1 1 7 ，1 2 9 , 1 6 1 3 2 ，4 6 _ 6 a l 1 0 87 8 21 3 4 3 ，4 5 。8 7 ，1 0 1 ，1 1 7 1 2 9 ，1 6 1 42 3 4 - g l c1 0 91 0 01 6 4 3 ，8 7 ，9 9 ，i 0 1 i1 7 ，1 2 9 ，1 6 1 ，1 8 9 5 2 ，3 ，4 - g a l i 1 29 1 0l 呻6 们8 7 ，9 9 ，1 0 1 ，1 1 7 ，1 2 孰1 6 1 ，1 8 9 52 6 g a l1 1 31 7 8 l 一3 44 3 ，4 5 8 7 ，1 1 7 ，1 2 9 72 4 一g 1 c1 1 74 0 31 3 6 4 3 ，8 7 ，1 1 7 ，1 2 9 ，1 8 9 82 4 _ g a ll 1 91 6 4 3l 一3 64 3 ，8 7 ，1 1 7 1 2 9 ，1 8 9 93 g a li 2 42 1 7 l 一2 ，4 ，64 3 8 5 8 7 9 9 1 2 7 ，1 2 9 1 8 9 ，2 6 1 由表5 可知： 1 f a 2 由g a l 和g l c 构成，摩尔比为7 9 7 ：1 0 0 ，这与g c 分析结 果( 8 0 9 ：1 0 0 ) 基本吻合； 2 可被高碘酸氧化的键型占总数的4 5 9 9 ，这与高碘酸氧化的 分析结果( 5 0 3 5 ) 相接近； 3 g a l 被检出六种键型：1 一、1 3 、l 一6 、1 3 ，6 、l 一3 ，4 、1 2 ，4 ，6 ： 4 6 a l 为非还原性末端残基； 5 分枝点残基有( 1 3 ，6 ) g a l 、( 1 2 ，4 ，6 ) g a l 、( 1 3 ，4 ) g a l 及( 1 3 ，6 ) g l c ； 6 g a l 在( 6 0 ) 处有分枝，分枝率为4 1 1 4 ，即平均每1 0 个 g a l 中有4 个g a l 为分枝点，这与高碘酸氧化的结果分析相近。 以上结果与部分酸水解、酶解、高碘酸氧化及s m i t h 降解的分析 结果基本一致。 ( 八) 结论 综合部分酸水解、酶解、高碘酸氧化、s m it h 降解及甲基化分析 等多种实验方法的结果分析，对f a 。的结构推断如下： 1 f a 2 为多分枝结构： 2 f 如由g a l 与g l c 组成。其中( 1 3 ) 6 a l 构成主链的核心结构， ( 1 6 ) g a l 构成主侧链的边缘； 3 f a ：的支链部分由( 1 6 ) g a l 、( 1 3 6 ) g a l 、( 1 2 ，4 ，6 ) g a l 、( 1 3 ，4 ) g a l 及( 1 3 ，6 ) g l c 构成；其中主要是( 1 6 ) 6 a l ，平均每1 0 个g a l 中有4 个g a l 为分枝点； 4 f a 2 末端残基只有一种，为( 1 一) g a l 。 2 0 实验方法 一、般方法 l 、常规干燥法 醇析后的样品依次用9 5 z , 醇、无水乙醇脱水，再用乙醚脱去乙 醇后，置于盛有n o s 及0 h 的真空干燥器内真空干燥。 2 、真空冻干法 将糖液装入圆底烧瓶中，将瓶子放入冻乙醇( 4 0 - 2 2 ) 中滚动使 糖液均匀的挂满内壁，将预冻好的装有糖样的瓶子放入冰柜( 7 0 ) 中过夜。开机挂瓶，抽真空至糖样干燥。 3 、甲醇解【8 2 删彻底干燥的糖样1 0 m g ，加入无水h c l 一甲醇 2 m l ，充封管，8 0 甲醇解2 0 小时，凉至室温后，用无水k o h - 甲 醇中和至p h = 6 ，然后4 0 c 减压旋转蒸干，常规干燥。 4 、硅烷化( t m s 衍生物制备) 【鼢9 0 】 向彻底干燥的甲醇解产物中加入0 2 m l 无水毗啶( 内含饱和甘露 醇作内标) ，7 5 c 溶解3 0 分钟，然后加入0 3 m 硅烷化试剂( t k 甲基 二硅胺烷：三甲基氯硅烷= 2 ：1 ) ，摇匀，静止几分钟，即可取上清进 行分析。 二、粗多糖的分级纯化方法 1 、冻融分级 斟】 将均匀的6 糖液，在一2 0 冷冻，室温缓慢融化，高速离心 ( 1 0 0 0 0 r p m ) 。重复几次。 2 、s c p h a d c xg 1 0 0 柱层析纯化 将脱蛋白、脱色素后的f a 。配成5 吲瞎溶液经s e p h a r o s eg - 1 0 0 ( 2 5 x9 0 c m ) 柱层析，酚硫酸法测多糖分布，收集糖峰洗脱液，经 浓缩、真空冷冻干燥，最终得乳白色粉末状多糖。 3 、脱蛋白咖 5 糖溶液，用英国进口链蛋白酶，按酶：蛋白= 1 ：5 0 取蛋白 2 1 酶，加入糖溶液中，加少量二甲苯防腐，1 n u c l 作激活剂，3 7 ( 3 保 温2 4 小时，按糖液总体积i 4 加入s e v a g e 试剂( 氯仿：正丁醇= 4 ：1 ) ，充分振荡l 一2 小时，静置，离心，取上清，重复进行，至无游 离蛋白为止。 4 、脱色素 向脱完蛋白的溶液中加入氨水，调p h 至8 - 9 ，然后边搅拌边加 入h 2 0 。，3 7 2 保温，搅拌，并随时加入h 如至溶液呈浅黄色为止， 流水透析2 4 小时，蒸馏水透析2 4 小时，然后浓缩，醇析，离心后沉 淀常规干燥。 三、糖的有关性质测定及纯度鉴定方法 1 总糖含量测定( 酚硫酸法) 【s 5 l 将l o m g 1 0 0 m l 糖溶液，6 的酚溶液，浓h ：s o , 依次按1 ：0 5 ：2 5 的比例加入，振荡，静止，冷却，然后在4 9 0 h m 波长下比色，所得数 值查标准曲线可得总糖含量。 2 分子量测定跖j 将糖样上s c p h a d e xg 1o oq 柱层析，用生理盐水洗脱，得洗脱体 积数值查标准曲线得分子量。 3 比旋光度测定【邶j 将l o m l 饱和塘液用国产