（遗传学专业论文）多倍体化与基因工程相结合创造不育的英国梧桐新品系.pdf

摘要 悬铃木作为优秀的行道树及园林树种 能适应城市环境和各种土壤条件 能吸 收有害气体和吸滞粉尘 具有较强的抗空气污染 抗光化学烟雾 有害气体及良好的滞 尘减噪 净化空气的能力 本实验研究了悬铃木属英国梧桐种的离体植株再生 多 倍化和减数分裂基因o s p h s l 的r n a i 载体的遗传转化 以英国梧桐种子为基础材料建立植株再生系统 结果表明 7 0 酒精处理4 0 s 1 7 0 0 的升汞处理4 0 m i n 在不影响种子的萌发和将污染率降到最低的前提下 m s 6 b a b 7 m g i n a a o 2 0 3 m g j l 为子叶诱导分化幼芽的最适培养基 m s 6 b a 0 3 m g l n a a o 0 1 蚋为丛芽扩繁的最适培养基 培养基中添加适量赤霉素 g a 3 对丛芽壮苗起到很 好的促进作用 m s 6 b a l 5 2 o m e l k t o 5 m g a l b a o 5 叽为叶片诱导分化芽的最适培养基 每个叶片平均的出芽为1 0 2 0 个 蔗糖和大量元素 m s 的浓度分别为2 5 9 和2 3 m s 为解决 丛芽叶片玻璃化的最适量 幼苗生根的最适培养基为1 2 m s n a a 0 j 班 6 b a o 1 叽 本实验研究了秋水仙素不同浓度和处理时间对英国梧桐丛芽和叶盘的诱导效果 发 现随着处理时间和浓度的增加 外植体的死亡率明显增加 多倍体细胞诱导率在一定范 围内随处理时间和浓度增加升高 以0 0 6 的秋水仙素处理4 8 h 的丛芽多倍体细胞诱导率 最佳 以0 0 5 的秋水仙素处理4 8 h 的叶片多倍体细胞诱导率最佳 且不对外植体产生严 重伤害 获得的候选多倍体与正常二倍体相比 生长迟缓 气孔器变大 染色体加倍 因此将这些候选多倍体株初步鉴定为多倍体 以英国梧桐试管茁叶片为试材 研究了卡那霉素 k a n 对离体叶片再生的影响 以确 定叶盘法基因转化的选择压和转化体的筛选浓度 同时研究了不同浓度的头孢霉素 c e o 对英国梧桐离体叶片再生的影响及对含有干涉减数分裂基因的农杆菌 e h a l 0 5 p a r t 2 7 d b p h s l 的抑菌效果 确定了侵菌共培养后合适的抑菌抗生素种类和浓 度 结果表明 叶片外植体芽诱导的卡那霉素临界筛选质量浓度为5 m g l 叶片外植体 芽诱导的头孢霉素临界除菌质量浓度为2 0 0 m g l 农杆菌菌株e h a l 0 5 p a r t 2 7 一d b p b s l 菌液浓度为o d 5 9 5 0 4 0 5 共培养培养基中乙酰丁香酮浓度为1 0 叩m o l l 感染时 间为2 0 r a i n 共培养时间为3 4 天 经过抗性植株的p c r 检测获得了抗卡那霉素的阳性植 株 初步证明外源基因o s p h s l 已整合到英国梧桐基因组中 本实验建立的英国梧桐的 遗传转化体系 为进行农杆菌介导目的基因培养悬铃木新品种奠定了理论基础并为培育 不掉毛英国梧桐新品系打下了良好基础 关键词 英国梧桐 无种毛 再生体系 秋水仙素 多倍化 减数分裂基因o s p h s l 遗 传转化 c o m b i n e p o l y p l o i d i z a t i o na n dg e n ee n g i n e e r i n g t e c h n o l o g yt oc r e a t es t e r i l ec u h i v a ro f p l a t a n u s a c e r i f o l i a t w i l l d a b s t r a c t p l a t a n a c e a ei se x c e l l e n ts i d e w a ya n dp a r kt r e e i tc a na d a p tt h ec i t ye n v i r o n m e n tw i t h v a r i o u ss o i lc o n d i t i o n c a na b s o r bh a r m f u la i rw i t ha b s o r bd u s t h a v es t r o n g e ra b i i i t yo f a n t i a i rp o l l u t i o n t h ea n t i p h o t o c h e m i s t r ys m o k e a n t i h a r m f u la i ra n dh a v eg o o da b i l i t yo f r e d u c et h en o i s e t h ed e c o n t a m i n a t i o na i r t h i se x p e r i m e n tw a sd e s i g n e df o r p l a n t r e g e n e r a t i o n i n d u c e m e n to fp o l y p l o i d r n a it r a n s f o r m a t i o no fm e i o s i sr e l a t e dg e n e o s p h s lg e n e t i ct op l a t a n u sa c e r i f o l i a a i t w i l l d t od i s s o l v et h ep r o b l e mo ff a l l i n gs e e d so fp l a t a n a c e a eb yb i o t e c h n i q u e ag o o d r e g e n e r a t i n gs y s t e mn e e d sf i r s te s t a b l i s h m e n t t a k i n gt h es e e d so fam u t a t i o np l a t a n u s a c e r i f o l i a a l t w i l l da st h em a t e r i a lt ob u i l du par e g e n e r a t e ds y s t e mo fp l a n t e x p e r i m e n t r e s u l t se x p r e s s e dt h a t7 0 a l c o h o l sf o r4 0 s e ea n d0 1 h g c l 2f o r4 0 m i nt r e a t e dw a st h eb e s t d i s t i l l e dm e t h o dw h i c hd i d n ti n f l u e n c et h ee x p l a i n s m s 6 b a m g l 1 n a a 0 2 o 3 m g l 1w a sa m o s ts u i t a b l ey o n gb u di n d u c t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o nm e d i u mo ft h ec o t y l e d o ne x p l a n t s m s 6 b a o 3 g f l n a a o o l m g l 1w a st h em o s ts u i t a b l ec u l t u r em e d i u mo ft h em u l t i s h o o t s a d d i n gs u i t a b l ea m o u n to fg i b b e r e l l i ca c i d g a 3 c o u l dm o m o t em u l t i s h o o t st og r o wh i g h e r m s 6 b a l 5 2 o m s l i b a 0 s m s l 1 n a a o 5 m g l 1w a s tt h es u i t a b l ey o n gb u di n d u c t i o na n d d i f f e r e n t i a t i o nc u l t u r em e d i u mo fl e a fe x p l a n t s a v e r a g ea d v e n t i t i o u sb u d sp e rl e a fs e c t i o n w a s l 0 2 0 2 5 9s u g a ra n dt h e2 3 m sw a st h em o s ts u i t a b l eq u a n t i t yt or e m a i nm e d i u m s o s m o s i t ya n dt od e v o i dl e a fv i t r i f i c a t i o n t h em o s ts u i t a b l er o o t i n gm e d i u mo ft h es h o o tw a s i 2 m s n a a o 5 m gl 1 6 b a o 1 螂 l 1 t h i se x p e r i m e n ts t u d i e dt h ei n d u c t i o ne f f e c to fc o l c h i c u mw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n a n dt r e a t m e n tt i m eo nm u l t i s h o o t sa n dl e a fo fp l a t a n u sa c e r i f o l i a a i t w i l l d a l o n gw i t h t r e a tc o n c e n t r a t i o na n dt i m ei n c r e a s i n g t h ed e a t hr a t eg r e wu ps i g n i f i c a n t l y t o oh i g ht r e a t c o n c e n t r a t i o nm i g h tl e a dt h er a t eo fp o l y p l o i dc e l lw a sd e c r e e d 0 0 6 c u l c h i c i n e sw i t h4 8 h t r e a t m e n tm u l t i s h o o t sw a se f f e c t i v eo np o l y p l o i d yi n d u c t i o n 0 0 5 c o l c h i c i n e sw i t h4 8 h t r e a t m e n tl e a fw a se f f e c t i v eo np o l y p l o i d yi n d u c t i o n t h ei n d u c i n gr o t ew a sh i g h a n de x p l a n t s m w a sh a r m e d g e n t l y o b t a i n e d s o m ep o l y p o l i dp l a n t sc o m p a r e dw i t ht h ed i p l o i d t h e m o r p h o l o g ya n dl e a v e ss t o m ah a dc h a n g e d i t sl e a v e ss t o m ab e c a i n es i g n i f i c a n t l yb i g g e r c h r o m o s o m er e d u p l i c a t i o na n dp o s i t i v ed e t e c t i o nb yu s i n gf l o wc y t o m e t e i j s op r i m a r yi d e n t i f i e d t h e s ep o l y p o l i dp l a n t sw a sp o l y p l o i d y i tw a ss t u d i e dt h a tt h ee f f e c to fk a n a m y c i n g a n o nt h eg r o w t ho ft h ee f f i c i e n c yo f a d v e n t i t i o u sb u dr e g e n e r a t i o nf r o ml e a fd i s c a n dt h ee f f e c to ft h ec o n c e n t r a t i o no f c e f o t a x i m e c e f o nt h ee f f i c i e n c y o fr e g e n e r a t i o na n dt h e p r e v e n t i n gg r o w t h o f a g r o b a c t e r i u as t r a i n se h a l 0 5 p a r t 2 7 一d b p h s l t h a tr n ai n t e r f e r e n c e r n a i o nm e i o s i s r e l a t e d g e n e t h er e s u l t s s h o w e dt h a tu t i l i z i n gt h el a t t e rm e d i u m a d d i n gd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fk a n t h eo p t i m a ls e l e c t i n gp r e s s u r e5 m g lo fk a nf o ra d v e n t i t i o u sb u dw a s c o n f i r m e d u t i l i z i n gt h el a t t e rm e d i u m a d d i n gd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fc e f t h eo p t i m a l s e l e c t i n gp r e s s u r e2 0 0 m g lo fc e f i nf o ra d v e n t i t i o u sb u d w a sc o n f i r m e d t h ev a l u eo fo d 5 9 5 w a s0 4 0 5 t h ea c e t o s y r i n g o n e a s c o n c e n t r a t i o ni nc o c u l t u r em e d i u mw a s1 0 0 m o 忆 t i m ef o ri n f e c t i o nw a s2 0 m i n t i m ef o rp r e c u l t u r ew a s3 4 d b yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p c r d e t e c t i o n i tw a sp r o v e dt h a to s p h s lg e n ew a si n s e r t e di n t ot h eg e n o m eo fp l a t a n u s a c e r i f o l i a a i t w i l l d t h ee s t a b l i s h m e n to ft r a n s f o r m a t i o ns y s t e mh a dg r e a tm e a n i n go n t h e o r ya n dt e c h n o l o g yf o rt h er e s e a r c ho ft h eg e n e t i cc u l t i v a t i o nn e w c u h i v a r so fp l a t a n a c e a e m e d i a t e db ya g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sa n dw a sag o o df o u n d a t i o nt oc r e a t es t e r i l ec u h i v a r o f p l a t a n u s a c e r i f o l i a a i t w i n d k e yw o r d s p l a t a n u sa c e r i f o l i a a i r w i l l d s t e r i l ec u h i v a r p l a n tr e g e n e r a t i o ns y s t e m c o l c h i c i n e p o l y p l o i d i z i n g m e o t i cg e n eo s p h s l g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n i v 图表清单 图2 1 英国梧桐子叶愈伤组织诱导分化图 2 6 图2 2 分化出的丛芽 2 7 图2 3 叶片分化 3 0 图2 4 英国梧桐幼苗的根 3 1 图2 5 英国梧桐组培苗移栽图 一3 1 图3 1 嵌合体 3 6 图3 2 候选多倍体与二倍体植株的形态比较 3 7 图3 3 二倍体与候选多倍体植株的叶片形态比较 3 7 图3 4 英国梧桐二倍体与候选多倍体植株气孔的比较 3 8 图3 5 英国梧桐二倍体与候选多倍体植株染色体的比较 3 9 图4 1p a r t 2 7 d b p h s l 载体 4 1 图舢2 比较不同浓度k a n 处理后英国梧桐叶片的分化图 4 5 图舢3 比较不同浓度c e f 处理后英国梧桐叶片的分化图 4 6 图4 4 农杆菌感染后初步筛选的英国梧桐抗性芽 4 8 图4 5 转化植株的p c r 鉴定结果 4 8 图4 6 转化植株经p c r 鉴定为阳性植株丛芽扩繁后植株的p c r 鉴定结果 4 9 表2 1 预处理对英国梧桐种子污染率 萌发率的影响 2 5 表2 2 不同激素浓度对子叶诱导分化的影响 2 6 表2 3 不同激素对丛芽扩繁的影响 2 7 表2 4 英国梧桐丛芽叶片玻璃化的影响因素 2 8 表2 5 添加g a 3 对英国梧桐丛芽伸长的影响 2 8 表2 6 不同激素对叶片诱导和分化的影响 3 0 表2 7 不同培养基对英国梧桐组培苗生根的影响 3 1 表3 1 不同加倍液浓度和加倍时间对英国梧桐丛芽 叶片生活率的影响 3 5 表3 2 英国梧桐二倍体与候选多倍体的形态特征比较 3 7 表3 3 英国梧桐二倍体与候选多倍体叶片上表皮气孔的比较 3 8 表3 4 诱导植株根尖的染色体数目分布 3 9 表3 5 多倍体组培苗与二倍体组培苗移栽的存活率比较 4 0 v 表t 1 不同质量浓度k a 对英国梧桐叶片芽诱导率的影响 4 5 表4 2 不同质量浓度c e f 对英国梧桐叶片芽诱导率的影响 4 6 表4 3 不同菌液浓度和不同浸染时间对转化效率的影响 4 7 v i 主要符号表 组织培养中 培养基的附加成分为微量元素 2 0 0 倍 有机物 2 0 0 倍 铁盐 2 0 0 倍 m s 大量元素 2 0 倍 培养基的p h 值为5 7 左右 英文缩写 m s w p m b a n a a m a i a a k t 2 4 d i a a z r l h c h g a 3 p i k a c r i f k a n c c f a s l b d n a r n a r n 处 英文全程 m u r a s h i g e s k o o g em e d i u m 1 9 6 8 w o o d yp l a n tm e d i u m l o y a la n dm c c o w n 1 9 8 0 6 一b e n z y l a m i n o p u r i n e a n a p h t h a l e n ea c i d i n d o l e3 b u t y r i ca c i d h d o l e 3 a c e t i ca c i d 6 f u f f u r y l a m i n o p u r i n e k i n e t i n 2 4 一d i c h l o r o p h e n o x ya c e t i ca c i d l n d o l e3 a c e t i ca c i d o z e a t i n l a c t a l b u m i nh y d r o l y s a t e c a s e i nh y d r o l y s a t e g i b b e r e l l i ca c i d p r o p i d i u mi o d i d e k a l i ia c e t a s r i f a m p i c i n k a n a m y c i n c e f o t a x i m e a c e t o s y r i n g o n e l u r i a b e r t a n im e d i u m d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d r i b o n u c l c i ca c i d r n ai n t e r f e r e n c e 中文名称 大量元素 木本植物培养基 6 苄基氨基嘌呤 a 萘乙酸 3 棚i 哚丁酸 吲哚乙酸 6 呋喃氨基嘌呤 激动素 2 4 二氯苯氧乙酸 吲哚乙酸 玉米素 水解乳蛋白 水解酪蛋白 赤霉酸 碘化丙锭 醋酸钾 利福平 卡那霉素 头孢霉素 乙酰丁香酮 l b 培养基 脱氧核糖核酸 核糖核酸 r n a 干扰 d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e脱氧核糖核苷三磷酸 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 r n a e n z y m er n a 酶 w a t e rd i s t i l l a t e dt h r e et i m e s 双蒸水 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n eh y d r o c h l o r i d i 三羟基氨甲烷盐酸盐 t r i s a c e t a t e e d t a b u f f e rt r i s乙酸e d t a 电泳缓冲液 t r i s e d t ab u f f e r t eb u f f e r a g a r o s eg e le l a e t r o p h o r e s i s 琼脂糖凝胶电泳 e t h e d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 m i c r o m o l 微摩尔 m i l l i g r a m l i t r e毫克 升 m i l l i l i t r e 毫升 m i c r o l i t r e 微升 c e n t i m e t e r 厘米 m i c r o m e t e r 微米 h o u r d a y小时 天 m i n u t e 分钟 s e c o n d 秒 r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 每分钟转速 一嗽 一一哪 眦 髓删吼血m 胂啪衄 l 舭 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明 所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果 除了文中特别加以标注引用的内容外 本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品 对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体 均己在文中以明确方式标明 本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担 论文作者签名 闻砚移 日期 旧年5 月 日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 即 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本 学校有权保存学位论文的印刷 本和电子版 并提供目录检索与阅览服务 学校可以允许采用影印 缩印 数字化或其 它复制手段保存学位论文 在不以赢利为目的的前提下 学校可以公开学位论文的部分 或全部内容 保密论文在解密后遵守此规定 作者签名 f 司唬矽日期 瑚7 7 指导教师签泐醐 哆 叩 第一章绪论 第一章绪论 1 悬铃木简介 悬铃木 p l a t a n a c e a e 是双子叶植物纲金缕梅亚纲的一科 即悬铃木科 仅一属悬铃 木属 为落叶乔木 1 属7 种 分布于北美 东欧及亚洲西部 我国引入栽培三种 美 国梧桐p l a t a n u so c c i d e n t a l i si a n n 俗称一球悬铃木 英国梧桐p l a t a n u sa c e r i f o l i a a i t w i l l d 俗称二球悬铃木和法国梧桐p l a t a n u so r i e n t a l i si i n n 俗称三球悬铃木 树 种具掌状裂的叶片 有长叶柄 具叶柄下芽 托叶大 上部平展而张开 下部鞘状 悬 铃木是单性花同株的 它的雄花和雌花都密集成球形的头状花序 生于不同的花枝上 两者区别在于雄花序无苞片 雌花序有苞片 雌花有6 个心皮 是分离的 果实为小坚 果 长可达9 毫米 基部有长毛 因此一个果球实际是由许多带长毛的小坚果组成的 当果球熟透时 常干枯炸裂 仔细观察 可许多带毛的小坚果 因其生长迅速 高 大 冠大荫浓 夏季降温效果好 树干通直 耐修剪 易繁殖 能适应城市环境和各种 土壤条件 能吸收有害气体和吸滞粉尘 具有较强的抗空气污染 抗光化学烟雾 有害 气体及良好的滞尘减噪 净化空气的能力 是优秀的庭院树和行道树 州 美中不足的是悬铃木球果成熟后悬挂于树上经冬不落 第二年4 5 月份球果干枯 炸裂 春季落果时 种子散落 着生在种子上的冠毛随处飞舞 不仅污染环境 影响交 通视线 为城市的清洁工作和行车带来诸多不便 而且经常导致人们皮肤痰痒 咳嗽等 不适 甚至诱发一些人产生鼻炎等过敏性病症 不慎落入眼中或吸入肺中还会引发角膜 炎 哮喘 呼吸道感染等疾病 严重危害人体健康 长时间影响城市环境卫生 2 木本植物组织培养概况 植物组织培养再生指离体植物组织或细胞在组织培养的条件下形成无根苗 根和花 芽等器官的过程 木本植物的植株再生途径可分为三类 一是先从外植体上诱导出愈伤 组织 再从愈伤组织上分化出不定芽或不定根的器官发生过程 包括从愈伤组织或悬浮 培养的细胞和原生质体再生植株 二是不经过愈伤组织阶段 直接从原始外植体上诱导 产生不定芽或不定根的直接器官发生 8 三是经外植体诱导形成胚性愈伤组织并发育成 胚状体 e m b r y o i d 再从胚状体萌发生长出苗的胚胎发生 e m b r y o g e n e s i s 途径 2 1 木本植物组织培养的特点 木本植物生育期长 进行品种改良及选育一个优良无性系要花费较长的间 耗费更 多的精力 木本植物的许多性状特性复杂而不稳定 同一树体不同部位 不同时间所处 湖北人学硕士学位论文 的生理状态不同 且大多木本植物是异花授粉植物 因此外植体材料差异较大 进行植 物离体培养试验可重复性小 木本植物由于多年田间生长 通过外植体建立无菌繁殖体 系相对困难 大多数草本植物离体培养能适应m s 基本培养基 而木本植物离体培养的 继代培养基成分对同一树种可能因基因型不同而不同 因继代培养代数不同而不同 建 立高效的木本植物再生植株体系难度较大 据报道 至少有3 0 种桉树已经在离体愈伤组 织培养中取得成功 然而植株再生成功的则只有1 2 种 9 1 0 l 在果树作物中 采用化学及 电融合法已经获得了柑桔 李 梨 柿 猕猴桃 苹果等多种果树的种间 属间甚至亚 科之间近1 0 0 个组合的体细胞杂种或胞质杂种 可是能够完成植株再生的也较少f 1 1 j 木 本植物继代增殖培养中培养物褐化 玻璃化问题较难克服 常规无性繁殖困难的树种 其组培技术各项技术指标的突破也存在一定的困难 迄今为止 木本植物组培技术尚未 真正找到可普遍遵循的规律 1 2 1 3 1 4 2 2 影响木本植物组织培养的主要因子 2 2 1 基因型与外植体类型 植物的品种及其基因型往往是体细胞胚胎发生的决定因素 白桦不同无性系叶片的 诱导率 再生植株的生根率及增殖倍数明显不同 而且不同无性系的组培苗在形态特征 上的表现各不相同1 1 5 j 对泡桐1 1 6 桉树 i 松树 切 苹果 1 8 j 等多种木本植物的研究也 证实了这一点 同样外植体的来源及其所处的发育阶段或生理状态及其不同部位 极性 也是影响木 本植物植株再生的重要因子 东北红豆杉茎尖能诱导出不定芽与不定根 但不定芽的形 成与6 b a i b a 比值和母树树龄有关 不定根的形成主要取决于i b a 的质量浓度与母树树 龄 1 9 1 在茶树子叶柄培养中 近胚轴端不定芽的分化率高 随着子叶柄断面离胚轴距离 的增大 其分化率降低1 2 0 2 1 l 2 2 2 培养基与外源激素 选用适宜的培养基是组织培养成功的关键问题之一 根据不同的培养目的f 诱导愈伤 组织 不定芽 分化 生根 所选用的培养基亦应有所不同 用于木本观赏植物组培 快繁的培养基有m s s h b 5 d k w w p m 等基本培养基 其中m s 为应用最普遍的培 养基 英国人w o l t e r 改良了基本培养基 成功的诱导出美洲山杨的芽苗 l i o y p 和m c c o w n 在m s 培养基的基础上 针对木本植物的特点 曾创出一种专门用于木本植物的培养基 w p m 其中许多成份较之m s 都有一定的改变 勿 a r r i l l a g a i 等把刺槐子叶接种在木本培 2 第一章绪论 养基上 不仅芽长高 而且诱导出新芽 矧 郑均宝等采用松科植物专用的n h 培养基进 行腊梅嫩茎段的离体快繁 获得成功 刎 杜盛等在脱皮榆离体培养中采用全量和大量减 半的m s 培养基两种无机盐浓度进行不定根诱导 结果表明 在丛生芽诱导时期全量m s 培养基优于大量减半的m s 培养基 但大量减半的m s 培养基却利于不定根的诱导 2 s l 木本植物组织培养中常用的植物激素包括i a a n a a 2 4 d 等生长素 赤霉素g a 和b a k t z 1 等细胞分裂素 其中b a z t 2 4 d 多用于丛生芽或愈伤组织的增殖过 程 i a a n a a i b a 等多用于生根培养 有时还添加肌醇 环烷酸钠 u i v c a b t 等其它物质 促进离体培养材料的生长发育 在木本植物组织培养过程中 细胞分裂素和生长素对芽的诱导和生长发育均起着重 要的作用 一般诱导不定芽的形成时细胞分裂素高于生长素的用量或只用细胞分裂素 而诱导不定根发生只用生长素或配合使用较低浓度的细胞分裂素 s 2 4 2 6 1 生长素对组培 中外植体不定根的诱导有着比较显著的作用 通过对不同生长素作用效果差异的研究发 现 多数种类中i b a 不仅促进生根效果好 而且根的进一步生长较正常 在一些种类中 l 姐和n a a t g 被广泛应用 一般认为生长素在较低浓度对发根有利 细胞分裂素对组培 中不定芽的分化及增殖有着显著的作用 不同种类的细胞分裂素对不同的材料作用差异 较大 但大多数种类以b a 最为有效 汪景山在山楂的组织培养当中发现 低浓度的b a 可促进不定芽的分化 提高浓度则产生丛生芽 并抑制节间生长 低浓度的z t 可促进芽 的分化 但不及b a 产生的芽多 2 7 1 细胞分类素对愈伤组织的形成也有明显作用 w o o j h 等认为在含有b a 的m s 培养基上 茎培养比其它器官培养产生较多的愈伤组织 矧 刘鹏 等在研究外源激素对七子花幼叶愈伤组织影响时发现 低浓度的z t 能有效地促进愈伤组 织的分化与生长 2 9 1 木本植物组织培养中 还经常加入其它的有机物 c i v i n o v a b 在研 究树木茎段培养时发现 加入天冬酰胺和谷氨酰胺能提高愈伤组织分化为芽的比率1 3 0 l 刘青林等将梅花愈伤组织转接在含有水解酪蛋白c h 的m s 培养基上 调查愈伤组织的增 殖系数 结果表明 c h 对梅花愈伤组织的生长 增殖有很好的促进作用1 3 1 l 2 2 3 光照 温度 光照 温度等培养条件对诱导木本植物再生起着重要调控作用 多种桉树愈伤组织 都能在1 2 h 光周期条件下形成根 但在暗处没有根或芽的形成 剐 苹果叶片暗培养比光培 养有利于促进不定芽再生 1 9 l 对于再生植株来说 长时间光照不足易引起再生植株的玻 璃化苗的出现 3 2 i 另外培养基中添加的附属物质有时也起一些关键作用 银杏茎段培养 中 活性炭对外植体芽的分化和增殖 具有非常重要的作用 随着活性炭水平 浓度 的 3 湖北大学硕士学位论文 提高 分化率 增殖率都呈上升趋势 3 3 孙清荣等的实验研究表明 乙烯抑制剂a g n 0 3 浓度在0 1 8 m 矿范围内对梨叶片和李子叶再生不定芽都有明显的促进作用 3 4 1 梁海永 等发现根皮苷有利于阿月浑子组培苗根的诱导 3 5 l 2 3 木本植物离体快繁中常见问题及解决方法 在植物离体快繁过程中 经常会遇到组培苗褐化 玻璃化 变异 污染等问题 给 整个生产带来诸多麻烦和经济损失 甚至导致前功尽弃 若这些问题得以解决 即会加 速林木工业化种苗生产的发展进程 卅 2 3 1 污染的原因及防止措施 在离体繁殖过程中 细菌和真菌侵染培养基产生菌斑使培养材料不能正常生长和发 育 以至死亡的现象称为污染 细菌污染的特点是菌斑呈黏液状 在接种1 3 d 后即可发 现 真菌污染的特点是污染部分会有不同颜色的霉菌 接种后3 1 0 d 才发现 造成污染 的原因很多 外植体长期暴露于田间 杂菌随时随处存在 培养基及器皿灭菌不彻底 操作人员粗心大意 不遵守操作规程 都会造成污染 3 6 j 7 洲 为此 防止污染的常用技 术措施是1 1 选材 选择合适的外植体材料 既可减少污染的发生 也可易于诱导培养 是实验成功的第一步 一般多年生的木本材料比幼嫩材料带菌多 田间生长的比室内生 长的材料带菌多 有泥土的材料带菌多 晴天经日晒可杀死部分细菌 应该在晴天的下 午采取外植体 用茎尖作外植体时 可在室内对枝条进行预培养 将枝条用水冲洗干净 后插入无糖的营养液或自来水中 使其萌发新梢 再用嫩梢作外植体 3 7 3 8 2 1 消毒 采 集的材料先用流水冲洗3 0 6 0 r a i n 污染严重的材料可在水中加入几滴洗涤剂或少量洗衣 粉刷洗后再用流水冲洗 取出材料用7 0 一7 5 酒精浸3 0 s 种子灭菌浸泡时间可适当延 长 经无菌水冲洗后用0 1 0 1 5 的升汞消毒8 1 0 m i n 或用0 5 0 2 5 的次氯酸钠 溶液消毒5 1 5 m i n 无菌水冲洗5 6 次 然后接种 木本植物材料内部易感染病菌 可在 培养基中加入抗生素控制污染 培养基在0 1 0 1 5 m p a 1 2 1 1 2 6 高压灭菌锅内消毒 2 0 3 0 r a i n 超净工作台用紫外光灯照射灭菌2 0 3 0 r a i n 紫外光灯及工作台面用酒精纱布 擦净 严禁在培养室内打开被污染的封口膜 被污染的培养器皿要经高温灭菌后再丢弃 培养物 培养室要定期进行熏蒸消毒 方法是高锰酸钾7 9 m 3 甲醛1 4 m l m 3 将高锰酸 钾用温水少许稀释 放于瓷质器盘 然后倒入甲醛 关闭门窗薰2 5 h 再开窗通风 也 可用臭氧灭菌机对环境进行消毒 接种过程中 使用的器具要在7 5 酒精中浸泡后用酒 精灯火焰灼烧灭菌 操作人员手臂用酒精消毒 工作过程动作要熟练 迅速 3 7 捌 4 第一章绪论 2 3 2 变异 离体快繁可获得大量形态 生理特性不变的植株 也可能出现些变异 特别是通过 愈伤组织形成的或悬浮培养繁殖的幼苗 更具有普遍性 体细胞无性系变异不能逆转 最终将导致离体繁殖的植株在很多性状上与母体不同 离体培养中 早期的培养条件可 改变培养物基因的表达 发生的变化是后天生成的 不能遗传 这些后生的变化可经长 期地生长或人为调节后逐渐消失 造成变异的因素主要有基因型 继代次数 激素用量 变异可从以下方面加以控制i 聊 3 9 4 0 4 1 1 1 选择合适的增殖途径 选择不经过愈伤组织 分化器官的途径 如采用生长点增殖 腋芽增殖 嫩枝段增殖 体细胞胚胎发生途径增 殖 减少经过愈伤组织产生变异的可能性 3 7 j 9 4 0 4 1 l 2 1 减少激素用量 在能满足材料分 化和生长的前提下 尽量降低激素水平 减少培养基中诱变因素 在早期培养中出现的 畸形苗可用酪氨酸0 1 5 0 3 9 砌以调节 有时可使用无激素培养基 将可能发生的变异 减小到最低1 3 3 9 4 0 4 1 3 缩短继代时间 限制继代次数 每隔一定继代次数后 要选择 适当的培养材料 重新开始接入外植体进行新的继代培养以保持其稳定性 定期检查及 时剔除生理 形态异常苗 3 7 3 9 4 0 4 1 1 2 3 3 褐化 褐化是指在离体繁殖过程中由培养材料向培养基中释放褐色物质 使培养基逐渐变 成褐色 培养材料也随之变褐死亡的现象 木本植物体内含有较多的酚类化合物 在完 整的组织和细胞中与多酚氧化酶分割存在 因此较稳定 当外植体被切割后 切口附近 细胞受到伤害 其分割效应被打破 酚类化合物和多酚氧化酶流出 酚类化合物被氧化 而成为褐色的醌类物质和水 醌类物质又会在酪氨酸酶的作用下 使外植体的蛋白质聚 合 导致培养基变褐 组织生长停止 死亡 消除或减少酚类物质的褐化 可通过以下 方法加以控制 3 印7 4 2 4 3 彤 1 选择适宜的外植体 对苹果离体叶片再生的研究中发现 新梢顶端1 4 片叶的再生能力明显高于下部叶片 对核桃新梢离体繁殖中褐化问题的研 究中表明 嫩枝顶芽和第1 2 芽作外植体褐化较轻 第3 4 芽作外植体褐化严重 且差 一一 异显著 由此说明 应选择分生力强的靠近顶部的幼嫩组织做外植体 另外 在生长季 节酚类物质含量高 冬春季取材比夏秋季取材褐化率低 在适宜的细胞脱分化和再分化 的培养条件下 使外植体处于旺盛的生长状态便可大大减轻褐变 3 7 4 2 4 3 4 4 2 加入抗氧 化剂 在离体繁殖中加入一定量的抗氧化剂或用抗氧化剂进行材料预培养 可减轻醌类 物质的毒害 有效地抑制褐化 一些常用的抗氧化剂有抗坏血酸 v c 聚乙烯吡咯烷酮 p v p 硫代硫酸钠 n a 2 s 2 0 3 有机酸 氨基酸 活性炭等 一般用量 抗坏血酸o 5 5 o g l 5 湖北人学硕十学位论文 硫代硫酸钠0 3 0 6 9 l 聚乙烯吡咯烷酮0 3 3 o g r e 活性炭0 2 1 0 在静止的液体培 养基中加入抗氧化剂比在固体培养基中加入效果好1 3 7 a 2 4 3 4 4 l 3 1 缩短转瓶时间及预处理 对于易褐变的材料 在外植体接种后1 3 d 转接到相同的新鲜培养基上 或在同一瓶中转 换位置 连续转移4 6 次可基本解决褐变的发生 离体培养过程中每次培养天数的多少 直接影响培养效果 缩短每次继代培养天数 可t h 3 0 d 缩短为2 0 2 5 d 也可减轻褐变的 发生 对材料进行预处理的方法是外植体经流水冲洗干净后 经2 5 c 的低温处理1 2 2 4 h 消毒后接种于只含蔗糖的固体培养基上培养5 7 d 使组织中的酚类物质外溢于培养基 再接种于合适的培养基中 如果仍有酚类物质渗出 则3 5 d 后再转移到新鲜的培养基上 这样重复几次 可基本解决褐变的发生 3 7 4 2 4 3 4 4 1 2 3 4 玻璃化 在离体繁殖过程中 培养植物的嫩茎 叶片出现半透明水渍状的现象称玻璃化 玻 璃化苗是一种生理失调状态 叶片肿胀或纵向卷曲 叶易碎 表皮缺少角质层蜡质 体 内含水量高 各种营养物质含量低 分化能力极低 很难继续用作继代培养的材料 这 种现象若不及时加以控制 会直接影响生产数量 质量 损失巨大 试验研究认为乙烯 对玻璃化形成有启动作用 当培养环境水分含量较高 通气不畅时 会导致乙烯产生 乙烯进一步引发其它激素和酶的活性 抑制蛋白质 纤维素和木质素的合成 促进叶绿 素的分解 形成玻璃苗 培养基的激素水平 培养温度 p h 值 光照 培养基的硬度等 也是形成玻璃化的重要条件 即细胞分裂素浓度越高 培养温度越高 玻璃苗比率越大 生长素含量增多也会促进乙烯的形成 培养基的硬度由琼脂用量和p h 决定 琼脂用量要 根据不同生产厂家的产品预先做凝固实验 调整好用量p h 值一般在5 4 6 2 过酸时造成 琼脂不凝固 过碱时会增加培养基的硬度 造成营养成分沉淀 不利于组培物的生长 光照不足再加上高温易引起培养苗过度增长 加速玻璃化发生 玻璃化应采用如下方法 控制 3 6 j 7 t4 5 4 6 1 1 调整培养基成分 培养基中的各种矿质营养对促进培养物的生长和发 育有积极的作用 据对山杨芽的离体培养实验结果表明 适当降低培养基中氮素和细胞 分裂素的水平 山杨玻璃苗数量大大降低 经过对甜柿休眠芽离体培养实验也说明 培 养基氮源减半也可降低玻璃苗的比率 适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂 降低 培养基的渗透势 减少水分含量 造成水分胁迫 也可适当降低培养瓶内的相对湿度 利用固体培养方式 增加琼脂用量 均可减轻玻璃化的产生i 4 5 4 6 j 2 1 激素水平及其它 条件 高浓度的细胞分裂素有利于促进芽的分化 也会提高玻璃化的发生比率 因此要 降低培养基中细胞分裂素的用量 不同品种 同一植物的不同器官外植体在培养的不同 6 第一章绪论 阶段需要激素的水平有较大变化 正确调配培