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存放全血温度及时间对提取 DNA 质量的影响 吴晓黎1 何 燕2 陈 菁2 单可人2 任锡麟2 1 贵阳医学院检验系临床生化学教研室 贵阳 550004 2 贵阳医学院分子生物学重点实验室 摘 要 采用 PCR 扩增评估提取 DNA 的质量 研究在不同温度 时间条件下存放全血对提取 DNA 的影响 结果 不同温度 4e 1 4 d 20e 3个月 85e 3 个月 条件下存放的全血 4e 存 放 1 4 d 与 85e 存放 3 个月无显著差异 4e 存放1 4 d 与 20e 存放 3个月 20e 与 85e 存放 3 个月呈显著差异 结论 4e 1 4 d 及 85e 3 个月 能获得较高质量的 DNA 样品 关键词 DNA 血液 白细胞 聚合酶链反应 中国图书馆分类法分类号 Q52313 分子生物学研究中最基本的一点是样品 的制备 即从要分析的标本中纯化核酸 这是 研究工作获得成功的重要的第一步 由于研 究目的不同 用于抽提 DNA 的起始材料的 种类可能差异很大 包括如1 700 2 000年 以前的木兰科叶子化石 1 从已灭绝动物皮 中发现的肌肉 2 单根人类毛发 3 和石蜡包 埋的活组织 4 及最常用的外周抗凝全血等 很显然每一种特殊样品有各自的限制和抽提 DNA 的不同要求 在研究工作中 最方便最 实用的 DNA 来源是外周血白细胞 因多种 感染介质可能存在于血液中 不少的研究工 作者往往希望作一次样品制品用于多次的分 子生物学实验 又由于标本来源不易 有时采 集例数很大 很难在较短的时间从大量的标 本中提取纯化 DNA 这些情况下均涉及标本 的保存 为保证 DNA 的提取质量 标本的 存放条件就显得至关重要 本文就存放于不 同温度及时间条件下外周抗凝全血 DNA 的 提取 进行初步的探讨 1 材料与方法 111 样品 取正常人外周静脉血 2 3 ml 肝素抗凝或 EDTA Na2抗凝 3 000 r min 离心 10 min 分离血浆和血细胞 血细胞分 成3 份 分别放置在 4e 1 4 d 20 e 3 个 月 85e 3 个月保存 112 白细胞的分离 采用低渗溶血法 5 将全血样品置于 15 ml 无菌塑料离心管中 加入无菌双蒸水约 12 ml 混匀 室温放置 5 10 min 4 000 r min 离心 10 min 弃上清 液 沉淀即为样品白细胞 113 白细胞 DNA 的提取 在白细胞沉淀 中加入 STE 至总体积 2 3 ml 悬浮白细胞 加蛋白酶 K 20 g L 至 50 Lg L 10 SDS 至 终浓度 015 充分混匀 放 37e 水浴恒温摇 床慢速振荡消化过夜 或 50 55e 恒温水中 保温 3 5 h 其间振荡 2 3 次 至白细胞块 状完全溶化后 取出冷却至室温或 4e 加等体积 pH810 T ris HCl 饱和酚 温 和振摇 15 20 min 使水相和有机相充分混 匀 4 e 或室温4 000 r min 离心 10 min 此时 DNA 存在于上层水相中 酚位于下层 中间 是变性的蛋白质 小心吸取上层水相至另一 无菌离心管内 在离心管中加入等体积的氯 仿 异戊醇 VBV 24B1 温和振摇 10 15 min 使水相和有机相充分混匀 4e 或室温 4 000 r min 离心 10 min 用无菌吸管小心吸 取上层水相 移至另一无菌离心管内 向离心管中加入 1 10 体积的 3 mol L NaAc 混匀 再加入 2 倍体积的无水乙醇 轻 轻上下摇动离心管 此时可见白色的 DNA 絮状沉淀 用无菌吸管吸出絮状 DNA115 ml 至无菌离心管内 在 70 冷乙醇中清洗 2 3次 每次 500 Ll 12 000 r min 离心 5 min 收集的 DNA 沉淀 可于 70 乙醇中 20e 保存备用 也可放入 DNA 抽干机内真空抽 干或放室温挥发乙醇 待 DNA 沉淀挥干乙 醇后 加适量的 TE 充分溶解 DNA 沉淀 即 232 第 25卷 第 3 期 2000 年 9 月 贵 阳医学 院学 报 JOURNAL OF GUIYANG MEDICAL COLLEGE Vol 25 No 3 200019 可进行进一步的分子生物学研究 114 白细胞 DNA 的定量 6 采用紫外吸 收法 将所提取的 DNA 用适量 TE 溶解后 取 10 L l DNA 溶液加入 1990 Ll 的 TE 中 振 摇混匀后转至石英比色杯中 同时用 T E 溶 液作空白调零 于 260 nm 处测其吸光度 A 值并计算 DNA 的含量 115 PCR 扩增评估所提白细胞 DNA 的质 量 由于这一常规的 DNA 提取法操作步骤 较多 因此应使用一对用作内在对照或共扩 增对照引物评估样品的 DNA 质量 我们采 用一对人 B 珠蛋白基因的寡核苷酸引 物 7 它的序列是 5 GAAGAGCCAAGGACAGGTAC 3 5 CAACTT CAT CCACGTT CACC 3 PCR 反应体系为 012 ml 薄壁管中加入 10 buffer 215 L l 华美生物工程公司生产 25 mmol L MgCl2215 L l 华美生物工程公司 生产 4 种脱氧三磷酸核苷酸 4 dNT P 华美生物工程公司生产 至终浓度 200 Lmol L 每种引物 100 pmol L 上海申友公 司合成 模板 DNA110 115 Lg T aq DNA 聚合酶1U 华美生物工程公司生产 无菌双 蒸水补充总反应体系至 25 Ll 混匀 离心片 刻 PCR 仪上循环 美国 PE 公司 2400 型 94e 预变性 5 min 循环周期依次为 94e 变 性45 秒 55e 退火45 秒 72e 延伸1 min 30 次循环后 72e 保温 5 min 115 210 琼脂糖凝胶电泳分离 溴 化乙锭染色 紫外光下观察目的条带 268 bp 并摄影 2 结 果 4e 1 4 d 与 85 e 3 个月的标本的 PCR 检出率无显著性差异 P 0105 DNA 平均含量呈显著性差异 P 0105 85e 3 个月保存的标本提取效果较好 4 e 1 4 d 与 20e 3 个月保存标本的 PCR 检出率呈 显著性差异 P 0105 DNA 平均含量呈显 著性差异 P 0105 4e 1 4 d 保存的标本 提取效果较好 20e 3 个月与 85e 3 个月 保存标本的 PCR 检出率呈显著性差异 P 0105 DNA 平均含 量呈显著差 异 P 0105 85e 3个月保存的标本提取效果较 好 见表 1 表 1 三种不同温度时间保存的血标本的 DNA 含量及 PCR 扩增检测 DNA 质量结果比较 Tab 1 A comparison between DNA concentration of the blood samples stored at different temperature and time and DNA quality tested with PCR method 保存温度 e 标本总例数 n 检出组 例数 含量 g L 未检出组 例数 含量 g L 4 1 4 d52458615401777131460131 20 3 个月884667165016722321350152 85 3 个月635282154111311171460154 3 讨论 从不同组织细胞或血细胞中获得高分子 量DNA 是进行分子生物学研究的先决条 件 DNA 以核蛋白形式存在于细胞核中 它 是由 4 种脱氧核糖核酸单体藉磷酸二酯键连 接而成的长链分子 制备 DNA 的原则是既 要将蛋白质 脂类 糖类等物质除去 又要尽 可能保持 DNA 分子的完整 近年来 蛋白 酶 K 及链霉蛋白酶 E 的应用使这 2 个原则 得到了保证 5 233 3 期 吴晓黎等 存放全血温度及时间对提取 DNA 质量的影响 蛋白酶 K 或链霉蛋白酶 E 均为广谱蛋 白酶 其主要特性是能在 SDS 和 EDTA 存在 下保持很高的活性 这样 在提取 DNA 的 反应体系中 SDS 将细胞膜 核膜破坏 并将 组蛋白等从DNA 分子上分离 SDS 及EDTA 抑制细胞中 DNA 酶的活性 蛋白酶 K 或链 霉蛋白酶 E 将所有蛋白质降解成小肽和氨 基酸 使 DNA 分子尽量完整地分离出来 获得高质量 DNA 的关键之一是防止 DNA 降解 提取 DNA 用的离心管等器皿及 试剂应提前高压灭菌 在提取 DNA 的过程 中还应尽量避免对 DNA 的机械剪切作用 因此在抽提过程中应尽量避免剧烈振荡 标本的存放条件分 3 种不同的温度 不 同的存放时间 4e 储存 1 4 d 20e 85e 储存 3 个月时同时取出提取 DNA 对 3 种不同温度 时间存放的标本所提取的 DNA 进行 PCR 扩增 观察所提取的 DNA 质量 实验结果显示全血短期储存时放置于 4e 较长时间储存最好放置于 85e 这样可以 确保能获得高质量的 DNA 样品 参考文献 1 Golenberg E M D E Giannassi Chcoroplast DNA sequence from a miocene magnolia species Nature 1990 344 656 658 2 Higuchi R B Bowman DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 1984 312 282 284 3 Higuchi R C H Von Beroldingen DNA typing from single hairs Nature 1988 332 543 546 4 Greer C E J K Lund PCR amplification from paraffin embedded tissues Recommendation on fixatives for long term storage and prospective studies PCR Methods Appl 1991 1 46 50 5 吴冠芸 主编1 基因诊断技术及应用 1 北京 北 京 医 科 大 学 协 和 医 科 大 学 联 合 出 版 社 19921174 176 6 J1 萨姆布鲁克1 分子克隆实验指南1 北京 科学 出版社 19931956 7 C1W1 迪芬巴赫 1PCR 技术实验指南1 北京 科 学出版社 1999170 2000 08 04 收稿 A Study of the Methods of Extracting DNA from Whole Blood Stored in Different Temperature Conditions Wu Xiaoli He Yan Chen Qing Shan Keren Ren Xilin Department of Clinical Laboratory Science Guiyang Medical College A study of the methods of extracting DNA from whole blood stored in different temperature conditions Using hypoosmotic hemolysis method and PRC method to evaluate the quality of the extracted DNA DNA Samples extracted from the whole blood stored at temperature of 4 e for 1 to 4 days 20e and 85e and for 3 months at were compared The result showed that no sig nificant difference was found between 4eand 85e but there was a significant difference be tween 20e and