（环境科学专业论文）海洋浮霉状菌分子生态学研究.pdf

氧化细菌的1 6 sr r n a 基因序列、声变形菌氨氧化细菌的1 6 sr r n a 基因序列 及氨氧化古菌的氨单加氧基因硎d a 的序列) ，显示了沉积物中复杂的氨氧化 微生物的组成，为认识海洋沉积物氨氧化微生物群落中复杂的竞争或协作的关 系提供信息。 4 ) 应用c a r d f i s h 技术揭示了长江口及三个南中国海剖面站位浮霉菌的丰度。 虽然长江口浮霉菌的丰度( o 2 3 2 0 5 3 1 0 4 个细胞毫升) 要高于南中国海水柱中 的浮霉菌的丰度( 0 1 5 1 0 2 5 1 0 3 个细胞毫升) ，但本研究的结果低于以前报道 的在沉积物和土壤中浮霉菌的丰度。 关键词：浮霉菌；1 6 sr r n a 基因；厌氧氨氧化；c a r d f i s h a b s t l 譬c l i n 他c e n td e c a d e s ，胁，l c 伽叼，凹，嚣h 硒b e c o m eo mo ft i l ef 醅u s e dg r o u 盼f o r p 细瑚幻缈f 嚣i sam i c r o b i a lm o d e lt 0e x p l o r et h ee v 0 l u t i d nr e l a t i o n s h i ph t w e e n b a c t e r i a 锄de u k a d ，0 t e sf o r 砥c h a r t e r i s t i co fc o m p 咖e n t 粕dp e p t i d o g l y c 锄l e s s p r e v i o u sw o 水s h o w e dt h a t c 幻彬f 嚣p i a y e di m p o r t a n t l 鹤i nm a r i n ec 盯b ( m a n dn i t r o g e nc y c l e ss u c ha sa n a m m o x p r o c e s s e sa 竹r i b u t e dt o3 0 - 7 0 m 撕n en i t r 9 9 g a sl o s s a l t h o u g l l 用锄c 幻叼删五盼i n v e s t i g a t i o n sh a v eb e e ni n c r e 弱e d ，l i t t l ei s l ( n o 帅a b o u tt h ed i s t r i b u t i o n ，d i v e r s i t y 锄da b 岫d 锄c eo f 尸7 锄c r d 叼脚，口j 妇r e g 捌i n g m a r i n ee n v i r o n m e n t s h e r ew e p 心s e n t s o m em o l e c u l 盯w o r i ( so nm a r i n e p l a 粥t o m y c e t e s 1 ) 1 6 sr i 州ag e n ea p p r o a c hi sa p p l i e dt 0i n v c s t i g a t e 纠册c ，鲫纵l p f i 瞪c 0 咖u n h yi n t h ev e r t i c a ld e e ps e as e d i m e n to ft h es o u t hc h i n as e a 扑dt h el a t i t l u d i 舱ls u r f k e s e a w 咖ro ft h ew e s t e mp a c i f i c0 c e 锄f o rt h ev e r t i c a ls e d i m e mo ft h es o u t hc h i n a s e 毛p c r 锄p l i f i c a t i o nu s i n g 舭p r i m e rs e tp i a 4 6 f 1 3 9 2 ro ft h es 锄p l e s 舶m s e v e n 辩d i m e n tl a y e 巧( 0 1m ，1m ，3 m ，5 m ，7 m ，9 m 锄d1 lmb e l o wt h es u r f j 比es e d i m e n t ) s h o w e dt h a t 尸肠刀c f o 彬耐缸e x i s 刷w i t h i nai i m i t c dr a n g eo fs e d i m e n td e p t h s ( ! ，5 m ) ， 觚dh a dad e c r e 觞i n g 删i nd i v e r s i t yw i t l li n c r e 舔i n gd e p 恤t h em 萄嘶t yo ft 1 1 e p l a _ 4 6 - f l3 9 2 - r 瞅r i e v e d q u e n c e sb e l o n gt 0 尸抛z f l 妇r e l a t e d 尸z 册饷叼抛，口j b ，f o r t h ei a t i t l u d i n a ls u r f h c e 豫a w a t e ro ft t l ew e s t e mp a c i f i co c e a n ，t i l er e s u l t s 陀v e a l e dt l l a t p i 他t l t l l q 黜1 0 d o p i r e l l 讧a b l a s t o p i r e l l t l l q c a 氐氐瓜妞瞄d 垴嗨p l 帆c t 0 哟，c e t e s c o m m u n i t y ( b e t w n8 3 3 a n d9 4 1 ) i na l l 轴喻c e a w a t e rs i t e s 锄dw 笛p r e 溯l t u n e x p e c t e dd i v e r 辩w h i l et h em i n o r i 够o fg e n e r ag g 坍l 口细a n dj f 叮锄c f o 删旧嚣w e o n l y f o u n di ns i t 瞄h 5 锄dh 2 陀s p e c t i v e l y i n t e r e s t i n g l y ，d i v e 体i 哆o fl o wl a t i t u d e ss e a w a t e r a p p e a 陀dh i g h e rm 鲫o fm i d l 锄t i t u d 髂1 i b s h u f rs 0 r w a 咒锄a i y s i s 删e a l e d s i 鲫i f i c 锄t i yd i 他代n td i v e r s 时p a n e mb e t 、e e ni nt h el a t i t u d i 他is u 晌舶s e a w a t e r 龃d i nt h e d i m e n t p o s s i b l y 他s p o n s et 0d i l f f e r e n th y d r 0 i o g i c a la n dg g r a p h i cf e a t u r e s 2 ) t w on e w 陀v e r 辩p r i m e r s ( p i a - 10 9 7 ra n dp i a - l3 6 8 r ) a r ed e s i g n e d 、 ，h i c h g r e a t i yp r 伽o t et h ep o t 明t i a la b i i i t yo ft h ef o n v a r dp r i m e rp i a 4 6 f b o t ht h e o r e t i c a l l y v t t 舳de x p e r i m e n t a l l y t h et e s ts h o w e dt h a tp c r 吣i n gt h en e wp r i m 盯s e t sr e d u c e d m i s m a t c h e st 0n o n 纠a 聆咖彬倌s 锄d 鳓p p i e m e n t e dt h ed i v e r s i t ) ，o f 尸肠刀c 幻啪绍s e s p e c i a l i yi n c r e 嬲i n gt h en u m b e 体o fg e n e 陋o f 口，圮r d 彬绝9i nb c m 删a t e r 锄d s e d i m e n t 翰m p l e s o u r 他鲫i t ss t r o n g l ys u g g e s tt h a tt h ed i v e r s i t yo fa 切圮幻彬纪s 弱 r e v 髓l e db yp i a 4 6 - f l3 9 2 - rh 硒b e e np o t e n t i a i l yu n d e 陀s t i m a t e d 3 )m o l e c u l a re v i d e n c e so f 锄m o n i u mo x i d i z i n gm i c r 0 0 唱a n i s m sw e 他p r e s e n ti nt h e o 1mi a y e ri nt h es 叫t hc h i n as e as e d i m e n ts t a t i o nm d 2 8 9 6 ， i n c i u d i n g 锄锄m o x - 陀l a t e dl6 sr r n ag e n e 辩q u e n c e s ，b e t a o 切纪d 施嘲，硒锄m o n i u mo x i d i z i n g b a c t e r i al6 sr r n ag e n e q u e n c e s 卸da r c h a 册ag e 鹏s e q n c e s o u rd a t a s u g g e s t e dt h a tt h e r e 玳c o m p r e h e n s i v ec o m p e t i t i o n so rc 0 0 p e m t i o n s 锄o n gd i 仃e r e n t 锄m o n i u mo x i d i z i n gm i c r o o r g 绷i s m si nt t l e d i m e n t 4 )c a r d - f i s ha p p r 0 h 、v 私a p p l i e dt 0i n v e s t i g a t et h ea b u n d 觚c eo f 肋，c f d 叼删f i 时 i nc h i n as e 邪o u rd a t a 陀v e a l e dt h a tt i i ea b u n d a n c eo f 尸j f 矗加f d 叼鹏纪sw 舔v 盯i e d o 2 3 - 2 0 5 3 1 0 4 c e i l s m li nt h ey a n g t z e 硒v e re s t u a 叮觚do 1 5 1 0 2 5 1 0 3c e i l s m ii n t h e a w a t e rc o l u m n so ft h es o u t hc h i n as e a 陀s p e c t i v e l y e v e nt h o u g hh i g h e rt h 锄i l l t h es e 飘，a t e rc o l u m n so fs o u t hc h i 眦s e 毛t h ea b u n d 锄c eo f 纠口m 伽叼脚舫i nt 1 1 e y a n g t z er i v e re s t u a 巧i sl o w e rt h a np 佗v i o u sr e p o n e di n i i s 锄ds e d i m e n t s k e y w o r d s ：砌c f d 彬舷，；l6 sr 剐n ag e n e ；柏锄m o x ；c a r d - f i s h v i i i 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利 和责任。 声明人( 签名) ：参吾舌亿 2 口。3 年0 月1 9 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦 门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸 质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允 许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关 数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密 的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( ( 请在以上相应括号内打“ ) 作者签名：信考素乜 日期：口g 年6 月i ，日 导师签名：拯醐：知署刨刖泪 第一章：文献综述 第一章文献综述 1 1 海洋微生物分子生态学概述 海洋微生物是海洋生态系统中的重要组成部分，海洋微生物的生态学研究， 有助于我们更为深入地掌握海洋微生物的分布特征及其在整个海洋生态系统中 的功能与作用，对深入开展海洋生态环境研究具有重要的意义。近年来，海洋微 生态生态学研究越来越受到海洋科学家的重视。但是目前仍然有相当数量的海洋 微生物尚未被我们发现，对海洋微生物的丰度、分布规律等也缺乏系统的了解。 分子生态学是指利用现代微生物理论与分子生物学和化学技术研究微生物 生态系统的结构及功能的学科。可以通过检测生物自然种群d 1 蛆序列多态性、 鉴定个体的基因型，在基因水平评价种群遗传分化，并在分子水平阐述分子适应、 基因水平转移等生态问题的机制，更好的揭示生物与环境之间的生态学意义，为 海洋环境的元素地球化学生物循环提供基础。分子生物学、基因组学和生物信息 学等新兴学科的发展及其向微生物学领域的渗透，为克服纯培养的局限性，全面 客观地研究微生物生态系统提供了全新的技术手段。其中d n a 分子是当前分子 生态学研究的主要对象。由于微生物基因组d n a 分子十分庞大，诊断其混合物 的组成需要依赖能够体现每个基因组基本特殊的序列片段，一般称为标记序列 ( m a r k e rs e q u e n c e ) 【7 1 。目前，用于微生物群落结构分析的基因组d n a 的序列信息 ( 标记序列) 包括3 种：进化指针序列，例如核糖体小亚基因序列( 1 6 1 8 s 枞) ； 各种功能基因的序列，随机扩增的基因组序列。 1 1 1 主要的分子生物学诊断技术 用于群落结构分析的分子生物学诊断技术主要有以下： ( 1 ) 克隆文库分析法( c i 仰ei i b 豫曙p m n l i n g ) 通过构建群落样品总基因组蛆文 库，分析文库中标记序列的类型和出现频率，可以得到微生物群落种群组成的分 析数据。核糖体小亚基( s m a s u b u n i t ，s s l dr n a 基因是最经常被选作克隆的基 因，成为系统发生的准绳。核糖体r n a 有3 种类型：2 3 s 、1 6 s 、5 s 枞，其中 1 6 sr 鼢蛆基因序列作为生物系统发育指标最为合适，主要依据是：它为细胞所 共有，其功能同源且最为古老，既含有保守序列又含可变序列，分子大小适合操 作，序列变化与进化距离相适应。从样本中提取总讲妊，采用p c r 和通用引物来 扩增s s ui 讯a 基因，通过分析s s ur n a 基因片段对微生物进行分类鉴定。这种 第一章：文献综述 方法可以详细地揭示样本中的微生物多样性直至种的水平，此外，得到的序列信 息亦可以作为建立特异性寡核苷酸探针的基础，为原位杂交等方法提供依据。如 果是用1 6 sr r n a 基因作为标记，可以通过与g e n e b 龃k 和r d p 数据库中已有序列 的比对，鉴定出各种序列类型的分类地位，许多序列可以鉴定到种的水平，这种 方法工作量大，成本高：同时如果分析的克隆数目足够多，可以比较完整地了解 微生物群落的基本构成特征；但这种方法不适合对微生物群落结构变化进行动态 跟踪研究。 ( 2 ) 分子杂交技术( m o l u i a r h y b r i d 幻吼t i o n ) 用已知的标记序列作为探针，可以检测微生物群落样品中是否有特定的微生 物种类存在及其种群水平的高低。例如，通过荧光原位杂交f i s h 可以把一个样 品中的特定微生物种类的细胞染色成一定的荧光，观察其在自然状况下的数量与 分布特点。但是，使用分子杂交技术的前提是要有已知种类的标记序列作探针， 对于大量存在的未知种类不能用分子杂交来研究。我们通常所说的分子探针是一 段长为1 6 2 4 b p 的寡核苷酸序列。探针的实际应用范围很广，从物种的分布和变 化规律到对有毒物种的生态监测都可以发挥巨大作用。 荧光原位杂交( f i u o r e 驰e n ei ns i t uh y b r i d i 臻t i o n ，f l s i i ) 就是将基因探针用荧 光染料标记，再使之与固定在载玻片上的微生物样品杂交，将未杂交的荧光探针 洗去后用普通荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜进行观察和摄像。f i s h 将精 确的分子遗传学鉴定和显微镜可视的图像信息结合起来，使得在天然环境中的单 个微生物细胞鉴别成为可能。由于该技术不需要任何选择、纯化和扩增的步骤， 并且可以同时对不同类群的细菌在细胞水平上进行原位的定性定量分析和空间 位置标识，因此被广泛应用于不同环境，如沉积物、海湾、土壤微生物群落和微 生物多样性的研究中。 c a r d f i s h 技术( c a t a 炒z e dr e p o n e rd e p i t i o n ，c a i m ) 实际上是在f i s h 技术 的一种，唯一不同的是，这种技术应用的探针是由辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s h p e r o x i d a 辩) 所标记的。经寡核苷酸序列和目标核酸结合后，再经咖i d e 信号放 大( 如图1 1 ) ，大大加强f i s h 的灵敏度，解决普通f i s h 技术所获得的信号总是 低于检测线或是由于背景噪音很强而无法识别的问题。 2 第一章，文缘连 1 h y b r i d i 拍t 沁n h o mr a d l 3 hp 拍d a 辨i h r p l + 一l a b e f e d o g o n u c i e 州d e 2 s i g n a i a m p i i 自c a t i o n c 口i y z e d 知”m d e p o s m o n c r d ) o f n u o n * c e n u v i a b e i e d 时m m l d e 圈1 1c r d _ f i 明原理图 f 培q m1 1t hp n - c 岫k o f c r 阻h s h ( 3 ) 遗传指纹图技术t 萨曲血萨r p 一6 西 利用p c r 技术扩增标记序列，然后通过一定的电泳、色谱等技术把扩增产 物解析成具有特定特征的图谱。一般每个条带( 或峰) 可阻看作是一个微生物类 群条带的染色强度( 或峰下面积) 可以反应这个类群的数量水平的高低，这样， 一个样品的微生物种群组成就可以通过一组条带组成的图谱( 或指纹) 反映出来， 这类技术也叫“微生物群落指纹图分析技术”( p c r 如s e d6 “g e | 州n t i “g ) 。 变性浓度梯度电泳( d e t i i 一“gg 哺d k n og de k t r o p h o r 醯，d g g e ) 和温度梯度 电泳( t e m p e n m ng n 抵n t 妒id e c l _ 0 灿。峭趣t 6 g e ) 是目前研究微生物多样 性的两种较成熟的方法可用来对环境样本中的生物多样性进行定性和半定量分 析。提取样本中的总d n a 对特定的d n a 片段进行p c r 扩增。p c r 扩增的产物 大小相似但它们的g c 含量和二级结构各不相同。当双链d n a 分子在古梯度变 性剂( 尿素、甲酰胺) 或运渐升高温度的聚丙烯酰胺凝胶中进行屯泳时，因其解 链的速度和程度与其序列密切相关，所以当某一裂链d n a 序列迁移到凝胶的一 定位置时，就会开始部分解链，部分解链的d n a 分子的迁移速度随着解链程度 的增大而减小从而使具有不同序列的d n a 片段停留在凝胶的不同位置。在引 物中加入一个g c “夹板”( 富吉g c 的一段序列) 可以防止d n a 完全解链。这两种 方法的灵敏度很高。含有错配的双链通常可以远远地与两个同源双链分开。 单链构拳多杏性( s i g i e 妯t n d e d n 如珊a 矗p o 咿m o r p h b m ，鹞c p ) 也是根据 与碱基序列有关的二级结构的不同来分离d n a 片段。与上面两种方法不同的 jj、 一 、 第一章：文献综述 是，s s c p 没有使用g c “夹板”。p c r 产物经过变性处理后，不同碱基序列的单链 d n a 在非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离开来。此方法中的正向引物没有经过磷酸 化，而反向引物是被磷酸化的。p c r 扩增后，用九核酸外切酶进行消化，磷酸化 的d n a 链被降解，从而除去d n a 非编码链。用s s c p 法比用d g g e 或t g g e 法得 到的电泳条带要复杂，电泳条带可以回收，进行p c r 再扩增、克隆、或者测序、 凝胶也可以用于印记试验。 限制片段长度多态性( r 鹤t r i c t i o nf 憎g m e n tl e n g t hp o 眵m o r p h i s m ，砌吧p )利 用能识别特定d n a 序列( 4 2 6 b p ) 的限制性核酸内切酶消化d n a ，得到不同长度的 d n a 片段。检测这种多态性的经典方法是利用单拷贝基因作为探针，进行 s o u t h e m 点杂交试验。放射性标记的探针与特定的d n a 片段相结合，酶切得到的 不同长度的d n a 片段被分别标记，经放射自显影技术检测放射性信号。另外一 种r f l p 方法是在对特定的基因序列( 通常为1 6 sr i 斟a 基因) 进行p c r 扩增后，用 限制性内切酶处理扩增产物，基于不同种群1 6 sr r n a 基因序列的差异，将得到 长度与数量不同的d n a 片段，通常用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离， 并利用荧光染料进行显色，得到特异性的电泳图谱。1 9 9 7 年，w e n t a 0 等在此基 础上建立了末端片段长度多态性( t e m i n a ir e s t r i c t i o n6 a g m e n tl e n 舒h p o i y m o 叩h i s m ，t r f l p ) 的方法，使用荧光或放射性标记引物的一端或两端，这 样酶切所得的末端片段被标记，电泳后只分析此末端片段的种类、长度、数量即 可。研究表明，采用t - r f l p 的方法可以有效地区分某一类群中的微生物，是研 究微生物多样性和群落结构的一个有力的工具。此外，t i 强l p 也被用来研究烃 类化合物对海洋沉积物中微生物群落的影响。 扩增片段长度多态性( a m p i i n e df r a g m e n t l e n g t hp o 炒m o r p h i s m ，削i l p ) 是研究 海洋微生物多样性的一项新技术，它结合了r a p d ( 啪d o ma m p l i f l e dp o l y m o 叩h i c d n a ) 和i 强l p 的优点【2 9 】。d n a 经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等 的随机限制性片段，将特定双链接头( a d a p t c r ) 连接在这些d n a 片段的两端，形 成一个带接头的特异片段，作为d n a 扩增的模板。接头序列以及与其相连的限 制位点作为随后进行的限制片段扩增的引物结合位点。p c r 引物3 末端含有选择 核苷酸，选择核苷酸延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择核苷 酸配对的限制性酶切片段被扩增。扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检 测。根据目前的报道，a f l p 可应用于与诊断、流行病学等相关的细菌分类学研 4 第一章：文献综述 究，在海洋微生物多样性研究方面的报道不多，然而a f l p 已被列为当前海洋微 生物群落多样性研究的重点技术之一。 实时定量p c r ( 代a i t i m ep c r ) 所谓实时定量p c r 技术，是指在p c r 反应体系中 加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个p c i t 进程，最后通过标准曲线对 未知模板进行定量分析的方法。经典p c r 一般分为扩增和检测两个阶段，常用溴 化乙锭染色，凝胶电泳为定性检测手段。由于定性实际上就是定量的一种粗约表 现，因此只要对检测手段进行改进就可以实现精确定量。荧光染料或荧光标记物 与扩增产物结合后，被激发的荧光强度和扩增产物成正比。而根据扩增原理，扩 增是呈指数增长，因此在反应体系和反应条件完全一样的情况下，样本含量应与 扩增产物的对数成正比，故在一定的条件下荧光强度和样本含量成正比。r e a i t i m ep c r 也被用来对海洋中不可培养的细菌进行定量研究。 1 1 2 我国海洋微生物分子生态学研究 我国既是陆地大国，又是沿海大国，拥有1 8 0 0 0 多公里的大陆岸线。依照联 合国海洋法公约中2 0 0 海里专属经济区制度和大陆架制度，我国可拥有约3 0 0 万平方公里的管辖海域。我国近海和管辖海域蕴藏着丰富的海洋资源，主要有海 洋生物资源、油气资源、固体矿物资源、海水资源、海洋能资源等。 研究海洋生物对于我们认识和开发海洋生物、发展海洋灾害系统、开发海洋 资源勘探技术、认识海洋生物进化历程，都有着非常重要的意义。1 9 9 9 年，海洋 科学研究机构提出了海洋生物多样性减少的问题，并将海洋生物多样性作为研究 重点。随着人类对海洋生态系统的不断研究和探索，海洋微生物在海洋物质循环、 能量流动及维持海洋生态系统多样性与稳定性方面的重要性被人们广泛认可并 展开深入研究。海洋微生物在生物地化过程中扮演着重要的角色，全方位地了解 和认识它们是保护海洋微生物多样性的本质策略。我国对海洋微生物多样性的研 究较少，起步较晚，尤其是在分子生物学领域。我国的海域面积辽阔，微生物资 源丰富，如果能对其进行合理的开发和利用，可促进我国生物多样性的研究以及 海洋事业的发展。分子生物学技术的应用增进了我们对海洋微生物多样性的了 解，使我们不必采用繁琐、粗糙的传统方法或者不经过培养直接就可以进行多样 性分析。通过分子生物学技术，某一种群的系统发生历史得以重现，从而也建立 了遗传多样性的时空结构。为了达到分离鉴定物种、种群或个体的目的，大量的 5 第一章：文献综述 分子生物学工具被用于实际研究。对于阐明某一物种的多学科定义和重建它的系 统发生历史来说，各种生物学理论和技术的多面结合是必不可少的。微生物资源 开发利用的前景非常广阔，从资源利用的角度出发，提出新思路，设计新的分离 程序。尽可能多地分离未知微生物，了解它们在海洋生态环境中的作用，是微生 物资源开发利用的重要前提和关键之一。 总体来说，我国对海洋微生物的研究目前还主要集中于浅海，虽然对深海微 生物的研究也有涉足，如2 0 世纪8 0 年代中期，在“南中国海中部环境和资源调查” 中，对该海区深达4 0 0 0 m 水柱中的异养细菌、放线菌和真菌的种类组成及分布特 征进行的研究；8 0 年代末开始的“太平洋中部多金属结核及其形成环境”的调查， 对大洋底部的铁细菌、锰细菌和硫酸盐还原菌的丰度和分布，以及它们对大洋多 金属结核形成的作用进行的研究。对南、北极的洋底微生物以及巴士海峡以东、 印尼伊里安岛以北的深海区水柱的细菌生态所开展的初步研究，但总体较为薄弱 【1 】【2 】【3 】【5 】o 而在8 0 年代以后，日本和欧美发达国家已开始并逐渐加强了对海洋微 生物的研究力度，现已形成研究热潮。 6 第一章：立献综述 1 2 浮霉菌概述 浮霉菌是总细菌分类上的一个主要分支形成一个独特的细菌门( 如图1 - 2 ) 。 浮霉菌具出芽生殖，缺少肽聚糖，是在微生物的进化、生态、细胞生物学、基因 组学上非常独特的一类微生物m 】叫唧【“q 。它们所显示的独特的特征t 如细胞 器的膜化、某些种属能在缺少氧气的情况下对氨进行氧化、拥有很大的基因组、 广泛的分布、参与海洋碳循环和氮循环等，都是非常有意思的研究领域。 m a e a 田l - z 可培莽细曹和浮i h i f t - 一1 0 m - ec q i 帅b 啦由- 叫用朋曲哪眦 1 2 1 浮霉菌的命名及分类 最早的浮霉菌被称为”p l 锄c t o m ”e s ”，是g i “”d1 9 2 4 年从h 岫9 4 r y 的池塘 里分离的纯菌p 口州n 口，j 肺蛳而命名的，p 口时f o 一口帆r 蝴是一种瞻形 第一章：女献综述 圈i o 分离的珊删，博如均哪g 电镛照片t 显示它独特的结构豆出芽生殖 f 蚪n 1 4 出c t - _ m i “舯p ho f l w h o kc e i j o f 州州m 邺k 岬，l o - g y c 憎k n 缸n ns i r u c l u r e o t h e i n 辨t b 删h 弘咖i o f 伍e 嘲l k t 枷j u n t 曲 ，h 衲g t h e 曲n r - 加no f e m i ls | m p k l k c c e d f r 0 u n h t h 时l k 成玫瑰环的浮霉菌( 如图l 3 和l _ 4 ) 。刚开始，g i m 嚣i 认为这种，胁恸r 蚓- f 船虹廓 是一种浮游真菌t 因此用”胸删，这个属名进行命名。这个类群的微生物同样也 被h e i i r i c i 和o h n n 于1 9 3 5 年在美国北部的一个湖泊中发现，被命名 为氇拓删打田k p ，泐”，不过h e c i 和j o h n s o n 都没有获得浮霉菌目的纯株。 第一章：文献综述 直到1 9 7 2 年才获得浮霉菌目的纯株，发现它们与以前报道的”妣“凰 s p h 醒r c 矿檑弱，因皿征忒愈笔为”8 i 口s l o e 锄l i ss p 妇e 如矿。 由于种种原因，这些早期被分离的菌株或是以后被分离的相似的菌株当时并 没有完全解决它们的命名问题，直到1 9 8 0 年，由s c h m i d t 和s t a r t 用电子显微镜证 实这些早期的菌株的确存在相似的细胞结构才被正式的解决【1 1 3 l 【1 1 5 】，随后根据从 其它环境如湖泊、土壤、海洋、淡水、盐湿地等环境中分离的纯株及用1 6 sr r n a 对环境样品的进化分析的结果，从而正式命名为浮霉菌目玎咖叼馏胁融0 。早 强甑浮霉菌黾吁l n n c | 0 稚秘e | o k 包括p 沁l m g 2 m m a p l o 琳l o 恻c e s 。 括口，p 而船r 口四个属1 1 2 0 】，根据从不同环境中分离出的代表纯菌株的特性，可以将早 期的四个属的定义归纳如表l l ： 表1 1 可培养砌埠c 细呻l c 呦f 四不同属的定义 1 a b l el 。lc h a 憎c t e r i s t i c sd i 概憎n t i a t i n gt h e 醇n e 魄o f 吨e o r d e r 用嬲删傀绷协 近些年随着浮霉菌新菌株的分离、纯菌株生理生化研究、代表菌株分子生物 学及基因组等相关研究的深入，极大的补充并修正了浮霉菌的分类工作【3 丌2 0 0 4 年，考虑到尸妇玩f ，口属之间1 6 sr r n a 基因之间的序列同源性差异太大，远远大 于通常认为的9 7 ；同时分离于淡水的斟傩 节妇胁妇，脚嵫畹肌f ，e 的二个代 表菌株也正在或已经完成基因组的测序工作，基于它们各自的特点及微生物分类 的基本准则，s c h l e s n e r 等人建议将p 抛地妇划分为三个属：尉嬲 叩如盯越，口， r 矗d 阳矿妇妇口和尸抛胁妇，现在也有人将这三个属统称为 尸抛如，口- 踟印妇妇珏鼬d p 叩触砌，口c l a d e ( 简称为p r b 大类) 。 厌氧氨氧化细菌( 矾a m m o xb a c t e r i a ) 是一类可以在厌氧的条件下直接将氨转 化为氮气( 锄栅m o xp r o c e s s e s ) 的细菌，现在所知道的所有的厌氧氨氧化细菌都 9 第一章：文献综述 属于浮霉菌。最先是s t r o u s 在g i s t b r o c a d e s 公司的污水处理器中发现c c 删抗切协 “b r o c a d i aa n a m m o x i d a n s ，菌，被命名为c c 硼删幻搬“b d 0 c a d i a ，属 1 2 l 】；随后德国和 瑞士几个污水处理厂的生物膜反应器中发现。谢f c 切淞“k u e n e i a 属的典型菌株 国，l 饿d 甜淞“k u e n e i as t u t t g a r t i e n s i s ，f 3 0 】【1 0 9 i 0 l i l 1l 】【l 1 2 1 ；s c h m i d 等在污水处理厂 ( w w t bw 弱t e w a t e rl r e a t m e n tp l a n t ) 中发现c m 西拟淞“s c a i i n d u ab r o d 勰”， c h 胛凼出m ，s c a i i n d u a w 她n e r i 具有厌氧氨氧化的能力，k u y p e r s 等在黑海的水柱 里发现了q ”砌出船s c a i i n d u as o r o k i n i i ，这三个菌株或克隆属于q 靴f f 如n 岱 c c s c a l i n d 属【7 7 】；2 0 0 7 年k a 渤l 等在德国的s b r 反应器态系统中发现另一厌氧 氨氧化细菌的新菌株，q m 诫如凇a n a m m o x o g l o b u sp r o p i o n i c u s ”，属于 c c m 出砌獬t a n a m m o x o g l o b u s ，属【7 l 】。 以上能培养的浮霉菌都属于异养型细菌，但是属于厌氧氨氧化细菌的一些则 属于化能自养型细菌。浮霉菌各个属各有特点，但同样也分布广泛。存在于各种 水体和沉积物、土壤环境及海洋环境中。其分类如下f 4 3 】： 浮霉菌门( p l 锄c t o m y c e t e s ) 浮霉菌纲( p i a n c t o m y c e t a l c i a ) 浮霉菌目( p i a n c t o m y c e 诅l e s ) 浮霉菌科( p l 孤c t o m y c e t a c e 神) 1 ( 占脚西譬玎“蛐玫瑰梨形属 2 ( g p 历m 胁) 出芽菌属 3 ( 函嘲妇嘲等球菌属 4 ( 尸抛，甜，口) 小梨形菌属 5 ( ，c f d 叨嬲) 浮霉菌属 6 ( r 幻却抛刀0 蛐红小梨形菌属 科未定( 均未能分离培养，为厌氧氨氧化菌舭a m n 的xb a c t e r a ) 7 ( 西醐酝口) 8 ( 缸肥，l p 一神 9 ( i s 妇加以啪 l o ( a n a m m o x o g l o b u s ) l o 第一章：文献综述 1 2 2 浮霉菌生理学特征 ( 1 ) 细胞壁的结构一般的细菌都具有包含肽聚糖作为其结构主要成份的细胞 壁，而只有浮霉菌和衣原体是例外。早在1 9 8 4 年，k 6 n i g 等就在几株浮霉菌的纯 菌中发现其缺少肽聚糖和拥有含有蛋白质的细胞壁【7 4 1 。这个结果后来也被相关 菌株如p 加肌妇 如r 砌和p 册c f o ，秽郴m 口廊的抗生素( 放线菌酮( d c y c l o s e r i n e ) ， 其主要是阻断肽聚糖的合成) 实验所证实。随后在包括g b 脚腕砌d 栅计衲6 淞 和幽印厅韶，口瑚胁出的浮霉菌中发现：这些菌株里缺少含有蛋白质的细胞壁【删； 另一个更具体的实验显示川删f r o 叼柳s 和p 触矾妇二个属的细胞壁上的蛋白富含 谷胺酸和半胱胺酸，这种具有二硫键的结构使得这种细胞壁具有对s o d i u m d o d e c y l s u l f ；i t e ( s d s ) 的抗性，而g p m 聊a r 口d 细愧洳6 淞的细胞壁则具有较低的半 胱胺酸。 ( 2 ) q u i n o n e 组成一个化学分类的标志，i s 0 p r e n o i dq u n i n em k 6 ，被发现伴随浮 霉菌的共发生【1 1 7 1 ，这种主要的i s o p r e n o i dq u i n n e 以前曾证明在革兰氏阴性细菌中 普遍存在：而另一种化学分类标志m e n a q u i n o n e 则存在其它的一些细菌的大类如： 点b 曲加f 如j ，0 ，f o 砷口g 口，月口v d 6 口c 胞，f 姗l 门甚至存在于古菌的部分科中，同时也存 在于浮霉菌中。 d ) d n a 的碱基含量浮霉菌的d n ag + c 含量大约是从5 1 7 l ，在伪m 船肠 d 6 j c 愧r d 6 琊和& 啦m 朋f f f 如及其近缘菌株的含量大于6 0 。对于大多数浮霉 菌而言，1 6 sr r n a 基因碱基的含量变化为5 3 5 7 。加妒砌p m 即历砌和其近缘菌 株的1 6 sr r n a 基因同源性最低可以到6 0 - 6 2 ，显示这个大类的细菌具有比其它 细菌更快的进化率。 ( 4 ) 脂质含量很多浮霉菌的属如尸艮聊啪叼柳f 和尸妇m f 口( 以前尸抛z f 妇称之为 “a 叫细”) 有独特的细菌型的醚连接的极性脂质，这种醚连接的极性脂质不同 于古菌的脂质【7 2 1 。早期对于浮霉菌的细胞脂肪酸的调查揭示了一些现象：一般 而言，棕榈酸( p a l m i t 0 i e i c i d s ) 和亚油酸( 0 1 6 i c i a s ) 更多的存在于真核微 生物中，而不是细菌；但奇怪的是，这些脂肪酸广泛的存在于浮霉菌中，虽然这 些也曾报道存在于其它细菌中。如1 8 碳的不饱和脂肪酸1 8 ：l 9 c 和1 8 ：l i l c 脂肪 酸被发现存在于纠册彻幔) w f 和尸触胁妇，同时也广泛存在于其它的细菌中。 a 枞菌株含有3 0 h n 1 8 ：o 脂肪酸，但缺少3 o h n 2 0 ：o ，这种特点是普遍存在 第一苹：文献综述 于浮霉菌中。其它科学家也在叔枇，口册胁砌中获得了3 o h 脂肪酸，但在 g p m 眦妇d 缸蝴6 淞的分离却没有获得成功4 4 1 。对于磷脂的存在也被报道于少 数的一些浮霉菌的菌株中，磷脂的有无可以反应出相关细菌的进化关系，当然这 种分子标记在一些属中具有一定的局限性。 最出名的是”i a d d e r a n e ”脂质( 醚状脂质) ，这种醚状脂质发现于化能异养的 厌氧氨氧化细菌( 扑a m m o x r e i a t e d 尸矾c f d 叨忧姗) ，如q 耽如胁淞“b r o c a d i a a n a m m o x i d a n s ”。这种脂质由一系列的环丁烷构成，出现在细胞器“厌氧氨氧化体” 的膜上，在这种膜的上面同时包含执行厌氧氨氧化过程的关键的酶。这种酯质由 于其致密性，可以保护细胞不受到在厌氧氨氧化过程中的一个有毒性的中间产生 肼( n 2 h 4 ) 的毒害。类似的这种梯状脂质虽然也存在于古菌中，但厌氧氨氧化 细菌的醚状脂质却是自然界中发现的唯一以四碳环所组成的脂质，因而这种特殊 的醚状脂质也成为鉴定厌氧氨氧化细菌最为独特的、最有效的生物标记之一【5 引。 ( 5 ) 多聚氨基酸组成像磷脂一样，多聚氨基酸也是一种重要的化学分类分子标 记，并且常常可以到鉴定到种的水平。除p 肠那幻，妒w 疗，疗唧翮协及其近缘种外， 所有经过分析的浮霉菌都含有大量的多聚氨基酸如多聚亚精氨酸 ( s y m h o m o s p e r m i d i n e ) ，它是以腐胺( p u t r 嚣c i n e ) 作为多聚氨基酸的主要成分。 这些以腐胺和亚精氨酸为组成的多聚氨基酸，也可以准确的反应浮霉菌的进化多 样性【5 9 】【8 l l 。 1 2 3 浮霉菌膜结合核酸的细胞生物学 所有的浮霉菌都有共同的一个特点，就是含有内部的“细胞器” ( c o m p a r t m e n t ) 。但对于不同的属，“细胞器”的具有不同的变化特点。这些“细 胞器”也只有通过c 叫o s u b s t i t u t i o n 或f r e e z e f 那t u r e 等技术才可以看得清楚，而在 超薄切片技术之前的化学固定技术无法达到这种效果。通过c r y o s u b s t i t u t i o n 或 f r e e z e f 孤t u r e 技术，我们可以很清楚的看到通过细胞内膜( i n t r y t o p l 签m i c m e m b c 抓e ，i c m ) 将细胞分为不同的部分【2 6 1 。如存在于尸泗胁妇和刷西 叩妇z ，出 的细菌的一种特殊的“细胞器”，叫p i r e l i u l a s 0 m