（微生物学专业论文）taq+dna聚合酶的定点诱变及保真度研究.pdf

华中农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 摘要 酶体外定向进化 i nv i t r od i r e c t e de n z y m ee v o l u t i o n 是近几年发展起来的一项 新技术 已广泛成功用于酶的体外定向改良 目前用于该领域的技术主要是易错 p c r 和基于同源重组的d n as h u f f l i n g 其核心都是基于p c r 过程的体外诱变最终 实现分子的多样性 程序的复杂性使应用受到一定限制 为使这一技术更加简单易 行 试图通过降低t a qd n a 聚合酶的保真度 使其适合于p c r 程序的直接基因诱 变 本研究根据t a qd n a 聚合酶结构与功能信息以及前人对该酶的研究基础 对 t a qd n a 聚合酶基因进行了定点诱变和保真度研究 并利用构建的低保真t a qd n a 聚合酶对人们关注的纤维素酶进行了体外进化 取得以下结果 l 通过长引物扩增策略将t a qd n a 聚合酶的6 6 1 位点密码子g c g 变为c a c 导致6 6 1 的缬氨酸变为组氨酸 获得突变体t a q v 6 6 1 h 并用g f p 作为模板通过 p c r 产物的克隆和序列测定分析了该突变体的保真度 结果表明 t a q v 6 6 1 h 的总 突变率为0 1 2 2 突变频率比野生型提高6 倍 有意思的是 9 5 的碱基突变发生 在a t 碱基 其中 a 变为g 占总突变频率的4 8 这一现象揭示了v 6 6 1 h 位点 不仅降低了t a q d n a 聚合酶的保真度而且与碱基突变选择性有关 这一新的发现不 仅为酶蛋白结构和功能关系的研究提供了新的信息 也为其进一步应用奠定了基 础 2 通过定点诱变将6 6 6 位密码子c a a 变为c g c 导致谷氨酰胺变为精氨酸 获得突变体t a q n 6 6 6 r 同样利用g f p 作为模板分析了t a q n 6 6 6 r 的保真度 结 果表明 总突变频率为0 0 4 2 发现该突变株对不同碱基之间突变频率也有明显差 异 其中 t 变为c 占总突变频率的4 2 这一突变特性为进一步研究t a qd n a 聚合酶的碱基突变选择性提供了新的线索 3 同样方法通过定点诱变技术将t a qd n a 聚合酶的6 6 4 位点的a c c 密码子 变为c g c 使苏氨酸变为精氨酸 获得了突变体t a q t 6 6 4 r 使用该突变酶进行 p c r 扩增 分析了t a q t 6 6 4 r 对g f p 基因碱基突变频率的影响 结果表明 碱基 总突变率为0 9 9 突变频率比野生型增加了9 9 倍 发现a 和t 转换为其它碱基 的比率占9 5 而t 转换为c 和a 转换为g 的频率分别占18 和4 2 在蛋白质 水平上 氨基酸突变率为2 3 碱基的定向富集导致带电荷氨基酸大幅度增加 这 一现象可能对热稳定性酶的体外进化有着重要的意义 t a qd n a 聚合酶的定点诱变及保真度研究 4 为了验证低保真度酶t a q t 6 6 4 r 在体外分子进化的实用性 本研究选择在 木质纤维素降解过程中起关键作用的纤维素内切酶作为目标分子 利用突变体t a q t 6 6 4 r 对该酶进行了体外诱变 筛选获得一个高活性突变株 相对活性是野生型的 1 8 倍 关键词 定点诱变 t a qd n a 聚合酶突变体 酶体外定向进化 纤维素内切酶 i i 华中农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 a b s t r a c t nv i t r od i r e c t e de n z y m ee v o l u t i o ni san e wt e c h n o l o g yw h i c hd e v e l o p si nr e c e n ty e a r s i th a s w i d e l ys u c c e e d e du s e di nt h e nv i t r od i r e c t e di m p r o v e m e n to fe n z y m e t o d a y e a s yw r o n gp c ra n d d n as h u f f l i n gw h i c hb a s e do nh o m o l o g o u sr e o r g a n i z a t i o na r et h em a i nt e c h n o l o g i e su s e di nt h i s d o m a i n h o w e v e r t h ec o r eo ft h e s et e c h n o l o g i e sa r ei nv i t r om u t a g e n e s i sw h i c hb a s e do np c rp r o c e s s a n de v e n t u a l l yr e a l i z e st h em o l e c u l a rm u l t i p l i c i t y b u tt h ep r o c e d u r ec o m p l e x i t yc a u s e st h el i m i t e d a p p l i c a t i o n i no r d e rt om a k et h i st e c h n o l o g yt ob es i m p l ea n dp r a c t i c a l a t t e m p t st or e d u c et h ef i d e l i t y o ft a qd n ap o l y m e r a s ea n df u r t h e rm a k ei tm o r ea d a p t a b l ef o rt h ep c rp r o c e d u r eo fd i r e c t e d g e n e t i cm u t a g e n e s i s a c c o r d i n gt ot h es t r u c t u r ea n dt h ef u n c t i o ni n f o r m a t i o no ft a qd n ap o l y m e r a s e a n do t h e rr e s e a r c hf o u n d a t i o no ft h i se n z y m e t h i sr e s e a r c hc a r d e do ns i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i sa n d t h ef i d e l i t yr e s e a r c ht ot a qd n ap o l y m e r a s e a n dt h e nb yu s i n gt h el o wf i d e l i t yt a qd n a p o l y m e r a s e c o n s t r u c t e db e f o r e p r o c e e d e dt h ei nv i t r oe v o l u t i o no fc e l l u l a s ew h i c hi so fw i d e l yc o n c e r na tp r e s e n t a n do b t a i n e dr e s u l t sa sf o l l o w i n g 1 t h r o u g hl o n gp r i m e ra m p l i f i c a t i o ns t r a t e g yt ot u r nc o d o na c c t oc o d o nc g ca tt 6 6 4s p o to f t a qd n ap o l y m e r a s e c a u s e st h et r a n s i to ft h r e o n i n et oa r g i n i n e a n do b t a i n st a qt 6 6 4 r m u t a n t a n dt a k eg f pa st h et e m p l a t e a n a l y z e dt h ef i d e l i t yo ft h i sm u t a n tt h r o u g hp c rp r o d u c tc l o n e a n dt h es e q u e n c ed e t e r m i n a t i o n t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a t t h et o t a lm u t a t i o nr a t eo ft a q v 6 61hi s 0 1 2 2 m u t a t i o nf r e q u e n c ye n h a n c e m e n t6t i m e sc o m p a r e dt ot h ew i l dt y p e i n t e r e s t i n gi s 9 5 b a s e m u t a t i o no c c u r si na tb a s e a n da m o n gt h e m m u t a n tf r e q u e n c yo fat oga c c o u n tf o r4 8 o ft o t a l m u t a n tf r e q u e n c y t h i sp h e n o m e n o ni n d i c a t e dt h a tt h ev 6 6 1 hs p o ti sn o to n l yi n v o l v e dw i t hr e d u c i n g t h ef i d e l i t yo ft a qd n ap o l y m e r a s e b u ta l s or e l a t e dt ot h es e l e c t i v i t yo fb a s em u t a n t t h i sn e w d i s c o v e r yh a sp r o v i d e dn e wi n f o r m a t i o nf o rt h es t r u c t u r ea n dt h ef u n c t i o nr e l a t i o n so ft a qd n a p o l y m e r a s e m e a n w h i l e l a i dt h ef o u n d a t i o nf o ri t sf u r t h e ra p p l i c a t i o n s 2 t u r nc o d o nc a at oc o d o nc g ca t6 6 6s p o tt h r o u g hs i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s c a u s e s c o n v e r s i o no fg l u t a m i n et oa r g i n i n e a n do b t a i n st a q n 6 6 6 r m u t a n t s i m i l a r l y a n a l y z e dt h ef i d e l i t yo f t a q n 6 6 6 rb yt a k i n gg f pa st h et e m p l a t e t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt o t a lm u t a n tf r e q u e n c yi s0 0 4 2 a n dd i s c o v e r e dt h em u t a n tf r e q u e n c yo ft h i sm u t a n th a so b v i o u sd i f f e r e n c et od i f f e r e n tb a s e a m o n g t h e m m u t a n tf r e q u e n c yo ftt oca c c o u n tf o r4 2 o ft o t a lm u t a n tf r e q u e n c y t h i sm u t a n t c h a r a c t e r i s t i cp r o v i d en e wc l u ef o rf u r t h e rr e s e a r c ho ft h eb a s em u t a n ts e l e c t i v i t yo ft a qd n a i i i t a qd n a 聚合酶的定点诱变及保真度研究 p o l y m e r a s e 3 t u r nc o d o na c ct oc o d o nc g ca t6 6 4s p o to ft a qd n ap o l y m e r a s et h r o u g hs i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s c a u s e dt h r e o n i n et ob e c o m ea r g i n i n ea n dh a so b t a i n e dt a q t 6 6 4 rm u t a n t u s e dt h i s m u t a n te n z y m et oc a r r yo np c ra m p l i f i c a t i o n a n a l y z e dt h ei n f l u e n c eo ft a q t 6 6 4 rt ot h em u t a n t f r e q u e n c yo fg f pb a s e t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a t t h et o t a lr a t eo f b a s em u t a t i o ni s0 9 9 t h em u t a n t f r e q u e n c yi n c r e a s e d9 9t i m e sc o m p a r e dt ow i l dt y p e a n dd i s c o v e r e dt h er a t i oo faa n dtt r a n s f o r m f o ro t h e rb a s ea c c o u n tf o r9 5 a n dt h er a t i oo ftt r a n s f o r n lf o rca n dat r a n s f o r n af o rga c c o u n tf o r 18 a n d4 2 r e s p e c t i v e l y i nt h ep r o t e i nl e v e l t h er a t eo fa m i n oa c i dm u t a t i o ni s2 3 t h eb a s e d i r e c t e dc o n c e n t r a t i o nc a u s e sl a r g e l yi n c r e a s eo fc h a r g e da m i n oa c i d a n dt h i sp h e n o m e n o np o s s i b l y h a sv i t a ls i g n i f i c a n c et ot h ei nv i t r oe v o l u t i o no ft h e r m o s t a b i l i t ye n z y m e 4 i no r d e rt oe n s u r et h eu s a b i l i t yo fl o w f i d e l i t ye n z y m et a q t 6 6 4 ri nt h ei nv i t r oe v o l u t i o n t h i s r e s e a r c ht o o ke n d o c e l l u l a s e w h i c hp l a ya ni m p o r t a n tr o l ef o rl i g n o c e l l u l o s e sd e g e n e r a t i o np r o c e s s a st h et a r g e t c a r r i e do n nv i t r om u t a g e n e s i sb yu s i n gt a q t 6 6 4 rm u t a n t a n do b t a i n e do n e h i g h a c t i v i t ym u t a n tb ys e l e c t i o n i t sr e l a t i v ea c t i v i t yw a s1 8t i m e so f w i l dt y p e k e yw o r d s s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s nv i t r od i r e c t e de n z y m ee v o l u t i o n t a qd n ap o l y m e r a s e m u t a n t 1 4 一e n d o c e l l u l a s e i v 华中农业大学2 0 0 8 届硕上毕业论文 缩略语表 v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 冰 如需保密 解密时间年 月日 是否保密p o 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果 也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料 指导教师对此进行了审定 与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明 并表示了谢意 研究生鲐刨鼎一一 帆彻g 年多月 z 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存 使用学位论文的规定 即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本 学校有权保存提交论文的印刷版和电子版 并提供目录检索和阅览服务 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位 论文 本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表 传播学位论文的全 部或部分内容 并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 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机诱变 重组 产生分子多样性文库 并根据欲达目标进行定向筛选 从而使某一 目标基因在自然界中可能需上万年的漫长进化过程有可能在几星期或几个月时间 内完成 酶分子体外定向进化丰富和发展了蛋白质工程的研究和应用 因此 也被称为 新一代蛋白质工程 为酶结构和功能研究以及生物技术产业提供了一个新的技术平 台 已广泛应用于工业 农业和医药等领域 并彰显出巨大的潜在生命力 c r a m e f ie t a 1 1 9 9 8 y o ue ta 1 1 9 9 6 s t e m m e r 1 9 9 4 a m s t u t ze ta 1 2 0 0 1 y a n oe ta 1 2 0 0 1 酶 体外定向进化包括两个关键步骤 一是d n a 分子的多样性文库的构建 二是根据 不同靶标分子的定向筛选 以下针对目前研究进展对这两个方面予以综述 t a qd n a 聚合酶的定点诱变及保真度研究 1 随机诱变技术 易错p c r e r r o rp r o n ep c r 是一种早期开发的随机诱变技术 主要原理是根 据t a qd n a 聚合酶缺乏3 5 校正活性的特点 用二价m n 离子替代二价m g 离子 或用非平衡d n t p 作为底物使p c r 过程中引起碱基错配导致p c r 产物发生随机突 变 l u t ze t a l 2 0 0 1 m o o r ea n da r n o l d 1 9 9 6 通常 这一技术的突变频率在o 2 0 8 之间 一般情况下 适宜的碱基突变频率与所达到的目标直接相关 如果突变频率 太高则负向突变克隆子增多 突变率太低 变库的多样性受限 会导致大量野生型 存在而增加筛选劳动强度 因此 选择合适的突变频率是实验成功与否的第一步 当然 碱基突变频率与目标基因的长度和实验目的有关 对于l k b 的d n a 序列来 说 碱基突变频率应控制在o 8 以下 m o o r ea n d a r n o l d 1 9 9 6 如果是研究某个氨 基酸残基变化对功能的影响 就应该降低突变频率 如果筛选方法非常直接有效 即在平皿上可直接观察被进化基因的表型 可适当提高突变频率 甚至经多轮p c r 诱变后再进行克隆筛选 c h e ne ta 1 1 9 9 1 使某一优良性状不断集加最终达到改良 的目的 c h e n c h e ne ta 1 1 9 9 3 等人用此法获得的枯草杆菌蛋白酶e 在非水相溶 液中具有催化能力 其活性是野生酶的1 3 l 倍 易错p c r 具有操作简便的特点 很多人将该技术与其它定向进化技术结合使 用 首先从点突变中筛选有用克隆 淘汰负突变 然后再用于其它技术 如d n a s h u 筒i n g 使d n a 分子进一步进化 2 基于序列同源性的重组技术 同源重组是生物在生存过程中为适应环境而普遍存在的一种生物学现象 主要 通过重组增加群体基因多样性及修复损伤基因而使物种得以延续和进化 遗传学证 据表明 点突变对改变酶的性质是一个渐变的过程 因此 通过随机诱变的方法很 难使有益片段组合 利用同源重组方法克服随机诱变方法的弊端使体外定向进化技 术又向前推进了一步 2 1d n a s h u f f l i n g d n as h u f f l i n g 又叫有性p c r 由s t e m m e r s t e m m e r 1 9 9 4 a 于1 9 9 4 年根据 d n a 同源重组原理率先提出 该实验首先利用t a qd n a 聚合酶的低保真度对d 内 酞胺酶进行了扩增 筛选出高活性突变体 然后进行了d n as h u f f l i n g 最后使酶活 2 华中农业大学2 0 0 8 届项 毕n 论文 性比野生型提高3 2 0 0 0 倍 该技术的最大优点是通过d n as h u f f i i n g 将有益突变基 因重新优化组合 该技术的核心是将相关基因用d n a s ei 水解成大小不一的d n a 片段 在无引物 的情况下 片段之间依靠它们同源配对相互结合发生自引导d n a 合成 这种现象 来自成千上万个分子间的随机组合 再加入两端特异性引物 便可合成全长的基因 形成一个庞大的随机突变文库 见图1 s t e m m e r w p n a t u r e1 9 9 4 图1 d n a 改组程序图 f i g 1d n as h u f f l i n g m e t h d o l o g 在单基因情况下 通常对该基因先进行随机点突变获得多个改良基因后 再进 行上述过程 最终实现由不同位点所致优良性状的集加 在无引物p c r 过程中 由于小片段配对偶尔会发生错误 使得突变形式多样化 包括缺失 插入等 这些 突变形式是常规诱变技术无法实现的 z h a oa n da r n o l d 1 9 9 7 a 再者 由于同源片 段之间是随机的 因此其重组位点是非特异的 但又由于d n a s el 具有偏爱切割嘧 啶核苷邻近位点的性质 从而可能会出现重组片段的不均一性 如果某一基因在不 同物种间的进化具有很高的序列保守性 且其生物学属性也有差异 就可以将这些 基因放到一起进行重新组装 于是 四年后s t e m m e t 等人 s t e m m e re ta l 1 9 9 8 璺旦坠塞量竺塑里皇塑 墨堡壅墨旦茎 提出了家族d n a 改组 d n a f a m i l ys h u 塌i n g 即利用来自相同或不同生物物种的 同源序列作为起始模板 进行d n a 改组的设想 见图2 r a j e l l u l i o nj 黧 撩 1 一 s p e c i e s4 d n a s h u f f i i n g s t e m m e r w p n a t u r e1 9 9 8 图2 家族d n a 改组图示 f i g 2d n a r a m n ys h u f f l i n g s t e m m e r 等人分别对来源于四种细菌的头孢霉素酶基因进行单基因d n a 改组 及家族d n a 改组 获得酶活性提高5 4 0 倍的重组体 而单基因d n a 改组仪获得酶 活性提高8 倍的重组体 表明家族d n a 改组比单基因d n a 改组更为有效 但家族 d n a 改组也存在局限性 通常对同源性低于8 0 的序列效率很低 d n a 改组技术 除了运用于单基因和基因家族的定向进化外 还能用于对整个操纵子甚至基因组的 进化 c r a m e r i 等 c r a m e r ie ta l 1 9 9 7 对负责砷盐解毒途径的操纵子进行了d n a 改组 其功能得到显著提高 2 2 交错延伸技术 交错延伸技术 s 缸g g e r e de x t e n t i o n p r o c e s s s t e p 由z h a o z h a oa n d a r n o l d 1 9 9 7 b c r a m e r ie la l 1 9 9 7 等人提出的一种d n a 改组简化技术 原理是在p c r 反应系统 中 将含不同点突变的d n a 混合 进行多轮变性 复性和延伸 在每一轮p c r 循 环中 那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸 最终 华中农 大学2 0 0 8 膈剐十毕业论史 使大多数p c r 产物序列含有不同亲本的序列信息 z h a o 等 z h a oe ta i 1 9 9 8 币 用该技术获得了热稳定性比出发菌株高1 7 的突变体 与d n a 改组技术相比 s t e p 程序更简单 是一种基于高度同源性的d n a 改组方法 见图3 图3 交错延伸技术 s t e p f i g 3d i r e c t e de v o l u t i o no f t h e r m o st a b l ee s t e r a s e s 2 3 体外随机引发重组 a r n o l d 等 s h a oe ta l 1 9 9 8 提出了一种体外随机引发重组 r a n d o m p r i m i n g nv i t r or e c o m b i n a t i o n r p r 方法 这种方法用一套随机引物来引导产生大量互补 模板不同位点的短片段 由于碱基的错配和错误引导 在p c r 反应中 片段之间 可以相互同源引导和重组 重新组装成全长基因 图4 与d n a 改组相比 r p r 有以下优点 其一 r p r 能以单链多聚核苷酸为模板 可使突变和重组发生在以单链d n a 为模板的p c r 过程 也可直接用于m r n a 为 模板的逆转录p c r 诱变过程 其二 d n a 改组利用d n a s e i 随机切割双链d n a d n a 片段必须通过纯化过程 以免d n a s ei 的污染 而r p r 技术无需此过程 除 t a qd n a 聚合酶的定点诱变及保真度研究 此之外 由于d n a s ei 切割双链d n a 偏爱嘧啶核苷酸邻近的位点的特性会使突变 随机性降低 如果r p r 技术所用随机引物长度一致则不会发生类似现象 同时 该技术不受d n a 模板的长度限制也是其中一大优点 图4 体外随机引发重组 f i g 4r a n d o m p r i m i n g nv i t r or e c o m b i n a t i o n 2 4 临时模板随机嵌合 临时模板随机嵌合 r a n d o mc h i m e r a g e n e s i so nt r a n s i e n tt e m p l a t e s r a c h i t t 技术与d n a 改组技术的不同是 它不需要热循环 链转移或交错延伸反应 而是 将随机切割的d n a 杂交到含有u 的同家族d n a 的临时模板上进行重新排序 通 过空隙填补和连接等形成新链 再降解临时模板 获得随机诱变基因文库 图5 c o c o 等 c o c oe ta 1 2 0 0 1 利用该法构建了二苯并噻吩单加氧酶的嵌合突变体库 首先在制备单链过程中掺入尿嘧啶作为临时模板 用d n a s e i 将目标基因水解成小 片段后作为临时模板杂交 再由t a qd n a 聚合酶和p md n a 聚合酶的内切酶活性 对小片段中5 及3 末端没有和模板杂交的部分进行剪切及缺口填平等过程 形成多 样性的嵌合d n a 分子 新d n a 链生成后 用尿嘧啶d n a 糖苷酶将临时模板降解 形成单链d n a 分子 再通过p c r 扩增 获得双链d n a 供克隆建库 该法的优点 是分子间的交叉突变频率高 使分子多样性远高于d n a 改组技术 6 华中农 大学2 0 0 8 届顾十毕业论立 暑 一 l 一一 厶 孽d i g e s ta n dt i l ll g a p s 善d i g e s t t r a n s i en t t e f l lp l a t ea n dpcr i c o c o h m e ta 1 n a t b i o t e c h n 0 1 t 9 3 5 42 0 0 1 图5 临时模板随机嵌合技术 r a c h i t t f i g 5r a n d o mc h i m e r a g e n e s i so at r a n s i e n tt e m p l a t e s 2 5 酵母重组增强组合文库 酵母重组增强组合文库 c o m b i n a t o r i a ll i b r a r i e se n h a n c e db yr e c o m b i n a t i o ni n y e a s t c l e y r 是一种将d n a 改组与酵母体内同源重组结合的一种方法 特别针 对一些基因在细菌中表达产物缺乏修饰而无生物活性的问题而设计 其过程主要是 将改组后的基因与线性化的酵母表达载体共转化酵母细胞 然后 在酵母细胞内发 生重组 对重组子进行功能筛选 t r u a n 等人 b e c a s s i se t a l 2 0 0 0 用该技术重组了 人细胞色素p 4 5 0 1 a 1 和i a 2 该方法为真核d n a 改组提供了新的工具 2 6 简并寡核苷酸基因改组 d n a 改组一般适用于同源性高于8 0 的基因 然而 自然界中大量的基因同 源性远低于8 0 使得已有d n a 改组方法的应用受到限制 于是g i b b s 等 g i i b se t a l 2 0 0 1 设计了一种能用于基因同源性较低的一类基因的改组方法 简并寡核 苷酸改组 d e g e n e r a t e o l i g o n u c l e o t i d e g e n es h u f f l i n g d o g s 利用该法对1 1 个木 聚糖酶基因进行改组 用c o d e h o p 法 o s t e m e i e re ta l 1 9 9 9 根据所有基因的 旦 皇墨量堕塑塞皇堡壅墨堡墨丝 些 保守序列设计简并引物 用p i l l 聚合酶扩增每个基因 用p c r 产物重叠延伸获得不 同杂合d n a 分子 最后用基因末端侧翼引物进行巢式p c r 扩增 便可获得全长杂 合基因 3 非同源性重组技术 3 1 非同源重组技术 d n a 改组及其衍生的技术已成为体外定向进化的强有力的工具 但这些技术都 是建立在同源重组的基础上 在应用方面受到了局限 因此 近年来又开发了基于 非同源重组进行基因改组的技术 g i b b se ta l 2 0 0 1 j o s h u a 等人提出了非同源性 重组法 n o n h o m o l o g o u sr a n d o mr e c o m b i n a t i o n n r r 将不同的非同源的d n a 分 子用d n a s e l 处理 产生大小不一的片段 再用d n a 聚合酶使片段变成平端 在平 端中加入发卡结构人工接头进行连接 形成一定长度的带有发卡结构的d n a 杂合 分子 用酶切除发 结构 再根据人工接头设计引物进行p c r 扩增 构建非同源 片段随机组合的完变文库 这样的文库由于来自非同源序列 一大部分可能没有活 性 因此 需要具备很好的功能筛选方法 j o s h u a a n a t u r e b i o t e c h n o l o g y 2 0 1 0 2 4 1 0 2 9 2 0 0 2 图6 非同源重组示意图 f i g 6n o n h o m o l o g o u sr a n d o mr e c o m b i n a t i o n 华中农业人学2 0 0 8 届硕士毕业论文 3 2 渐进切割 b e n k o v i c o s t e m e i e re ta 1 1 9 9 9 等人建立了渐进切割产生杂合酶 i n c r e m e n t a l t u r n c a t i o nf o rt h ec r e a t i o no f h y b r i de n z y m e s i t c h y 技术 该技术是利用核酸外切 酶i i i 通过对两种基因进行切割 控制时间或酶量 获得一系列仅有一个碱基缺失 的d n a 片段 然后将其中一个基因的5 一随机片段与另一个基因的3 一片段随机连 接产生杂合基因库 该技术可适用于结构域交换杂合子的操作 也可用于结构与功 能关系研究 i t c h y 法操作比较麻烦 l u t z 等人 l u t ze ta 1 2 0 0 1 对此法进行了 修饰 提出了t h i o i t c h y 方法 原理是将两基因串联在同一载体上 再通过p c r 延伸 酶切 连接以便产生随机突变文库 3 3s h i p r e c 技术 上述i t c h y 技术可以不依赖于序列同源性进行重组 其原理是一个随机片段 与另一个随机长度片段相融合 重组主要发生在结构不相关的位点 因而突变库中 杂合子的比率很低 要想提高功能性杂合子的比例需将融合发生在结构相似的部 位 如果没有足够的相似性 同源重组就不能发生 因此 s i e b e r 等 s i e b e re ta 1 2 0 0 1 提出不依赖序列同源性的蛋白质重组 s e q u e n c eh o m o l o g yi n d e p e n d e n tp r o t e i n r e c o m b i n a t i o n s h i p r e c 方法 该方法的原理是 先用含限制性内切酶切割位点 的人工接头将两个待杂合的基因连接成一个基因二聚体 然后用d n a s ei 处理成大 小不一的片段 经s l 酶或t 4 聚合酶产生平端并环化 最后用限制性d n a s ei 内切 酶水解环化的d n a 的接头区 从而产生杂合基因突变库 3 4 随机多重组p c r i t c h y 技术是一种非同源重组的d n a 改组方法 但一次实验只能用于两种结 构基因 d n a 片段端点拥有限制性酶切位点的d n a 片段能用于构建杂合d n a 文 库 问题在于片段之间连接处是人为的几种相同的氨基酸残基可能会对蛋白质的功 能产生影响 c h oe ta 1 2 0 0 0 因此 t s u j i 等人 t s u j ie ta 1 2 0 0 1 建立了一种通过p c r 对多个非同源d n a 片段进行改组的方法 即多重组p c r m u l t i r e c o m b i n a n tp c r r m p c r 该法是 将不同的d n a 片段进行随机平端连接 p c r 扩增产生二聚体 连接成不同长度的 d n a 分子 电泳回收所需长度片段 根据序列之间的重叠实现片段间的拼接 产 生时间重组文库 9 t a q d n a 聚合酶的定点诱变 保真度研究 3 5 改变d n a 长度的随机突变 根据p c r 方法 人们可以通过引物设计很容易地实现碱基的掺入和缺失 d i e f f e n b a e he ta l 2 0 0 4 预先设计两对引物 分成两个p c r 反应系统 然后将 两个系统的p c r 产物混和在一起 在无引物的情况下 进行自引发扩增 也可在 第二论p c r 系统中加入特异引物 最终获得掺入或缺失突变的d n a 片段 见图7 t g 电堡e c q r o r 图7 改变d n a 长度的随机突变 f i g 7 r a n d o m m u t a t i o nb yc h a n g e s i n t h e l e n g t ho f d n a 而这种突变方法只能以一种预定的方式发生 p i k k e m a a t 等人 p j k k e m a a ta n d j a n s s e n 为了实现随机d n a 片段缺失和重组 建立了一种随机重复或缺失的方法 该方法经质粒载体线性化后 将同一基因的3 端和5 端分别用核酸外切酶b a l 3 1 逐步酶解 切除片段的质粒载体部分 产生两组3 和5 端截短的基因片段 随 后将两组随机长度d n a 片段进行连接 在融合点上产生了d n a 片段的重复或缺失 该法通过控制b a l 一3 1 的酶量和酶解时间 很容易控制片段的大小 通过片段大小 控制突变发生的区域 3 6 随机插入 缺失突变 以p c r 方法为基础产生的随机点突变通常只能发生在一个或两个位点 如果 棚 rcp g汀 牛中 n 大学2 0 0 8 居砸十毕业论z 引入多个位点就会受到限制 为克服这一限制 m u r k a r n a i 等人 m u r a k m itl 2 0 0 2 提出了一种在基因全长范围内的随机位点突变方法 称为随机插入和缺失突变 r a n d o mi n s e r t i o na n dd e l e t i o n r i d 该方法可产生多个碱基的缺失及特定序列的 随机插入 并可引入任何碱基 这一方法可j 日于蛋白质结构与功能的研究 3 7 叠加饱和诱变 当通过随机诱变或通过结构与功能研究获知蛋白质某一些位点氨基酸残基对 功能产生影响时 人们希望每一位点在功能上都能发挥其最大作用 为能达到这一 目的 晟近r e e t z 等人 r e e t ze ta l 2 0 0 7 设计了叠加饱和诱变 1 t e r a t i v es a t u r a t i o n m u t a g e n e s i s i s m 方法 该方法主要是在通过实验或通过计算机模拟获得某些位 点信息的基础上 首先对每个在功能上有贡献的单个氨基酸残基进行饱和诱变 找 出其它1 9 种氨基酸中对功能影响是大的氨基酸残基所对应的密码予 选择其中一 个为模板a 将第二个位点编码贡献最大的氨基酸残基密码子与模板a 第一个最优 密码子进行组合 称为模板b 然后再将第三个最优密码子与模板b 组合 依此类 推 最终将所有优质密码子组合在一起 在功能上产生叠加效应 r e d z 等人利用 该技术增加了枯草芽孢杆菌脂酶的热稳定性 r e e t z m t n a t u r e2 8 9 1 9 0 3 2 0 0 7 图8 叠加饱和诱变 f