（有机化学专业论文）l谷氨酸合成新工艺研究.pdf

硕士学位论文 摘要 l 谷氨酸是一重要的化合物 主要用发酵法生产 玉米 小麦 甘薯 大米 甘蔗糖蜜 甜菜糖蜜等是发酵生产谷氨酸的淀粉质主要原料 原料的选择往往依 耐于当地的资源状况和经济效益 我国南方省份主要以大米直接糖化生产谷氨酸 但近年来随着大米价格不断上涨 谷氨酸生产成本不断升高 提高技术水平 降 低生产成本 提高劳动生产率是以大米为原料的湖南谷氨酸生产企业的当务之急 因此 本文根据湖南的实际情况 依托湖南省教育厅研究课题 0 5 d 0 3 2 利用陈 粮丈米为原料生产谷氨酸 为大米的综合利用开辟了一条新途经 本论文研究了用陈粮大米双酶法糖化液发酵生产谷氨酸的新工艺 主要取得了 以下三个方面的结果 第一 研究了使用大米作为原料 经水解制糖 微生物发酵后提取谷氨酸的 合成工艺流程 确保其主要经济技术指标分别达到 糖化收率9 5 9 8 发酵转化 率5 5 5 6 产酸率9 7 1 0 3 完全可以满足谷氨酸发酵 同时对制糖中分 离出的大米蛋白进行综合利用 制成大米蛋白粉 从而降低谷氨酸的生产成本 第二 通过确定陈粮大米双酶法糖化的工艺参数 使其液化 糖化便于控制 糖化液可直接用于中糖发酵或高糖流加发酵 本文确定的陈粮大米双酶法糖化工 艺参数为 液化p h 5 8 6 0 g t 一淀粉酶l o 1 2 u g 干物质 1 0 6 1 0 9 维持5 8 m i n 闪冷到9 5 9 7 保持9 0 1 2 0 m i n 糖化p h 4 2 4 4 糖化酶1 0 0 1 2 0 u g 干物 质 温度6 0 2 时间2 8 3 2 h 第三 拓展了谷氨酸生产过程中的发酵废液的综合利用 本文采用谷氨酸生产 中等电后的上清液发酵生产细菌纤维素 其发酵工艺参数是 糖化液3 0 接种 量2 4 温度2 8 3 2 发酵起始p h 3 6 3 9 静置发酵时 培养基的深度 为o 8 2 0 c m 发酵时间8 1 0 天 利用谷氨酸提取中的上清液发酵生产细菌纤 维素 同目前一般使用椰子水和蔗糖生产细菌纤维素相比 其成本仅为3 0 同 时 大大减少了发酵废液的排放污染 具有良好的经济效益及环保价值 关键词 l 谷氨酸 陈粮大米 双酶法糖化 发酵 工艺参数 i i l 一谷氨酸合成新工艺研究 a b s t r a c t l g l u t a m i ca c i di sak i n d o fi m p o r t a n tc h e m i c a lc o m p o u n d w h i c hi sm a i n l y p r o d u c e db yf e r m e n tm e t h o df r o mm a i z e w h e a t s w e e tp o t a t o r i c e s u g a rm o l a s s e s b e e tm o l a s s e s t h es e l e c t i o no fr a wm a t e r i a li su s u a l l yd e p e n d e n to nt h er e s o u r c ec o n d i t i o n sa n d e c o n o m i cr e t u r n s p r o v i n c e si ns o u t hc h i n am a i n l yu s er i c et op r o d u c eg l u t a m i ca c i d u n f o r t u n a t e l yt h ep r i c eo f r i c ei so nt h er i s e t h ep r o d u c t i o nc o s to fg l u t a m i ca c i da l s o i n c r e a s e w h a tm a k e si tu r g e n ti nh u n a np r o v i n c ei st oi m p r o v et e c h n o l o g y r e d u c et h e p r o d u c t i o nc o s ta n di m p r o v ep r o d u c t i v i t y b a s e do nt h ep r a c t i c a lc o n d i t i o na n dw i t h t h ep r o j e c to fh u n a ne d u c a t i o nd e p a r t m e n t 0 5 d 0 3 2 t h i sr e s e a r c he m p l o ym e l l o w r i c ea sm a t e r i a lt op r o d u c eg l u t a m i ca c i d w h i c he x p l o r e san e ww a yo fu s i n gr i c e c o m p r e h e n s i v e l y a u t h o re x p l o r e dt h en e wt e c h n o l o g yo fu s i n gm e l l o wr i c et op r o d u c eg l u m a t i c a c i db ye m p l o y i n gd o u b l ee n z y m es a e c h a r i f i e dl i q u i dt of e r m e n t t h er e s e a r c hr e s u l t s i nt h i sp a p e ra r ea st h ef o l l o w i n g f i r s t l y i tr e s e a r c h e so nt h et e c h n o l o g yo fu s i n gr i c ea sm a t e r i a lt op r o d u c es u g a r b yh y d r o l y s i sa n dt h e ng e tg l u t a m i ca c i db ym i c r o o r g a n i s mf e r m e n t i t se c o n o m i ct e c h n i c a ld a t aa r ea st h ef o l l o w i n g s a c c h a r i f i c a t i o nr a t e9 5 9 8 f e r m e n t r a t e5 5 5 6 a c i dr a t e9 7 一1 0 3 t h e s ec o n d i t i o n st a i lf u l l ys a t i s f yt h en e e do f g l u t a m i ca c i df e r m e n t a tt h es a m et i m ei tc a nm a k ec o m p r e h e n s i v eu s eo fr i c ep r o t e i n f r o ms u g a rm a k i n ga n dp r o d u c er i c ep r o t e i np o w d e r w h i c hw i l lr e d u c et h ec o s to f p r o d u c t i o n s e c o n d l y a u t h o rb u i l tu pt h eo p t i m i z e dp r o c e s st os y n t h e s i z eg l u t a m i ca c i df r o m m e l l o wr i c eb yd o u b l ee n z y m es a c c h a f i c a t i o n a n dp r o d u c e dt h ei n d e xt h u s l i q u e f a c t i o n a n ds a c c h a r i f i c a t i o nc a l lb ec o n t r o l l e d t h eh i g h e ra n dl o w e rs u g a r c o n c e n t r a t i o nl i q u i dc a nb ed i r e c t l ys a c c h a r i f i c di nt h ef e r m e n t t h et e c h n o l o g i c a l i n d e x e si nt h i sr e s e a r c ha r er e s p e c t i v e l y l i q u e f a c t i o np h5 8 6 0 i t l a m y t a s e1 0 1 2 u gd r ym a t e r i a l 1 0 6 1 0 9 cl a s tf o r5 8 m i n f l a s h c o o lt o9 5 9 7 c k e e pf o r 9 0 1 2 0m i n s a c c h a r i f i c a t i o np h 4 2 4 4 s a c c h a r i n c a t i o n e n z y m e1 0 0 1 2 0 u g d r ym a t e r i a l t e m p e r a t u r e6 0 土2 t i m e2 8 3 2h a t h i r d l y t h ec o m p l e xu s eo ff e r m e n t e dw a s t el i q u i di nt h ep r o d u c i n gp r o c e s sw a s s t u d i e d t h er e s e a r c ha d o p t e du p p e rc l e a nl i q u i dt h ef e r m e n tt op r o d u c eb a c t e r i a l 3 0 v a c c i n a t i o n 2 4 t e m p e r a t u r e2 8 3 2 c f e r m e n to n o f fp h 3 6 3 9 i n s t i l lf e r m e n t t h ed e p t ho fm e d i u mi so 8 2 0 c m t h ef e r m e n tt i m ei sf o r8 1 0d a y s t h ep r o d u c t i o nc o s to fb a c t e r i a lc e l l u l o s ei nt h i sr e s e a r c hi so n l y3 0 w h e nc o m p a r e d w i t ht h em e t h o do fu s i n gc o c o n u tm i l ka n ds u g a r c a n e a tt h es a m et i m e i ta v o i d st h e p o l l u t i o na n di so fb e t t e re c o n o m i cr e t u r n sa n dt h ee n v i r o n m e n t a lg o o df r i e n d k e yw o r d s l g l u t a m i ca c d m e l l o wr i c e d o u b l e e n z y m es a c c h a r i f i c a t i o n f e r m e n t t e c h n o l o g yd a t a l 谷氧酸合成新工艺研究 插图索引 图2 1由葡萄糖发酵谷氨酸的理想途径 1 4 5 图2 2由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径 6 图2 1 3由醋酸或正石蜡原料发酵谷氨酸的推测途径 l 钉 6 图2 4 谷氨酸对酸与碱的溶解度 3 5 图2 5 等电点一离子交换法提取谷氨酸工艺流程 3 8 图3 1液化时问对d e 值的影响 4 3 图3 2 酶用量对糖化d e 值的影响 4 5 图4 1接种量对纤维素的影响 4 8 图4 2 温度对发酵的影响 5 l 图4 3 起始p h 值对发酵的影响 5 2 v i i 硕士学位论文 表2 1 表2 2 表2 3 表2 4 表2 5 表2 6 表2 7 表2 8 表2 9 表2 1 0 表2 1 1 表2 1 3 表2 1 4 表2 1 5 表2 1 6 表3 1 表3 2 表3 3 表3 4 表4 1 表4 2 表4 3 表4 4 表4 5 插表索引 某些有机氮源的主要成分 2 0 多级温度控制模式 发酵周期3 2 h 2 2 采用溶解氧相对值控制通气量的模式与采用净增o d 值和耗糖速度控制通 气量的模式比较 2 4 发酵前期p h 值过高的处理 2 9 发酵初期p h 值偏低的处理 2 9 发酵过程泡沫太多的处理 3 0 在发酵旺盛期发酵液出现紫红色的处理 3 0 发酵后期发酵液发红的处理 3 0 谷氨酸产生后又下跌的处理 3 0 发酵周期拖长的处理 3 0 发酵温度过高的处理 3 1 谷氨酸两种结晶型比较 3 2 溶液p h 与谷氨酸电离平衡的关系 3 3 不同p h 值时 溶液中谷氨酸离子形成的比例 3 3 温度对谷氨酸溶解度的影响 3 5 大米浸泡时换水次数对生物素等添加量的影响 4 1 喷射液化温度对糖化液质量的影响 4 2 底物浓度对糖化液质量的影响 4 4 糖化液的p h 值对糖化液的质量及等电的影响 4 6 谷氨酸提取液和椰子水发酵培养基的组成 4 9 糖化液加入量对细菌纤维素产量的影响 5 0 静止培养与摇瓶培养的结果比较 5 1 培养基深度对细菌纤维素产量的影响 发酵时间对细菌纤维素产量的影响 i l 5 2 5 3 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明 所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研 究成果 除了文中特别加以标注引用的内容外 本论文不包含任何其他个人或集体 已经发表或撰写的成果作品 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体 均已在文 中以明确方式标明 本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担 作者签名 啤哥 日期 y 年f 9j 1 b 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 本 人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可 以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 本学位论文属于 1 保密口 在 年解密后适用本授权书 2 不保密囱 请在以上相应方框内打 作者签名 藩季 日期 积年 月多 e t 导师签名 孑可疽石了 日期 w 诺年厂月 厶日 硕士学位论文 1 1 氨基酸合成简介 第1 章绪论 氨基酸的制造是从1 8 2 0 年水解蛋白质开始的 1 8 5 0 年在实验室内用化学法也 合成了氨基酸 1 8 6 6 年德国的h r i t t h a u s e n 博士利用硫酸水解小麦面筋 分离到 一种酸性氨基酸 依据原料的取材 将此氨基酸命名为谷氨酸 1 8 7 2 年h l a s i w i t z a n dh a b e r m a a n 用酪蛋白也制取了谷氨酸 1 9 0 8 年东京帝国大学池田菊苗博士在 研究海带时 发现海带的鲜味是由于谷氨酸钠所致1 1 1 以此为契机开始了工业上 生产谷氨酸的研究 1 9 1 0 年日本味之索公司以植物蛋白 小麦面筋 豆粕 为原 料用盐酸水解生产谷氨酸 这是世界上最早成功的工业生产氨基酸的方法 第二次世界大战后不久 美国农业部研究所的l b l o c k w o o d 发现萤光杆菌在 葡萄糖培养基中能积累a 一酮戊二酸 并发表了用酶法或化学法将此酮酸转换为 l 一谷氨酸的研究报告 2 1 1 9 4 8 年起日本的研究人员在这方面积极开展研究 并 发现了对糖转化率5 0 6 0 的i 一酮戊二酸产生菌 1 9 5 4 年多田 中山两位博士报 告了直接发酵谷氨酸的研究 1 9 5 6 年臼本协和发酵公司木下祝郎分离选育出谷氨 酸棒杆菌1 3 在葡萄糖培养基中直接积累l 一谷氨酸 对糖转化率4 0 以上 1 9 5 7 年起谷氨酸发酵 4 j 正式工业化生产 发酵法生产谷氨酸的成功 是现代发酵工业的重大创举 也是氨基酸生产中 的重大革新 大大推动了其它氨基酸发酵研究和生产的发展 日本的研究人员为 了改良谷氨酸棒杆菌的性能 引入遗传生化学的知识与技术 培养了许多人工诱 发突变栋 从而使赖氨酸 鸟氨酸 缬氨酸 丙氨酸 高丝氨酸 苯丙氨酸 酪 氨酸 异亮氨酸 甘氨酸 瓜氨酸 脯氨酸 苏氨酸 色氨酸等发酵的研究结果 相继报道 5 6 1 并在生产上得以实现 我国从1 9 5 8 年开始筛选谷氨酸产生菌 同时进行了大量的谷氨酸发酵基础性 研究 1 9 6 4 年在上海投入工业化生产试验 随后 在北京分离选育出北京棒杆菌 a s l 2 9 9 和钝齿棒杆菌a s l 5 4 2 两株谷氨酸产生菌 并且在各地先后建厂采用了发 酵法生产谷氨酸 接着又进行了其它氨基酸的研究 1 9 6 5 年鉴定并发酵生产l 一 缬氨酸 l 一异亮氨酸 l 一亮氨酸 l 一赖氨酸 1 9 7 2 年鉴定并发酵生产l 一谷 氨酰胺 l 一精氨酸 初步形成了我国自己的氨基酸发酵工业 1 9 8 6 年我国发酵 l 一谷氨酸钠的产量超过日本 目前年产1 0 0 万吨以上 居世界第一位 由于技 术提高的幅度较大 使生产成本具备一定的国际竞争能力 目前 氨基酸国际市场需求有比较显著增大 作为调味添加剂的l 一谷氨酸 钠仍有增长的空间 主要应用于饲料添加剂的l 一赖氨酸盐 l 一色氨酸 l 一苏 l 一谷氨酸合成新工艺研究 氨酸 主要应用于抑菌荆的甘氨酸和一些药用氨基酸输液制剂需求增长十分迅 速 并且氨基酸的应用领域正在向化工 化装品方面拓展 尤其是随着世界人口 的增长和生活水平的不断提高 养殖业将有一个持续的发展 将带动饲料业的发 展 而饲料添加剂用的氨基酸将是未来氨基酸产业发展的一个热点 世界各大公 司 如日本味之素公司 日本协和发酵公司 德国d e g g u s a 公司以及美国a d m 公 司等 正在技术开发和经营规模上展开了激烈的竞争 在氨基酸发酵技术方面 人们通过各种途径在不断完善和提高 随着先进的 电子技术发展 在氨基酸发酵中不断应用先进的电子仪表和计算机控制系统进行 检测和控制 逐步实现连续化 自动化生产 7 8 不断改进设备和进一步探求新 的工艺路线 在新工艺和和新型设备的推广和应用下 使发酵产率得以提高 在 菌种方面 利用多年来积累的氨基酸生物合成和调节的知识作为理论依据 结合 分子生物学 分子遗传学的研究定向选育高产的氨基酸产生菌 尤其是应用d n a 重组 基因定向诱变技术打破了种属界限 集中不同菌株的优点 从而选育出高 产 优质 易于自动化生产的基因工程菌 提高了产酸水平和转化率 氨基酸发 酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种氨基酸的现代工业 氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵p 1 氨基酸的积累是建立于对微生物正常 代谢的抑制之上 氨基酸发酵的成败取决于能否解除其控制机制 能否打破微生 物正常的代谢调节 人为地控制微生物的代谢 氨基酸发酵为好气性发酵 在氨 基酸发酵过程中要发生一系列复杂的生物化学变化 都是以代谢控制理论为发酵 的理论基础 于是 发酵是整个生产的关键 但应该看到后处理提纯的单元操作 和提纯设备选用是否恰当 也会大大影响产品质量和总的得率 1 2 本论文的选题背景及目的 发酵生产谷氨酸的原料有淀粉质原料 玉米 小麦 甘薯 大米 甘蔗糖蜜 甜菜糖蜜等 原料的选择往往要根据当地的资源状况和经济效益来考虑 我国北 方 般以玉米为原料先制造淀粉 然后用玉米淀粉糖化 发酵 等电 结晶生产 味精 而中国南方省份则以大米直接糖化生产谷氨酸 以前大多采用口感较差 不受市场欢迎的早籼米 但近年来随着大米价格不断上涨 谷氨酸生产成本不断 升高 以大米为原料生产味精的厂家受到了很大的冲击 很多生产厂家纷纷倒闭 或转产 提高技术水平 降低生产成本 提高劳动生产率是以大米为原料的谷氨 酸生产厂家的当务之急 湖南素有 鱼米之乡 的美称 如何把农业大省变为工业 大省 是湖南食品工业的发展目标 提高以大米为主的农产品的综合利用能力和 深加工能力是我省食品工业发展的根本出路 湖南麦穗味精有限责任公司年生产 味精1 0 0 0 0 吨 生产鸡精1 0 0 0 吨 大米蛋白8 0 0 0 n 屯 复合肥料1 0 0 0 0 吨 每年所需 2 5 0 0 0 n j 大米 折合早籼稻7 5 0 0 万斤 提高谷氨酸生产技术水平 为当地经济建 硕士学位论文 设服务 不仅可以解决农民卖粮难的问题 而且为大米的综合利用开辟了一条途 经 特别是利用陈粮大米为原料生产谷氨酸 更有着极大的社会效益和经济效益 我国的谷氨酸钠 味精 产量 2 0 0 4 年超过1 0 0 万吨 已高居世界首位 味 精生产企业正向大型化 集约化发展 生产水平不断提高 已达到或接近国际先 进水平 生产成本也明显下降 从中国发酵工业协会味精分会的统计资料看 2 0 0 4 年主要经济技术指标排序在前1 0 位的味精生产厂家中 糖化收率在9 9 以上 发 酵转化率在5 8 以上 均达到国际先进水平 但产酸率仅在1 0 以上 最高 1 3 6 1 0 而国外一般为l3 1 5 因此与国外相比 产酸率还有一定的差距j 但在这些技术指标较好的厂家中 没有一家是完全用大米作为原料的 而以大米 为原料的厂家 糖化收率不足9 8 产酸率不足9 7 发酵转化率不足5 6 如 以陈粮大米为原料 其技术指标则更低 且少有报道 j 陈化粮是指贮藏三年以上的粮食 只能用于饲料和工业酒精的生产 陈粮则 是贮藏期在三年以内的转库粮 与陈化粮不同的是 国家对陈粮的使用并未做出 明确的规定 而作为谷氨酸生产的原料与直接食用的粮食在质量要求上存在着一 定的差别 只要不选用霉变米 减少黄曲霉的含量 在陈粮转变为陈化粮之前 陈粮大米用于谷氨酸生产是确实可行的 而陈粮的价格仅为新米的6 5 左右 具 有比较价格优势 将给生产企业创造更好的经济效益 同新米相比 陈粮在外观 上颜色较深 并有少部分黄米 在组成成分上 水分含量低2 3 淀粉含量 低l 2 并且蛋白质变形严重 通过对陈粮大米双酶法糖化工艺的研究 使 液化 糖化便于控制 糖化液可直接用于中糖发酵或高糖流加发酵 国内外对 大米双酶法糖化生产谷氨酸的报道较少 从文献 l2 报道的情况来看 采用的 生产工艺大多参照淀粉制糖 利用陈粮大米生产谷氨酸的报道1 1 1 更少 总体来讲 大米中的蛋白质 脂肪 灰分和杂质均要高于淀粉 这样 一方 面在淀粉的糖化过程中生成的各种氨基酸 维生素 磷 钾等微量元素溶于糖液 中 有利于谷氨酸发酵过程中菌体的生长 另一方面则会在谷氨酸发酵过程中产 生大量的泡沫 造成发酵过程的逃液和染菌 由于大米的粉浆粒度高于淀粉 当 底物浓度过高时 大米粉浆很难完全液化 容易造成粘度过大 过滤困难 同时 因为大米中的蛋白质含量高于淀粉 生产的糖化液易于混浊 泛自 透光率低 糖化转化率低 谷氨酸发酵时生物素等的添加量难以控制 导致产酸率低 发酵 转化率低 因此 国内目前以大米为原料的生产厂家大多先采用大米生产上罐糖 然后用淀粉生产流加糖 大米因品种 产地 加工方法 贮藏条件和时间等情况 不同 大米的质量和组成成分有很大的区别 陈粮大米的区别更大 因此 陈粮 大米双酶法糖化工艺和糖化液的质量对后期谷氨酸的发酵有着很大的影响 基于此 本论文的主要目的是进行l 一谷氨酸合成新工艺研究 首先我们希望 l 一谷氨酸合成新工艺研究 针对陈粮大米的原料特点 通过对大米的浸泡温度和时间 底物浓度 粉浆粒度 加酶量等的控制 采用连续喷射液化技术进行双酶法糖化 经液化 糖化 过滤 等工序 生产谷氨酸发酵用糖化液 采取有效措施 使糖化收率达9 9 以上 d e 值 还原糖 总糖 达9 7 以上 透光率达9 7 以上 糖化液纯度高 过滤速度快 颜色浅 糖化液发酵性好 而具有较好的社会效益和经济效益 其次我们希望 对大米双酶法糖化中去除的大米蛋白进行分离提纯 提取经济价值较高的大米蛋 白粉 为湖南大米深加工寻求一条途径 同时也能有效降低大米发酵谷氨酸的生 产成本 第三 我们希望寻找一条谷氨酸发酵废液的综合利用途径 既能减少废 液直排带来的环境污染 又具有较好的经济价值 本论文希望通过上述工作 进 一步丰富以陈粮大米为原料的l 谷氨酸合成新工艺研究 努力提高产酸率及糖酸 转化率 使谷氨酸发酵的产酸率达1 0 以上 发酵转化率达5 8 以上 达到国内 外回行业的先进水平 硕上学位论文 第2 章淀粉糖原料发酵生产l 谷氨酸 2 1l 谷氦酸发酵机制 谷氨酸的生物合成包括酵解途径 e m p 磷酸乙糖途径 i i m p 途径 三羧 酸 t c a 环 乙醛酸循环 伍德一沃克曼反应 c 0 2 的固定反应等 2 1 1 谷氨酸发酵的代谢途径 由葡萄糖发酵谷氨酸的理想境界途径见图2 1 o f f 2 1 由葡萄糖发酵谷氨酸的理想途径1 1 4 在谷氨酸发酵时 糖酵解经过e m p 及h m p 两个途径进行 生物素充足菌h m p 所占比例是3 8 控制生物素亚适量的结果 发酵产酸期 e m p 所占的比例更大 h m p 所占比例约为2 6 生成丙酮酸后 部分氧化脱羧生成乙酰c o a 一部分 固定c 0 2 生成草酰乙酸或苹果酸 草酰乙酸与乙酰c o a 在柠檬酸合成酶催化作用 下 缩合成柠檬酸 再经下面的氧化还原共轭的氢基化反应生成谷氨酸 由葡萄 糖生物合成谷氨酸的代谢途径见图2 2 谷氨酸生成期的主要过程用黑体箭头表 示 至少有1 6 步酶促反应 在糖质原料发酵法生产谷氨酸时 应尽量控制通过 c 0 2 固定反应供给四碳二羧酸 而在醋酸发酵谷氨酸或石油发酵谷氨酸时 却只 能经乙醛酸循环供给四碳二羧酸 见图2 3 四碳二羧酸经草酰乙酸又转化成柠 檬酸 由于三羧酸循环中的缺陷 丧失a 一酮戊二酸脱氢酶 即丧失 一酮戊二酸氧化 能力或氧化能力微弱 谷氨酸产生菌采用图2 2 中所示的乙醛酸循环途径进行 代谢 提供四碳二羧酸及菌体合成所需的中间产物等 因此 对异柠檬酸的两种 竞争反应是很重要的 为了获得能量和产生生物合成反应所需的中间产物 在谷 氨酸发酵的菌体生长期 需要异柠檬酸裂解酶反应 走乙醛酸循环途径 但是 在菌体生长期之后 进入谷氨酸生成期 为了大量生成 积累谷氨酸 最好没有 异柠檬酸裂解酶反应 封闭乙醛酸循环 这就说明在谷氨酸发酵中 菌体生长期 异柠檬酸裂解酶反应 封闭乙醛酸循环 这就说明在谷氨酸发酵中 菌体生长期 誓一 娶 厂l 1 罄胁 p 一 一掣置b l 一谷氨酸合成新工艺研究 的最适条件和谷氨酸生成积累期的最适条件是不一样的 葡萄糖 e m 为 t 图2 2 由葡萄糖生物合成谷氪酸的代谢途径 正烷烃一脂肪酸 乙酸一乙酰 图2 3 由醋酸或正石蜡原料发酵谷氨酸的推测途径 在菌体生长之后 假如四碳二羧酸是1 0 0 通过c 0 2 固定反应供给在生长之 后 理想的发酵按如下反应进行 c 6 h 1 2d 6 瓯 寺o z c s 日9 0 4 c 0 2 3 h 2 0 1 8 01 4 7 l 摩尔葡萄糖可以生成1 摩尔的谷氨酸 谷氨酸对葡萄糖的重量理论转化率 为 嬖垒墼霎塞璧 坚三 1 0 0 8 1 7 1 摩尔的葡萄糖 1 8 0 若c 0 2 固定反应完全不起作用 丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的催化作用下 脱氢 脱羧全部氧化成乙酰c o a 通过乙醛酸循环供给四碳二羧酸 反应如下 3c 6 h 1 2 0 6 6 丙酮酸一6 乙酸 6 c 0 2 6 乙酸 2 n h 3 3 0 2 2 c s h 9 0 4 n 2 c 0 2 6 h 2 0 3 摩尔葡萄糖可以生成2 摩尔的谷氨酸 谷氨酸对葡萄糖的重量理论转化率 为 堡塑璧 堡丝 1 0 0 5 4 删 3 摩尔的葡萄糖3 1 8 0 实际谷氨酸发酵时 因控制的好坏 加之形成菌体 微量副产物和生物合成 消费的能量等 消耗了一部分糖 所以实际转化率处于中间值 换言之 当以葡 萄糖为碳源时 c 0 2 固定反应与乙醛酸循环的比率 对谷氨酸产率有影响 乙醛 酸循环活性越高 谷氨酸生成收率越低 2 1 2 谷氨酸生物合成的调节机制 2 1 2 1 糖代谢 e m p 途径 p h m p 途径 的调节 1 能荷控制 糖代谢的调节主要受能荷的控制 也就是受细胞内能量水平的控制 1 6 糖代 谢最重要的生理功能是以a t p 的形式供给能量 在葡萄糖氧化过程中 中间产物 积累或减少时 进而引起能荷的变化 造成代谢终产物a t p 的过剩或减少 这些 中间产物和腺嘌呤核昔酸 a t p a d p a m p 通过抑制或激活糖代谢各阶段关 键酶活性来调节能量的生成 当生物体内生物合成或其它需能反应加强时 细胞内a t p 分解生成a d p 或 a m p a t p 减少 能荷降低 就会激活某些催化糖类分解的酶或解除a t p 对这些 酶的抑制 如糖元磷酸化酶 磷酸果糖激酶 柠檬酸合成酶 异柠檬酸脱氢酶等 并抑制糖元合成的酶 可糖元合成酶 果糖 t 6 磷酸酯酶等 从而加速酵解 t c a 环产生能量 通过氧化磷酸化作用生成a t p l 一谷氮酸台成新工艺研究 当能荷高时 即细胞内能量水平高时 a m p a d p 都转变成a t p a t p 增加 就会抑制糖元降解 柠檬酸合成酶 异柠檬酸脱氢酶 并激活糖类合成的 酶 如糖元合成酶和果糖一l 6 一二磷酸酯酶 从而抑制糖的分解 加速糖元的 合成 2 生物素对糖代谢速度的调节 谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型 生物素对谷氨酸产生菌的生长和糖的代 谢影响很大 许多研究表明 生物素充足菌h m p 途径所占的比例是3 8 生物素 亚适量为2 6 生物素对糖开始到丙酮酸为止的糖降解途径的比率并没有显著的 影响 主要是影响糖解速度 在生物素充足条件下 丙酮酸以后的氧化活性虽然也有提高 但由于糖降解 速度显著提高 打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡 丙酮酸趋于生 成乳酸的反应 因而会引起乳酸的溢出 2 1 2 2 三羧酸循环 t c a 循环 的调节 1 优先合成 谷氨酸比天冬氨酸优先合成 谷氨酸合成过量后 谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶 的活力和阻遏柠檬合成酶的合成 使代谢转向天冬氨酸的合成 2 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的调节 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈和抑制 1 7 受谷氨酸和天冬氨酸 的反馈阻遏 3 柠檬酸合成酶的调节 柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶 除受能荷调节外 还受谷氨酸的反馈 阻遏和乌头酸的反馈抑制 4 异柠檬酸脱氢酸的调节 异柠檬酸脱氢酶催化的异柠檬酸脱氢脱羧生成q 酮戊二酸的反应和谷氨酸 脱氢酶催化的q 一酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸的反应是一对氧化还原共轭反 应 细胞内q 一酮戊二酸的量与异棕檬酸的量需维持平衡 当 一酮戊二酸过量时对 异柠檬脱氢酶发生反馈抑制作用 停止合成q 酮戊二酸 5 谷氨酸脱氢酶 g d h 的调节 谷氨酸产生菌的谷氨酸脱氢酶活性都很强 这种酶以n a d p 为专一性酶 谷 氨酸发酵的氨同化过程 是通过连接n a d p 的l 谷氨酸脱氢酶催化完成的 沿着 由柠檬酸至n 一酮戊二酸的氧化途径 谷氨酸产生菌有两种n a d p 专性脱氢酶 即 异柠檬酸脱氢酶和l 一谷氨酸脱氢酶 在谷氨酸的生物合成中必须有谷氨酸脱氢酶 和异柠檬酸脱氢酶的共轭反应 在铵离子存在下 两者非常密切地偶联起来 形 成强固的氧化还原共轭体系 不 与n a d p h 2 的末端氧化系相连接 使a 酮戊二酸 坝士学位论文 还原氨基化生成谷氨酸 见图2 1 谷氨酸生产菌需要氧化型n a d p 以供异柠 檬酸氧化用 生成的还原型n a d p h 2 又因a 酮戊二酸还原氨基化而再生为n a d p 由于谷氨酸产生菌的谷氨酸脱氢酶比其它微生物强大得多1 1 8 所以由三羧酸循 环所得的柠檬酸的氧化中间物 就不再往下氧化 而以谷氨酸的形式积累起来 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏 若铵离子进一步过剩供给 时 发酵液偏酸性 p h 在5 5 6 5 谷氨酸会进一步生成谷氨酰胺 6 a 酮戊二酸脱氢酶 在谷氨酸产生菌中 a 酮戊二酸脱氢酶先天性地丧失或微弱 这是谷氨酸产 生菌糖代谢的一个重要特征 谷氨酸产生菌的0 t 酮戊二酸氧化力微弱 尤其在生 物素缺乏条件下 三羧酸循环到达值 酮戊二酸时 即受到阻挡 对导向谷氨酸形 成具有重要意义 在铵离子存在下 a 酮戊二酸因谷氨酸脱氢酶的催化作用 还 原氨基化反应生成谷氨酸 2 1 2 3 乙醛酸循环 d c a 循环 的调节 1 d c a 循环的关键酶 乙醛酸循环中的关键酶是异柠檬酸裂解酶和苹果酸酶 其反应是 异柠檬酸裂解酶 异柠檬酸 呻乙醛酸 琥珀酸 苹果酸酶 乙醛酸 乙酰c o a 7 苹果酸 2 以糖质为原料的谷氨酸发酵中生物素对d c a 循环的影响 在糖质原料的谷氨酸发酵中 d c a 循环可以作为t c a 循环有缺陷时四碳二羧 酸的补充和能量供给来源的末端氧化系 但在谷氨酸生成期 若再由d c a 循环 提供四碳二羧酸合成谷氨酸 谷氨酸对糖的转化率就大为减少 因此 以糖质原 料的谷氨酸发酵在谷氨酸生成期d c a 循环应关闭 乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖 琥珀酸阻遏 1 9 1 为醋酸所诱 导 以葡萄糖为原料发酵生产谷氨酸时 通过控制生物素亚适量 几乎看不到异 柠檬酸裂解酶的活性 原因是丙酮酸氧化能力下降 醋酸的生成速度慢 所以为 醋酸所诱导形成的异柠檬酸裂解酶就很少 再者 由于该酶受琥珀酸阻遏 在生 物素亚适量条件下 因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶的 活性 并阻遏该酶的生成 乙醛酸循环基本上是封闭的 代谢流向异柠檬酸一a 一 酮戊二酸一谷氨酸的方向高效率地移动 3 醋酸或乙醇为原料的谷氨酸发酵的d c a 循环 在以醋酸或乙醇为原料的谷氨酸发酵中 d c a 循环是四碳二羧酸的唯一补充 来源 催化d c a 循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶 异柠檬酸裂解酶由草酸 草 l 一谷氨酸合成新工艺研究 酰乙酸 a 酮戊二酸产生拮抗性抑制 琥珀酸产生混合抑制 t c a 循环的中间产 物抑制异柠檬酸裂解酶的程度比抑制异柠檬酸脱氢酶强烈 且这种抑制性是带有 累积性的 又由于异柠檬酸脱氢酶的k 值比异柠檬酸裂解酶的k 值小 即使菌 体内异柠檬酸浓度很低 异柠檬酸代谢进入t c a 循环还是比进入d c a 循环更容 易 有利于a 酮戊二酸的生成 当菌体内四碳二羧酸浓度低到不足以抑制异柠檬 酸裂解酶时 需要d c a 循环运转 而d c a 循环运转生成的乙醛酸与细胞内的草 酰乙酸又能够共同抑制异柠檬酸脱氢酶 即使异柠檬酸裂解酶的k 值很高 而 代谢还是由t c a 循环转为d c a 循环 由于d c a 循环的运转 导致四碳二羧酸过 剩 异柠檬酸裂解酶又将会被抑制 因而乙醛酸浓度又将下降 解除对异柠檬酸 脱氢酶的抑制 t c a 循环又开始运转 这样 d c a 循环和t c a 循环不断交替运转 2 1 2 4c 0 2 固定反应 1 磷酸烯醇丙酮酸 p e p 分解反应与c 0 2 固定反应 经跟踪标记 发现草酰乙酸的补充可通过c 0 2 固定反应来完成 在谷氨酸产生 菌中已检出二种c 0 2 固定反应酶 磷酸烯醇丙酮酸 p e p 羧化酶和苹果酸梅 葡萄糖生成的p e p 分别经分解途径生成乙酰c o a 和经c 0 2 固定反应生成草酰 乙酸 p e p 羧化酶对p e p 的表现亲和力约是丙酮酸激酶的1 1 0 当p e p 的浓度低 时 p e p 羧化酶不被乙酰c o a 和二磷酸果糖激活 p e p 容易进入分解途径 当乙酰c o a 浓度增加 与二磷酸果糖共同激活p e p 羧化酶 同时 随着乙 酰c o a 氧化 使a t p 水平提高 结果丙酮酸激酶受a t p 抑制 代谢由分解途径转 向c 0 2 固定反应 c d l 菩星兰垫 草酰乙酸 gtppepg d p c n i 早眠乙暖十 苹果酸酶 苹果酸脱氢酶 丙酮酸i 亏茅c o 苹果酸 亏 寻草酰乙酸 一 l 州d n a d h h 随着t c a 的中间产物浓度的增加 可认为与其保持平衡的天冬氨酸浓度也 增加 将反馈抑 1 p e p 羧化酶 同时 生物合成和需能反应使a t p 浓度降低 a t p 对丙酮酸激酶的抑制被解除 a m p 激活此酶 又转向分解途径 防止了草酰乙 酸的过剩 因此 在谷氨酸合成中 糖的分解代谢途径与c 0 2 固定反应的适当比例是提 高谷氨酸对糖收率的关键问题 2 生物素对c 0 2 固定反应的影响 生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶 参与c 0 2 固定反应 据文献 2 0 于艮道 生物素 硕士学位论文 大过量 1 0 0 p g l 以上 c 0 2 固定反应可提高3 0 2 1 2 5 氮的导入及氮代谢的调节 1 生成谷氨酸的主要酶反应 在谷氨酸发酵中 生成谷氨酸的主要酶反应有以下三种 谷氨酸脱氢酶 g h d 所催化的还原氨基化反应 a 酮戊二酸 n h n a d p h 2 与谷氨酸 h 2 0 n a d p 转氨酶 a t 催化的转氨反应这一反应是利用已存在的其他氨基酸 经过转氨酶的作用 将其它氨基酸与a 西酮戊二酸生成l 谷氨酸 苎 h q h 2 卜 一凹2 a 一酮戊二酸氨基酸谷氨酸a 一酮酸 合成酶 g s 催化的反应 n a d p h 2 n a d p 一酮戊二酸 谷氨融二 手o z 谷氨酸 以上三个反应中 还原氨基化是主导性反应 2 氮代谢的调节 控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力 使合成的谷氨酸不 去转化成其它氨基酸和参与蛋白质的合成 在生物素亚适量时 几乎没有异柠檬 酸裂解酶 琥珀酸氧化力弱 苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞 同时又由于完全 氧化降低的结果 使a t p 形成量减少 导致蛋白质合成活动停滞 在铵离子适量 存在下 生成积累谷氨酸 生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其它氨基酸和合 成蛋白质 在生物素充足条件下 异柠檬酸循环裂解酶增强 琥珀酸氧化力增强 丙酮酸氧化力加强 乙醛酸循环的比例增加 草酰乙酸 苹果酸脱羧反应增强 蛋白质合成增强 谷氨酸减少 合成的谷氨酸通过转氨作用生成其它氨基酸量增 加 2 1 3 谷氨酸发酵细胞膜渗透性的控制 谷氨酸发酵的关键在于发酵培养期间谷氨酸生产菌细胞膜结构与功能上的 特异性变化 使细胞膜转变成有利于谷氨酸向膜外渗透的样式 即完成谷氨酸非 积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变 这样 由于终产物谷氨酸不断地排出于 一 加 c l c i 矗 严p 渊 卸 以 如州 j l叫f叫 l 一谷氨酸合成新工艺研究 细胞外 使细胞内的谷氨酸不能积累到引起反馈调节的浓度 谷氨酸就会在细胞 内继续不断地被优先合成 又不断地透过细胞膜 分泌于发酵培养基中 得以积 累 2 1 3 1 化学控制方法 通过控制发酵培养基中的化学成分 达到控制磷脂 细胞膜的形成或阻碍细 胞壁正常的生物合成 使谷氨酸生产菌处于异常的生理状态 以解除细胞对谷氨 酸向胞外漏出的渗透障碍 1 控制细胞膜的合成 细菌细胞膜主要是脂类 2 0 3 0 和蛋白质 6 0 7 0 此外还有少量糖蛋 白和糖脂 约2 以及微量核酸 而脂类主要为极性类脂一甘油磷脂 甘油磷 脂由甘油 腊肪酸 磷酸和含氮碱组成 通过控制磷脂的合成 导致形成磷脂合 成不足的不完全的细胞膜 生物素缺陷型 a 使用生物素缺陷型菌株 2 1 1 进行谷氨酸发酵时 限制发酵培养基中生物素 的浓度 作用机制 生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰c o a 羧化 酶的辅酶 该酶催化乙酰c o a 合成丙二酰c o a 生物素促进脂肪酸的合成 再由 脂肪酸合成磷脂 选育生物素缺陷型 阻断生物素合成 限制外源生物素供应量 抑制不饱和脂肪酸合成 使磷脂含量减少 导致磷脂含量不足 细胞膜结构不完 整 提高了细胞膜的谷氨酸通透性 当磷脂合成减少到正常量的1 2 左右时 细 胞变形 谷氨酸向膜外漏出 积累于发酵液中 控制的关键 为了形成有利于谷氨酸向外渗透的磷脂合成不足的细胞膜 必 须控制生物素亚适量 5 1 0 9 g l 发酵初期 菌体正常生长 菌体形态为单个 成对 八字形 棒状 椭圆 短杆形 当生物素耗尽后 在菌的再次倍增期间 开始出现异常形态的细胞 菌体伸长 膨大乃至不规则形 边缘有折绉 稍模糊 电镜观察似庖疹样 完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变 形成 磷脂合成不足的不完全的细胞膜 发酵后期常出现类似花生状的有横隔膜的多节 细胞 但菌体形状基本清楚 此时能够高产谷氨酸 倘若生物素过剩 就会只长 菌不产酸或长菌好产酸低 b 对生物素过量的原料 如糖蜜 使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵 时 可以在发酵适当时间通过添加表面活性剂 如吐温6 0 或饱和脂肪酸 g 1 6 18 及其亲水聚醇酯类 同样能清除渗透障碍物 积累谷氨酸 作用机制 表面活性剂 高级饱和脂肪酸的作用 并不在于它的表面效果 而是在不饱和脂肪酸的合成过程中 作为抗代谢物具有抑制作用 对生物素有拮 硕士学位论文 抗作用 通过拮抗脂肪酸的生物合成 导致磷脂合成不足 结果形成磷脂不足的 细胞膜 提高了细胞膜对谷氨酸的渗透性 控制的关键 必须控制好添加表面活性剂 饱和脂肪酸的时间与浓度 必须 在药剂添加后 在这些药剂存在下 再次进行菌的分裂增殖 形成处于异常生理 关态的产酸型细胞 即完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变 若 剩余生长太多 意味着谷氨酸生产菌细胞不能完成成有效的生理学变化 若剩余 生长不足 意味着谷氨酸生产菌没有机会完成这种转变 油酸缺陷型 使用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时 限制发酸培养基中油酸的浓度 作用机制 由于油酸缺陷型突变株切断了油酸的后期合成 丧失了自身合成 油酸的能力 即丧失脂肪酸生物合成能力 必须由外界供给油酸 才能生长 通 过限制外源供给的油酸量 就可限制磷脂的合成 从而达到控制细胞膜的渗透性 般控制磷脂合成量减少到正常量的1 2 左右时 细胞变形 谷氨酸可分泌积累 于培养液中 控制的关键 对油酸缺陷型突变株的谷氨酸产生力来说 最重要的因子是细 胞内的油酸含量 若