基于群体感应的膜生物反应器膜污染的控制研究.docx

基于群体感应的膜生物反应器膜污染的控制研究摘要：膜污染是膜生物反应器（mbr）长期稳定运行和广泛应用的瓶颈问题，其中最普遍、对膜通量影响最大的是膜生物污染，就是指微生物在膜面上形成生物膜或者在膜表面和膜孔内滋生成为微生物菌落。而研究表明，微生物生物膜的形成要受到微生物群体感应系统的调控，由此可以阻断群体感应抑制生物膜的形成，从而控制膜污染。本文针对mbr膜生物污染控制，从微生物群体感应系统、信号分子、群体淬灭机制等方面进行阐述，并介绍了一些基于群体淬灭的新颖的生物污染控制手段。关键词：膜生物污染，群体感应，信号分子，群体淬灭1膜生物反应器1.1概况为了解决水资源的紧缺及水质污染问题，人们正致力于探索高效节能的水处理新技术，其中膜生物反应器水处理技术，由于具有体积负荷高、占地面积小、剩余污泥量少、出水水质好且稳定等优点，已受到各国水处理技术科技工作者的关注。所谓膜生物反应器(mbr)，是一种新型高效的水处理技术，将生物处理与膜分离技术相结合而成的一种高效污水处理新工艺，膜分离指以外界能量或化学位差为推动力，以膜的选择透过性，对双组分溶质或溶剂进行分离、分级、提纯和富集的方法。膜生物反应器综合了膜处理技术和生物处理技术的优点，通常在常温和常压下进行生化反应，产物或副产物从反应区连续地分离出来，打破反应平衡，从而可大大地提高反应转化率，增加产率或处理能力，过程能耗低、效率高。尽管膜生物反应器的技术可行性早已被人们认可，但处理工艺的费用较高，在一定程度上限制了它的推广。膜工艺的费用主要来自膜价格、膜更换频率和能耗需求。随着制膜水平的提高，膜的价格已大大下降；膜的更换频率与膜的稳定运行有关，但膜污染问题大大影响了膜系统的稳定运行；能耗高的原因是多重的，其中之一是膜污染造成通量下降而迫使能耗增加以维持通量。由此可见膜污染是影响mbr经济性和推广应用的重要因素。1.2膜生物污染膜污染是指mbr内混合液中的悬浮颗粒、胶体粒子或溶解性大分子有机物在膜表面和膜孔内吸附沉积，造成膜孔径减小或堵塞，使膜通量下降的现象。根据造成污染的物质不同可分为无机污染、有机污染和生物污染。其中以有机污染和生物污染最为普遍，对膜通量的影响最大。本文就是针对膜生物污染进行研究。生物污染1是由于各种微生物通过扩散、重力沉降、主体对流等作用而能动地积累在膜面上形成生物膜或者在膜表面和膜孔内滋生成为微生物菌落而造成的。在膜表面滋生的微生物还可以分泌细胞外多聚物渗入膜表面，并与膜以化学键的形式紧密地交联在一起，从而改变膜的透水性和渗透特性，既导致了膜透水能力的下降，又遏制了水力剪切力对污染层的去除作用。膜生物污染过程，也就是其表面生物膜的形成过程，大体可分为四个阶段2。第一阶段：腐殖质、聚糖脂与其它微生物的代谢产物等大分子物质在膜面吸附，形成一层具备微生物生存条件的生物膜。第二阶段：进水微生物中粘附速度快的细胞形成初期粘附过程。这一阶段是生物膜的初期发展阶段，生物膜受水剪切力和细菌死亡脱除的影响因而生长缓慢。第三阶段：由于后续大量菌种的粘附，特别是细菌胞外聚合物(eps)的形成，加剧了微生物的繁殖和群集。第四阶段：生物污染的最终形成阶段，在这一阶段生物膜的生长和脱除达到动态平衡，生物膜将趋于稳定。由于生物污染造成了膜的不可逆堵塞，使过滤阻力上升，引起膜通量的下降。2群体感应2.1群体感应信号分子群体感应(quorum sensing, qs)是细菌根据自身细胞密度变化进行自我协调的一种群体行为。许多细菌能产生并释放一种被称为自诱导物的信号分子，随着细菌密度的增加，信号分子不断积累，当积累到一定浓度时则会与胞浆受体蛋白结合，调控细菌相关基因的表达，使细菌形成一种群体行为3，如调节生物发光、细菌的群集运动4、抗生素的合成、生物膜的形成5-7、细菌色素产生、致病基因的表达等。不同的细菌使用不同种类的化学物质作为信号分子，这些物质6主要分为3类：存在于革兰氏阴性细菌中的脂肪类衍生物，大多数是n-酰化高丝氨酸内酯(n-acylhomoserine lactones，ahls)类物质，共同之处在于都含有一个酰化高丝氨酸内酯环，不同的ahls别在于n-基侧链的长度不同，或3-碳位置的取代基不同,或侧链中不饱和键不同。ahls是由乙酰化的脂肪酸和sam(s-adenosyl methionine)在luxl型合成酶的作用下生成的。革兰氏阳性细菌以修饰过的寡肽(oligpeptide)作为细胞间交流的语言。二酮哌嗪类化合物(dkp)，2-庚基3-羟基4-喹啉(2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone pqs)和呋喃酰硼酸二酯等，被称为ai-2(autoinducer-2)8。ai-2作为种间交流信号分子，是由luxs合成酶合成的，首先合成一个dpd(4，5-dihydroxy-2，3-pentanedione)，然后对dpd进行折叠修饰，不同的细菌进行不同的修饰。2.2群体感应系统的调控机制革兰氏阴性菌中研究最为深入和详细的群体感应系统是luxi/r型群体感应，其中luxi是ahls合成酶，luxr是凋节蛋白。在低细胞密度时，每一个细胞仅合成基础水平的组成型ahls信号分子；随着细胞数量逐渐增加，可自由进出细胞的ahls信号分子在细胞内外累积，当足够高的细胞密度使ahls达到域值水平时，ahls结合并激活r蛋白，活化的r蛋白作为转录调节子迅速启动编码ahls合成酶luxi基因表达，诱导ahls自身生产，促进ahls信号分子的大量释放而形成r-ahls复合物，结合到目的基因启动子上启动qs介调的基因表达。每种细菌的luxi的酰基结合位点针对自身生产的ai侧链基团，由于不同种类细菌的luxi不同，这就造成了ai的多样性。luxr与酰基结合位点具有很高的特异性，只有同源的才能和luxr结合形成具有调节活性的复合蛋白质。因此，尽管微生物处于多种ahls的环境中，仍然能够排除干扰，只对自身物种的ai产生应答。所以，luxi/r信号通路通常用于细菌种内的信息交流。细菌同时具用多套luxi/r信号通路，并且与其它信号通路，如camp，相互连通。何种信号通路发挥作用是由细菌所处的发育阶段以及环境条件等决定的。不同的ai调控细菌表现出不同的生理行为，比如通过运动吸附到固体表面、生物膜的形成等，而且这些调控是由不同的信号通路来实现的9。luxr与ai同时存在于胞浆中，因此必然存在某种机制，在ai浓度较低的状态下可以阻止luxr与ai的结合。zhu研究发现，细菌体内有一种trar蛋白质，它对ahls的前体进行折叠，只有经过修饰的ahls才能与luxr结合。当细菌密度较低时，trar的半衰期很短只有几分钟。因此不能对ahls进行折叠，而在细菌密度较高时，trar的半衰期是30 min，可以促使ahk与luxr的结合10。革兰阳性菌的qs体系大多以寡肽(autoinducing peptide，aip)为信号分子，与ahls不同，aip需要abc转运蛋白或其它膜通道蛋白将其转移到细胞外11。随着细胞生长，信号分子浓度逐渐增加，当达到域值时，aip与对应的激酶受体蛋白结合，并通过磷酸化转导给同源的响应调节子rr蛋白，经磷酸基启动自体诱导反应，迅速转录aip前体蛋白，经激酶修饰形成大量aip信号分子，进而启动目的基因表达。和革兰氏阴性菌相似，不同种类革兰氏阳性菌分泌的寡肽也不尽相同，受体蛋白和寡肽的结合具有很高的特异性，因此寡肽也作为是种内交流的信号分子。在群体感应调节系统中，夏威夷弧菌同时具有革兰氏阴性和阳性细菌群体感应的调控系统，既有ahls自诱导物（ai-1），还产生第二套自体诱导系统（ai-2）。现在普遍认为，许多种的革兰氏阴性和阳性细菌都可以产生这种ai-2，其产生依赖于一个被称为luxs的蛋白，与具有种特异性的ahls和寡肽类ai不同，一般认为ai-2是种间细胞交流的通用信号分子12。总的来说，qs是由几个关键步骤组成的：基础水平信号分子的产生；信号分子累积；信号感应；信号自体诱导反应和目的基因活化。图1.1 细菌的群体感应信号系统6a：革兰氏阴性细菌luxi/r信号通路；b：革兰氏阳性细菌寡肽/双组分蛋白信号通路c：夏威夷弧菌杂合型信号通路3群体感应对生物膜的作用parsek和greenberg提出了细菌社会化行为的概念，并指出形成生物膜的微生物具有社会化行为的特征，细菌生物膜能够在恶劣的环境中生存的主要原因之一是细菌之间的相互协调作用，这正是通过细菌的群体感应系统来实现的13。群体感应参与了调控生物膜形成过程中关键基因的表达，从而使生物膜具有特殊的生理行为特征。从浮游状态到细菌生物膜，细菌经历了从低密度到高密度、从无组织到有组织状态的过程。在细菌完成了附着期以后，细菌群体感应机制就在生物膜的形成中发挥重要作用。有研究表明，缺失ahls信号分子的铜绿假单胞杆菌突变菌株形成了扁平、致密、均质的生物膜，而野生型菌株则形成了结构复杂，异质的生物膜14。如果在突变株细菌生物膜生长的过程中加入ahls分子，则该细菌可以恢复形成成熟的生物膜。yeon等15监测了在mbr各工作点滤饼层的ahls信号生物活性，结果表明：早期（22h）没有检测到信号分子，46h后有部分，58h信号分子激增，72h后信号分子与生膜污染的量同时增加。体外研究发现7，群体感应系统健全的细菌可以形成典型的能对抗杀菌剂的生物膜；而群体感应系统残缺的细菌，则不能形成典型的生物膜，并且容易被冲洗掉以及对杀菌剂敏感；但如果在群体感应系统残缺的细菌生物膜生长过程中加入ahls分子，则该细菌又恢复形成成熟生物膜的能力。如果在群体感应系统健全的细菌培养液中加入群体感应拮抗剂，则可形成结构既薄又稀疏的生物膜。不仅如此，缺乏群体感应系统的细菌其生物膜中细胞间的排列松散，难以形成复杂的空间结构。这些结果表明，细菌群体感应参与调控细菌生物膜的形成，因此可以通过阻断群体感应抑制生物膜的形成，从而控制膜污染。4群体淬灭机制研究表明，一些物质对微生物细胞间的qs有抑制或干扰作用，可阻断细菌间“信息交流”，阻止qs依赖型基因表达，称作群体淬灭。群体感应调控过程与细菌信号的合成、分泌及运输等过程密切相关，因此qs体系可以提供三处有效的攻击靶点：信号产生者(luxi同系物)、信号分子和信号分子受体(luxr同系物)，其淬灭可通过抑制信号分子合成、降解信号分子、降低转录调节蛋白( r蛋白) 活性等途径调控。4.1抑制信号分子合成qs调控作用离不开信号分子合成和参与。革兰氏阴性菌的信号分子ahls在胞内有关酶的作用下进行化学合成需要作为底物的酰基供体(acyl-acp)和腺苷甲硫氨酸(s-adenosyl-methionine)提供高丝氨酸内酯。参与信号化学合成过程的酶类包括信号合成酶、烯酰基-acp ( enoyl-acp)还原酶fabi、酰基携带蛋白(acp) 等多种酶。三羧酸循环产生的enoyl-acp在还原酶fabi作用下被还原为酰基供体acyl-acp，酰基供体acyl-acp 经过信号合成酶的催化作用与sam 反应化学合成细胞信号ahls16。因此，只要能抑制ahls 合成酶活性或消除底物等信号合成过程中任一环节均可阻断信号分子合成。研究表明，s-腺苷甲硫半胱氨酸同系物对铜绿假单胞菌信号合成酶rhli活性有抑制效果，一定程度上可抑制信号分子合成17。信号分子合成需要酰基供体，作为合成底物的酰基供体可通过三羧酸循环或脂肪酸合成途径获得。杀菌产品三氯生( triclosan) 就是运用qs淬灭理论研制而成，其通过抑制烯酰基-acp活性来阻断信号分子的合成，达到杀菌目的。4.2降解信号分子通过降解信号分子使其在胞外达不到发挥调控作用的临界阈值浓度，不能与r蛋白结合形成具有转录调节子激活作用的多聚合物，淬灭qs系统。根据物质特性，信号分子降解主要分两种：生物分解和化学降解。前者利用微生物合成具有降解信号活性的内酯酶或酰化酶水解，后者使用一些化学合成物质如氧化卤素（hclo等）进行降解。群体淬灭细菌(quorum-quenching bacterium qq)：微生物间的群体密度介导相关的生物学功能活性，但整个微生态网络中也存在多种qs信号干扰或淬灭的作用方式。研究证明，jafr 等18以马铃薯为实验材料，用融合表达luxr/luxi-gfp的重组大肠杆菌为指示菌，从中分离出多种具有ahls降解活性的微生物。丁贤19等以根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)为指示菌从海洋环境筛选出具有ahls 降解活性的芽孢杆菌，以产紫杆菌cv026为指示菌从海泥中筛选出具有降解活性的放线菌20。试验表明，这些降解菌能抑制弧菌生物膜形成21，甚至表现出潜在的益生作用22。从生物技术和实际应用角度出发，人们期望筛选和鉴定出具有明显降解ahls信号活性的微生物，研发有潜在应用价值的生物防控高效抗菌剂，开发丰富的微生物资源。本文的思路就是通过筛选群体淬灭细菌来抑制膜生物污染。群体淬灭酶：从芽胞杆菌中分离aiia内酯酶能水解信号分子内酯环中的酯键，形成相应的n-酰基高丝氨酸（图1.2）。目前已在20多种细菌中发现aiia的同源蛋白，尽管其特异性各不相同，但都能降解ahls信号分子24，类似的内酯酶aiib也在根癌农杆菌和节杆菌(arthrobacter)中被分别鉴定出来25,26。ahls内酯酶对ahls分子中的酰基链长具有特异性，内酯酶活性因链长和c3位置上的取代基不同而变化27。虽然ahls内酯酶能开裂内酯环，但所形成的n-酰高丝氨酸不稳定，在酸性条件下能够自动闭环而恢复ahls信号活性。研究发现，铜绿假单胞菌和土壤中分离的争论贪噬菌(variovorax paradoxus)能分泌ahls酰胺酶28，打开信号分子n-( 3-氧已基) -1-高丝氨酸内酯中酰基和高丝氨酸内酯环之间的氨基键水解成脂肪酸和高丝氨酸内酯（图1.2），并以ahls为惟一能源生长。ahls酰胺酶催化的ahls降解是一种不可逆反应，与ahls内酯酶相比，应是一类有较大开发价值的群体淬灭剂。这类酶同样对ahls信号分子的侧链长度有特异性。图1.2 ahls信号分子的酶解方式23化学物质降解：研究表明，某些化合物( 如卤素氧化物) 对信号分子也表现出相似的降解活性。化学物质hclo或hbro可有效迅速降解酰基高丝氨酸内酯( 3-oxo-ahls) ，作用1 min 即可降解信号浓度75%，但对非3-oxo-ahls不表现降解活性29。海洋指状岩褐藻（laminariadigitata）的藻类叶片上细菌难以生长就是因为海洋指状岩褐藻产生一种卤素过氧化酶可催化卤素反应生成卤素氧化物，后者可穿透细菌生物膜与ahls共作用破坏信号ahls的介导调节活性，从而抑制细菌qs 使之不能在藻类叶片上生长繁殖。还有一种钝化ahls信号分子最简单的方式是将ph值提高到7.0以上，使ahls分子的内酯环裂解而开环，以防止qs控制基因和毒素因子的表达30。4.3降低或抑制受体蛋白活性降低或抑制r蛋白活性一般通过qs抑制剂实现，这些抑制剂通过与信号分子竞争性结合受体而降低活化受体的浓度。事实表明，很多植物化学物质具有细菌qs抑制活性。研究发现，黄芩苷和大黄素能抑制菌株铜绿假单胞菌生物膜形成是因为该物质在结构上与信号分子相似，与信号分子竞争结合r蛋白，抑制信号分子与r蛋白结合31,32，一旦其与r蛋白结合能改变r蛋白构象使之不稳定而易于水解，进而阻断qs控制的生理学反应及生物学功能表达。卤代呋喃酮33能抑制铜绿假单胞菌生物膜形成和毒素产生、胡萝卜软腐欧文氏杆菌抗菌素和胞外酶产生。5基于群体淬灭的生物污染控制将群体感应的概念应用于膜生物反应器（mbr）控制生物污染，这是一种新颖的生物污染控制手段，并被证实是有效、经济可行的。根据群体淬灭机制，群体淬灭酶可以用来抑制膜污染。根据yeon等人34的研究，在膜生物反应器中出现的ahls是膜污染的主要原因，当向膜生物反应器中添加ahls酰基转移酶会使跨膜压力（tmp）下降（图1.3）。研究表明，当酰基转移酶i的kim35将群体淬灭酶（酰化酶）直接固定到纳滤膜，由于阻止了胞外聚合物（eps）的分泌减少，从而减缓了蘑菇状的成熟生物膜的形成。然而，实际问题中酶的活性非常不稳定，要求更有效的群体淬灭方式。图1.3 mbr中跨膜压力变化图注：实心圆为添加了ahls酰基转移酶，空心圆为没有添加ahls酰基转移酶群体淬灭细菌相比酶法更经济，因为前者具有较长的寿命，并且不需要任何酶的纯化过程。oh h-s 36将分泌n-酰基高丝氨酸内酯酶的重组大肠杆菌和从实际mbr反应器中分离得到的群体淬灭红球菌分别压入中空纤维膜的微孔中，制作成一个微生物容器（图1.4），将其放入mbr反应池中用来缓解过滤膜表面上的生物污染。由于微生物容器的孔径为0.4m，小于一个细菌细胞的大小，群体淬灭细菌无法从其中逃脱。相反，信号分子可以自由通过微生物容器毛孔，从而被微生物容器的群体淬火细菌降解。此外，营养物质可以进入微生物容器，用于维持群体淬灭细菌的活动。cheong37从实验室规模的mbr分离出群体淬灭细菌假单胞菌属1a1，并封装在中空纤维的微孔膜的微生物容器，使mbr的生物污染得到控制。假单胞菌1a1可能是产生并分泌ahls-酰基转移酶，降解各种不同种类的n-酰基高丝氨酸内酯类信号分子（ahls），但是它对每个ahls的降解率有较大差异。kim38在mbr中使用群体淬灭细菌（红球菌bh4）包埋的自由移动的磁珠，由于群体淬灭使生物膜变得松散，易于脱落，抑制生物污染。群体淬灭效果也很大程度上依赖于生物反应器和膜之间的的混合液再循环利用率，jahangir39使用微生物容器内连续再生的群体淬灭细菌，微生物容器超过100天稳步保持其群体淬灭活动。这个方法有效地中断细胞与细胞之间的通信（群体感应），使mbr曝气量减少，从而具有节能潜力。图1.4 微生物容器照片放大图36参 考 文 献1 刘晨光. 膜生物反应器运行中膜污染控制对策的研究d. 天津: 天津大学, 2008.2 高钦. 膜生物反应器中的膜污染研究综述j. 山西建筑, 2009, 35(19): 179-180.3 juhas m, eberl l, tmmler b. quorum sensing: the power of cooperation in the world of pseudomonasj. environmental microbiology, 2005, 7(4): 459-471.4 vattem da, mihalik k, crixell sh, et al. dietary phytochemicals as quorum sensing inhibitorsj. fitoterapia, 2007, 78(4): 302-310.5 杜青珍. 废水处理系统生物膜中细菌的共凝集d. 苏州: 苏州大学, 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