（应用化学专业论文）PEI衍生物的设计、合成及其转染性能的研究.pdf

硕士论文 p e 衍生物的设计 合成及其转染性能的研究 摘要 阳离子聚合物聚乙烯亚胺 p e i 被认为是基因转染效率最高的聚合物之一 但当它 转染效率高时 其分子量较大 细胞毒性也大 而小分子量时其细胞毒性小 但转染效 率低 因此设计在聚乙烯亚胺 p e i q 丁引入疏水组分 p h 敏感组分和可降解组分 探讨 各种修饰组分增加其转染效率和降低其细胞毒性的规律具有重要的理论意义和潜在的 应用价值 首先 我们合成了不同疏水碳链长度的n 烷基丙烯酰亚胺和不同连接臂长度的n 烷基酰胺酸的琥珀酰亚胺活化酯 n h s 活化酯 使它们与p e i2 7 0 0 和b p e i2 5 k d a 反应 制得相应的p e i 衍生物 探索疏水脂肪基对聚合物载体转染能力的影响 其次 合成了 各种酸酐修饰的p e i 衍生物 研究了p e i 侧链上偶联羧基的密度对p h 敏感性及其基因 转染性能的影响 最后 合成了三种二缩水甘油酯交联剂 环氧酯型 与低分子量的p e i 交联 制备可降解的p e i 衍生物 探索引入羟基和可降解组分对聚合物载体的水溶性和 细胞毒性的影响 通过初步评价 筛选出偶联羧酸官能团的p e i 衍生物 p 3 6 和丁二酸二缩水甘油酯 交联的p e i p 5 4 具有较高的转染效率 然后 这两种聚合物 b p e i2 5 k d a 和商品化的 试剂f u g e n 6 以2 9 3 细胞 b 1 6 f 1 0 细胞 a 5 4 9 细胞和h e p g 2 细胞为受体细胞 增强绿 色荧光蛋白质粒 e g f p 为报告基因进行了细胞转染实验 结果表明 p 3 6 p 5 4 的转 染效率高于b p e i2 5 k d a 与f u g e n 6 相当 这两种聚合物与d n a 形成的复合物的粒径 在1 0 0 n m 2 0 0 n m 之间 且与b p e i2 5 k d a 包裹d n a 的能力相似 p 3 6 p 5 4 的细胞毒 性低于b p e i2 5 k d a 总之 在聚合物中引入羧酸官能团和可降解组分对提高聚合物载 体的转染效率有积极作用 关键词 脂质聚合物 p h 敏感 可降解 聚乙烯亚胺 基因转染 a b s t r a c t硕上论文 a b s t r a c t p o l y e t h y l e n i m i n e p e i h a sb e e nk n o w na se f f i c i e n tg e n ec a r t i e rw i t l lt h eh i g h e s tc a t i o n i c c h a r g ep o t e n t i a l h i g l lt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yo fp e i a l o n gw i t hi t sc y t o t o x i c i t y s t o n g l y d e p e n d so ni t sm o l e c u l a rw e i g h t s m a l lp e ii su s u a l l yn o n c y t o t o x i cb u tl e s se f f i c i e n t i n o r d e rt oi m p r o v et h ec e l lt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y t h ee f f e c to fh y d r o p h o b i cm o i e t i e s c a r b o x y l f u c t i o n a lg r o u p sa n dd e g r a d a b l ec o m p o n e n t w h i c he h c h a n c et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y w a s s t u d i e di nt h i sp a p e r c r o s s l i n k i n gl o wm o l e c u l a rw e i g h tp e i 析t l ls m a l lc r o s s l i n k e r sa n d m o d i f i c a t i o no fs u i t a b l em o l e c u l a rw e i g h tp e lw e r eu s e dt or e d u c ec y t o t o x i c i t yo fp e ia n d e n c h a n c ei t st r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y f i r s t l y t ou n d e r s t a n dw h e t h e rt h eh y d r o p h o b i cp r o p e r t i e so fl i n e a rh y d r o c a r b o na l k y l c h a i n sa f f e c tt h et r a n s f e c t i o n c a p a c i t y o f p o l y m e r i cv e c t o r s w es y n t h e s i z e d n a l k y l a c r y l a m i d ew i t hv a r i e dl e n g t ho fh y d r o p h o b i cg r o u p sa n dn h y d r o x y s u c c i n i m i d e n h s e s t e r so fn a l k y l a m i ca c i dw h i c hh a v ev a r i e dl e n g t ho fs p a c e r a r m s p e id e r i v a t i v e s w i t h h y d r o p h o b i cg r o u p s w a s p r e p a r e dt h r o u g h a d d i t i o no f p o l y e t h y l e n i m i n e t o n a l k y l a c r y l a m i d eo rn h y d r o x y s u c c i n i m i d e n h s e s t e r so fn a l k y l a m i ca c i d s e c o n d l y w es y n t h e s i z e dp e id e r i v a t i v e s i n t ow h i c hc a r b o x y lg r o u p sw e r ei n c o r p o r a t e d t h ep u r p o s e o fm i d i f y i n gp e lw i t hc a r b o x y lg r o u pi st oi n v e s t i g a t et h ef u c t i o n a lr o l e so fc a r b o x y lg r o u pi n p o l y m e r m e d i a t eg e n ed e l i v e r y t h i r d l y d e g r a d a b l ep e id e r i v a t i v e sw a sp r e p a r e db y c r o s s l i n k i n gp e i2 7 0 0 诵t 1 1s m a l le p o x y b a s e dc r o s s l i n k e r s s oa st or e d u c ei t sc y t o t o x i c i t y i ni n i t i a ls c r e e n i n ga s s a y s w ep i c k e do u tp e id e r i v a t i v e s 州t l lc a r b o x y lg r o u p p 3 6 a n d p e id e r i v a t i v e sp r e p a r e db ya d d i t i o no fp e i2 7 0 0t os m a l le x p o y b a s e dc r o s s l i n k e r s 5 4 p 3 6 p 5 4 b p e i2 5 k d aa n df u g e n 6w e r ea c c e s s e dw h e n2 9 3c e l l b 16 f10c e l l a 5 4 9c e l la n d h e p g 2c e l la sr e c e p t e rc e l la n de n h a n c i n gg r e e nf l u r e s e e n tp r o t e i n e g f p a sr e p o r t e rg e n e t h er e s u l ti n d i c a t e dp 3 6a n dp 5 4h a v eh i g h e rt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yt h a nt h a to fb p e i2 5 k d a a n da r ec o m p a r a b l et ot h a to ff u g e n 6 p 3 6a n dp 5 4a r es i m i l a rw i t hb p e l 2 5 k d ai nt h e i r c o n d e n s i n gd n a i n t on a n o p a r t i c l e s f u r t h e r m o r e p 3 6a n dp 5 4h a v el o w e rc y t o t o x i c i t yt h a n b p e l 2 5 k d a i naw o r d t h e s et w op o l y m e r sa r es a f ea n de f f i c i e n tg e n ed e l i v e r yv e c t o r si n v i t r oa n da r ep r o m i s i n gt ob eu s e di nt h ef u t u r e k e yw o r d l i p o p o l y m e r p h s e n s i t i v e d e g r a d a b l e p o l y e t h y l e n i m i n e g e n et r a n s f e c t i o n u 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果 尽我所知 在 本学位论文中 除了加以标注和致谢的部分外 不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果 也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料 与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明 矽o c 年厂月纠1 3 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档 可以借阅 或上网公布本学位论文的部分或全部内容 可以向有关部门或机构送 交并授权其保存 借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容 对 于保密论文 按保密的有关规定和程序处理 知0 1 年6 月2 1 日 硕士论文p e i 衍生物的设计 合成及其转染性能的研究 1 绪论 r n a 干扰 r n ai n t e r f e r e n c e r n a i 技术是指与内源m r n a 同源的小片段外源双链 r n a d o u b l es t r a n d e dr n a d s r n a 导入细胞 产生约2 1 2 3b p 的小分子干扰r n a s h o r t i n t e r f e r e n c er n a s i r n a 从而导致特定基因表达沉默 目前这一技术已经广泛用于探 索基因功能 基因治疗等领域 显示出不可估量的学术价值和医用价值 随着多国科学家参与的人类全基因组计划进入尾声 揭示蛋白质结构与功能已成为 生物学领域研究的热点 由于r n a i 可以使特异基因m r n a 发生降解 从而获得蛋白 质功能缺失或降低的突变株 这使科学家可以利用r n a i 技术广泛地研究和观察不同基 因的功能 所以现在r n a i 已成为一种强有力的基因研究工具 r n a i 作用具有高效性和高特异性的特点 它能使目标蛋白的m r n a 发生特异性的 降解 因此 r n 也是基因沉默疗法的理想工具 它比以往的其他基因沉默技术 如 反义o d n 寡聚脱氧核苷酸 核酶等技术 更有效 更灵敏 更方便 更安全 随着2 0 0 6 年r n a i 的发现者获得诺贝尔奖 r n a i 技术已经不仅仅是研究基因功能的一种强大工具 目前利用r n a i 技术开发核酸药物己成为未来疾病的分子治疗学中一个非常重要的方 向 非病毒性基因或其他一些核酸药物将可作为一些重症疾病的替代疗法 但是这些疗 法通常需要对核酸药物进行全身给药 以便将核酸药物递送到靶细胞 从而对一些遗传 性疾病 病毒感染或癌症进行治疗 迄今 安全有效的载体的研发一直是限制基因药物 投放临床试验的瓶颈 尽管r n a 干扰存在诸如 脱靶效应 机体免疫反应 竞争微r n a 通路 对靶基因沉 默的非治疗作用等安全性问题i l 但其在反向基因组学 基因治疗 抗病毒 抗肿瘤 抗遗传疾病以及胚胎干细胞的研究中显示了巨大的潜力 并且正孕育着一场核酸药物开 发的新技术革命 因此r n a i 技术不论是作为有效的基因研究工具还是用其开发切实可 行的治疗药物其最大的障碍均在于如何将这些r n a 分子片段有效地转染到体内的靶细 胞f 2 转染是指通过机械 物理 化学和生物等方法将目标d n a r n a 或蛋白质带入真核 细胞中 使其发挥 定的生物学功能 现已成为研究基因表达 基因功能和蛋白质功能 的重要手段 安全高效地将核酸转移到特定的细胞中是基因治疗和r n a 干扰技术的核 心 也是基因表达调控 突变分析 蛋白质结构与功能分析等研究中的重要技术环节 因此是现代生物技术中最有价值和最经常使用的技术之一 当前主要使用的转染系统是 物理转染系统 基因枪 电穿孔和裸d n a 直接注射 病毒载体和非病毒人工合成的转染载体 其中物理转染系统只能应用于皮肤 肌肉和肝 脏等有限几种组织 因此转染载体主要集中于病毒载体系统和非病毒载体系统 l 绪论硕士论文 1 1 基因转染载体 用于转染的理想载体应符合三个主要标准 1 保护转基因免受细胞基质的核酸酶 的降解 2 携带转基因穿透细胞膜 进入细胞核 3 无有害影响 3 j 基因载体通常分为 病毒载体和非病毒载体 1 1 1 病毒载体 病毒载体是指将适当长度的外源d n a 插入病毒基因组的非必需区 包装成重组的 病毒颗粒 可供利用的病毒分为逆转录病毒 慢病毒 腺病毒 病毒载体能高效地介导基因转染 基因可长期表达 目前已有病毒载体转运基因治 疗血友病 心脏衰竭 关节炎 肌肉萎缩症以及其他一些疾病的临床试验 但是基因治 疗临床试验中发现的急性免疫反应 免疫原性 插入诱导变异已引起了关于一些常用的 病毒载体的安全问题的忧虑 病毒载体能转运遗传物质到多种细胞 但制备和使用操作 复杂 价格较高 和重组病毒运送质粒的尺寸有限 特别是有潜在的安全等问题 促使 研究者转向非病毒基因转染体系1 4 j 1 1 2 非病毒载体 非病毒载体由于具有低细胞毒性 低免疫原性和易制备和使用等优点 所以受到越 来越多的关注 随着非病毒载体的转染效率逐渐提高 非病毒载体获得了更加广泛的使 用 这也使基因治疗前景越来越光明 非病毒载体主要是指聚合物载体 包括聚合多肽 和脂质体 目前已经合成了多种非病毒载体 其中聚合物基因载体占有重要的地位 研 究较多的聚合物基因载体主要有阳离子多聚物型载体 非缩聚型聚合物体系 可生物降 解的聚合物体系 多复合脂质体体系 热 p h 敏感聚合物体系及聚合型胶束体系等 本 文着重介绍了阳离子脂质体和p e i 两种最典型和最热门的非病毒载体 1 1 2 1 阳离子脂质体 阳离子脂质是一类普遍用于基因转运的合成载体 自从1 9 8 7 年被f e i g n e re t a l 第一次 用于基因传递 5 j 已合成大量阳离子脂质 也叫细胞转染试剂或脂质体转染试剂 并应 用在细胞培养 动物和逐步进行第一阶段和第二阶段的病人临床实验的转染 阳离子脂 质的制备技术简单 迅速 因此在体外细胞水平的转染实验中获得了广泛地使用 多价阳离子通过与带负电荷的核酸间的静电作用 是对核酸进行浓集压缩 并形成 微粒的关键组分 虽然体外实验证明阳离子脂质具有各种优点 但当l i p o p l e x e s 注射进 人血液后 它的表面能与血浆蛋白产生强烈相互作用 还能跟含有多糖一蛋白质复合物 的组织发生作用 这种相互作用导致了l i p o p l e x e s 在体内循环中的快速清除 半衰期 5 r a i n 这种快速清除具有双重危害 第一 容易导致机体炎症反应 第二 到达靶组 织的药量减少 为了克服这些缺点 一种办法是采用在酸性条件下带正电 但在p h7 4 2 硕士论文p e i 衍生物的设计 合成及其转染性能的研究 时呈电中性的可滴定阳离子脂质 6 j 另一种办法是在微粒形成后通过共价修饰将阳离子 基团转化成阴离子或电中性基团 还有一种办法是设计一种通过二硫键连接的能将d n a 包裹进纳米粒的阳离子脂质 在二硫键交换反应后 微粒表面的电荷可以变成负电或呈 电中性忉 由于阳离子脂质复合物的体内毒性和快速清除性 可以选用阴离子脂质微粒 以降 低载体微粒与带负电荷的血清蛋白 如白蛋白以及细胞外基质的非特异性结合 在这种 方法中 d n a 通常被阳离子聚合物聚乙烯亚胺 p o l y e t h y l e n e i m i n e 鱼精蛋白硫酸盐或 聚赖氨酸预先浓集压缩成为纳米级别的阳离子核 然后加入阴离子脂质或脂质体作表面 衣膜 最终形成带负电荷或电中性的脂质微粒 s 9 1 p e g 是一种惰性的生物相容性材料 它能极大程度地减小微粒与细胞表面的相互作 用 体外研究表明 p e g 化的脂质微粒载体可以减少与细胞膜的作用 降低基因的细胞 转染率 从而减少细胞对d n a 微粒的摄取 另一方面 p e g 化的脂质能大幅提高基因载 体系统的安全性 这是由于它能提高载体系统在体内的稳定性 延长其体循环时间 从 而降低释药系统的毒副作用i l 训 某些阳离子聚合物 如p e i 聚乙烯亚胺 是有效的体外转染试剂 将脂质分子 如胆固醇用p e i 修饰后 再接合到聚合物主链上 这就生成了水溶性的脂质共聚物 它 被认为整合了阳离子脂质和多聚阳离子的双重特性 d n a 能够迅速地被这种共聚物所包 裹 并且可以从内含体中脱离到细胞质中或跨越胞膜进入到细胞质中 目前这种整合阳 离子脂质和多聚阳离子聚合物结构的设计正成为新型基因载体开发的趋势 例如r o b e r t l a n g e r 和d a n i e lga n d e r s o n l 利用各种小分子多胺与各种链长的丙烯酰胺或丙烯酸酯 进行麦克尔加成反应 最后组合合成获得了大量的类脂质产物 从中筛选的化合物已进 行了动物体内转染实验取得很好的应用效果i l 1 2p h 敏感的基因转运体系 病变组织的p h 曲线 如炎症 感染 癌症 与正常组织显著不同 全身部位的感染 原发肿瘤 转移肿瘤的p h 值低于正常细胞的p h 值 这个性质可以被用来制备刺激 反应 药物或基因运载体系 实现疾病部位的靶向运输 病变和正常的细胞具有跨膜p h 梯度 可以被用来细胞内运输大分子 众所周知 细胞组件如 细胞质 内涵体 溶酶体 内 质网 高尔基体 线粒体和细胞核都维持独特的p h 值 1 2 p h 值从溶酶体的4 5 变化到线 粒体的8 0 考虑到p h 值梯度 p k a 值5 0 8 0 的治疗化合物理化性质发生显著的变化 进 而改变整个转运体系的基因包裹能力 因此 具有p h 敏感的基因转运体系将对基因的细 胞内运输产生积极的影响 分为p h 敏感脂质体 p h 敏感聚合物载体 l 绪论硕士论文 1 2 1p h 敏感脂质体 为了实现脂质体以p h 可调控的方式释放活性包裹物 使用p h 敏感组分修饰脂质体 p h 敏感脂质体被细胞内吞 跨越细胞膜 在核内体微酸性环境下与核内体膜融合 并释 放活性包裹物进入细胞质 1 3 最近的研究主要集中于构建新的脂质分子和有p h 敏感性 或用不同p h 敏感聚合物修饰的脂质体 l4 1 使脂质体具有表面亲水性以延长寿命和配体 介导靶向定位的能力 综合p h 敏感度 延长的寿命和靶向定位能力的脂质体能够将包合 物运送到细胞质 目前已尝试不同方法制备p h 敏感脂质体 例如混合p h 敏感的两性分子比如油酸 1 5 和胆固醇半丁酸 1 6 j 和非双分子层的磷脂二油酰基磷脂乙醇胺制备p h 敏感脂质体 在这 种情况下 p h 敏感两性分子作为p h 敏感稳定剂 只在带负电荷时稳定不稳定的脂质体 用于制备该种类型p h 敏感脂质体的脂质分子有强烈的形成六角形结构的倾向 使混合法 制备的脂质体双分子层结构容易受到破坏 释放包裹药物或基因的能力 混合p h 敏感两 性分子和脂质分子制备p h 敏感脂质体的方法不能彻底改善脂质体不稳定的缺陷1 1 7 1 另外一个有效制备p h 敏感脂质体的方法是p h 敏感的膜活性分子修饰脂质体 多种 融合蛋白的多肽衍生物和其类似物已用于脂质体膜 带有羧基的合成两性聚合物已被用于制备p h 敏感脂质体i t s j 9 带有羧基的两性聚 合物通过疏水碳链与预先形成的脂质体疏水作用 固定在脂质体脂质体表面 修饰的脂 质体在中性p h 环境下稳定 在微酸性p h 环境下 羧基结构单元质子化导致溶解脂质 体的脂质分子去稳定化 并释放脂质体包裹物 a l i ap o l o z o v a 和f r a n c t i o i s em w i n n i k 制备了含十八烷基疏水碳链和羧酸残基的聚丙烯酰亚胺无规共聚物 并证实带有羧基的 两性聚合物与一系列的囊泡 脂质体 相互作用 而固定在脂质体表面 脂质体和共聚 物间结合力主要包括带电荷的双分子层脂质体和甘氨酸残基 羧酸基 的静电吸引以及 较弱的疏水相互作用 2 0 l m i r af f r a n c i s 和g a n g ad h a r a 将含十八烷基疏水碳链和羧酸 残基的聚丙烯酰亚胺无规共聚物与脂质体复合 2 稳定脂质囊泡的同时 使脂质体囊泡 具有p h 敏感性 在p h 7 2 时复合的脂质囊泡4 c 下9 0 天内维持脂质体双分子层结构 3 7 c 微酸性环境下 聚合物破坏囊泡双分子层结构 释放包裹物 因此脂质体能通过噬 菌作用内化后运输包裹物进入细胞质 上述方法通过添加两性聚合物到脂质体体系 克服脂质体不稳定和缺乏可调控的药 物释放的缺点 由于两性聚合物简单附着在脂质体表面 修饰物仍容易从脂质体表面解 离 s a n g m i nl e e 等 2 2 首先制备裸脂质体 然后加入带胆固醇末端的聚丙烯酸 c h 0 1 p a a 胆固醇单元可以轻易插入已形成的脂质体 聚丙烯酸固定在脂质体表面 最后加入l 8 二氨基 3 6 氧辛烷 交联聚丙烯酸成笼状分子 制得的聚合物笼脂质体 p c l s 高度稳定 冻干成粉状 再分散而无凝聚结构损失 它们能在酸性环境下 释 放有效负载如 钙黄绿素 4 硕士论文p e i 衍生物的设计 合成及其转染性能的研究 与基于多肽的p h 稳定剂相比 由于制备简便和低的免疫原性合成聚合物有更大的优 势 1 2 2p h 敏感聚合物载体 由刺激 敏感的聚合物构造的纳米颗粒已被提议用作抗癌药物的运输体系 刺激 敏 感聚合物的物理性质的变化 如 溶胀 退胀 颗粒破坏和聚集 响应环境条件的变化 进而改变纳米颗粒 细胞的相互作用 在肿瘤部位控制药物从慢到快释放 p h 敏感的聚 p 氨酯 p b a e 作为新型可生物降解的阳离子聚合物 推动了靶向药物和基因传递 体系的发展 在肿瘤的酸性微环境下 p b a e 经历了迅速析出的过程 并立刻释放它的 包含物 使用p b a e 纳米颗粒转染体系 肿瘤部位的紫杉醇积累量比使用聚己内酯 p c l 8 p h 敏感聚合物 纳米颗粒包含紫杉醇显著增加 2 3 2 4 2 5 2 6 1 普鲁兰醋酸 一种线形多 聚糖 引入磺胺二甲氧嗪以制备p h 敏感的自组装纳米水凝胶颗粒 低p h 值下亚德里亚 霉素的释放增加 细胞毒性增加 2 7 另外 可以通过控制疏水烷基部分链长控制聚合物载体的p h 敏感度 s t a y t o ne ta 1 幽j 表明可以通过选择不同的烷基丙烯酸和丙烯酸 烷基丙烯酸的比例控制聚 烷基丙烯 酸 的p h 敏感度 聚丙基丙烯酸 聚 烷基丙烯酸 家族的一员 在p h 6 5 时能有 效破坏脂质体膜 显著提高脂质体复合物的体外转染效率 同时带有疏水烷基和羧基的两性聚合物包裹药物后 进入微酸性的环境中 由于聚 合物中羧酸质子化显示出p h 敏感性 释放包裹物 因此 羧酸是p h 敏感转运体系的 不可缺少的组分 1 3 聚乙烯亚胺 p e i 衍生物作为基因载体 可以制备不同长度 分枝或线性的p e i p e i 伯胺能与大多数功能官能团发生取代或 加成反应 p e i 是在非病毒基因载体体系中 对各种各样的细胞类型有超越其他体系的 转染能力 p e i 聚合物能与d n a 分子成功复合 形成均匀的球形颗粒 研究表明低分子 量的线形p e i 有最有效的转染和最小的毒性 2 9 1 非质子化的不同p k a 值的胺在较宽范围 p h 下有缓冲能力 使d n a 以所谓的 质子海绵效应 机理从核内体释放 3 0 但是大量 的正电荷和不可降解性在体内产生相当的毒性 3 1 3 2 1 因此以p e i 为有效成分进行新型的 基因载体的设计与合成一直在积极地进行中 其中利用各种交联剂交联小分子p e i 或对 合适分子量的p e i 进行修饰是目前的主要研究方向 1 3 1p e i 聚乙二醇偶联物 p e i d n a 复合物表面大量的正电荷虽然对吸附在细胞表面有利 但是导致红细胞聚 集 并与血浆成分 血清蛋白 血浆纤维蛋白原 补体c 3 作用 结果 p e i d n a 复合物 在血清存在下不稳定 对转染效率的提高和聚乙烯亚胺复合物的体内应用非常不利 5 l 绪论硕士论文 一个增加颗粒体内半衰期的方法是屏蔽或掩盖表面电荷 脂质体领域研究结果表明 带有亲水分子如 聚乙二醇 p e g 涂层的囊泡能明显减少肝脏和脾脏的巨噬细胞吸收 进而增加血液中循环时间1 3 引 最近相同的屏蔽p e i d n a 复合物表面电荷的方法被不同研 究小组应用于修饰p e i 聚合物的转染颗粒 通过在聚合物复合物的表面形成亲水聚合物 层 获得立体稳定性 因而减少自动或非自动的非特异性相互作用 该方法的缺点是亲 水臂聚乙二醇屏蔽复合物表面正电荷的同时 也会减若复合物和靶向细胞的相互作用 3 4 1 因而p e g p e i 偶联物的体外转染效率明显低于未修饰的相应复合物 但是一些研究 小组注意至u p e g 化后仍能有效转染 p e g 的转染抑制效应依赖几个参数 p e g 链长 p e g 密度 p e l 分子尺寸 可以解释这种差别 p e g 化的另外一个益处是明显降低p e i d n a 复合物的细胞毒性 1 3 2 靶向细胞的载体 p e i 偶联物 p e i d n a 复合物通过与带负电的细胞膜静电吸引吸附在细胞表面 然后内化进入细 胞 由于p e i d n a 复合物表面正电荷使其极易与血液组分发生非特异性作用 在较短的 时间内几乎被全部清除 一个非常有吸引力的策略是用细胞特异性作用取代细胞和转染 复合物的静电相互作用 以触发d n a 复合物的受体介导内吞 这种主动靶向要求在靶向 细胞表面存在可识别的受体 使用的载体与之有高的特异性和识别位点亲和性 不同类 型的载体 如 糖残基 肽 蛋白和抗体被用于p e i d n a 复合物的靶向 1 3 3 可降解p e i p e i2 5 k d a 有较高的转染效率 但细胞毒性非常大 低分子量的p e i 细胞毒性较小i 却几乎没有转染效果 因此 几位研究者用低分子量的p e i 和体内可降解的交联剂合成 高分子量的交联p e i 衍生物 l e ee t a l 3 5 l 使用3 3 二硫代二丙酸琥珀酰亚胺酯作为二硫交 联剂合成交联低分子量的p e i 所得的交联p e i 介导的基因转染效率匕i p e i2 5 k d a 低两倍 但是对培养的细胞毒性较小 酯键交联剂是一种在细胞微酸性环境下可以水解的交联剂 k i me t a l l 3 6 使用含有酯 键的p e g 双官能团化合物交联低分子量的p e i 交联p e i 与p e i2 5 k d a 细胞活性4 0 0 o 相比 有较低的细胞毒性 细胞活力8 0 转染效率比相应的母体高3 倍 但不如p e i 2 5 k d a 用酯键交联剂 l 4 丁二醇二丙烯酸酯 l 6 己二醇二丙烯酸酯交联低分子 量p e i 所得的p e i 衍生物 d n a 复合物能保留d n a 达2 4 d 时 这些聚合物复合物对c 2 c 1 2 细胞的毒性较不可降解的p e i2 5 k d a 明显减轻 而转染效率 i p e i2 5 k d a 高2 1 6 倍 3 7 1 c h oe t a l l 3 s 用p e g 二丙烯酸酯交联低分子量的聚乙烯亚胺 细胞毒性较低 交联p e i 1 3 k d 对2 9 3 t h e p g 2 和h e l a 细胞几乎没有毒性 交联p e i 最高转染效率可达p e i2 5 k d a 的1 5 2 5 倍 k i me ta l i j 卅以戊二醛交联低分子量的p e i 所得的高分子量p e i 有酸不稳定性 在p h 6 硕上论文p e 衍生物的设计 合成及其转染性能的研究 5 4 环境中半衰期为2 5 h 酸不稳定的交联p e i 细胞毒性低于p e i2 5 k d a 但是转染效率也 低于p e i2 5 k d a 在p e i 骨架引入可降解组分后 大多数交联p e i 衍生物虽然细胞毒性低于p e i2 5 k d a 但是转染效率没有达至f j p e i2 5 k d a 的水平 1 3 4 水溶性脂质聚合物 p e i 正电荷密度高 但是p e i 的毒性与其相对分子质量有关 低分子量p e i 毒性较高 分子量p e i 低 但与d n a 形成的复合物颗粒粒径却较大 在体内易聚集 低分子量p e i 的转染效率比高分子量p e i 低 高分子量p e i 转染效率较高而细胞毒性大 阳离子脂质体 的阳离子密度低 每个脂质分子含一个或几个带正电的胺 以致大量的脂质分子才能对 d n a 有效包裹 但是阳离子脂质体的疏水官能团有助于形成胶束 并与细胞膜作用 促 使脂质体复合物穿透细胞膜 鉴于p e i 和脂质体各有优缺点 许多研究者使用疏水官能 团修饰聚乙烯亚胺 综合两者的优点 伯胺和仲胺官能团与d n a 缩合 叔胺促进细胞浆 质逃离 而亲脂组分提高p e i 衍生物的细胞膜穿透性m j 脂质聚合物的疏水官能团可以是胆固醇 也可以使脂肪长链 胆固醇与磷脂是共 同构成细胞膜和脂质体的基础物质 胆固醇具有调节膜流动性的作用 故可称为 脂质体 流动性缓冲剂 因而胆固醇作为脂质体配方中重要的中性脂质 对于 提高脂质体的稳定性非常重要 s a n g o hh a n r a mi m a h a t o 4 l j 等使用分枝聚乙烯 亚胺 p e i m w l8 0 0 和胆固醇氯甲酸酯合成无毒的水溶性脂质聚合物 w s l p 这些水 溶性脂质聚合物与d n a 质粒紧密复合 纳米复合物颗粒尺寸在2 5 9 1 4 8 5 n m 之间 以 c t 2 6 结肠腺癌细胞和2 9 3 t 人胚肾转化细胞为转染对象 与p e l 2 5 0 0 0 p c m v l u c 或p e i 1 8 0 0 p c m v l u c 相比 对c t 2 6 细胞和2 9 3 t 细胞都有较高的转染效率 聚合物母体结构也是影响水溶性脂质聚合物转染能力的重要因素 d a r i ny 等用胆固 醇修饰三种几何构形的高分子量l p e im w2 5k d a 线形 l t 形 t 线形厂r 形制备l p e i 胆固醇偶联物 l p c 分别为l p c l l p c t l p c l t l p c t p d n a 复合物的纳米颗粒 尺寸大约2 5 0 n m 表面电荷 1 0 m v 在d n a 酶存在下该复合物保护d n a 达1 8 0 分钟 l p c l 和l p c t 转染b 1 6 f 1 0 细胞 结果表b l p c l p d n a 复合物的蛋白表达水平高于 l p e i 是b p e i 的两倍 但是细胞活力没有明显的降低 l p c t p d n a 复合物不同转染率 的部分原因在于复合物与质膜相互作用的位点构形发生变化1 4 2 1 以上方法不加选择的偶联胆固醇单元偶联n p e i f l 胺和仲胺官能团 因为伯胺官能 团对d n a 缩合有重要作用 不可避免地减弱p e i 与d n a 的缩合 d o n g a nw a n g 等t 4 0 j 将胆 固醇氯甲酸酯连接到分子量为1 8 0 0 和1 0 0 0 0 的b p e i 的仲胺官能团制备水溶性脂质聚合 物 且只有一个胆固醇分子嫁接n p e l 分子上 为p e i 和d n a 的空间相互作用预留了足够 空间 制得的复合物纳米颗粒尺寸在l1 0 2 5 0 n m 之间 电位2 3 m v 到3 0 m v 7 l 绪论硕 卜论文 p e i c h o l p c m s e g f p 复合物体外转染j u r k a t 细胞 绿色荧光蛋白表达水平较高 而毒性 较低 王燕铭等使用分子量的聚乙烯亚胺 p e l 6 0 0 及其胆固醇衍生物与聚 l 天冬酰胺 c o l 赖氨酸 p s l 进行开环反应 合成一类新型的肿瘤靶向基因载体 合成聚合物的 复合物能与d n a 形成结构稳定的复合物 在聚合物侧链引入一定数目的胆固醇 可以明 显提高载体对于癌细胞h e p g 2 和h e l a 的转染效率 这类新型的基因载体具有良好的细胞 相容性 较高的转染效率以及易于进行靶向修饰等特点 在基因治疗研究领域中将具有 较好的潜在应用价值 4 引 水溶性脂质聚合物的另一类亲脂官能团是脂肪长链 a w sa l s h a m s a n 等l 4 4 j 制备油酸 和硬脂酸修饰的聚乙烯亚胺衍生物 这些疏水修饰的聚乙烯亚胺衍生物与s i r n a 缩合能 力高达母体p e i 的三倍 胎牛血清中能有效保护s i r n a 避免分解 修饰聚乙烯亚胺转染 s i r n a 至b 1 6 黑色素瘤细胞 转染效率优于母体p e i 甚至与一些商用试剂的转染效率相 当 n a t h a np 等通过乙酸酐修饰b p e i 提高了b p e i 的转染效率 修饰b p e i 的转染能力随 着乙酰化度的改变 出现规律性的变化 p e i d n a 复合物的基因转运能力随着乙酰化度 的提高而增加 而当乙酰化度超过伯胺的5 7 时 基因转运能力随着乙酰化度的提高而 降低 基因转运能力的规律性变化可能是由于聚合物缓冲能力和聚合物 d n a 相互作用 强度的适当平衡1 4 引 无论胆固醇修饰还是脂肪酸修饰聚乙烯亚胺 都可能一定程度提高p e i d n a 复合物 的基因转染效率 一方面可能是由于脂肪长链屏蔽了聚乙烯亚胺表面多余的正电荷 使 p e i 复合物纳米颗粒的稳定性提高 另一方面使聚合物缓冲能力和聚合物 d n a 结合强度 得到适度的平衡 促进包裹d n a 在细胞质及时释放 1 4 本文研究内容 综上所述聚合物载体的设计一般应考虑如下组分 1 阳离子组分 主要用于缩合 负电性的d n a 与d n a 形成复合物 2 p h 敏感组分 使其包裹d n a 后进入细胞后在 细胞的内涵体的酸性环境下可以迅速解离 将d n a 释放到细胞质内 目前文献报道的主 要是在聚合物骨架上偶联羧基 脂质体中加入阴离子的磷脂酰乙醇胺 3 碳水化合物 衍生物等 其作用是提高组织相容性 改善水溶性和提高靶向性及核定位能力 4 疏 水官能团 主要是不同链长的烷基侧链 其作用是帮助所形成的转染复合物更易于插入 细胞膜 从而有利于细胞的内吞吸收 5 聚合物骨架上和侧链上的可降解组分 其目 的是进入细胞后 在内涵体等酸性细胞器内及时失去与d n a 的结合能力 释放游离的 d n a 进入细胞质 促进d n a 的细胞核内表达 这样通过改变聚合物载体的结构 从而 导致影响其包裹d n a 的行为 达到改善和调整聚合物载体的生理性质和转染能力的目 8 硕上论文p e i 衍生物的设计 合成及其转染性能的研究 的 基于上述认识 我做了三方面的研究工作 1 合成了n 十二烷基丙烯酰亚胺 n 壬基丙烯酰亚胺 n 丁基丙烯酰亚胺 n 丁基琥珀酰胺酸n h s 活化酯 n 十二烷基琥珀酰胺酸n h s 活化酯和n 丁基戊酰胺酸 n h s 活化酯等中间体 与p e l 2 7 0 0 和p e l 2 5 l a 的伯胺反应 制得相应的p e i 衍生物 探索了不同疏水碳链长度和疏水碳链与p e i 聚合物骨架间的连接臂长度对p e i 衍生物的 亲油 亲油平衡的调整能力 进而考察其水溶性 转染效率和细胞毒性 评估在p e l 分 子中引入疏水的亲脂组分对p e i 衍生物的转染能力和其对转染细胞的毒性的影响 2 使用p e i2 7 0 0 和p e i2 5 k d a 作为母体化合物 分别与琥珀酸酐 戊二酸酐 a 甲基丙烯酸反应 制得一系列不同羧酸修饰度和不同羧酸官能团与p e i 骨架间连接臂长 度的p e i 衍生物 探讨了聚合物侧链上不同的羧基修饰度和不同结构的羧基修饰改变 p e i 衍生物的p h 敏感度的能力 以及对p e i 衍生物包裹d n a 的能力和从内涵体逃离 进入细胞质后与d n a 解离的能力的影响 进而弄清在p e i 侧链偶联羧基是否能够提高 p e i 衍生物的转染效率 3 合成了己二酸二缩水甘油酯 二硫代二丙酸二缩水甘油酯 丁二酸二缩水甘 油酯等三种环氧酯型的交联剂 与p e l 2 7 0 0 反应生成交联的p e i 使用环氧酯型交联剂 是为了在交联p e i 衍生物中引入羟基 改善其水溶性 酯键型交联剂可以使交联p e i 衍生物进入细胞后 在内涵体的微酸性环境中水解成低分子量的p e i 使p e i 衍生物的 细胞毒性降低 选用三种不同的环氧酯型交联剂是为了通过改变交联长度和引入比酯键 更容易降解的二硫键 证实调整交联p e i 衍生物的结构和降解速度对提高其转染能力和 降低细胞毒性有重要作用 9 2p e 衍生物的合成和修饰 硕士论文 2p e i 衍生物的合成和修饰 2 1 实验试剂及仪器 2 1 1 实验试剂 表2 1 1 实验试剂列表 试剂名称生产厂商及规格 十二胺 壬胺 丁胺 丙烯酰氯 戊二酸酐 丁二酸酐 a 甲基丙烯酸 n n 二环己基碳二亚胺 d c c n 羟基琥珀酰亚胺 n h s 环氧氯丙烷 己二酸 二硫代二丙酸 丁二酸 十六烷基三甲基溴化铵 氢氧化钠 无水m g s 0 4 三乙胺 碳酸钾 碳酸氢钠 氯化钠 盐酸 3 6 3 8 b p e l 2 7 0 0 d a b p e l 2 5 k d a 无水乙醇 二氯甲烷 四氢呋喃 a i f aa e s a r a r 天津市光复精细化工研究所 a r 成都市科龙化工试剂厂 a r 遍海达瑞精细化工品有限公司 a r 遍海达瑞精细化学品有限公司 a r 遍海凌锋化学试剂有限公司 a r 遍海凌锋化学试剂有限公司 a r 遍海晶纯试剂有限公司 a r 遍海晶纯试剂有限公司 a r 南京化学试剂有限公司 a r 中国医药集团呢遍海化学试剂公司 a r 东京化成工业株式会社 a r 国药集团化学试剂有限公司 a r 遍海凌峰化学试剂有限公司 a r 遍海凌峰化学试剂有限公司 a r 遍海试四赫维化工有限公司 a r 遍海金山亭新化工试剂厂 a r 遍海凌锋化学试剂有限公司 a r 南京化学试剂有限公司 a r 遍海凌锋化学试剂有限公司 a r 逅海中试总公司 a r s i g m a s i g m a 国药集团化学试剂有限公司 a r 南京化学试剂有限公司 a r 遍海四赫维化j 阳育限公司 a r l o 硕 t 论文p e i 衍生物的设计 合成及其转染性能的研究 表2 1 1 实验试剂列表 续 试剂名称生产厂商及规格 无水乙醚 丙酮 d 限 d m s o 上海实验试剂有限公司 a r 上海凌锋化学试剂有限公司 a r 国药集团化学试剂有限公司 a r 国药集团化学试剂有限公司 a r 氯仿 上海申博化工有限公司 a r 2 2 实验内容 2p e i 衍生物的合成和修饰 硕士论文 实验步骤 5 4 m l 三乙胺 3 7 4 r e t 0 0 1 5 2m l 丙烯酰氯 6 5 m m 0 1 m 时加入3 2 4 m m o l 正十二胺 或正壬胺或正丁胺的冷氯仿溶液中 冰浴过夜反应 反应液用含少量h c i 的n a c i 溶液 洗涤几遍 然后n a c i k 2 c 0 3 饱和溶液洗涤 最后无水m g s 0 4 干燥 过滤 旋蒸除氯仿 丙酮中结晶两次 得白色晶体 n 壬基丙烯酰亚胺 n 丁基丙烯酰亚胺的合成与n 一十 二烷基丙烯酰皿胺刚4 6 1 2 2 1 2p e i 衍生物的合成 反应式 j 眦 队n j n 二r l r c h 2 ii c h 3 2 r c h 2 s c h 3 3 r c h 2 3 c h 3 实验步骤 称量o 5 9p e i2 7 0 0 d a c 2 h 5 n 1 1 6 m m 0 1 在2 0m l 烧瓶中溶于1 5 m l