（分析化学专业论文）荧光相关光谱单分子检测系统研究及应用.pdf

内容摘要 内容摘要 举分子研究楚人们长期以米瀚梦想 也楚j 砭十多年来的研究燕点 国予在单 分子检测中背景的影响非常严重 近年来的研究重点都集中在如何获得黼信背比 的肇分子售号上 本工作报告基予激光共焦构溅 构建了一套离灵敏浚 高稳定性的荧光相关 光谱 f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y f c s 单分子检测系统 该系统采用 激光激发 鼹高数镶藐径物镜後激光柬聚焦 弗震露一物镜收集榉茹的荧光 单 光子计数器角于实时记录荧光信譬 该荧光语母用相关器实时相关 整个系统操 持物镜焦点 针孔以及单光子计数器光敏区同轴 该自组装系统在光学收集方面 采耀了独特的设计 健淹学睃集效率褥到更鼯嬲挺裹 对鼙个r h o d a m i n eg r e e n 分 子 冀信磉比超过3 0 0 完全能够实现单个分予的检溅 用建立的荧光相关光谱装置对荧光纳米量子点的一些特性 如流体幼力学直 径 攀分子亮度以及分子量进行了疆究 缝豢袭疆 荧光鞠关光谱方法镯攀 快 速 需要样品量少 是一种新的 可靠的荧光爨子点表征方法 对自合成爨子点 的研究寝明 量子点缀包壳后 即形成核 壳结构 其表磷化学稳定性显藩增加 健单分子亮度有瑟下隆 该装置还用于诺配修复蛋白 镣配d n a 辐强作用研究 捩酸分子杂交一点突 变研究以及与微流控芯片的联用中 这些工作寝明 荧光相关光谱在生物单分子 糗溅磷究中可发撂纛要终臻 关键谰 荧光相关光谱 单分子梭溯 共焦 爨子点 蛋囱一d n a 相互作用 核 酸杂交 微流控芯片 联用 a b s u a c t a b s t r a c t s t u d yo ns i n g l em o l e c u l eh a sb e e np e o p l e sd r e a ma n dh a sa t t r a c t e dm o r ei n t e r e s t si n t h el a s td e c a d e b e c a u s eo ft h es e r i o u sb a c k g r o u n dn o i s ei ns i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n s m d m o s t o f t h ei n t e r e s t sa r ef o c u s e do ni m p r o v i n gt h es i g n a l t o b a c k g r o u n dr a t i oo f s i n g l em o l e c u l e i nt h i sr e p o r tas e n s i t i v ea n ds t a b l ef l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y f c s s e t u p f o rs i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o nw a sd e v e l o p e db a s e do nac o n f o c a lm o d el a s e rw a su s e d a st h ee x c i t e dl i g h ts o u r c ea n dw a s h i 曲l yf o c u s e db yu s eo f t h eo b j e c t i v ew i t hh i g h n u m e r i ca p e r t u r e t h ey i e l d e df l u o r e s c e n c es i g n a l sw e r ec o l l e c t e db yt h es a m e o b j e c t i v e a n dw e r er e a l t i m er e c o r d e d b y as e n s i t i v e s i n g l ep h o t o nc o u n t i n gm o d u l e t h e s e f l u c t u a t i o n si nf l u o r e s c e n c ew e r ea u t o c o r r e l a t e di nt i m e t h ek e yf a c t o rt oo b t a i na g o o df c s c u r v ew a st oa l i g nt h ep i n h o l ew i t ht h eo b j e c t i v ef o c u sa n dt h ea c t i v ea r e ao f t h es i n g l ep h o t o nc o u n t i n gm o d u l e s i n c eau n i q u ed e s i g nw a sa p p l i e di nt h eo p t i c a l c o l l e c t i o ns e c t i o n t h ee f f i c i e n c yf o rc o l l e c t i n gy i e l df l u o r e s c e n tp h o t o n sw a s i m p r o v e d e f f e c t i v e l y t h es i g n a l t o b a c k g r o u n dr a t i of o rs i n g l er h o d a m i n eg r e e nm o l e c u l ew a s m o r et h a n3 0 0 t h i si n d i c a t e dt h a tt h eh o m e b u i l tf c s s e t u pc o u l db eu s e dt od e t e c t s i n g l em o l e c u l e t h eb u i l tf c ss e t u pw a su s e dt oc h a r a c t e r i z et h el u m i n e s c e n tq u a n t u md o t s q d s s o m eo ft h e p r o p e r t i e s s u c h a st h e h y d r o d y n a m i cd i a m e t e r o ft h e p a r t i c l e s t h e b r i g h t n e s so fs i n g l em o l e c u l ea n dt h em o l e c u l a rw e i g h t w e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ef c sm e t h o dw a ss i m p l e r a p i da n dl o ws a m p l e c o n s u m p t i o n a n di sa a b s t r a c t n e w r e l i a b l ec h a r a c t e r i z a t i o nm e t h o df o rf l u o r e s c e n tq d s b yc a p p i n gq d sw i t hah a r d s h e l l pf o r m i n gac o r e s h e l ls t r u c t u r e w ef o u n dt h a t t h e s t a b i l i t yo ft h es u r f a c e c h e m i s t r yw a si m p r o v e d w h i l et h eb r i g h t n e s so f s i n g l em o l e c u l ew a sd e c r e a s e d b e s i d e s t h ef c ss e t u p w a sa l s ou s e dt oi n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o no f m i s m a t c h e d r e p a i r p r o t e i n m u t s w i t ht h em i s m a t c h e dd n a t h eh y b r i d i z a t i o no f n u c l e i ca c i df o rp o i n t m u t a t i o n a n dt h eh y p h e n a t i o nw i t hm i c r o f l u i d i cc h i p t h e s ew o r k ss u g g e s t e dt h a tf c s t e c h n i q u ep l a y a ni m p o r t a n tr o l ei ns i n g l eb i o m o l e c u l ed e t e c t i o n k e y w o r d s f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y s i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n c o n f o c a l q u a n t u md o t s i n t e r a c t i o n o fp r o t e i nw i t h d n a h y b r i d i z a t i o n o fn u c l e i ca c i d m i c r o f l u i d i cc h i p h y p h e n a t i o n 上海交通大学博士后出站工作报告 第一章单分子检测及荧光相关光谱技术研究进展 随着对自然界认识的不断深入 人们已经不满足于只对宏观世界的了解 而 更想从微观领域探索自然界的本质 分子作为组成物质世界的一个塌基本单元 小到无机小分子 大到生物大分子 都具有复杂的结构和丰富的性质 直接观察 研究 操纵甚至加工单个分子一直都是人们的梦想 随着科学技术的发展 些 高分辨率高灵敏度的分析仪器不断涌现 与之相适应也诞生了 门新的学科一单 分子科学 单分子的研究经历了一个有趣的发展历程 1 9 5 2 年 e s c h r 6 d i n g e r t l j 宣称人类 永远也不可能只对一个电子 原子或分子进行实验 但是仅过了8 年 f e y n m a n 2 i 就指出 按照我们的意愿安排原子不会有任何实质性的限制 到了二十世纪八十 年代初 扫描隧道显微术 s t m p 的出现从根本上改变了人们的观念 该技术的 出现使人类首次在三维空间下观察到单个原子在物质表面的排列状态 随后对单 分子单原子的研究如雨后春笋般热了起来 继s t m 之后 科学家们又陆续发展 一些单分子 原子 研究方法 如原子力显微术 a f m 近场扫描光学姥微术 n s o m 等 上述这些方法都是基于对固态介质上的单分子 原子 进行分析的 和固态介质上的单分子 原子 研究相比 溶液中的单分予检测更具有挑战 性 由于在溶液中分子总是处于不断的运动 导致其不能固定在某 位置i 二 因 此溶液中的单分子运动轨迹更难跟踪 因为绝大多数的化学反应都是在溶液中进 行的 组成生物体的基本单元一细胞内也存在大量的生物化学反应 因此研究溶 液中的单分子行为更具有重要的意义 如果说对固态介质 包括固体表面 上的 单分子 原子 研究大大促进了纳米科学的发展 那么溶液中的单分子研究必将 对生命科学的友展起到重要的推动作用 第一节固态介质的单分子 原子 研究 材料学的发展促使人们迫切需要了解材料表面的化学结构 形貌等信息 基 于材料表面性质的研究而发展起来的一系列单分子技术有效地推动了纳米科学的 2 第 章单分子检测及荧光相关光谱技术研究进展 发展 由于这些技术都是通过用微小探针接近样品表面 对在探针 样品之间作用 的物理量 隧道电流 原子间力等 边检查边扫描 从而对微小领域的形状进行 观察及物性分析 故通称为扫描探针显微术 s c a n n i n g p r o b em i c r o s c o p y s p m 1 1 1 扫描隧道显微术 s c a n n i n gt u n n e l i n gm i c r o s c o p y s t m 1 9 8 2 年i b m 公司瑞士苏黎世实验室的两位科学家gb i n n i g 和hr o h r e r 研 制出一种新型显微镜一扫描隧道显微镜 引 其原理是利用量子力学中的隧道效应 1 4 1 通过探测固体表面原子中电子的隧道电流来分辨固体表面的形貌 这一新技术 的出现立刻在全世界引起轰动 两位科学家也因此获得1 9 8 6 年诺贝尔物理学奖 根据量子力学原理 由于电子的隧道效应 金属中的电子并不完全局限于金属 表面之内 电子云密度并不是在表面边界处突交为零 在金属表面以外 电子云 密度呈指数衰减 衰减长度约为1n n 3 用一个极细的 只有原子线度的金属针尖 作为探针 将它与被研究物质 即样品 的表面作为两个电极 当样品表面与针尖 非常靠近 虫予针尖尖臻蒙予与襻菇褒嚣蒙子颡存在极徽弱茨斥力 或弓l 力 运遘在 扫摘时控制这种力的恒定 带有针尖的微懋臀将对应于针尖与样品表渐原予间作 用力的等位面而在垂直于样品的表面方向起伏运动 使一束激光经过光学系统聚 焦奁擞悬譬鹜露 著获微悬臀耱瑟反射到党褒谴置梭溺嚣 d e t e c t o r 当送舒襻 品扫描时 徽憨储将随样品表面形貌而弯鞠起伏 反射光束也将随之偏移 因而 通过光学检测等方法可以获得样品表面形貌的信息 a f m 其有广泛豹蠲途 姆聚是最近尼警a f m 被广泛应矮垂生余秘学领域的 研究中 r i e f 等人对多糖的结构进行了研究 w o n g 等测定了链酶亲和素一生物 素间的作用力 l e e 等人测定了d n a 两条互补链间的作用力 埘 丽b o l a n d 和 r a t h e r 对d n a 锻墓对验氢键骆怒避孳亍了磷突 强 著谈为镪个互於碱蕊辩之阗的笺 键力为5 4p n s u n 和y o k o t a 呶对错配d n a 和m u t s 蛋翻的相互作瑙逃行了研究 1 1 4 l 第一章单分予捡测及荧光相关光港投术研究进展 爨挚 瘴荸 麓午 纛警 f i g 1 1s c h e m a t i cr e l a t i o n s h i pb e t w e e na t o m i cf o r c ea n dd i s t a n c e 3 邋场季霉 薹蠢擎纛徽本 n e a r f i e l ds c a n n i n go p t i c a lm i c r o s c o p y n s o m 物体波面外的场分布一般划分为两个区域 躐离物体表面仅几个波长的区域 称为近场 从近场外到涎穷远称作远场 在近场区域既有可向远处传播的辐射场 又有仗羧予魏落表嚣一令波长敬蠹鹣藩辐羹砉场 纂辐 鸯孝璐存在予鞠薅表嚣 强度 随离开表丽距离的增加而迅速衰减 又称隐失场 e v a n e s c e n tf i e l d 而在蛾场区 域只存在辐射场 没旃q 辐射场 n s o m 豹原理单程1 9 2 8 年弹耄s y n g e 疆密 毽壹妥2 0 毽纪8 0 年代牙 在实验 上获得成功f 1 5 1 近场扫描光学显微镳一般由三部分组成 激光器和光纤揲针构成 的 局域光源 带有超微动装置的样赭台以及由鹾微镜构成的 光学放大系统 搽镑孔径一簸在2 0 1 2 0n l n 壹深舒发麓的竞壹i 黉壶戆失波橡残 其强凌隧距离 增大而星指数下降 探针只能在1 0 0 n m 以内的邋场区激发荧光圃 样品发射的荧 光经收集藤再经数据处理可转换为样品表面的光学像 n s o m 与a f m 类似 也采 臻搽锌招攘祥磊表瑟 n s o m 懿分辨率由竞擐镑珏弪弱搽锋写样品之阚瓣翊稼夫 小决定 与光源的波长无关 因此不受瑞利判据 6 i 0 五 6 1 耐3 6 代表可分辨的最 小距离 九为a 莉竞波长 r l 为辑囊 攒数 0 先入鸯雩半惫 疆截 可敬褥鬟缩米级静 分辨率 将光探针以恒高模式在样晶表面扫描 可以得到样晶的光学显微圈像 进而得到发面的形貌 和a f m 一样 n s o m 也在生命科学领蠛获褥了一定的应溺 k i m 等蔫n s o m 技术观察了y o y o 一1 染色的九一d n a m 1 g a r c i a p a m j o 等也对缘包荧光蛋白进行了荧 鸯 森 黪 键 梅 蠖 工t 土 上海变通大学博士后出站1 作撒告 光成像5 1 该技术也被用于研究一些生物大分子在细胞膜上的分布 定位及鉴定 等1 埽 2 n s o m 与单分子操纵技术结合可用于研究单个d n a 分子的伸展和卷曲 2 1 拉伸 2 2 1 除了以上几种主要的扫描探针显微技术外 还发展了其他 些技术 如磁力 显微术 弹道电予发射显微术 光子扫描隧道显微术等 这些显微技术利用探针 与样品的不同相互作用 来探测表面或界面在纳米水平上的物化性质 实现对单 分子 原子 的观察 第二节溶液中的单分子研究 检测 为了研究生理环境下的单个生物分子 发展水溶液中的单分子检测技术十分 重要 激光诱导荧光技术 l a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c e l i f 由于具有非常高的灵 敏度而成为溶液中单分子检测最常采用的手段 但在生物体系中 绝大多数的物 质 如碱基和核酸 氨基酸和蛋白质 以及其他生理活性物质都不产生荧光或荧 光量子产率很低 因此对生物分子进行荧光标记是溶液中单分子检测不可或缺的 步骤 迄今已发展了多种荧光探针及其与生物分子标记的方法 激光诱导荧光技术检测单分子的关键在于如何从大背景中提取单分子信号 在激光荧光检测法中背景噪音主要来源于喇曼和瑞利散射j 样品溶液 盖玻片固 有荧光以及检测器暗电流 其中喇曼噪音由于可以与单分子荧光信号重叠而影响 最大 w e i s s 指出1 2 遵循以下四个原则可以有效降低背景噪音 1 尽量减小激 发区体积 因为单分子信号与激发体积无关 而背景噪音与激发体积成正比 2 采用高效光学收集元件 3 采用低暗电流检测器 4 采用其他多种手段消除背 景荧光 基于这些原则 目前已发展了多种溶液中的单分子检测技术 1 2 1 流体聚焦法 h y d r o d y n a m i c a l l y f o c u s e df l o w 流体聚焦法是由k e l l e r 和d o v i c h i 等人1 2 4 2 5 1 首先提出的 他们采用与流式细胞 计类似的方法完成了对溶液中单分子的检测 采用的样品通道逐渐变窄 至最窄 处只允许一个细胞 或一个分子 通过 使激光束垂直照射样品通道并正好聚焦 于该最窄处 这样可得到非常小的检测区体积 簸霹壹接薅予d n a 冀蔽大 j 鹣灏量 o r d e n 等1 2 霹赘该菠零每 平行荧光成像检测技术结台 提离了检测通量 由于其与流式细胞技术的原理相 同 该法又被称作单分子流式细胞技术 s i n g l em o l e c u l ef l o wc y t o m e t r y s m f c 2 2 徽演浚法 m i c r o d r o p l e t s t r e a m r a m s e y l 2 8 2 钾等人酋先提出了微滴流法 待研究的分子被限制在直径小于8u m 的微滴内 将微滴悬浮 使激光舅分子的相互作用时间超过分子的光化学寿命 这祥裁戆够褒察裂篱教静荧竞强壤与簿润熬关豢 这委是肇分子磺究魏特征 爱 早期采用的方法样品通量小 使萁发展受到限制 后来他们对该法进行了改进 采用线性四极杆技术对微滴流进行电动力学聚焦 3 叭 具体作滋如下 获鹾迄徽滚发垒黎产生黪 j 滚滴耪始直径为 5 陋 笈垒速率2 5h z 缀滇 在充电环附近被带上电荷 然后进入线性四极秆区 荷电微滴在该处聚焦 使荷 电微滴通过相向辐射的a r 激光器的束腰部公 观察区的微滴巍径为6 5g m 由f 东分撵发霉致激游交 j 采忍门羧毙予诗数羧零嫒集荧竞 光学系统与箕纯荧光 显微术类似 采用该法成功对低至1 5f m 的r 6 g 溶液进行了测定 信噪比一1 0 对该法溅一步改进聪 使微滴直径下降到1u m 发生速率提穗剐1 0 1 0 0h z 口 篷褥注意酌是 n i c h k o v a 等久筘2 l 浆鼹类辍系统缎会荧光淬必对藤谨串豹兰氯酚避 行了分 6 斤 检测限选测1 6g g l 丽且样品无须除稀释外的任何处理 该梭测方法 简单快遽 检测能力完全满足职业接触魑险评怙 2 3 焚先藕摄 f l u o r e s c e n c ep o l a r i z a t i o n 荧光偏振的原理是由p e r r i n f 3 3 1 发展起来的 1 9 5 3 年w e b e r 3 4 1 将其用于嫩化体 系的研究 从光源发出的一束光线经垂喜起偏器愿成为垂意偏振炎 样黯被垂直 辕豢党激发丽产生镶鞭兹荧嚣 该荧光经箍镶瓣嚣可嚣密与襻蒹滚度膏关靛永平 或垂戡方向的偏振荧光强度 偏振荧光强度的定义是发射荧光在垂直和水平方向 上的强魔差与总的发射强度之睨 偏振荧光强度与荧光分予受激发时分予转动的 速度袋反眈 丽分子转动秘速度 溶液酶温残 精度鞋及分子的体积有美 强暴 温度和粘度固定 则偏振荧光与分子体积成正比 大分子旋转慢 发出的偏振荧 f 一海交通大学博士后出站工作报告 竞强 小分子旋转妖 其缡援荧光弱 荧毙镝霰法褒己在舔臻纯学中淑褥重要靛 应用 传统的荧光偏振技术给出的是系综的平均值 分子的分布信息 溶液的不均 匀谴谂怠濒及 些徽蕊交纯静僖怠会丢失 涎蔫激壳诱凳技术靛发疆 采瘸单分 子荧光偏振技术 s i n g l em o l e c u l ef l u o r e s c e n c ep o l a r i z a t i o n s m f p 可以谢效解决 这些闯题 在s m f p 中 弓l 起荧光偏振信号姻荧光取向反映了蛋白的取向以及探 锗 穗对于蛋自静爨位置 对予s m f p 舔言 弼予分予标记镌荧光搽锊静选择菲霉 重要 除了满足一般激光诱导荧光所需的条件外 如量子产率高 光漂自小 光 稳定性赢等 探针的吸收和发射跃迂偶极矩嘏 雌同轴也很藏要 可用r 0 定量表达 这一褥 蔹 柏是固簸在弹瑟上是有经意彀秘豹探镑豹荧竞备囱异往蓬 当宠金目轴 时 等于0 4 由于前述角位簧怒未知的 般不可能从探针的偶极取向中测得蛋 白区的取向 最避几年发展的多密能团探针可解决这一问题 对标准荧光蕞徽镜上送行 j 改动焉郢可逡嚣s m f p 实黢 详缀酶激羧方式 数据聚集和分析等可参见文献l 站1 采用该技术h u 和l u 监测了单个t 4 溶葭酶分 子在缡食到细蔼细胞表面时的转动行为 1 2 4 荧免共搽麓爨转移 f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r f r e t 对合适的荧光物质可以构成一个能量供体 d o n o r 简称d 和能量受体 a c c e p t o r 简称a 对 当d a 距离远大予熬磁攘距离黠 只要d 与a 黪基态和 第一激发态振动髓缀淹的能量装箱当 或者说d 的发羹 光滋与a 匏吸收光谱能有 效重褥时 则由于偶极一偶极之间的相互作用i j i 发生从d 到a 的非辐射能最转移 这就楚募名的f g r s t e r 偶极一偶檄髓量转移理论 3 其能量转移效率为 r 41 驴f 可2 鬲写 r o 菇宁 为i a 之霾豹距离 轴楚q 弱 对d a 褥懿鼯离 它与染瓣熬竞耪 理性质以及两种染料的偶极一偶极问相互韵取向因子有关 可以看出 r 越大 t 1 越小 因此实验测缁j n 后 就可以求出d a 之间的距离 由于其能量传递的距离可 透 1 0 鼬 函藏f r e t 鬻逢予生蘩大势予静褐蒙骚突 缀典的f r e t 方法测得的怒系综的平均慎 很多有用的信息被忽略或丢失 8 第一章荦分子梭测及荧光相关光潜技术研究进袋 焉壁它对样品蛉缝发要求缀裹 采鼹荸分子荧光共振能量转移 s m f r e t 不设 可以蓉到系综测定时的平均距离 更重要的魑可以直接观察构象性质的分布及其 随时阃的演变 另外 像蛋白手斤凝 生物大分予的起伏波动以及酶动力学过程等 只毒凌游分子瘩平上才 遂霉亍完全遮表蔹 图l o 是s m f r e t 的实验装鬟示意整 s m f r e t 实验方法通常有两种 一种是将待测分子围载在谶一液界面或识埋在凝 胶内 采用共焦宽场成全内反射激发 记录荧光随时问的变化直至荧光闭被光破 嚣f 3 另一耪是w e i s s 等天发袋麴漆滚中s m f r 量t 技本f 4 2 4 3 1 和蔻一鼓术糖毙 该技术具有几个优点 1 不存在染料一表面的相互作用 2 较短时间内可以获 得多个分子的数据 这样可以提供更有意义的统计结果 3 从光子爆发数据中提 取弱分予信怠啄用于对不均一性鞠亚群 s u b p o p u l a t i o n 鹣识鼷 f i g 1 2s c h e m a i es e t u po f s m f r e t e x c i t a t i o n e x c i t a t i o nl a s e rb e a m l o b j e c t i v e d j d 2 e x c i t a t i o nd i c h r o i cm i r r o ra n d e m i s s i o n d i c h r o i c m i r r o r f f i l t e r a p d l a p d 2 a v a l a n c h e p h o t o n d e t e c t o r j i a 等人泓1 将g c n 4 获霾定森氨薹硅铯豹毅璃上 铁r 6 g 帮t e x a sr e d 鬟供 体和受体 用s m f r e t 对单个g c n 4 肽的拼髓和去折叠进行了研究 z h a n g 等 4 1 j 通过生物素 抗生物索蛋白相互作用把d n a 底物链接到载玻片表面 研究了t 4 挠蘩豢在单令摹链d n a 或叉获d n a 上豹缝装 r h o a d e s 簿入攀s l 磅究了鑫交溶滚 中蛋白的折叠和去折叠 s c h u l e r 椁嗍研究了溶液中不同长魔聚脯氨酸两端染料的 能量转移效率与长度的关系 目前s m f r e t 范成为溶液中单分子研究最主要的手 段之一 4 7 4 2 上海交通大学博士后出站工柞报告 1 2 5 荧光相关光谱 f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y f c s 该技术将在下节专门介绍 9 单分予荧光偏振 荧光共振能量转移 荧光相关光谱以及其他一些可用j 二单 分予捡测夔荧竞光港技零 又被绞称巍擎努子光谱 s i n g l e m o l e c u l es p e c t r o s c o p y s m s 或浆分子荧光光谱 s i n g l e m o l e c u l ef l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y s m f s 2 6 赣邋遘串豹荦分子捻溺 s i n g l e m o l e c u l e d e t e c t i o n i n m i c r o c h a n n e l s m d m c l y o n 和n i e t 5 3 j 采用c 0 2 激光微吸量管控制机将普通的的电泳藏细管 1 5 0l a m o d x 2 一 5 或1 0 一h mi d 拉的更为缩窄 梭测段5 0 0 6 0 0 1 1 1 1 1i d 如此窄静毛细管 对分子的运动有明聂的限定作用 可显著减少分予的布朗运动 从两能对溶液中 单分子进行详细研究 他们通过测定通道内的光予爆发 研究了单个r 6 g 和单个 t 4d n a 冀凝 势对皴逶遴襄总溶液中单分予的鸯散扩教系数逡行了比较 枣子微 通道的限制作用 其扩散时间延长了5 0 1 0 0 倍 z a n d e r 等人 采用与n i e l 5 3 1 相似 鹣装置襄黼等悫缀毛缨管 荠结合f c s 辩嚷场终瓣下染辩标记豹挚令攀谈营酸分 子进行了研究 x u 和y e u n g l s 5 5 6 l 将微通道奄泳与单分子成豫结台 对荦分子进行实融成像观 察 研究t 自由溶液中单分子的扩散以及光勰 固液晃面上蛋白与其他分子的 乍 用 其中单分子成像是通 避将光学显微镜与增强c c d i c c d 结合而实现 为了 减小鼹察体积 他们采用隐失波激发葛英一液体 器灏敢分子 i c c d 可对每个像素 提供单分予检测能力 数獬通过高速读数器记录 更迸一步地 m a 和y e u n g 等i 5 穗擞芯冀与上述残檬装置联嗣对m n a 逶褥了磅突 l e e 耱y e u n g l 5 8 瓷c e 与单分 子成像结合用于分子的识别 准确魔大于9 9 另外y e u n g 等人1 5 9 1 用普通c c d 代 替i c c d 辩上述装置逶芎亍激进 对核酸努子不经p c r 放大 通过攀努予戏像壹袋 定 量了核黻的浓度 总之 y e u n g 簿人在将微通道与单分子成像结合方面做了大量 而且杰出的工作 这些工作又被称作单分子电溶 s i n g l em o l e c u l ee t e c t r o p h o r s i s s m b 除默上灸缀筠凡耱滚滚孛攀分子梭溅方法羚 冀谯懿光镊技术 o p t i c a l t w e e z e r 荧光寿命法 f l u o r e s c e n c el i f e t i m e 原予力显微术 a f m 等也被用 i o 第一章单分子榆溯厦荧光相关光潜技术研究进戚 在溶泼申魏单分子磅窕中 第三节荧关相关光谱在单分子研究中的应用 荧光相关光潜技术是本报告的核心研究内容 以 f 对其作系统介绍 涨落竞谱赘酝念始予2 9 毽绝窃 6 0 l 1 9 7 2 年 m a g d e e l s o n 帮w e b b 在涨落 光谱的基础上又提出了荧光相关光谱 f c s 1 6 1 此后 e l s o n 等 6 2 6 3 r i g l e r 等i 删 均做成了开拓性的工作 和光散射技术相比 f c s 利用了荧光的高灵敏魔和高特 箕注 阋麓荧竞静缀多特征 翅强度 波长 荧宠寿念绫凝薅援等邦哥黻终先分 析特 怔 因此 f c s 经出现就成为 f 十分吸引人的技术 所谓荧光相关光谱 就是通过测定溶液中微区内 通常 并对荧光 强度随时间变化的函数进行分析 从而获得粒予浓度 化学动力学参数锋有关信 息的一种荧光分析方法 在荧光相关党港发展之褶 入铜一直致力予絮旃减小照瓣体积 撵嵩信嗓毙 从而搬高灵敏度 但由于计算帆技术 光学技术以及光学检测技术的限制使之发 展缓慢 1 9 9 3 年r i g l e r 等 6 5 l 浆用激光共焦技术 使检测体积降到l o 5 l 以下 灵敏浚褥弱显著撵离 鸯魏f c s 技零进入了快速茇袋通道 瑟l 3 中显示了近一卜 年来有关f c s 方法的文献的统计 从中可以辫出这方面的研究近似成戡线上升态 势 爨深入的统计发现 应用性的研究 尤其是各辩生物体系中的研究 占据了 大部分静文献篦倒 表1 1 给密f c s 发震过程中一些其煮赣要意义麓工俸 上海交通大学博士詹出站工作报告 9 0 92 0 0 02 0 0 12 0 0 22 0 0 32 0 0 42 0 0 5 y e a r f i g 1 3 s t a t i s t i c so i lf c sl i t e r a t u r e si nt h el a s td e c a d e b l o c kc o l m n n n u m b e ro f p u b l i s h e df c sa r t i c l e s g r e yc o l u m n e s t i m a t e dn u m b e ro f f c sa r t i c l e sb a s e do nt h ep u b l i s h e dn u m b e rd u r i n gt h ef o r m e rt h r e em o n t h s d a t af r o m s c i e x p a n d e d b a n ko f l s i t a b l e1 1s o m e i m p o r t a n t w o r k sf o rf c s y e a r a u t h o r s c o n t r i b u t i o n s t 9 1 1 s v e d b e r ga n dl n o u y e l 6 0 p r e s e n t e df l u c m a t i o ns p e c t r o s c o p y 1 9 7 2 m a g d e e l s o na n dp r e s e n t e df l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y w e b b 6 i 1 9 7 4 e h r e n b e r g a n dm g l e 6 4 j袋r s ts t u d i e dt h er o t a t i o nd i f f u s i o nb yf c s 1 9 8 t h o m p s o n e ta l 6 6 1 d e v e l o p e d 协l i n t e r n a lr e f l e c t i o nw i t h f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y t i r f c s 1 9 8 9r i c k aa n db i n k e r t 6 7 p r o p o s e df l u o r e s c e n c ec r o s s c o r r e l a t i o n s p e c t r o s c o p y f c c s 1 9 9 4 r i g l e ra n de i g e n 6 8 p r o p o s e df c c s i nb i o s e i e n e e s 1 9 9 6s c h w i l l ee ta l 6 9 1 r e a l i z e df c c si ne x p e r i m e n t 1 9 9 0q i a na n de l s o n t 7 0 p r o p o s e df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yd i s t r i b u t i o n a n a l y s i s f t d a 1 9 9 0 d e n k s t r i e k l e ra n d i n v e n t e d t w o p h o t o n f l u o r e s 0 2 n e e m i c r o s c o p y f r p f m 1 9 9 5w e b b i v l l b e r l a n d s o a p p l i e d t pi nf c s t p f c s a n dg r a t t o n 7 2 j 1 9 9 3 r i g l e r e t 采跚 r e a l i z e dc o n f o c a lf c s 1 9 9 9 c h e r ta n d o n t 7 3 d e v e l o p e d p h o t o nc o u n t h i s t o g r a m p c h 差co 墨a 卫 一 塑 童望坌至墼塑 墨茎堂塑羞堂堂莛查婴塞垄墨 3 童傍藤瑾辩 6 5 7 4 7 q 我们知道 某 物质的荧光强度与其浓度成正比 同样 在开放微区内平衡 时记录的荧光信号强腹也与其中的荧光分子数威正比 由于荧光分子的扩散 或 密予纯学反应 导黎邋天或褒 辙区翁分子数爨总是在葜乎缀镶处获生燮化 嚣 丽导致荧光信号强度墩不断变化 即产生荧光的涨落现象 如图1 4 它足时间 的函数 月融 岔 重 窆1 m 匦 嘟确蛔 瀚t m i c 矜 f i g 1 4s c h e m a t i cp r f n c i p l eo ff c se x p e r i m e n t a p a r t i c l e sd i f f u s i o ni nal a s e r f o c u s e dv o l u m e b l i m et r a j e c t o r yo f p a r t i c l e se n t e r i n g t h ev o l u m e t h eh o r i z o n t a la x i sc o r r e s p o n d st ot h ea c q u i s i t i o nt i m e 5 jw h i l et h ev e r t i c a l a x i sc o r r e s p o n d st op h o t o nc o u n tr a t e s c p h o t o nb u r s t t h ed u r a t i o no ft h eb u m t r e f l e c t st h ep a r t i c l er e s i d i n gt i m ew i t h i nt h ev o l u m ew h i l et h ei n t e n s i t yo fb u r s tr e f l e c t s t h em o l e c u l a rb r i g h m e s so f p a r t i c l e s d a m o e o r r d a t i o nc u l w eo f f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y t r a c e 徽嚣内荧宠分孑数在锰一对阚f 静交疆譬数焚毙强凄懿浚落擅为 6 f f f o 一 f 一 上海燮通大学媾上后出站工作报告 一般强扫一纯囊裙关函数 n o r m a l i z e da u t o e o r r e l a t i o nf u n c t i o n g f 将荧光涨 落与迟延时问t 相关 警 这尾符号 代表时间平均假 5 f t 表示在任一时间 的荧光涨落 6 川 口代 表经迟延时间t 后的荧光涨落 g t 反映了经怒 迟延时闻t 厝焦点区粒予遂动状态的 改受程度 宅与蚊予数扩教戳及化学反应遴纛蹇接稳关 姿迟延时阉为0 时霹簿 g o 6 r 2 f 2 代表荧光强度的相对涨落程度 由于6 刑与瓢w 成正比 帕代表f 时间刚 微区内的分予数目 根摆统计学知识有 g 鬻 鬻 丽1 一 口觑0 是照射微噬内分子数目的倒数 避赢 慧蘩微送的有效钵积瞧可敬求密 k c l g o c 4 f c 饯表了群菇瓣统诗平均浓度 在实验中 5 f t 与s n t 成蔽比 但比例系数妒 探测灵敏度 是位置矢量 的函数 它由光学系统决定 a r 夺 r 鑫 牵 s e 扫 5 8 c r t 是位鼹 时浓度的变化 方程 5 代入 2 褥 g 0 6 獭采用激必傺激发踅源露 经菸焦显镦镳照袈裂榉瑟上豹激走寒璺热燮戆三维 离新分布 其径向和轴向半径分剐设为oo 和z o 定义为激光强度下降剁1 e 2 时的 距离 则分子扩敞系数为 d 堕 7 4 d 些型 器 幽数 1 4 第一章单分子检测及荧光相关光谱技术研究进展 这里r d 为荧光分子的特征扩散时间常数 定义为g t 下降到g 0 2 时的t 值 对自由扩散分子 方程 6 可转换为 g 下 1 二 t d 8 如果再考虑背景荧光以及分子在三线态时的驰豫行为 则方程 8 变为 6 2 朋 2 南 1 9 a 这里如和 l o t 分别代表背景和总的荧光强度 丁为分子处于三线态时的百分含 量 l t r i i n 为三线态的衰减时间常数 d e c a yt i m ec o n s t a n t 如果溶液巾有m 种不同的荧光粒子 得到的总自相关函数就是每种粒子自相 关函数加权平均之和 9 b 其中中 錾 9 c q j h j 2 这里蛾为第j 个粒子的权重因子 岛为其量予效率 毋 为相对分子 分数 如果分子只在r y 平面扩散 则方程 8 简化为 g 2 南 鬲1 1 0 1 d 1 3 2 荧光相关光谱实验技术 单光子自相关是荧光相关光谱最常用的方法 其装置示意如图1 5 所示 激光 器产生的激发光经双色镜反射进入显微镜物镜 并聚焦于样品上 产生的荧光经 同一物镜收集后穿过双色镜和发射滤光片 再用透镜聚焦 穿过置于焦点处的针 孔进入单光子计数器 雪崩二极管a p d 或高性能光电倍增管p m t 检测 自相关 过程由相关器完成 荧光相关光谱实验需要根据不同的染料体系选择不同的激发 波长 激光器 物镜和针孔决定照射体积与信噪比 物镜应选择高数值孔径 上峙 q 岗鲁 幼加南 卜 上海交通大学博士后出站i 作报告 n a 0 9 蛉承浸或瀵浸物镜 铮子l 只 唾一般褒2 0 3 0 0 9 m 之趣 另乡 应鲶终绦 持针孔和物镜焦点在同一焦平面上以确保得到很小的探测体积和高信噪比 二s l 旦卧圆n 商事7 f i g 1 5s c h e m a t i cs e t u p o f f l u o r e s c e n c ec o r r e