（分析化学专业论文）毛细管电泳手性分离及蛋白结合研究.pdf

西南大学硕士学位论文摘要 毛细管电泳手性分离及蛋白结合研究 分析化学专业硕士研究生杨峰 指导教师章竹君教授 摘要 毛细管电泳 c e 技术以其高效 快速 微量 操作模式多样化 样品和溶剂 消耗少 费用低等优点 受到众多分析化学工作者的特别关注 手性药物的分离是分析化学领域的重要研究课题 对药学研究具有重要意义 药物对映体的理化性质极为相近 分离难度很大 且有很高的要求 而手性药物口 服或注射到人体内后 药物分子由血液转移到其作用靶点 药物对映体在血液中浓 度的测定及与血清蛋白质结合常数的测定 对于手性药物的药理学和立体选择性药 代动力学研究具有重要意义 未结合药物浓度比起总的药物浓度能更真实的反映药 物在体内的活动 因此很有必要对手性药物进行对映体药物蛋白结合研究 本论文利用毛细管电泳技术与迎头分析 f a 联用 建立了手性药物西孟旦的 高效 灵敏和选择性好的c e 分离检测方法 并研究了其在线分离对映体与牛血清 白蛋白的相互作用 此外还利用毛细管电泳紫外检测人血及尿样中的甲磺酸帕珠沙 星 最后一方面工作是将激光诱导荧光技术与毛细管电泳分离技术结合测定了豌豆 荚中天然左旋多巴的含量 并将其用于血样中的测定 全文由两部分组成 第一部分详细介绍了毛细管电泳分离技术及其在手性药物 一蛋白结合相互作用上的研究原理和应用 综述了近十年来的应用及发展情况 第二部分涉及三方面的工作 一是首次将高效毛细管电泳迎头分析应用于手性药性药物西孟旦 牛血清白蛋 白 b s a 的结合研究 对c e 手性拆分及c e f a 法的实验条件进行综合探索 羧 甲基一b 一环糊精作为手性选择剂 最佳c 剐队分析条件为 添加了羧甲基一b 一环糊 精的等渗磷酸盐生理盐水 p b s 作为c e 背景电解质 分离电压2 5 k v 分离温度2 5 0 c 西南大学硕十学位论文摘要 进样时间为4 0 秒 进样压力1 0 p s i 二是毛细管电泳紫外检测测定了人血及尿样中甲磺酸帕珠沙星 紫外检测的 条件是 氧氟沙星为内标 p h6 0 的磷酸盐缓冲溶液 7 5 m m o f l 作为运行缓冲液 在1 0 k v 高压下进样1 2 s 分离电压选择2 0 k v 波长为2 4 7 n m 甲磺酸帕珠沙星在 1 0 1 0 r 8 7 0 1 0 t g m l 浓度范围内线性良好 r 0 9 9 96 检出限为5 o 1 0 母g m l 三建立了一个荧光素异硫氰酸酯 f r r c 作为衍生试剂毛细管电泳激光诱导 荧光联用检测豌豆荚中天然左旋多巴的高灵敏方法 检测限达到7 8 1 0 1 0 9 m e 同 时我们还测定了食用豌豆荚后人血中左旋多巴的含量 证实了食用大约1 0 0 9 豌豆 荚相当于服用一片o 2 9 左旋多巴胶囊 可用于帕金森症症食物疗法 我们还利用微 透析取样技术 高效液相色谱化学发光检测方法测定了左旋多巴 c e l i f 方法的灵 敏度是其他方法的近1 0 0 0 倍 关键词 毛细管电泳迎头分析手性分离药物蛋白结合激光诱导荧光 i i 西南大学硕十学位论文 a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa n d i t sa p p l i c a t i o no n s t e r e o s e l e c t i v eb i n d i n gs t u d y m a s t e ro fa n a l y t i c a lc h e m i s t r y f e n gy a n g t u t o r p r o f z h u j u nz h a n g a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s c e h a sm a n i f e s t e di t sv e r s a t i f i t ya n dp o t e n t i a li nt h e s e p a r a t i o no fc h i r a ld r u g s b e c a u s eo fi t sh i g he f f i c i e n c y r a p i da n a l y s i s l o wc o s t w i d e r a n g eo f s e p a r a t i o nm o d e sa n dv e r yl o wc o n s u m p t i o no f b u f f e ra n ds a m p l e se t c t h es e p a r a t i o no fe n a n t i o m e r so fd r u g si sa ni m p o r t a n ts u b j e c to fr e s e a r c he s p e c i a l l y i nt l l ep h a r m a c e u t i c a lf i e l d b e c a u s eo ft h es i m i l a rp h y s i c o e h e n f i c a lp r o p e r t i e so f t w oe n a n t i u m e r s t h e s e p a r a t i o nb e c o m e s m o r ed i f f i c u l t w h e nc h i r a ld r u g sa r c t a k e no r a l l yo ri n j e c t e di n t ob i o l o g i c a lb o d y t h e ya r et r a n s f e r r e dt ot a r g e to r g a n t h e d e t e r m i n a t i o no fc n a n t i o m e rc o n c e n t r a t i o ni nb i o l o g i c a lf l u i da n dt h em e a s u r e m e n to f b i n d i n gc o n s t a n to fd r u gw i t h s e r u ma l b u m i nh a v eag r e a ts i g n i f i c a n c ei nt h e p h a r m a c o l o g yr e s e a r c h e sa n ds t e r e o s e l e c t i v ep h a n n a c o k i n e t i ca n a l y s i so fc h i r a ld r u g s u n b o u n dd r u gc o n c e n t r a t i o n ss h o wb e t t e rc o r r e l a t i o nt ot h ep h a r m a c o l o g i c a la c t i v i t y t h a nt h et o t a ld r u gc o n c e n t r a t i o n s e r u mp r o t e i nb i n d i n gh a sas i g n i f i c a n te f f e c to nt h e p h a r m a c o k i n e t i ca n dp h a r m a e o d y n a m i cp r o p e r t i e so f ad r u g i nt h i sp a p e r c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw a sc o m b i n e dw i t hf r o n t a la n a l y s i s a ne f f i c i e n t a n ds 傩i t i v ea n a l y s i sm e t h o do ft h es i r a e n d a n ss t e r e o s e l e c t i v eb i n d i n gs t u d yw a s e s t a b l i s h e d m o r e o v e r al l i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s i i p c e m e t h o df o r d e t e r m i n a t i o no fp a z u f l o x a c i nm e s i l a t ei nh u m a np l a s m aa n du r i n ew a sd e v e l o p e d e v e n t u a l l y aw o r kb a s e do nc a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i sw i t l ll a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c e w a sr e p o r t e d e df o r t h ed e t e r m i n a t i o no f t h en a t u r a ll d o p ai np e a s e c o d t h et h e s i si sd i v i d e di n t ot w op a r t s p a r to n ed e s c r i b e sc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i si n i i l 两南大学硕十学位论文a b s t r a c t d e t a i l sa n dr e v i e w sr e c e n td e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o ni ns e p a r a t i o no fe n a n t i o m e r so f d r u g sa n dt h e i rp r o t e i nb i n d i n g p a r tt w oi n c l u d e st h r e ea s p e c t s o n e a ne f f i c i e n ta n ds e n s i t i v ea n a l y s i sm e t h o do ft h es i m e n d a n ss t e r e o s e l e c t i v e b i n d i n gs t u d yw a se s t a b l i s h e d t h ee n a n d o m e r i cs e p e r a t i o nw a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e d w i t hc a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i su s i n gc a r b o x y m e t h y l p c y e l o d e x t r i n c m p c d a sc h i r a l s e l e c t o r t h es a m p l e sw e r ep r e p a r e db ym i x i n gk n o w nc o n c e n t r a t i o n so fd r u ga n db s a i np h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p b s p h 7 4 a n de q u i l i b r a t e a tr o o mt e m p e r a t u r ef o r3 0 r a i n al a r g ev o l u m eo fs a m p l es o l u t i o nw a si n j e c t e da t0 5p s i f o r4 0 s e c i n t ot h ef u s e d s i l i c ac a p i l l a r y 5 8 5c r u x7 5 p r oi d w h i c hw a sf i l l e d 耐t hp b sb u f f e rc o n t a i n i n g c m p c d t h ed r u gw a se l u t e da saz o n a lp e a kw i t hap l a t e a ur e g i o nu n d e rc o n d i t i o no f p b sb u f f e rw i t h2 5 k va t2 5 0 c t w o ac a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no f p a z u f l o x a c i nm e s i l a t ei n h u m a np l a s m aa n du r i n ew a sd e v e l o p e d t h ed e t e r m i n a t i o nw a sp e r f o r m e do n a f u s e d s i l i c ac a p i l l a r yo f3 9 e r a x 5 0 1 x m i d o fw h i c he f f e c t i v el e n g t hi s2 8 5 c m 7 5 m m o l lp h o s p h a t eb u f f e r0 h 6 o w a su s e da sr u n n i n gb u f f e r s a m p l e sw a t ei n j e c t e d e l e c t r i c a l l y 1 2 s l o k v i n t ot h ec a p i l l a r y t h ea p p l i e dv o l t a g ew a s2 0 k va n dt h e d e t e c t i o nw a ss e ta t2 4 7 n m i n t e r n a ls t a n d a r dw a so f l o x a c i n t h el i n e a r i t yr a n g ew a s f r o m l 0 l o 8 t 0 7 o 1 0 7 咖l r o 9 9 9 6 t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s5 0 x 1 0 9 9 m lt h e m e t h o di se f f i c i e n t r e p r o d u c i b l ea n df e a s i b l ef o rd e t e r m i n a t i o no f p a z u f l o x a c i n t h r e e a l l i g hs e n s i t i v em e t h o do f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc o u p l e dw i t hl a s e r i n d u e o d f l u o r e s c e n c e l i f d e t e c t i o na n ds e l e c t e df l u o r e s e e i ni s o t h i o e y a n a t e f i t c a st h e d e r i v a t i z a t i o nr e a g e n tf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fl d o p ai np e a s e c o dw i t ht h ed e t e c t i v e l i m i to f7 8 x 1 0 一o g m l w ea l s od e t e r m i n e dl d o p ai nh u m a nb l o o da f t e rt a k i n g p e a s e c o da n dv e r i f i e dt h a te a t i n g1 0 0gp e a s e c o da p p r o x i m a t e l ye q u a l st ot a k i n go n e s y n t h e t i c a ll d o p at a b l e tw i t l lt h eq u a l i t yo f0 2 9 i no u rm e t h o d t h es e n s i t i v i t yi sn e a r l y 1 0 0 0t i m e sh i g h e rt h a nt h a to fo t h e rc em e t h o d s w eh a v ea l s od e t e r m i n e dl d o p ai n r a b b i tb l o o db ym i c r o d i a l y s i ss a m p l i n ga n dh i g h p e r f o r m a n c ef i q u i dc h r o m a t o g r a p h y w i t hc h e m i l u m i n e s c e n c e r i p l c c ud e t e c t i o n 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t k e yw o r d s c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s f r o n t a la n a l y s i s e n a n t i o m e r i cs e p a r a t i o n p r o t e i nb m d m g l a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c e v 独创性声明 学位论文题目 主避生 跹也逸媛匣隧聋鐾 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得西 南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 意 学位论文作者 杉辛签字日期 莎呷年5 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留 使用学位论文的规 定 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许 论文被查阅和借阅 本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复 制手段保存 汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 本论文 口不保密 口 学位论文作者签名 槲导师签名 签字日期 幽外7 年f 月卵日签字日期 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 叫b 邮编 两南大学硕十学位论文 第一部分综述 第一部分综述 第一章毛细管电泳分离检测及其手性药物拆分的研究进展 毛细管电泳手性分离是2 0 世纪8 0 年代以来新兴的一种分离技术 这项技术为 极性大 热稳定性差和挥发性手性药物的拆分提供了经济有效的手段 因它操作简 单 运行成本低 分离效率高而被广泛应用于药物 生物 大分子 临床医学等领 域 目前毛细管电泳手性药物分离方法的讨论主要集中在各种手性添加剂与对映 体药物的匹配以及具体实验中条件最优化选择上l r l 随着各种具体方法的成熟 c e 在现实中的应用会更广泛 1 毛细管电泳对手性药物的拆分 1 1 毛细管电泳简介 毛细管电泳 c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s c e 是内径为2 5 1 0 0 lm 的弹性石英 硅熔毛细管柱内的荷电粒子以电场为驱动力 按其电泳淌度差异来实现分离的一种 现代分析技术 1 9 8 1 年 j o r g e n s o n 2 首次采用7 5 im 内径的硅熔毛细管在3 0 k v 电压下分离氨基酸 获得了4 x1 0 5 m 的理论塔板数 开创了高效毛细管电泳 h i g h p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r c s i s h p c e 分离分析方法的先河 也标志着c e 技术的诞生 表1 毛细管电泳的检测方式 与传统的分析方法如 分光光度法 平板电泳法 薄层和液相色谱法相比 毛 西南大学硕十学位论文 第一部分综述 细管电泳技术具有分离效能高 分析速度快 自动化操作 样品用量少 可与多种 检测器联用 表1 如激光诱导荧光 质谱 等特点 显示了极大的优越性 3 近 十余年来 毛细管电泳技术得到迅猛发展 成为近年来最重要的分离分析工具之一 4 5 6 毛细管电泳技术已经渗透到生物医药的多个研究领域包括免疫分析 7 8 药物的治疗监测 9 l o 手性药物拆分及立体选择性药代研究 1 l 1 2 体液中违 禁药品和毒品的检验 1 3 1 等 毛细管电泳分析的物质范围越来越广 从蛋白质 核 酸等生物大分子到糖类 脂类 各种内源性小分子和离子 药物等 其中毛细管电 泳技术在分离检测生物组织或体液中的疾病特征性物质例如某些神经递质 肽和蛋 白质类细胞因子方面 以及手性药物方面显示了突出的优势和应用潜力 1 2 手性药物拆分毛细管电泳方法原理 手性异构体的存在是自然界的普遍现象 在药物化学领域尤为突出 两个异构 体的生物活性如药效和药物动力学存在很大的差别 使用消旋体药物可能导致错误 的药动学行为和作用模式 例如震惊世界的t h a l i d o m i d e 致畸事件就是忽视立体化学 问题的灾难 1 9 9 2 年美国食品药品管理局规定 今后凡研制具有不对称中心的药 物 必须给出手性拆分结果 欧共体也采取了相应的措施 因此 无论是从科学的 角度还是市场需求的角度来讲 都给手性技术的发展带来了空前未有的机遇和挑 战 手性化合物的分离是对分析化学的一大挑战 要求分离技术具有高灵敏度 高 选择性及高分离效率 色谱法是常用的手性分离技术 其中以高效液相色谱 h p l c 应用最多 但方法费时费力 手性分离柱昂贵并且不易达到基线分离 目前 毛细管 电泳 c e 用于手性分离十分活跃 已被证明是最简单高效的手性分析方法之 1 4 对于手性药物来说 其对映体具有相同的分子量和电荷数 它们的电泳迁移率 也相同 采用一般的电泳液无法实现分离 有必要在电泳液中添加具有光学活性的 分子识别试剂 例如光学活性金属配位配合物 1 5 环糊精及其衍生物 1 6 1 7 1 8 可溶性冠醚 1 9 大环抗生素 2 0 环糊精以外的糖类化合物 2 1 2 2 等能与手性对映 体形成不同稳定性的对映体 从而达到分离的目的 2 手性药物拆分毛细管电泳常见模式 按照毛细管电泳的操作模式 主要可分为 毛细管区带电泳 c a p i l l a r yz o n e 2 两南大学硕十学位论文第一部分综述 e l e c t r o p h o r e s i s c z e 胶束电动毛细管色谱 m i c e l l a re l c c t r o k i n c t i cc a p i l l a r y c h r o m a t o g r a p h y m e c c 毛细管凝胶电泳 c a p i l l a r yg e le l e e t r o p h o r e s i s c g e 毛细管电色谱 c a p i l l a r ye l e v t r o c h r o m a t o g p h y c e c 毛细管等速电泳 c a p i l l a r y i s o t a e h o p h o r e s i s c l t p 毛细管等电聚焦 c i e f 除毛细管等电聚焦外 其他分离 模式都可以用于手性拆分 根据分离对象在溶液中的存在形态 可采用不同的电泳模式 对于带电荷的化 合物 多采用c z e 法 而不带电荷的中性化合物 往往采用m e c c 法 c z e 和m e c c 是手性药物拆分的常用操作模式 以c z e 的应用最为广泛 其中又以环糊精作为手 性添加剂最为常见 2 1 毛细管区带电泳 c z e 2 1 11 3 一环糊精的c z e 拆分体系 早在1 8 9 1 年 v i l l e r s 2 3 就发现了环糊精 c y c l o d e x t r i n c d 它们是由软 化芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用于淀粉而形成的 是由6 7 8 或更 多个d 吡喃葡萄糖单元通过d 1 4 糖苷键键连而成 分别称为a c d b c d y c d 等 2 4 b c d 最易得 也最常用 其结构示意图见1 1 f i g 1 1s t r u c t u r eo f1 3 一c d c d 分子的独特结构使其广泛的应用于分子识别 并且具有良好的手性异构体 分离识别能力 手性药物与c d 形成的配合物之间稳定性的微小差异 导致它们的迁 移速度不同 从而达到分离的目的 d c d 2 5 y c d 2 6 2 7 也用于手性拆分 但 以t b c d 最常见 一般1 3 c d 适于比苯环大 比苯并芘小的分子的手性分离 2 8 羟 丙基 1 3 c d 等中性c d 衍生物得到了广泛的研究和应用 2 9 3 0 3 1 但是由于都不带 电荷 在分离过程中不受电泳驱动力的影响 故无法单独用于中性化合物的c z e 分 离 近年来 实现了在c d 环的某一特定位置引入如氨基 磺酸基 羧基等具有离子 西南大学硕十学位论文第一部分综述 化特性的功能团 使得这些c d 衍生物不但能溶于水 而且在一定的条件下以离子的 形式存在 所以 它们在c z e 条件下 既可分离带有电荷的手性化合物 也可分离 不带电荷的非离子性化合物 负电性b c d 有磺烷基醚衍生化 磺酸化和羧基衍生 化三类 t e r a b e 3 2 首次使用带正电荷的6 3 一氨基一乙基 氨基 舌脱氧基一1 3 一c d 即 a e a b c d 分离了丹酰化氨基酸 另外一些两性b 一环糊精 3 3 环糊精与其他手性添加剂联用 3 4 3 5 3 6 乃至 多元环糊精体系 3 7 在手性拆分上也有应用 2 1 2 其他的c z e 拆分体系 利用c e 进行手性化合物分离分析的第一例是根据金属配合物配位体交换得以 实现的 在电泳液中加入铜 i i 一卜组氨酸配合物 有效地分离了多种丹酰化氨基 酸手性化合物 3 8 此体系在手性拆分方面还很活跃 3 9 4 0 4 1 1 8 冠6 四羧酸 t 8 c 6 h 4 是常用的冠醚类手性选择剂 林金明等人 4 2 采用c d 和 1 8 c 6 i 1 4 混合识别剂 成功地分离了既具有位置异构又含有手性异构的氟化苯丙氨 酸 发现酸度的影响非常明显 利用1 8 c 6 h 4 同时还受到试样结构的限制 只有部分 含有氨基的试样才能有效地与冠醚环形成配合物 所以目前所报道的所有分析对象 都是含氮化合物 k u h n 4 3 针对冠醚在c e 手性分析方面的研究与应用做了较详细的 综述和评论 如果能够开发新型且使用面广的c e 手性化合物分离用的冠醚 将对手 性化合物分子识别起到重要的贡献 糖类糊精这一类型的天然化合物来源丰富并且大部分可溶于水 寻找和发现可 用于c e 分离的品种相对比较容易 所以这方面近年来得到较快的发展 4 4 4 5 大分子抗生素结构中含有多种功能团 如羟基 氨基 多环等 这些功能团以 及环状分子中的光学异构部位的原子对于分子间的相互作用和手性分子识别都具 有重要的作用 目前己使用的大分子抗生素试剂有万古霉素 v a n c o m y c i n 4 6 瑞 斯托菌素a r i s t o c e t i na 4 7 利福霉素b r i f a m y c i nb 4 8 和t e i c o p l a n i n 4 9 蛋白质也被成功地用于毛细管区带电泳手性分离 用于h p c e 手性拆分的蛋白质 有牛血清白蛋白 5 0 卵类粘蛋i t o v o m u c o i d 5 1 血清类粘蛋白 5 2 纤维素酶 5 3 人 白蛋1 1 t 5 4 等 蛋白质浓度对手性分离的影响因手性化合物在蛋白质分子上作用点 的不同而不同 5 5 吸附在毛细管壁上的蛋白质会引起峰拖尾和分离重现性变坏 4 西南大学硕士学位论文第一部分综述 采用涂层柱可降低蛋白质在毛细管壁上的吸附 从而使峰型和分离重现性得到明显 改善 2 2 毛细管胶束电动色谱 毛细管胶束电动色谱 m e c c 是t e r a b e 等在8 0 年代中期开创的一种毛细管电泳分 离模式 在缓冲体系中加入表面活性剂如十二烷基硫酸钠 s d s 或十六烷基三甲基 澳化胺 c t a b 当高于其临界浓度时 则会形成胶束 中性溶质的分离机制是利用 在水相和胶束分配的差异进行分离 而对于带电离子则同时有电迁移 静电作用 两相分配等多种分离机理 根据所使用的拆分剂的种类不同 m e c c 体系分为单一体系和混合体系 单 一体系 拆分剂为某一种手性胶束 混合体系分为非手性胶束 手性添加剂和胶束 手性添加剂 后者又分为手性胶束十手性添加剂和非手性添加剂 手性胶束 3 展望 随着h p c e 技术的完善和人们对手性药物的重视 今后手性药物的h p c e 分析 分离将会得到进一步发展 在手性分离的研究中 除了继续扩大现有各类环糊精应 用范围外 人们可对环糊精进行各种化学修饰 充分借鉴h p l c 手性分离的知识 经验和成果以及与手性作用有关的其他学科的成果 开拓各种类型的适于毛细管电 泳分析需要的手性选择剂以满足多种药物手性分离的需要 在继续进行手性分离研 究的同时 对定量研究和实际样品手性分析的研究将会得到发展和加强 据统计 5 6 目前使用最多的是环糊精类 大约8 0 d a 上的手性分离应用工作都是选用环 糊精类来完成的 目前在选用手性选择剂时 主要是凭经验 用实验的办法完成的 将分子设计方法用于毛细管电泳手性分离中 作为筛选和设计合适的手性选择剂的 辅助工具 可减少实验的盲目性 提高成功率 可以预料 由于c e 的高效 快速 简单等特点 它将在手性物质的分离方面发挥越来越大的作用 手性分离成功的关 键在于选取合适的手性选择剂 发展和研究新型的手性选择剂及筛选合理有效的手 性选择剂仍是手性拆分的研究方向 5 西南大学硕十学位论文 第一部分综述 第二章药物与蛋白相互作用及其毛细管电泳研究 1 药物与蛋白相互作用研究 探索药物与蛋白质的结合特性 无论对于新药开发和指导临床用药 还是探索 生命体系的化学过程和生物物理过程都具有非常重要的意义 研究药物一蛋白结合 作用的内容包括结合为电的种类数 m 各种类蛋白分子结合的药物分子数 n i 及相应的结合平衡常数i l i 研究药物一蛋白的结合位点有助于了解结合机制以及 药物间相互取代的机理 可预测药物间相互取代的可能性 以及在某些疾病所致白 蛋白急剧变化的情况下药物与蛋白质的结合 对调整药物剂量 预测毒性 并最终防止 毒性的产生等均具有重大意义 亲和常数的测定提供了药物 蛋白结合的亲和势或强 度 数值的大小直接影响药物的分布与消除 因而影响药物作用的强度和时间 这些 参数的测定对研制活性和耐受性都更好的新药物非常重要 药物与蛋白质分子存在非共价键作用 这种作用多采用位点结合模型解释 这 是一种纯经验模型 5 7 药物与血浆蛋白的相互作用 可视为服从质量作用动力学 定律的一种平衡 药物 蛋白质 药物 蛋白质复合物 1 1 1 1 平衡时有 巴 c d 芦 圭 兰g 屯1 1 1 2 式中 g 表示未结合药物 游离药物 的浓度 m o l l 1 p f 表示该系统中总的蛋 白质 结合的和未结合的 的浓度 m o l l 1 c b 则表示结合药物的浓度 t o o l l 1 岛和觑1 分别表示正向和反向反应的速率常数 测定药物与蛋白结合的结合参数基于下述两个条件或假设 1 药物与蛋白质以外的其它大分子的结合可忽略不计 也就是说 结合药物的 浓度等于总的药物浓度减去游离药物的浓度 即 g g g 式中c f 表示总的药 物的浓度 m o l l 1 2 药物与蛋白的结合平衡在分析过程中保持不变 假定每个药物分子与蛋白质的结合只有一类结合位点 则有 6 西南大学硕十学位论文 第一部分综述 k 生 鱼 t l c p c c b 1 1 3 式中 k 代表平衡常数 即药物与蛋白的结合常数 将此方程变形并整理得 k c u p t 2 g 1 kcu 1a 4 g p f k c i k c u 0 1 5 可以看出 代表体系中与总蛋白质结合的药物的浓度分数 若每个蛋白质分子有行个同等的结合部位 则有 r 重排得 n k c u 1 k c u 上 n 酪 g 以 g 对 作图可得一直线 s c a t c h a r d 方程 5 8 和n 另一种重排为 1 1 6 1 1 7 由直线的斜率及截距可求得置 l 上 上上 7 一 n k 巴 1 1 8 以l 序对l g 作图 可得一直线 由直线的斜率及截距可求得k 和斗 这就是k l o t z 双倒数作图的理论依据 5 9 如果每个药物分子与蛋白质的结合存在两类或更多类的结合位点 则方程 1 1 6 需扩展为 旦 兰旦 只 芦1 1 墨g 1 1 9 式中 m 表示蛋白质共有m 类结合位点 n b 局分别表示一个蛋白质分子第i 类结合 位点的位点数日及结合常数 这个方程从形式上来说类似于l a n g m u i r 吸附方程 药物与蛋白质结合的结合分数 占 按下式计算 7 西南大学硕七学位论文 第一部分综述 g g q 1 1 1 0 式中 c i 和g 的意义同上文 由上式可见 研究药物一蛋白结合作用需要测定游离药物浓度或者结合药物浓 度 下面介绍的各种实验方法正是直接或间接地测定药物的游离浓度或者结合浓 度 测定的方法非常多 常规的分析方法由 动力学透析法 平衡透析 超滤法 微透析法 超离心法 酶动力学法 色谱法有 亲和色谱法 高效分子排阻色谱法 砷 光学分析法有 紫外一可见分光光度法 荧光分析法 6 1 6 2 核磁共振波谱法 和园二色性谱法 此外 还有非常重要而且发展迅速的毛细管电泳法 6 3 6 4 6 5 6 6 6 7 和质谱法 6 8 及一些其他的方法 但这些方法存在着某些弊病 严重地影响了游离药物浓度的准确性测定 导致了 结合条件的某些偏差 如前3 种方法存在着膜对药物的吸附 结合型药物通过膜的 泄漏 膜中的某些成分溶解在溶液中 以及d o n n a n 效应 由于蛋白和药物均带电荷 使 得膜两侧的游离药物浓度不相等 等问题 分配平衡法中由于有机溶剂的使用 可以 导致蛋白的变性 同时其本身可与少量蛋白结合 影响药物与蛋白的结合 凝胶过滤法 中由于蛋白用量较大 费时 不适合药物蛋白结合体容易解离的药物的测定 光谱法 在测定中必须除去蛋白的影响 另外 药物与蛋白结合平衡也会由于过滤过程中样品 浓度的改变而被破坏 因此 滤液要少于总样品溶液的l 5 而这些问题在与蛋白有 较高结合率的药物中变得更为严重 同时 要测定低浓度的游离型药物浓度也是很困 难的 为了克服传统的药物一蛋白结合分析方法中的弊病发展了i i p f a 方法 2 研究药物一蛋白结合作用的高效毛细管电泳法 当今集高速 高效和高选择性有点于一身的毛细管电泳法在生命科学研究方面 是常规凝胶电泳和高效液相色谱的强有力补充 根据实验操作 参数提取方法 特别是被分析物所在体系的动力学以及热力学 本质是的不同 研究药物一蛋白结合作用的毛细管电泳法可分成下面几个方法 毛 细管电泳h u m m e i d r e y e r 法 c e h d 毛细管电泳一迎头分析法 c e f a 毛 细管电泳一空位峰法 c e v p 亲和毛细管电泳法 a f f i n i t yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 两南大学硕士学位论文 第一部分综述 a c e 空位亲和毛细管电泳法 v a c e 和毛细管电泳一配体分离法 c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s l i g a n ds e p a r a t i o nm e t h o d c e l s 6 9 7 0 上述方法可根据电泳 图中的峰面积 c b h d 法和c e v i 法 峰高 c b f a 法 或淌度即迁移时间 a c e 法 7 l 和v a c e 法 的变化求得体系中游离药物或结合药物的浓度 2 1 毛细管电泳迎头分析法的基本原理 高效迎头分析f f l i g hp e r f o r m a n c ef r o n t a la n a l y s i s h p f a 是近几年发展起来的 一种能同时测定药物与蛋白结合平衡中游离药物浓度和总药物浓度的一种新的色 谱方法 它克服了传统药物 蛋白结合分析方法的弊病 使分析更加快速 准确 有 效 利用高效液相色谱 h p l c 和高效毛细管电泳 h p c e 系统可以有效的进行 h p f a 在药代动力学研究中 用h p f a 方法 通过测定峰高和峰面积得到游离药物浓 度和总药物浓度 可同时了解药物蛋白结合情况及测得生物利用度等药动学参数 另 外h p f a 相当于药物的富集 大大提高了药物的检测限 h j p l u g d r u g p r o t e i n 口 墨二二 一一 二二圈 旺二 圈 口 6 5 蕊ic jj 正湖2 4 f i g 2 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h ef r o n t a la n a l y s i sc z em e t h o d 1 d r u g 2 p r o t e i n 3 b u f f e r 4 p r o t e i n d r u gc o m p l e x h p f a 有2 个基本的要求 一个是药物和蛋白之间移动速度的不同 另一个是在 样品溶液中存在着结合平衡 在h p c e f a 中 对药物一蛋白质结合的研究则利用蛋白质与药物电泳性质的 不同 图2 1 在中性 p h 7 4 i 0 1 7 磷酸盐缓冲液中 药物与蛋白质所带电荷不 一致 从而表现出不同的电泳性质 随着蛋白与药物的分离 结合部分的解离平衡连 续进行下去 直至蛋白与药物完全分离 形成2 个区带 经检测器得到平台峰 图2 2 从而计算出游离药物浓度和总药物浓度 9 两南大学硕士学位论文第一部分综述 在h p f a 中 当进样体积增加时峰高增加 再进一步增加进样体积 峰高不再增加 而是出现一个平台峰 因为在样品溶液中游离药物浓度是恒定的 此平台高度不再随 进样量的多少增高 而是宽度变宽 即面积增加 刚出现平台高度的进样体积为h p f a 所必需的最小进样体积 m r v m i v 随着结合常数 药物容量因子及柱长度的增 加而增加 随着柱的理论塔板数的增加而降低 7 2 结合药物 未结合药物 样品溶液 一迎头分析法一 f i g 2 2s c h e m a t i cc o m p a r i s o nb e t w e e nh i g hp e r f o r m a n c ef r o n t a l a n a l y s i sa n d u l t t a f i l t r a f i o nm e t h o d 7 3 2 2 毛细管电泳迎头分析法的特点 h p f a 具有以下几个特点 1 可以直接进样 进行自动分析 省去不必要的环 节 减少了误差 克服了传统分析方法带来的弊病 2 当药物峰与蛋白峰完全分离 时 可同时从药物平台峰的峰面积和峰高计算出总药物浓度和游离药物浓度 3 可以连接到在线的高效液相色谱或毛细管电泳系统中 使得分析更加快速 准确 简 便 4 由于 r e g u l a t i o ne f f e c t 效应 7 4 平台区域的洗脱体积比最初注射体积 大 这种效应大大提高了样品的检测限 可用于蛋白结合率很高 而游离药物浓度极 低的药物的研究 5 h p c e f a 中与毛细管电泳手性拆分技术相结合 可分别测 得外消旋体中2 个对映体的蛋白结合情况 6 在h p c e f a 中 可分析纳摩尔级的 样品 或进行微量样品 1 0 舢的测定 这对分析药物与缺乏的或者较难获得的蛋白 质 如脂蛋白 a 一球蛋白等 的结合的研究是非常有利的 在药代动力学研究中 隔 室模型的确立直接关系着药代动力学参数测定的准确性 随着药物在体内的代谢 血药浓度逐渐降低 提高检测限对获得正确的隔室模型是非常重要的 h p c e f a 恰 好能解决这个问题 3 展望 1 0 二 二 国 f 法滤超 西南大学硕士学位论文 第一部分综述 高效毛细管电泳法在研究药物一蛋白结合作用方面的优点 第一 分离效率高 这是因为分离效率 或柱效 与扩散系数成反比 而蛋白质和药物与蛋白质相互作 用后形成的复合物等均为生物大分子 扩散系数小 第二 可以采用与活体生理条 件相同 或相似 的体系进行研究 例如 c e l s 法可以直接用人血浆来研究结 合作用的差异 第三 样品用量少 如c e h d 法 c e f a 法 a c e 法 c e l s 法都只需要微升级甚至纳升级的蛋白溶液 这在只能获得微少样品或者稀有蛋白时 特别重要 第四 操作方便简单 易于与其他技术如质谱m s 联用 第五 加入手 性添加剂 便可对手性药物各对映体的蛋白结合进行研究 其异同对于药物的代谢 动力学参数等有重要意义 应用高效毛细管电泳法研究药物一蛋白结合作用时要注意的一个主要问题是 毛细管壁的蛋白吸附 由于蛋白和毛细管内壁之间存在库仑或 和 疏水相互作用 经常会出