（生物医学工程专业论文）飞秒脉冲激光诱导的星形胶质细胞钙波.pdf

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 i 摘 要* 新近研究显示，星形胶质细胞可以接受外界的刺激，以钙信号的形式做出响应, 这种钙信号还成为星形胶质细胞与其他细胞或组织之间信息交流的桥梁。这些结果揭 示星形胶质细胞是中枢神经系统功能活动的重要参与者。但目前对于钙信号的产生机 制与功能都还不是很清楚，一个重要的原因在于尚无一种同时具备无损、强度可控、 不需要添加外源试剂的诱导钙信号的方法出现。 本文利用飞秒脉冲激光刺激体外培养的星形胶质细胞，诱导了细胞内的钙升高。 不同的光刺激强度诱导星形胶质细胞产生两种钙升高模式： s- 型钙升高或者 h- 型钙升 高。光刺激后外源性 pi 染料的进入，高倍物镜下观察到细胞膜的可逆变化及钙升高 的外钙依赖性，证实了光致穿孔效应是飞秒激光能够诱导细胞钙升高的原因。 光穿孔诱导的钙升高能够引起钙波，两种钙升高模式引起的钙波范围不同：s- 型 钙升高产生的钙波半径是 80.2 7.3 m，h- 型钙升高产生的钙波半径是 176.6 12.1 m。药理学证据证实这两种钙升高引起的钙波都是胞外 atp 信号因子通过 p2y受体 介导的。 将这种刺激方法应用在与神经元混合培养的星形胶质细胞上，s- 型钙升高及钙波 不会引起神经元的钙活动，而 h- 型钙升高及钙波能够引起附近神经元的同步钙升高。 这说明，星形胶质细胞不同强度的反应对神经元钙活动的影响不同。 以上结果表明，飞秒脉冲激光的光穿孔效应能够诱导出星形胶质细胞的钙升高和 钙波，具有无损、强度可控、不改变细胞内外环境等优点，是一种新的诱导钙信号的 方法。 关键词：星形胶质细胞 钙波 光致穿孔 飞秒脉冲激光 *本研究由国家自然科学基金（批准号：60478016） ，国家海外杰出青年科学基金（批准号：30328014）和教育 部科学技术研究重大项目（批准号：重大 10420）资助 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 ii abstract the present studies show that astrocytes may response to various stimuli with calcium signal，which is a bridge for communication among astrocytes or with other cells. these results suggest that astrocytes participate in the functional activity of the central nervous system. however, the mechanism and function of the calcium signal are not clear. that the method is scatheless, strength- controlled, without the requirement for additional reagent has not been found is one of the reasons. in this paper, the calcium elevation and subsequent wave of astrocytes are induced by the femtosecond pulsed laser. there are two different patterns of calcium elevation induced by different intensity of the laser: spike- type (s- type) and higher and/or sustained- type (h- type) extracellular calcium- dependent of calcium elevation after stimulus confirmed that photoporation is the reason of calcium elevation induced by femtosecond pulsed laser. the calcium elevation induced by photoporation can spread around the other astrocytes. the radius of calcium wave induced by s- type and h- type calcium elevation is 80.2 7.3 m and 176.6 12.1 m, respectively. pharmacological evidences have confirmed that extracellular atp through p2y receptor is the mechanism of calcium wave. the calcium wave induced by h- type calcium elevation can induce the synchronous transient rises of calcium in neurons, and nor the calcium wave induced by s- type calcium elevation. this suggests that different degrees of activity in astrocytes modulate different responses of neurons. these results suggest that photoporation induced by femtosecond pulsed laser could result in the calcium elevation and wave of astrocytes. the photic stimulus has the advantages including scatheless, strength- controlled, unchanged intracellular or extracellular environment of astrocytes and etc. it is a new method to induce the calcium signal of astrocytes. key works: astrocytes calcium wave photoporation femtosecond pulsed laser 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密， 在 年解密后适用本授权书。 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 本论文属于 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 1 绪论 胶质细胞是神经系统内数量众多的一大类细胞群体，它们分布在神经元之间。在 脑和脊髓内，胶质细胞是神经元的 10 倍。外周神经系统的胶质细胞主要是施万细胞； 中枢神经系统的胶质细胞有：星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、室管膜细 胞、bergman胶质细胞和 m ler胶质细胞等1。 传统观念一直认为中枢神经系统内信息的传递与整合是由神经元网络完成的，胶 质细胞只是起支持、营养及协助代谢等作用。研究技术的发展，尤其是膜片钳记录和 钙成像技术，揭示出胶质细胞上表达了很多离子通道和神经递质的受体。因此胶质细 胞的研究出现了新的突破， 尤以中枢神经系统内数量最大的星形胶质细胞最为显著2。 星形胶质细胞也可以感受外界的刺激，包括：机械刺激、物理刺激和化学刺激， 并以胞内钙离子浓度升高的形式做出响应。这种钙升高的信号形式从时间上表现为振 荡，从空间上表现为钙波2。大量研究表明，星形胶质细胞通过钙信号可以与其他胶 质细胞，甚至是大脑内的神经元之间进行信息交流或对话：一方面存在由神经元向星 形胶质细胞的信息传递，一方面星形胶质细胞也能反馈调节神经元的活动。这些研究 结果显示星形胶质细胞参与了中枢神经系统内的信息传导与处理，是中枢神经系统功 能活动的重要参与者3。 但是目前对于钙信号的产生机制与功能意义都还不是很清楚。 成功诱导钙升高的方法是研究星形胶质细胞钙信号的基础，传统刺激方式有：机 械刺激4、电刺激5、药物刺激以及解笼锁6等。但目前为止，还没有出现一种同时具 备无损、易重复、强度可控、不需要添加外源试剂的刺激方法。 近年来双光子激发显微成像技术的应用越来越广泛。 它具有很多优点： 波长更长， 受散射影响小，容易穿透标本；使用长波长的近红外光，比短波长的光对细胞的毒性 小；观察标本时，只在焦平面上才有光漂白和光毒性等，因此双光子显微镜比单光子 显微镜更适合用来观察厚标本和活细胞及进行定点光漂白实验7。而且使用大功率的 双光子进行定点扫描时， 还可以产生不破坏周围组织而使聚焦平面组织气化的效果8， 所以已经有研究者使用双光子进行光致穿孔的实验研究9, 10，也有研究者利用高功率 的双光子诱导细胞产生胞内钙升高11。 本文利用高瞬时功率的双光子激光诱导星形胶质细胞的钙升高，研究了钙升高的 机制；分析了光刺激方法的特性；用药理学方法研究了光诱导钙波的产生机制和星形 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 胶质细胞钙信号对神经元活动的影响和作用。 1.1 星形胶质细胞的研究进展 一般认为表达了胶质原纤维酸性蛋白（gfap）的一类细胞是星形胶质细胞。但 是研究表明，星形胶质细胞在不同脑区和不同发育时期表达的 gfap 存在差异，尤其 是病理状态下。例如：星形胶质细胞损伤时 gfap 的表达增加，正常情况下不表达 gfap 的 m ller 细胞在病理条件下也会表达 gfap2。因此，目前认为对星形胶质细 胞最好的分类是基于其功能的。现在得以认同的星形胶质细胞的功能是：它们构成了 非神经组织与神经元间一个结构和功能的界面，通过一系列的受体及离子通道，维持 与监控神经系统的完整性3。 早期研究表明星形胶质细胞在大脑中的功能包括： （1）分泌细胞因子，维持神经 元的生存、发育、再生和分化； （2）对脑损伤和修复的作用； （3）对神经元微环境的 调控作用； （4）免疫功能与血脑屏障调控作用3。 以上这些是星形胶质细胞的传统研究方向，对于星形胶质细胞的新近研究有一大 部分都集中于星形胶质细胞的钙信号的机制与功能方面。 1.1.1 星形胶质细胞的钙通道 真核细胞中，钙离子的平衡机制是相同的，胞内钙离子的水平取决于膜上的钙离 子转运体和胞浆中的钙缓冲剂2（如图 1- 1 所示） 。钙离子的转运体包括几种钙离子通 透性的通道、三磷酸腺苷（atp）驱动的钙泵和电化学驱动的钙交换泵。转运体存在 于细胞膜（保证胞内外钙离子的交换）和胞内器官膜上（例如，内质网、线粒体、高 尔基复合体以及细胞核） 。后者形成了胞内钙存储系统钙库。钙离子进入胞浆后， 大部分被钙离子结合蛋白所结合。图 1- 1 显示了适用于各种胶质细胞的细胞钙离子平 衡机制。 星形胶质细胞的钙信号通道主要包括电压门控钙离子通道和各种受体介导的钙 离子通道。 macvicar 等人首先在 k+电导被阻断和 10 mm ba2+的环境下证明了在 camp 处理 的培养皮层星形胶质细胞上存在钙离子的动作电位2。随后，同样的钙动作电位在从 视网膜急性分离下来的 m ller胶质细胞上也被记录到。运用经典的钙成像技术，人们 发现用高 k+刺激星形胶质细胞，通过电压门控的钙通道可以使胞内钙升高2。虽然体 外培养的星形胶质细胞上确实存在电压门控的钙离子通道，但是在体的星形胶质细胞 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 上是否表达这种类型的通道呢？尽管有研究证明，在急性分离的成熟海马上，星形胶 质细胞对氯化钾有胞内钙离子浓度升高的响应，然而用微电极或者膜片钳技术对脑片 上的星形胶质细胞进行研究时，并没有发现电压依赖的钙电流。因此星形胶质细胞上 是否存在电压门控的钙离子通道还是一个具有争议的问题。 图 1- 1 细胞钙离子平衡机制2 figure 1- 1 calcium homeostasis in cells2 星形胶质细胞通过其表达的相关的受体，可以对各种神经递质或神经因子产生钙 响应，例如：谷氨酸12（glutamate） ，三磷酸腺苷13（atp） ，?- 氨基丁酸（gaba） ， 肾上腺素或去肾上腺素（epinephrine/norepinephrine） ，组胺（histamine）2等等。本 文重点讨论谷氨酸受体和 atp 受体两种。 在中枢神经系统中，谷氨酸是主要的兴奋性神经递质。根据药理学、电生理学和 生物化学特性，谷氨酸受体主要分为离子型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体。离子型 谷氨酸受体是阳离子特异性通透的受体，主要分为 ampa 受体，nmda 受体和 k 受 体。研究结果表明，星形胶质细胞上表达有 ampa 受体和 k 受体，但是基本没有检 测到 nmda 受体的表达2。 低浓度的谷氨酸能引起星形胶质细胞上离子型谷氨酸受体 水向通道的开放12，使钙离子进入胞内，导致胞内钙离子水平升高，这种钙升高的持 续时间很短，且不能重复。 代谢型谷氨酸受体家族有八个亚型（mglurs1- 8） ，其中 mglur1 和 mglur5 通过 g 蛋白与磷脂酶 c 偶联，可以激活 insp3调节的胞内信号通路；而其它的 mglurs 与 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4 腺苷环化酶联接2。中高浓度的谷氨酸作用于星形胶质细胞可以诱导其钙振荡响应， 即重复性的钙升高和回复14。 甚至在胞外无钙的情况下， 也可以诱发这种胞内钙振荡， 说明振荡与星形胶质细胞的胞内钙库释放有关。 研究表明这种钙振荡是与 g- 蛋白偶联 的 mglur5 介导的，mglur5 首先激活磷脂酶 c，产生 ip3，从而激活胞内钙库膜上的 ip3受体，最终导致胞内钙库释放钙离子15。也有研究结果表明，这种振荡是 mglur1 和 mglur2 亚型介导的16。此外还有另外一种解释钙库释放的理论，即通过 ryanodine 受体诱导的钙库释放2。但到目前为止，这条途径在星形胶质细胞上是否发挥作用还 存在争议。 作为一种重要的能量来源， atp 分子几乎存在于有机体的所有细胞中。 目前， atp 也已经被证实是一种重要的信号分子。传统上，细胞膜上的 atp 受体主要分为 p1 和 p2 受体两型。随着对这些受体性质的进一步研究，发现 p1 受体其实是腺苷（atp 水 解产物）受体，而 p2 受体才是真正的 atp 受体2。根据药理学特性，p2 受体家族被 分为两组：离子型受体（p2x和 p2z）和代谢型受体（p2y，p2u，p2t 和 p2d） 。实验 结果表明，p1 受体和 p2 受体均在星形胶质细胞上表达，并且参与胞内钙离子浓度改 变的调控。james t. porter的研究表明，在急性分离的海马脑片上，腺苷可以引起星 形胶质细胞的胞内钙浓度升高，并且这种钙升高来源于胞内钙库的释放17，这证明了 p1 受体能在在体水平表达，并且参与调控了星形胶质细胞的胞内游离钙离子水平18。 p2 受体中离子型的 p2x 受体和代谢型的 p2y、p2u 受体都参与了胶质细胞的钙水平 调控13, 19, 20。 1.1.2 星形胶质细胞的钙信号 如前所述，星形胶质细胞以胞内钙离子水平升高的形式响应外界刺激。而这种钙 升高的形式又可分为时间和空间两种，时间形式的称为钙振荡，即重复性的钙升高和 回复；空间形式的称为钙波，即相邻细胞间钙升高的传播。 一般地，低浓度的受体激活剂（如谷氨酸，glutamate）只能诱导星形胶质细胞一 个峰形的钙升高；中浓度的可以诱导出重复性的钙升高行为；高浓度能的诱导出起始 的峰形钙升高和紧接着的持续钙升高。有研究结果表明，钙振荡中第一个峰形是离子 型受体被激活导致外钙内流的结果，而第二相的振荡或持续升高则是代谢型受体被激 活，引起 ip3通路的级联反应，诱发胞内钙库释放导致的。这种代谢型受体，对于谷 氨酸来说，有文章明确指出是 mglur515。振荡过程中磷酸激酶 c（pkc）扮演了负 反馈的角色，实验证明 pkc 的抑制剂能够增强振荡，甚至将振荡的形式转变为非振 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5 荡的持续形式；而 pkc 的激动剂则阻断了钙离子的升高。这是由于，pkc 的抑制剂 使得 mglur5 保持在非磷酸化的激活状态，所以引起了钙升高的持续响应；而 pkc 的激动剂通过磷酸化的作用不能激活 mglur5，从而阻断了钙离子水平的升高21。对 于嘌呤受体，有人认为是 p2u受体的激活产生了振荡，也有人认为是 p2x7和 pkc 的 相互作用调控了振荡信号19。 同时， 钙依赖性的钙升高22、 生理因子23、 缝隙连接 （gap junction）通道和钙波24也在振荡中起了一定的作用。 星形胶质细胞的钙振荡代表一种高度可塑性的信号14，体现了神经元和胶质细胞 间的相互通信。突触前释放的 glutamate 诱导产生了胶质细胞的钙振荡，同时钙升高 又诱导胶质细胞释放 glutamate 调节神经元的兴奋性传递。而且胶质细胞的钙振荡频 率与神经元的放电活动频率相关，提高对神经元的刺激频率，胶质细胞的钙振荡频率 也随之增加14；反之，胶质细胞的钙振荡频率也能够调节神经元活动的频率25。胶质 细胞甚至可以区分突触活动的不同水平和不同形式，也就是说胶质细胞通过钙振荡编 码与神经元进行通讯26。但是，研究胶质细胞自发钙活动的学者称，自发的钙振荡是 不依赖于神经元的活动的27，是细胞内部的自发机制引起的。另外，也有学者认为胶 质细胞的钙振荡与癫痫、阿尔茨海默等疾病有关28，称星形胶质细胞的钙振荡是组织 癫痫的症状和致病原因29。 星形胶质细胞的钙升高在空间范围内是可以传播的，即一个细胞被刺激后发生了 胞内的钙升高，接着这种钙升高可以跨越细胞间隙传递到相邻的细胞，产生像水波一 样的现象（如图 1- 2） 。这种现象得到了人们的重视，因为这本身就是一个放大机制， 使得一个空间点的响应信息可以传播到更远的地方。 为了研究这种传播现象，必须使用一种方法干扰细胞内外的钙离子分布水平，现 在常用的方法有：机械刺激4、电刺激5、局部喷加药物以及解笼锁6（光致释放信号 因子）等。通常都认为钙波是胞内钙库释放导致的，但是钙波的传播通路至今还处于 争论中，主要有两种观点（图 1- 3） ：一是细胞间表达了 gap junction这样的通道，使 得 ip3信号递质可以从一个细胞直接传递给相邻细胞，引起相邻细胞的 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 6 图 1- 2 机械刺激引起的星形胶质的钙波30 figure 1- 2 calcium wave induced by mechanical stimulus in astrocytes30 图 1- 3 钙波传播机制31 figure 1- 3 mechanism of calcium wave31 升高4；二是产生钙升高的细胞可以分泌信号因子到胞外，这种信号因子扩散到邻细 胞，引起相邻细胞相应受体的激活产生钙升高32。现在研究结果，一般都认为胞外信 号因子是 atp。虽然有研究结果证明星形胶质细胞的钙升高也可以使得细胞分泌 glutamate33，但是它不是钙波的传播信号因子6。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 7 钙波是信息传递的载体。一个区域的神经元接受刺激释放神经递质，使得周围星 形胶质细胞发生钙升高， 进而产生钙波， 钙波传递到远处又会引起远处神经元的反应， 这样钙波就将一个局部的神经元的反应传递到了更远处。伴随着钙波，星形胶质细胞 也会产生钠波5。钠离子是 glutamate 转运体转运 glutamate 时带入胞内的，它激活了 na+- atpase，增加了星形胶质细胞对能量的需求，从而增加了葡萄糖的利用。有文章 指出，钠波的产生引起了星形胶质细胞摄取葡萄糖的空间效应，产生代谢波34。目前， 正电子成像和功能核磁共振成像一般都默认神经元的代谢活动与血管活动成线性关 系的，但事实上神经元的代谢活动需要达到一个阈值才会随血管活动线性增加，所以 导致神经元活动引起的血流的增加与神经元活动不能严格成比例关系。pet 成像和 fmri 成像的分辨率也因此受到限制。而星形胶质细胞产生代谢波的功能对解释这个 非线性关系具有很重要的作用34。 在许多脑区中，星形胶质细胞的突起完整地包绕突触35，由于在突触间隙存在有 这种神经末梢和星形胶质细胞的突起间的亲密关系，神经元很有可能向星形胶质细胞 发送信号。在混合培养的细胞上，人们观察到刺激神经元可引起星形胶质细胞的胞内 钙振荡和钙波36，培养的脑片上也有类似的现象，提示在这两种细胞间确实存在有交 流。后来的研究陆续证明了两种细胞间交流的信号因子有 glutamate、atp37等神经递 质，甚至是突触释放的 gaba 也会引起星形胶质细胞的响应38。这些神经递质作用 于星形胶质细胞上引起其内钙升高，又会促使星形胶质释放神经递质，如 glutamate、 atp 等。现在的研究结果认为，星形胶质细胞释放的 glutamate 影响兴奋性神经元的 突触传递39；而其释放的 atp 抑制了兴奋性神经元的突触传递或者兴奋了抑制性神 经元的突触传递38, 40。因此，星形胶质细胞对神经元的突触传递的调节作用具有不同 效果。目前，对于星形胶质细胞在何种情况下释放哪种神经递质还不是很清楚。 1.2 双光子显微成像术的发展与应用 激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy，简称 lscm）是近 代生物医学成像设备中最重要的发展之一，它是在荧光显微镜成像的基础上安装了激 光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图像处理，从而得 到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，以及在亚细胞水平上观察诸如 ca2+、ph 值、 膜电位等生理信号及细胞形态的变化41。同时，它可以处理活的标本，不会对标本造 成物理化学特性的破坏，更接近细胞生理状态。因此激光扫描共聚焦显微镜已广泛应 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 8 用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域， 对生物样品的定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，成为这些领域新一代 强有力的研究工具。 而近年来，光学显微镜技术中一个最引人注目的成就就是双光子激发现象在共聚 焦激光扫描显微镜中的广泛应用。随着飞秒激光技术和光学显微镜技术的发展，现在 人们已经能够比较容易地制造并使用双光子共聚焦激光扫描显微镜，对样品在双光子 激发后发出的荧光进行观察和三维成像。 1.2.1 双光子显微成像原理以及优点 在激光照射下，基态荧光分子或原子吸收一个光子后跃迁到激发态，随后又驰豫 到某一基态，同时以光子形式释放能量而发出荧光。这一过程就是通常的单光子激发 情况。而双光子激发是一个分子或原子在同一个量子过程中，同时吸收两个光子而跃 迁到激发态。比如在单光子激发情况下，nadh酶在 350 nm的光激发下产生 450 nm 的荧光，而在双光子激发情况下，nadh 酶则需要同时吸收两个 700 nm 的光子才能 产生 450 nm 的荧光42。这就是说，双光子技术使我们无需使用紫外光源就能达到检 测紫外荧光探针的目的。由于单光子激发的线性过程，在整个激发光路里的样品都由 于激发而发出荧光，而对于双光子激发而言，只有在焦点处微小区域内的样品才能吸 收足够的双光子而发出荧光。并且双光子激发所产生的荧光强度与激发光的光强平方 成正比，因而与单光子激发的线性过程相比，双光子激发就需要很强的激发光强，这 就使双光子激发具有很高的空间局域性。 近几年来，双光子共聚焦显微镜的研究引起了人们极大的兴趣，这是因为双光子 共聚焦显微镜与单光子共聚焦显微镜相比具有许多突出的优点：第一，双光子共聚焦 显微镜可以采用波长比较长的在生物组织中穿透能力比较强的红外激光作为激发光 源，因此可以解决生物组织中深层物质的层析成像问题；第二，由于双光子激发产生 的荧光波长远离激发光波长，因此双光子共聚焦显微镜可以实现暗场成像；第三，双 光子激发可以避免普通荧光成像中的荧光漂白问题和对生物细胞的光致毒问题；第 四，双光子跃迁具有很强的选择激发性，有利于对生物组织中一些特殊物质进行成像 研究；第五，双光子共聚焦显微镜比单光子荧光共聚焦显微镜具有更高的横向分辨率 和纵向分辨率42。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 9 1.2.2 双光子显微镜成像在神经生物学中的应用 双光子激发显微成像在神经生物学的第一次应用是在脑片上对树突棘的结构和 功能的成像。结合钙成像的双光子成像揭示了树突棘的功能是对钙离子进行分室化。 研究表明结合钙成像的双光子成像对于探测单个钙通道是非常有效且灵敏的。能量共 振转移通常被用来检测细胞内蛋白质之间的相互作用，结合双光子激发成像的能量共 振转移法可以在完整的神经元网络上研究神经系统的分室化效应的生物化学动力学。 而结合了双光子的荧光寿命成像测量可以量化fret成像， 在适当的荧光探针帮助下， 双光子荧光寿命成像可以实现单光子计数，并在树突棘的研究中已经得到了应用。在 神经细胞上使用双光子进行光致释放谷氨酸或钙离子干扰细胞，比紫外光具有更高的 时空分辨率，但目前面临的挑战是，大部分笼锁分子非常小，需要相对较短的激发波 长（700 nm） ，而在这个波长下，外源发色光团会吸收双光子产生比较大的光毒性。 为了跟踪分子的运动，需要标记感兴趣区域的分子。漂白后荧光恢复就是一个非常好 的测示方案。使用双光子漂白后，树突棘颈处的生物化学底物的扩散就可以被检测出 来，另外利用双光子激活笼锁分子的荧光集团或者 xfps 也可以检测标记分子的扩散 和移动，而且光激活比漂白后荧光恢复更具有优势：由于光激活前的荧光很弱，可以 得到更高的信噪比；具有更小的光毒性。另外，以前的胞外记录只能记录一个或少个 的神经元，而且记录细胞的类型和位置都不精确。结合荧光探针的双光子成像对神经 元网络成像就可以解决这类问题43。 双光子技术直到飞秒脉冲激光器出现后才真正被应用。飞秒脉冲激光也称短脉冲 激光，是利用锁模等技术将脉冲宽度压缩到 10- 11 s，同时脉冲的峰值被提高很多，因 此脉冲时间范围内光的能量非常巨大。近年来，飞秒脉冲激光又有了新的应用光 致穿孔， 如利用飞秒脉冲激光照射细胞表面， 将外源 dna或者 rna转入细胞内9, 10。 对于光穿孔有一种理论这么认为：飞秒脉冲激光在脉冲的时间范围内，能量大到将以 往的热能造成的损害替换成了组织的汽化。这样的结果导致在微米水平上没有别的直 接损害，即当光聚焦在组织上时，只留下一个小孔，而邻近组织没有任何坏死发生8。 有研究者利用双光子刺激细胞，诱导细胞的活动44, 45，但没有明确说明双光子刺 激细胞的产生细胞活动的机制。shigeki iwanaga 等人仔细研究了局部光刺激诱导的 hela 细胞的钙波，他们认为导致被刺激细胞钙升高的原因跟刺激部位有关：刺激细胞 胞质引起的钙升高跟外钙以及磷脂酶 c 通路都没有关系， 而刺激胞膜导致的钙升高则 是因为引起了胞膜瞬时穿孔，外钙流入导致11。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 10 1.3 本文的研究内容 全文一共分五个章节，各个章节主要内容总结如下： 第一章：绪论，主要介绍星形胶质细胞的研究进展、热点问题；双光子显微成像 的技术原理，以及双光子显微成像技术在神经生物学中的应用。 第二章：讨论星形胶质细胞和神经元培养方案以及常见问题。 第三章：实验系统的介绍，实验条件参数的确定，以及实验中涉及的染料的使用 方法、条件等等。 第四章：实验结果，飞秒脉冲激光诱导的星形胶质细胞的钙升高和钙波现象，激 光诱导细胞钙升高的机制，星形胶质细胞钙波的传播机制，以及星形胶质细胞的钙波 对神经元的作用，根据以上结果探讨了星形胶质细胞的功能。 第五章：全文总结。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 11 2 星形胶质细胞培养 细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验 技术之一，具体指：从体内组织取出细胞，模拟体内的生理环境，在体外建立适当的 温度、酸碱度、无菌和一定营养条件，维持其结构和功能，并使之生长繁殖的一项技 术46。 星形胶质细胞是神经组织内数量最多，分布最广的胶质细胞。在生理情况下，它 能够分泌细胞因子，对正常神经元的存活具有重要作用；同时它又与多种疾病的病理 变化密切相关，如癫痫、阿尔茨海默病等。所以研究星形胶质细胞的功能，探讨中枢 性疾病的病理生理学机制与药物的影响，对防治神经系统疾病具有重要意义。因此， 培养和纯化星形胶质细胞，具有重要的理论和应用价值。 许多体外培养已证明，星形胶质细胞对神经元具有支持作用，而神经元也可影响 星形胶质细胞的状态。神经元的生长能够诱导星形胶质细胞发生明显的形态改变，神 经元细胞膜的一种分子可影响体外培养的星形胶质细胞的增殖能力，并且两种细胞之 间可以进行信息的交流与对话3。 在体的神经元与星形胶质相互作用研究报道比较少， 可见在体研究大脑细胞这种相互作用的难度。因而体外培养的星形胶质细胞与神经元 共存模型成为这方面研究的基础。 本文中涉及了星形胶质细胞的纯化培养和星形胶质细胞神经元的混合培养两 部分。神经胶质细胞和神经元的培养方案有所不同，因为神经胶质细胞是可以分裂增 殖的细胞群，使用传代培养方式；而神经元只能采用原代培养方式进行培养。目前， 对于这两类细胞群均有成熟的体外培养方案，主要有无血清培养基47, 48和有血清补充 的培养基49两种体系：需要加入血清的培养基现在的应用多为 dmem 和 mem；典 型的无血清培养基是 1993 年 brewer 首次应用的 b27/nneurobasal（nb）培养基，即 用化学添加剂维持神经细胞的存活与生长而不需要在培养基中添加血清。本实验中涉 及到这两种基本的方法。 2.1 细胞培养的准备 2.1.1 实验器材 （1）主要仪器 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 12 水套式 co2培养箱（forma 公司） ：维持培养液的 ph 值、温度、湿度等条件； 倒置显微镜（olympus 公司） ：观察细胞的生长情况； 制冷 ccd（princeton公司） ：拍摄细胞图片； 冰箱（荣事达公司） ：用于保存细胞培养基、试剂等物品； 电热鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司） ：用于玻璃器皿烘干和灭菌； 磁力过滤器（德国格尔曼公司） ：配制解剖液、培养液时的过滤灭菌； 电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司） ：用于恒温孵育或血清灭活等； 精密电子天平（mettler toledo 公司） ：称量药品； 净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司） ：进行无菌操作； 高压消毒锅（上海三申公司） ：用于消毒实验器材； 磁力搅拌器（保定兰格恒流泵有限公司） ：配置溶液时搅拌溶液用； 渗透压计（wescor 公司） ：精确溶液以及培养基的渗透压； 精密 ph 计（上海雷磁仪器厂） ：精确配制不同 ph 值的溶液。 （2）常规溶液 多聚赖氨酸（pdl） ：sigma, 货号：p - 1145 用超纯水配制好后过滤，200 l或 400 l/tube分装，- 20避光储存。母液浓为 1 mg/ml，工作液浓度为 0.050.1 mg/ml。 hbss 溶液（1 l） 配制 1 l hbss 溶液需要 nacl， 8.4 g； kcl， 0.224 g； hepes， 2.38 g。 用 1 m naoh 将 ph 值调至 7.17.2 左右，再用超纯水将渗透压调至 290 10 mosm/kg，过滤，4 储存。 胰酶溶液（trypsin solution） 0.125% trypsin（gibco brl（1 : 250） ，货号：27250 - 042） 0.02% edta 先用尽可能少量 hbss 溶解 edta （用 1 m naoh溶解 edta） 。 再加适量 hbss， 用 1 m hcl 调节 ph 到 7.17.2 左右，溶解 trypsin，最后定容过滤，并分装为 0.8 ml/tube，于- 20储存。 dmem（dulbecco s modified eagle medium） ： gibco，货号：12100 - 046（powder，10 1 l） 配制 1 l dmem 溶液时，需要 dmem 粉末，1 l包装；nahco3，2.2 g；葡萄糖， 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 13 1.5 g。ph 值调至 7.17.2 左右，再用超纯水将渗透压调至 290 10 mosm/kg，过滤， 4储存。 胎牛血清（fcs） ：杭州四季青公司 灭活、分装：1 ml/tube，- 20储存 neurobasal media（without l- glutamine） gibco, 货号：21103 049，500 ml b27：gibco，货号：17504 - 044 分装 0.2 ml/管，- 20储存 glutamax：gibco，货号：35050 - 61 分装 0.2 ml/管，- 20储存 马血清（hs） ：hyclone 公司 灭活、分装：1 ml/tube，- 20储存 （3）培养材料的选择 由于大鼠的神经系统比较发达，与人类的相似性大，故在神经细胞的体外培养中 一般选用大鼠。本实验采用的是 wistar大鼠。大鼠约在胚胎发育第 15 天（e15）出现 锥体神经元，胎龄 1720 天的大鼠锥体神经元的分化已经基本完成，这时的海马组 织易于分离，脑膜也容易去除，而神经胶质细胞的数量相对较少，齿状回的颗粒细胞 也未出现。因此一般采用的是胎龄 18 天左右的胎鼠作为培养神经元的材料，此时海 马神经元体外培养的成活率可达到 8090%。而星形胶质细胞的分裂增生高峰发生在 动物胚胎晚期及出生以后，培养星形胶质细胞一般选择 02 天的新生大鼠3。 （4）试剂的选择 培养用液的选择同样重要，不同厂家、不同批次的试剂之间会存在很大的差异。 下面列举出了本实验中常用的几种试剂。 dmem：培养基葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸钠浓度对细胞培养影响很大。本 文实验中采用的是 gibco，12100 - 46 或者 sigma，d5648，二者成分相同，不含丙酮 酸和 hepes。培养基一般不要求冰冻保存，特别是对于含血清的完全培养基而言，因 为一些营养成分可能会在冻融后损失掉。通常在 4保存，建议培养基配制后三个月 内用完。 b27/neurabasal（nb） ：即无血清培养基，可以消除来自血清的不均一性。另 外，使用这类培养基可用来检测生长因子以及其它促进神经元存活或生长的因子，或 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 14 者用来检测那些可保护神经元免遭环境毒物损伤的制剂。专用于神经元的培养基在某 些培养环境中还可以减低非神经元细胞的增殖，可使神经元纯化。 hepes：羟乙基呱嗪乙硫磺酸（n - a- hydroxythylpiperazine- n - ethanesulfanic acid） 。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的 ph 值范 围。使用终浓度为 1050 mm，一般培养液内含 20 mm hepes 即可达到缓冲能力。 在外液和 hbss 中用 hepes 作为缓冲剂代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度 co2培养 环境的限制。 血清：细胞在单纯的基础培养基中不能存活，基础培养基常常要添加血清， 血清终浓度多为 520%。常用的血清有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分 裂因子，常被用于增殖细胞，也用于原代培养。而马血清常常用来做有丝分裂后的神 经元培养。血清的不同批号含有不同的成分，应该在使用前对血清进行测试。血清在 使用前通常在 56加热 30 min，这一过程称为灭活。 细胞黏附因子：常用鼠尾胶、小牛皮胶、多聚赖氨酸等。本实验中采用多聚 赖氨酸处理玻璃或塑料培养皿的表面，通过改变器皿的电荷来促进细胞的黏附，并且 经过处理的器皿表面能吸附血清的成分，有助于细胞的黏附和生长。通常使用的是左 旋异构体 l 赖氨酸（poly- l- lysine，pll） ，在某些情况下也采用右旋异构体多聚赖氨 酸（poly- d- lysine，pdl） 。pdl 不易被培养细胞所分泌的蛋白酶破坏，理论上讲更 有利于细胞培养。本文实验选用的是 pdl。 谷氨酰胺：由于细胞自身无法合成必需氨基酸，所以无论何种培养基均需含 有几种必须氨基酸。l- 谷氨酰胺是大部分细胞培养基的基本成分，但它不稳定，在中 性的水溶液中会自发降解，因此培养中需要频繁地补加，这就增加了破坏无菌状态的 可能性，并会产生毒性水平的氨。本实验使用 glutamax，它是一种二肽，在细胞内分 被氨基肽酶分解为 l- 谷氨酸和 l- 丙酮酸，防止了 l- 谷氨酰胺的降解，增加了稳定性， 最小化了毒性氨的产生。glutamax分装成 0.2 ml/管储存于- 20。 2.1.2 培养用品的洗涤和消毒灭菌 （1）玻璃器皿的洗涤和消毒灭菌 新的玻璃器皿首先自来水刷洗，除去灰尘。烤箱中烘干，浸入 5%稀盐酸中 12 小 时以除去脏物、铅、砷等物。取出后自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后 用烤箱烘干。用清洁液（重铬酸钾 120 g ；浓硫酸 200 ml；蒸馏水 1000 ml）浸泡 12 小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗 15 次，最后用蒸馏水冲洗 35 次和用双 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 15 蒸水过 3 次。使用过的玻璃器皿可直接泡入洗涤剂溶液中，然后用清水刷洗干净，然 后烘干。烘干后泡入清洁液（酸液） 。洗干净后先烘干后用牛皮纸（油光纸）包装。 包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸汽成直线上升时，关 闭安全阀，当指针指向 15 磅时，维持 2030 min。 （2）属器械的洗涤和消毒灭菌 金属器皿不能泡酸， 洗涤时可先用洗涤剂刷洗， 再用自来水冲洗干净， 然后用 75% 酒精擦拭，空气中晾干。 （3）料制品的洗涤和消毒灭菌 泡入洗涤剂溶液中，然后用清水刷洗干净，然后烘干。然后再泡入 5%盐酸液 6 小时，再用自来水、蒸馏水、三蒸水洗净，烘干。高压消毒后在培养箱内吹干备用。 （4）盖玻片的处理 将盖玻片首先在清水中泡6小时以除去粉尘及生产过程中残留的对细胞有害的物 质；然后用浓酸清洁液浸泡 1224 小时，清水冲洗后，用蒸馏水在摇床中摇 24 小时， 并且换水 20 次；之后换无水乙醇，摇 4 小时；烘干备用。用前灭菌，可以选择高温 灭菌或者高压灭菌。高压灭菌的玻片，在培养皿中与皿的底部粘的较牢，不易漂移， 但是高压灭菌的玻片在泡 pdl 之前容易相粘在一起，不易分离，比较麻烦。而采用 高温灭菌的玻片，处理相对简单，但是在培养皿中容易漂移。 2.2 星形胶质细胞培养方法 这一节主要讨论星形胶质细胞的纯化培养50- 52和神经元、星形胶质细胞的混合培 养48, 53。培养方案以文献中的为基础，这里进行一定的修改，具体内容如下： （1）培养前的准备 培养前一天进行高压灭菌， 玻片、 50 ml 和 15 ml 离心管、 1.5 ml ep 管、 6090 mm 直径的玻璃培养皿、超纯水、tip 枪头等实验器具需要做好高压灭菌。 培养前准备接种培养基。根据实际采用的培养方案来配制接种液体：90% dmem + 10 % fbs（星形胶质细胞培养基方案） 。使用前先在培养箱孵育 2 个小时左右。 培养前处理玻片，用 pdl 液包被灭菌后的玻片，室温放置 2 个小时以上或- 4包 被过夜。然后用灭菌后的超纯水洗三次，铺在直径为 35 mm的一次性培养皿内，晾干 后待用。一般认为加热、紫外线照射和乙醇处理均会破坏底物的性质，所以建议包被 好的玻片不宜采用紫外线照射。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 16 若是第一代星形胶质细胞的培养，需要准备培养瓶。培养瓶需要提前紫外灯照射 0.5 h以上，然后用 pdl 液体铺满瓶底，在培养箱中放置 2 h以上。种植细胞前用灭 菌后的超纯水洗三次，晾干后待用。 解剖老鼠前准备手术器械，将解剖器械（眼科剪 1 把，组织镊 1 把，眼科弯镊 1 把，系结镊 2 把）和塑料培养皿放到超净台内，紫外线照射 20 min左右。 （2）星形胶质细胞的原代培养 工作台内准备：取冰袋、解剖液 30 ml 和 trypsin so