（环境工程专业论文）角蛋白废物微生物水解技术的研究.pdf

致谢 谨以此文献给关心我的老师、同学、朋友和家人! ， 首先，感谢我的导师郑平教授。非常感谢导师多年来对我学业上的悉心指导、生活上的 热心帮助以及人生态度上的积极影响。郑老师渊博的专业知识、严谨踏实的治学态度、真诚 待人的品德风范以及追求不止的事业作风都使我受益匪浅这些都将鞭策着我不断前进，成 为我终生的宝贵财富。从科研的选题、开展到展后论文的定稿无不凝聚着导师的心血，值此 论文完成之际，对导师多年来的谆谆教诲和无私帮助表示最诚挚的感谢! 本论文的完成也离不开众多老师、同学和朋友的热心帮助与人力支持。在此要感谢环l 系的胡宝兰老师( 博士) 、俞秀娥副教授和徐向阳教授，他们在科研过程中给予了非常热心的 指导和帮助并为试验的开展提供了诸多方便。此外还要特别感谢植保系的徐同教授，徐教授 在真菌鉴定工作中的耐心指导为我提供了非常大的帮助。 同样要感谢和我一起学习和生活的同学和朋友们。我们实验室是一个和谐、学术气氛浓 厚、追求上进的集体感谢实验室的卢刚博士、武小鹰博士、张少辉博士、郭夏丽博士、李 金页博士、曾江宁博士、吴东雷博士、孙建平博士和本科生冯继勤同学以及已经毕业的林丰 妹硕士和夏风毅博士；此外还要感谢项硕、方程冉、柯强、李勇先、丁伟林、王菝和同寝室 的樊梅英、周德平、曹顺爱、叶伟红等朋友，他们都在工作、生活和学习中提供了无私帮助 带给我无限的快乐! 最后要感谢我的父母和爱人! 在漫长的求学路上，家人无论在何种情况下，都一直给予 我最大的支持和鼓励对他们的感激我无法用言语表达愿我学业的完成能令他们感到欣慰 和幸福! 时光荏苒，三年前刚步入华家池的情形还历历在目，而如今我要告别硕士生涯，向这里 的一切说再见了：但是慈爱的导师、可爱的同学、美丽的华家池以及温馨和睦的实验室集体 己深深留在了我记忆中并且永不磨灭。愿大家工作顺利、永远幸福! 谭量量 2 0 0 3 年5 月于浙江大学 浙江大学环境。r 程顶士学位论文摘要 摘要 我国拥有丰富的角蛋白资源，它们大多未被充分利用，有的甚至污染环境， 造成公害。采用微生物水解技术，可将其转化成很好的资源。角蛋白具有不溶于 水和抗分解的性质，要将这项技术成功地应用于角蛋白废物的开发，必须找到高 活性的降解菌株，建立合适的水解工艺并研创高效的水解装置。 本课题针对羽毛角蛋白废物的资源化利用，进行了为期三年的系统研究并取 得了如下研究成果： ， 1 分离了八个羽毛角蛋白的高效降解菌株i 以某养殖场污水处理系统的活性 l 污泥作为分离源，分离纯化了两株放线菌( a 1 和a 2 ) ，三株真菌( f 1 、f 2 和f 3 ) ， 三株细菌( b 1 、b 2 和b 3 ) 。试验证明，这些菌株都有很高的降解羽毛角蛋白的活 性，其中以a 1 和f 1 的降解活性最为突出。菌株a 1 和菌株f 1 都能以羽毛为唯 一的碳源、氮源和能源生长，将其接种于经过灭菌处理的羽毛培养基中，振荡培 养4 5 天后可使整枝羽毛完全消失。1 r 、 2 鉴定了一株高效羽毛角蛋白降解菌。商株f 1 能在马铃薯蔗糖培养基上生 t 长。2 8 c 点植培养1 0 天，菌落直径可达3 c m ，菌落生长较快。菌落无味，表面 粉末状，正面呈淡粉红色，背面呈紫红色。菌丝有隔膜多核，直径2 3 微米。 子实体结构复杂，具有帚状分枝，产生成串的分生孢子，分生孢子椭圆形，表面 光滑。未见有性阶段。初步判定菌株f 1 属于半知菌亚门、丝孢菌纲、丝孢菌目、 丛梗孢科、拟青霉属( p a e c i l o m y c e s ) 。迄今为止，国内外还没有拟青霉降解羽 毛的文献报道。y 3 试验了两个高效降解菌株( f 1 和a 1 ) 的生长条件( 营养条件和环境条件) 。 l 在营养条件上，着重考察了钙离子和镁离子的添加效应。研究证明，两种离子对 菌株f 1 和菌株a 1 的产酶及其酶活都有显著的刺激作用。在环境条件上，着重考 察了溶解氧、起始p h 值和温度的影响。研究证明，菌株f 1 和菌株a 1 皆为好氧 性微生物；菌株f 1 产酶的最适p h 值为9 左右，最适温度为3 0 c = 菌株a 1 产 4 建立了菌株f ，和菌株a ，降解羽毛角蛋白的动力学方程。b 究证明，这 两个高效菌株的降解反应可用b r i g g s h a | d a n e 方程( v = 妄i ) 拟合。试验求 得菌株f 1 ：v m a x = 2 7 9 5 9 ( l - h r ) ，k 。= 1 1 9 7 9 l ；菌株a 1 ：v m a x = 0 6 6 1 9 ( l h r ) k m = o 6 2 8 9 l 。在羽毛角蛋白浓度较高时( 反应初期) ，宜选用菌株f 1 ，充分利用其反应 潜力大的特点；在羽毛角蛋白浓度较低时( 反应后期) ，宜选用菌株a 1 ，充分利用 其底物亲和力大的特点。由于反应速度是决定生产成本的重要因素，选用菌株f 1 的经济性优于菌株a 1 。 ) ， 5 ， 提出了羽毛角蛋白微生物水解的新工艺。扣先将收集的羽毛进行清沈， 再进行加热预处理然后采用特制反应器水解，最后从水解液中分离回收水溶蛋 白，由水解残渣生产高蛋白饲料。采用该工艺，可从1 k g 羽毛回收水溶蛋白0 1 1 k g ， 制得高蛋白饲料o 6 k g 。y 6 研创了高效的羽毛角蛋白微生物水解装置艏鉴垃圾堆肥和活性生物滴滤 池技术，设计了羽毛沥滤床反应器。将经过加热预处理的羽毛作为“填料”，放置 于羽毛沥滤床反应器的中段，让高效菌株在其中生长代谢，使无机培养液从装置 项部喷淋至“填料”上，富含水溶蛋白的水解液从底部引出。羽毛沥滤床反应器 的主要操作和效能参数为：供气量1 1 9 5 2 m 3 m 3 d 。沥滤量0 3 m 3 ，m 3 d ，回流量 6 7 2 m 3 m 3 d ，容积负荷6 6 7 k g m 3 d 。转化率4 0 ，容积产品( 可溶蛋白) 产率 2 4 k g m 3 也y 。 关键词：角蛋白角蛋白酶角蛋白降解菌微生物水解可溶蛋白生物沥 滤床 k 2 浙江大学环境工程硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t al o to fk e r a t i n a c e o u sm a t e r i a l sa r er e l e a s e di nc h i n a 。b u tt h e yh a v en o t b e e nu s e dp r o p e r l y k e m t i n a c e o u sm a t e r i a l sw o u l db e c o m eag o o dr e s o u r c ei f p r o c e s s e dw i t hm i c r o o r g a n i s m s i no r d e r t oe x p l o i tt h er e s o u r c e ，i ti sn e c e s s a r y t oa c h i e v es o m em i c r o b i a ls t r a i n sw i t hh i g ha c t i v i t y , d e v e l o pan e w p r o c e s s f o r k e r a t i nh y d r o l y s i sa n d d e s i g na t a i l o r - m a d ee q u i p m e n tf o rt h er e a c t i o n t h er e u s eo ff e a t h e rw a s t e sw a ss t u d i e dd u r i n gt h el a s tt h r e ey e a r sa n d t h ef o l l o w i n ga c h i e v e m e n t sw e r e g a i n e d ： 1 e i g h tm i c r o b i a ls t r a i n sw i t hh i g ha c t i v i t y f o rf e a t h e r - d e g r a d a t i o nw e r e i s o l a t e df r o mt h ea c t i v a t e ds l u d g eo faw a s t e w a t e rt r e a t m e n tp l a n to naf a r mf o r a n i m a lh u s b a n d r y a m o n gt h e m ，t w os t r a i n sw e r ei d e n “f i e da sa c t i n o m y c e t e s ( a 1a n da 2 ) t h r e es t r a i n sw e r ei d e n t i f i e da sf u n g i ( f 1 f 2a n df 3 ) a n dt h r e e s t r a i n sw e r ei d e n l f i e da sb a c t e r i a ( b 1 b 2a n db 3 ) a l lt h e s em i c r o o r g a n i s m s w e r ea b l et od e g r a d ef e a t h e re f f i c i e n t l y , a n ds t a i na 1a n ds t r a i nf 1s h o w e dt h e h i g h e s ta c t i v i t y b o t hs t r a i na 1a n d s t r a i nf 1c o u l dg r e wo nf e a t h e r sa st h es o l e c a r b o n n i t r o g e n a n de n e r g ys o u r c e s t h ew h o l ef e a t h e r s p r e t r e a t e db y a u t o c l a v i n gw o u l dd i s a p p e a r i nt h ec u l t u r eo fs t r a i na 1o rs t r a i nf 1i n4 - 5 d a y s 2 t h ec h a r a c t e d s t i c so f s t r a i nf 1w e r ef u r t h e rs t u d i e d s t r a i nf 1g r e wf a s t w i t ha c o l o n y o f3c e n t i m e t e r si nd i a m e t e ra f t e rc u l t i v a t e do np s a ( p o t a t o - s u c r o s ea g a r ) a t2 8 0f o r1 0d a y s t h ec o l o n yw a so d o r l e s sa n di t s s u r f a c el o o k e dp o w d e r ya n dw h i t et op i n k t h eb a c ko fc o l o n yw a sp u 币l e h y p h a ew e r e2 - 3 p mi nd i a m e t e rw i t hr e g u l a rs e p t aa n dp l u r i n u c l e a r i tw a s c h a r a c t e r i z e db ym a c r o n e m a t o u sp e n i c i l l a t ec o n i d i o p h o r e s ，a n dt h ed i v e r g e n t p h i a l i d e sc o n s i s t e do fas w o l l e nb a s et a p e r i n gi n t oar a t h e rl o n ga n ds l e n d e r n e c k c o n i d i aw e r ei n c h a i n 。s m o o t h - w a l l e d 。e l l i p s e s e x u a lp r o p a g a t i o nw a s u n k n o w n s os t r a i nf 1w a si d e n t i f i e da sp a e c i l o m y c e sb a i n p a e c i l o m y c e si s 3 浙江大学环境丁程硕士学位论文 a b s t r a c t f o u n df o rt h ef i r s tt i m et ob ea b l et od e g r a d ef e a t h e r 3 t h eg r o w t hc o n d i t i o n so fs t r a i nf 1a n ds t r a i na 1w e r et e s t e d t h e y w e r eb o t ha e r o b ea n dt h e i ra c t i v i t yw e ss t i m u l a t e db yc a 2 + a n d m 9 2 + a sf o r s t r a i nf 1 t h ep ha n dt e m p e r a t u r eo p t i m aw e r ed e t e r m i n e dt ob e9a n d3 0 r e s p e c t i v e l y a sf o rs t r a i na 1 ，t h ep ha n dt e m p e r a t u r eo p t i m aw e r e8a n d 3 5 4 0 s e p a r a t e l y 4 t h e f e a t h e r - d e g r a d i n gk i n e t i ce q u a t i o n so fs t r a i nf 1a n ds t r a i na 1w e r e e s t a b l i s h e d i tw a sp r o v e dt h a tb o t hd e g r a d i n gp r o c e s s e sc o u l db e e x p r e s s e d b y 酬g g s - h a i d a n e e q 旧怕n ( v = 妄：畿) , s t r a i n f i ：v m a x = 2 7 9 5 9 l ( ，i ( m = 1 1 9 7 9 l ，s t r a i na i ：v m a x = 0 6 6 1 9 ( l 。h r ) k m = o 6 2 8 9 l w h e nt h e c o n c e n t r a t i o no ff e a t h e rw a s h i g h ( i nt h ei n i t i a ls t a g eo ft h er e a c t i o n ) s t r a i nf 1 w a sab e t t e rc h o i c ef o ri t sg r e a t e rr e a c t i o np o t e n t i a l b u ti nt h el a t t e rs t a g eo f t h er e a c t i o n 。w h e nf e a t h e rc o n c e n t r a t i o nw a s j o w , s t r a i na 1w a sab e t l e rc h o i c e f o ri t s g r e a t e ra f f i n i t y b e c a u s et h er e a c t i o nr a t ew a st h ep r i m a r yf a c t o rt o d e t e r m i n ee c o n o m i cc o s t s t r a i nf 1w a sab e t t e rc h o i c ef o re x p l o i t a t i o nt h a n s t r a i n a l 5 an e w p r o c e s so ff e a t h e r - b i o d e g r a d a t i o nb ym i c r o o r g a n i s m sw a sp u t f o r w a r d f e a t h e r sw e r ef i r s t l yw a s h e dw i t hw a t e rp r i o rt o a u t o c l a v i n g t h e n h y d r o l y z e di n t a i l o r - m a d ee q u i p m e n t s o l u b l ep r o t e i n sw e r er e c l a i m e df r o m h y d r o l y z a t e a n df e e d s t u f f so f h i g hp r o t e i n w e r e p r o d u c e df r o mh y d r o l y t i c r e s i d u e sa tl a s t 0 1 1 k gs o l u b l ep r o t e i na n d 0 6 k gf e e d s t u f f o f h i g hp r o t e i nc o u l d b er e c l a i m e df r o m1k gf e a t h e rw a s t e s b y t h i sp r o c e s s 6 h i g h - e f f i c i e n c yh y d r o l y t i ce q u i p m e n tf o rf e a t h e r - k e r a t i nw a sc r e a t e d a n ds t u d i e d f e a t h e rl e a c h i n gb e dw a sd e s i g n e dw i t hg a r a g ec o m p o s ta n d a c t i v eb i o - f i l t e re q u i p m e n t sf o rr e f e r e n c e f e a t h e r sp r e t r e a t e db ya u t o c l a v i n g w e r eu s e df o r 。p a c k i n gm a t e r i a l s ”a n dp u ti nt h em i d d l eo ft h eb e do nw h i c h 4 塑婆墨兰堑堡堡堡主兰皇笙奎 一竺堕! 兰里二一 m i c r o o r g a n i s m sg r e w i n o r g a n i cc u l t u r em e d i aw e r es p r a y e do nt h e “p a c k i n g m a t e r i a l s ”f r o mt h et o pa n dh y d r o l y z a t ew i t hl a r g ec o n t e n to fs o l u b l ep r o t e i n s w a sl e do f ff r o mt h eb o t t o m i t so p e r a t i n ga n de f f i c i e n tp a r a m e t e r sw e r ea s f 0 o w s ：a i rf l o wr a t e ( 1 19 5 2 m 3 m s d ) ，i n f l u e n tf l o wr a t e ( o 3 m 3 m 3 d ) ，r e t u r n f l o w r a t e ( 6 7 2 m 3 m 3 d ) ，v o l u m e t r i cl o a d i n g r a t e ( 6 6 7 k g m 。d ) ，c o n v e r s i o n p e r c e n t a g e ( 4 0 ) v o l u m e t r i c s o l u b l ep r o t e i np r o d u c t i o nr a t e ( 2 4 k g m 3 d ) - k e y w o r d s ： k e r a t i n ； k e r a t i n a s e ；f e a t h e r - d e g r a d i n gm i c r o o r g a n i s m b i o d e g r a d a t i o n ；s o l u b l ep r o t e i n ；b i o l e a c h i n gb e d 5 浙江大学环境工程硕士学位论文时吉 1 前言 角蛋白存在于许多脊椎动物的外骨骼结构中，如毛发、鳞片、羽毛、蹄、角、 鼻和爪等，是一种坚韧的不溶性蛋白。“硬”角蛋白( 如动物的蹄和角) 含硫量较 高( 约占干重的5 ) 。“软”角蛋白( 如人的表皮) 含硫量较低( 约占干重的1 ) 。在各种动物的蹄角、毛发和羽毛中，粗蛋白含量分别为8 2 8 ( w ，下同) 、8 15 和8 7 8 ；经过加工提纯后，得率分别可达3 9 、2 8 和2 6 。 我国拥有丰富的角蛋白资源，尤其是在现代农业中，大规模的家禽养殖产生 了大量角蛋白废物，它们大多未被充分利用，有的甚至污染环境，造成公害。若 加以妥善处理，可使之转化成很好的资源。近年来，随着氨基酸的应用范围的拓 宽，传统氨基酸原料( 蛋白质) 短缺严重。因此，妥善处理并利用这些废物资源， 对于缓解氨基酸原料的供求矛盾具有重要的现实意义。 角蛋白的结构稳定，具有不溶于水和抗分解的性质，会给资源化利用带来困 难i i “。但是，只要能从自然界筛选到高活性的角蛋白降解菌，研发出合适的水解 工艺并设计出高效的反应装置，角蛋白资源化利用的前景依然是十分诱人的。 1 1 角蛋白废物的用途及一般利用方法 1 1 1 角蛋白废物的各种用途 ( 1 ) 饲料 3 - 5 1 或饲料添加剂【8 】 据测定，鸡、鸭、鹅的羽毛，猪、牛、羊的皮毛和蹄角，以及人发均含有粗 蛋白8 0 以上( 其中含有1 0 种动物所必需的氨基酸) ，粗脂肪1 2 ，粗狄分1 0 2 ，钙0 0 4 ，磷0 1 2 ，总能4 6 5 兆卡，千克，消化能3 4 2 兆卡，千克，代谢 能3 1 3 兆卡，千克，还含有常量元素、微量元素、维生素以及一些未知生长因子嘲。 上述角蛋白废物可加工成饲料或饲料添加剂。特别值得一提的是，由角蛋白废物 生产的氨基酸微量元素螯合剂【7 】，可与畜禽生长所必需的微量金属离子反应生成 具有环状结构的配位化合物，大大提高微量元素的生物利用率。 ( 2 ) 肥料 6 浙江a 学环境 。程硕士学位论文i 订吉 选择合适的螯合剂，将微量元素螯合起来，能大大提高作物对微量元素的吸 收利用率。然而，廉价的氨基酸螯合剂是决定氨基酸微量元素市场生命力的关键。 若能利用当地的鸡毛、猪毛等为原料，来获得氨基酸螯合剂，螫合制取氨基酸微 肥，可大大降低生产成本 8 】。除利用角蛋白降解产物做螯合剂外，也可以用其生 产液体氨基酸复合微肥归】。在微生物角蛋白酶的作用下，羽毛等废物可被逐渐降 解，缓慢释放氨素【t o a q 。 ( 3 ) 农药和医药 角蛋白水解制得的氨基酸及其衍生物，金属络合物对农作物具有杀菌防病和 刺激生长的双重效果f 1 2 1 。它们作为杀菌剂、杀虫剂、除草剂和植物生长促进剂的 功能，正受到人们越来越多的关注。 复合氨基酸溶液可以直接注入人体补充营养，替代部分人血浆，并对肝病有 一定疗划1 3 1 。胱氨酸可防止脂肪变性、肝硬化以及其他肝病，也是治疗膀胱炎、 秃顶、脱发、神经病、中毒性病症的特效药。 ( 4 ) 皮革填充物和复鞣剂 经过适当的碱降解处理可以从羽毛获得分子量为2 ，0 0 0 2 0 ，0 0 0 的蛋白质 混合物【1 4 i ，将其用作镉鞣鞋面革及服装革的填充材料，可使革具有更好的丰满性 和弹性，并能改善皮革的染色性能【1 5 , 1 6 。另外，经乙烯基类单体接枝改性后，将 羽毛蛋白用作铬革的复鞣剂，具有优良的选择填充性，使部位差降低3 3 7 ，并 对铬革染色无影响旧。 ( 5 ) 其它用途 食用浓缩调味液：在家禽羽毛蛋白中，含有丰富的谷氨酸、天冬氨酸等鲜味 氨基酸。以角蛋白为原料水解提取胱氨酸后，剩余母液可生产营养丰富、味道鲜 美的新型食用浓缩调味、液【。这种方法不但充分利用了蛋白质资源，还消除了以 角蛋白为原料生产胱氨酸后剩余母液的环境污染问题。 薄膜和包装材料：将羽毛进行深加工，能够制成可食用的薄膜和蒙皮包装材 料【1 9 1 。这类产品清晰、坚固，柔韧、无异味，还能够制成香肠等食品。 化妆品和洗涤剂：近年来发现，羽毛角蛋白还是制作化妆品的优质材料。经 过加工后，可从羽毛角蛋白制得棕榈酰缩氨酸，进一步制成皮肤清洁剂、涂擦剂、 7 浙江 学环境 ：程硕士学位论文j j l 吉 口红和化妆品的湿润剂【1 9 1 。 1 1 2 常用的角蛋白水解工艺 ( j ) 水解原理 角蛋白的组成成分是各种氨基酸，十几种氨基酸通过肽键网珏构成多肽长链。 这些长链又依靠双硫键、氢键、盐键、酯键等复合成角蛋白，并使角蛋白呈曲折 交联的三维结构。水解就是要切断角蛋白中的各种化学键( 主要是肽键) 使氨基 酸游离出来。可以想象，在发生角蛋白水解释放氨基酸的同时，也会发生氨基酸 的分解反应。随着水解程度的提高，氨基酸的释放量越来越大，氨基酸的分解速 度也随之加快。这是导致水解法提取氨基酸效率不高的根本原因。 在角蛋白水解中，前期主要产生氨基酸，氨基酸分解较少；后期氨基酸分解 加速，分解速度甚至太于产生速度，致使氨基酸不但不增加，反而逐渐减少。因 此，若以获得氨基酸为目标，不应以肽键的消失来判定水解的终点，而应以氨基 酸含量的高低来判定水解的终点。在水解液中，氨基酸含量会随角蛋白浓度、水 解时间、水解温度等工艺条件而变化，水解终点亦会偏移。 ( 2 ) 水解工艺 角蛋白的水解方法很多，目前在我国常用的有化学处理法、高温蒸煮法和微 生物酶解法。 a 化学处理法 化学处理法包括酸解和碱解，即用盐酸、硫酸、过氧乙酸和氢氧化钠等酸碱 溶液使角蛋白分解1 2 c - 2 2 。 酸水解：这类方法在2 0 世纪6 0 年代国外即有报道，主要用于饲料工业和氨 基酸工业。将一定量的角蛋白与一定浓度和体积的酸混合，加热水解后中和干燥。 经此处理，角质蛋白的双硫键破坏，继而肽键断裂，氨基酸游离。 碱水解：一般用氢氧化钠水解，随氢氧化钠浓度增加，水解液中胱氨酸含量 降低。以高浓度碱液水解时，部分氨基酸由l 型转变为d 型。 酸碱处理都会破坏部分氨基酸。酸碱中和还会产生大量盐分，产品用作饲料 或饲料添加剂后，会抑制动物生长。 b 高压加热水解法 8 浙江a 学环境j 一程硕士学位论文前方 高压加热水解法一般应用于角蛋白饲料生产中，其流程为：羽毛清杂、投入 水解罐，直接或间接通入蒸汽，水解成块状蛋白质凝胶，烘干粉碎后用作饲料。 产品质量取决于时间、温度、压力等工艺参数。 目前我国大多采用这种方法进行角蛋白饲料的生产。由于工艺设备落后，工 艺参数不易控制，水解效果不佳，产品质量不稳定，氨基酸消化率低或蛋白严重 变性。生产过程中需要锅炉、水解罐、烘干等设备，生产成本偏高。持续过度的 蒸汽加热处理不仅会破坏一些热敏氨基酸( 半胱氨酸、赖氨酸等) ，而且会降低某 些氨基酸的消化率或利用率吲。 c 微生物水解处理法 先热压处理，再用角蛋白降解菌水解，这是角蛋白废物资源化的另一类方法， 但国内外争议较大，至今未见产业化技术和产品。 d 其它方法 除上所述，在饲料加工中还有挤压膨化法、熔炼法等。其中，彩化法的原理 是利用膨化机内高温高压和高剪切作用，使羽毛在减压膨化中破坏角质蛋白牢固 的空间结构，断裂双硫健。角质蛋白纤维变成较小的蛋白质亚单元和线状排布的 肽链群后，易于被动物消化吸收。该法在我国还没有普遍应用。 1 2 角蛋白的微生物降解 角蛋白具有不溶于水和抗分解的性质，这些性质主要决定于如下几个方面： 胱氨酸残基所提供的分子间双硫键的高度交叉连接；氢键的作用：分子间相互的 疏水作用。根据氮基酸的组成，a 一螺旋每前进四圈，双硫键就出现一次。羊毛纤 维被拉伸以后就有抗拉伸力，双硫键可逆的氧化和还原作用是羊毛纤维抗拉伸力 的来源。由于角蛋白稳定的化学结构，致使它不能被一般的蛋白酶( 如胰蛋白酶、 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶) 水解。然而，在自然界并没有发现角蛋白废弃物的积聚， 这应归功于角蛋白降解菌的作用。迄今为止，已有多种角蛋白降解菌被分离并得 到深入研究。从这些微生物中分离的角蛋白酶活性很强，可以水解多种难降解的 纤维蛋白类，如胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白。经微生物角蛋白酶处理，角蛋白 废物可转化为十几种氨基酸。因此，发掘高活性的角蛋白酶。是开发和利用动物 羽毛和毛发的重要环节。在强调可持续发展的今天，角蛋白酶的研发和角蛋白废 9 浙江大学环境工程硕士学位论文前言 物的利用不失为一个很有前景的环保举措。 1 2 1 角蛋白降解菌 早在十九世纪初期，人们就发现一些生物能降解角蛋白，如衣蛾，苍鹰和兀 鹰【2 4 】以及一些放线菌【2 5 】。真菌能在角蛋白组织上生长，也早己被人们知晓。目前， 已发现3 0 余种微生物可降解角蛋白】，其中有细菌( 如b a c i l c u sl i n c h e n i f o r m i s ， b a c i l c u s s u b t i l i s ) 、放线菌( 如s t r e p t o m y c e ss p p ，t h e r r n o a x t i n o m y c e s c a n d i d u s ) 和真菌( c a n d i d as p p ，a s p e r g i l l u ss p p ，t n c h o p h y t o ns p p ， m i c r o s p o r u ms p p ) 。 ( 1 ) 细菌 在家禽养殖废物的高温厌氧消化系统中，发现了能够降解羽毛角蛋白的细菌。 进一步分离，获得了地衣芽孢杆菌( b a c i l c u sl i n c h e n i f o r m i sp w d 一1 ) 伫7 咖。以羽 毛粉末为基质时，这种细菌的最适生长温度为4 5 5 0 。c 。虽然地衣芽孢杆菌是从 厌氧环境中分离得到的，但它的好氧生长明显快于厌氧生长；反之，好氧降解角 蛋白积累氨基酸的能力则不如厌氧降解，这可能与好氧条件下氨基酸易被进一步 转化有关嗍。据此，可在好氧下培殖菌株，尔后用于厌氧降解。地衣芽孢杆菌 p w d 1 不能降解未经高温蒸煮的羽毛。要使羽毛降解，必须使羽毛高温蒸煮2 分钟以上p l l 。最近，又从厌氧消化系统中分离了一种羽毛降解菌( 弧菌科， v i b n o n a c e a e ) 。它是中温性细菌，在2 5 3 0 下生长良好，在2 天内可使羽毛 几乎完全降解，包括羽小枝和羽轴。特别值得一提的是，这种细菌能够直接降解 未经蒸煮的羽毛旧，因而更具开发价值。 ( z ) 放线菌 n o v a l 等人发现，弗氏链霉菌( s t r e p t o m y c e s f r a d i a e ) 可使自然界中的角蛋 白降解。他们以羊毛为基质来培养该放线菌，初步探明角蛋白的降解机理，提出 了角蛋白复合酶学说 3 3 - 矧。将从土壤中分离得到的纯白高温放线菌 ( t h e r m o a c t i n o m y c e s c a n d i d u s ) 用于羊毛分解试验，发现以羊毛作为唯一碳源 和氮源时能诱导角蛋白酶的合成。尽管纯白高温放线菌的嗜热角蛋白酶与弹性蛋 白酶和枯草杆菌蛋白酶d y 很相似，但具有更高的水解a 和b 角蛋白的活性。其 活性是蛋白酶k 的2 倍，是枯草杆菌蛋白酶d y 和弹性蛋白酶的4 5 倍p ”。 1 0 浙江大学环境工程硕士学位论文前言 ( 3 ) 真菌 真菌是最早发现的能够降解角蛋白的微生物。早在1 9 2 6 年，n a n n i z z i 就提 出环癣真菌可水解角蛋白。n i c h e r s o n 3 8 认为，皮肤真菌之所以能够降解角蛋白 是因为它们能像衣蛾幼体那样合成一种酶来还原角蛋白。用头发培养2 5 株栉霉 菌( c t e n o m y c e s ) 、沙鲍洛氏菌( s a b o u r a u d i t e s ) 、发癣菌( t f i c h o p h y t o n ) 和 表皮癣菌( e p i d e r m o p h y t o n ) 时，发现头发有两种类型的损伤，一种是表面被真 菌( 如红色发癣菌，t n c h o p h y t o nr u b r u m ) 侵蚀，另一种是独特的穿孑l 菌丝沿头 发长轴侵蚀，形成裂缝。后一种形式的损伤常常导致发轴分裂口3 1 。黄曲霉 ( a s p e r g i l l u sf l a v u s ) 一直被认为是最有前景的角蛋白酶生产菌，但是这种真菌 可产生黄曲霉毒素。g r a d i s a r 等人分离了另一种能合成角蛋白酶的真菌( 微孢长 囊头孢霉菌，o o r o t o m y c e sm i c r o s p o r u s ) ，它能降解人体角质层，且不产生毒素， 同时还能够降解指甲和蹄角f 3 9 4 0 。m u h s i n 等人从污水污泥中分离到两种 d e r m a t o p h y t e s 和两种s a p r o p h y t e s ，能够降解人发、鸡毛和羊毛【4 1 】。k a u l 等人 也从一百种鸟类的羽毛上分离到1 4 种( 它们分别属于1 0 个属) 能够利用角蛋白 的真菌( c h r y s o p o n u m 、m a i b r a n c h e a 、c h a e t o m i u m 、s e p e d o n u m 、m i c r o a s c u s 、 s c o p u l a f i o p s i s 、c u r v u l a f i a 、f u s a f i u m 、a s p e r g i l l u s 、p e n i c i l l i u m ) 4 2 】。 1 2 2 角蛋白的酶解机理 ( 1 ) 降解机理 微生物之所以能够降解角蛋白是因为它们可合成一种特殊的酶角蛋白 酶。经过对细菌、放线菌、真菌的研究，目前普遍认为微生物降解角蛋白可分为 三个彼此相关的步骤：变性作用、水解作用和转氨基作用。 a 变性作用 由于角蛋白的双硫键可稳固其立体化学结构，使其抗化学试剂和水解酶的攻 击，因此一旦双硫键遭到破坏，角蛋白就很容易变性，从而丧失它不溶于水和抗 酶作用的能力。将角蛋白高温蒸煮或将其碾磨成粉末，能降低角蛋白中胱氨酸的 含量1 4 3 】。用还原剂巯基乙酸盐处理角蛋白，也可打破双硫键从而增加胰蛋白酶和 芽孢杆菌碱性蛋白酶的水解能力【3 1 1 。但是，在角蛋白酶降解角蛋白过程中，不需 要还原剂或辅酶的参与。角蛋白酶中的双硫键还原酶是角蛋白降解的关键，它作 用于双硫键，将胱氨酸( 孓s ) 还原为半胱氨酸( - s h ) ，使角蛋自高级结构解 浙江大学环境工程硬士学位论文前吉 体而形成变性角蛋白【1 , 4 4 。 微生物降解角蛋白的机理各不相同，因此降解过程中的产物也不相同1 1 , 4 5 , 4 6 。 目前，对多数角蛋白降解菌如何还原破坏胱氨酸双硫键的机理还不清楚。某些真 菌通过菌丝体表面所分泌的亚硫酸盐及其产生的酸性环境来破坏双硫键；链霉菌 则通过产生胞外还原酶来破坏双硫键删。由于不溶于水的角蛋白只能以颗粒形态 存在于胞外，双硫键的还原也只能发生在细胞外面，尤以发生在细胞表面的胞联 氧化还原系统( c e l l b o u n dr e d o xs y s t e m ) 中的可能性最大。在这种情况下，它 需要不溶的角蛋白与细胞紧密接触【拈l 。后来对纯白高温放线菌的观察发现，双硫 键还原正是通过胞联氧化还原系统进行的【3 2 l 。在弗氏链霉菌和地衣芽孢杆菌的角 蛋白酶解时，没有检出释放的巯基 4 6 - - 4 引，这可能是由于胱氨酸双硫键还原产生的 半胱氨酸( 一s h ) 很快被转化成了其它产物。 b 水解作用 只有在变性后，角蛋白才能被水解1 46 1 。在多肽酶的作用下，变性角蛋白逐步 水解成多肽、寡肽和游离氨基酸1 1 】。 c 转氨基作用 在添加羊毛的培养液中，随着纯白高温放线菌的生长，羊毛降解成可溶性多 肽和氨基酸，经脱氨基作用产生氨，使培养液p h 逐渐升高。这是微生物以蛋白 质为基质生长时一种典型的削减氮源的方法 4 钟。这一现象表明，微生物优先利用 非角蛋白作为氮源，而角蛋白则作为碳源嗍。 角蛋白酶是一种诱导酶，只有环境中出现角蛋白时微生物才会合成 2 7 , 5 t , 5 2 1 。 大豆粉可代替角蛋白诱导微孢长囊头孢霉菌角蛋白酶的合成。可见，真菌角蛋白 酶诱导物的特异性相对较低删。 ( 2 ) 影响因素 微生物合成角蛋白酶的数量因种而异。纯化的角蛋白酶是一种单体蛋白【驺】， 不同微生物合成的角蛋白酶分子量一般都为3 0 3 3 k d a 2 s - - 2 8 , s 4 ，而它们适宜的温 度、p h 值和p l 值却不尽相同。 a 温度 地农芽孢杆菌的角蛋白酶可在低温下保存，置于- 2 0 1 2 和4 保存1 9 天后， 活性分别丧失7 和2 0 。若在室温( 2 0 2 5 1 2 ) 下保存，4 5 天内即丧失一 1 2 浙江太学环境：_ l ：= 程硕士学位论文前吉 半活性。酶活性丧失的主要原因是酶的自解。 b p i 值和p h 值 以偶氮角蛋白为基质培养地衣芽孢杆菌，测得p l 为7 2 5 ( 等电聚焦法) 。角 蛋白接近中性，p h 5 8 时束缚在c m 一纤维素上，d h 高于6 8 才会游离。最适p h 值为7 5 ，接近其p l 值。当角蛋白所带的净电荷最少时活性最大州。值得注意的 是，弧菌科菌株的最适生长温度为3 0 ，角蛋白酶的最适温度却是5 5 ( 表1 ) 。 表1 几种角蛋白酶适宜的温度和d h 值范围 t a b l e1t h ea p p r o p r i a t et e m p e r a t u r ea n dp hf o rs e v e r a lk e r a t i n a s e s c 其它物质的影响 实验证明，还原剂( 如巯基乙醇) 可提高角蛋白酶的活性。据此认为，巯基 乙醇有助于打破双硫键从而提高酶解能力r 3 0 。亚硫酸钠主要作用于双硫键，但也 可作用于多肽【1 1 。 添加其它碳源( 如葡萄糖) 和氮源( 如蛋白质) 可导致角蛋白酶活性的降低 2 9 , 4 0 】。p m s f 可1 0 0 抑制角蛋白酶活性，e d t a 、菲绕啉3 8 , s o 、二价汞离子1 3 2 、 铝离子【弱】、磷酸盐嗍对角蛋白酶也有抑制作用，但钙、镁离子有促进作用1 3 2 1 。 1 3 角蛋白废物的微生物水解工艺 先经热压处理，再采用角蛋白降解菌厌氧或好氧水解角蛋白废物，根据不同 要求，采取不同的方法收集、分离、纯化降解产物，最终得到产品。目前，这种 1 3 _ i i i i 江大学环境工程硕士学位论文前言 方法还未见生产性应用。 作者认为该法具有开发前景，关键在于能否找到高效降解菌株并设计出一套 适合这种高效降解菌株的水解工艺和水解装置。如果解决了上述问题，微生物水 解技术可望成为角蛋白资源化的有效方法。采用微生物水解技术不但可以节省动 力和能源，还可以提高氨基酸的消化率或利用率，并有效保护热敏氨基酸，从而 改善必需氨基酸的平衡性。w o o d g a t e 曾对酶处理羽毛粉与常规高压蒸煮羽毛粉 的营养价值进行比较研究，试验发现酶处理羽毛粉的真代谢能值、5 种必需氨基 酸的含量以及消化率( 或可消化必需氨基含量) 均高于高压蒸煮羽毛粉【5 ”。对于角 蛋白降解菌，文献报道已有3 0 余种；对于水解工艺和装置，文献报道可谓稀少。 然而，高效的水解工艺和装置恰恰是角蛋白废物资源化的关键所在。 角蛋白废物是一种固体废弃物，因此在考虑处理工艺和装置时，可以借鉴传 统的垃圾处理。传统垃圾处理包括卫生填埋、堆肥处理和焚烧处理【5 7 , 5 8 】。显然， 卫生填埋和焚烧处理无法实现对有机质废物的资源化利用，堆肥处理就成了唯一 可以借鉴的方法f 矧。堆肥处理是将垃圾废物进行堆置，借助垃圾中的各种微生物 的作用，使有机废物转化成腐熟有机肥的过程删。若采用堆肥技术来处理角蛋白 废物，存在诸多缺点：堆肥技术一般采用分批发酵，不能连续获取产品；堆 肥过程包括升温阶段、高温阶段、降温阶段和保肥阶段【6 1 】，其中高温阶段会破坏 热敏氨基酸；堆肥产物只能用作肥料或饲料，从