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虎纹捕鸟蛛丝的结构与性能及其静电纺再生加工摘要摘要蜘蛛丝纤维是自然界力学性能最优良的天然蛋白质纤维，蜘蛛丝还具有生物可降解性、生物相容性等性能。虎纹捕鸟蛛是一种可人工养殖的蜘蛛，其所产的丝纤维具有良好的潜在应用价值，但天然蜘蛛丝较杂乱难以直接利用，需将其再生加工为可直接使用的产品形式，静电纺就提供了一种简单易行的制备片状蜘蛛丝纤维制品的方法。本文以虎纹捕鸟蛛丝和大腹园蛛牵引丝为研究对象，主要进行了以下几方面的研究：虎纹捕鸟蛛丝的基本结构和性能：测定与分析了虎纹捕鸟蛛丝的基本结构与性能，并与大腹园蛛牵引丝作比较。虎纹捕鸟蛛丝纤维的表面光滑，直径是己知蛛丝中最小的，在水等溶剂中几乎不收缩；其氨基酸组成中，丙氨酸、丝氨酸的含量比大腹园蛛牵引丝多，且含有较多的极性氨基酸，但甘氨酸的含量比大腹园蛛牵引丝少；虎纹捕鸟蛛丝纤维的分子构象具有显著的伊折叠结构特征，同时也有0 【螺旋和无规卷曲分子的存在；结晶度大于大腹园蛛牵引丝；耐热性也优于大腹园蛛牵引丝。天然蜘蛛丝的溶解性能：以虎纹捕鸟蛛丝和大腹园蛛牵引丝为对象，研究了不同溶剂体系下这两种不同类属蜘蛛丝的溶解性能，以期找到一种溶解效果好、价廉、低毒的溶剂。大腹园蛛丝在9 m l i b r 、9 9 六氟异丙醇( h f i p ) 以及8 8 甲酸里的溶解率均超过9 0 ，而虎纹捕鸟蛛丝的溶解能力小于前者，在上述3 种溶剂中的溶解率分别i是1o 3 、7 4 9 和5 7 7 。再生蜘蛛丝蛋白的分子结构：用s d s 凝胶电泳测定了大腹园蛛牵引丝甲酸溶液的分子量分布，发现其分子量分布较宽，在5 0 3 0 0 k d a 之间；用红外光谱对再生蜘蛛丝蛋白膜的分子结构分析发现，由两种蛛丝在不同溶剂里溶解后所得的再生蜘蛛丝蛋白膜中，都含有仅螺旋无规卷曲分子和伊折叠结构的分子，并且h f i p 和l i b r 的作用基本相似，而以甲酸为溶剂时，再生大腹园蛛牵引丝蛋白膜中，伊折叠分子的特征吸收峰明显增强。经过再生加工后，蜘蛛丝蛋白的伊折叠分子结构有所弱化。静电纺再生蜘蛛丝的结构与性能：用静电纺丝的方法得到了再生虎纹捕鸟蛛丝和大腹园蛛牵引丝纤维构成的非织造织物。将虎纹捕鸟蛛丝和大腹园蛛牵引丝分别溶解虎纹捕鸟蛛丝的结构与性能及其静电纺再生加工摘要在h f i p 、h f i p 和甲酸的混合溶剂中，制得用于静电纺丝的再生蜘蛛丝蛋白溶液，并在一定的条件下进行静电纺丝。分别用扫描电镜、傅立叶红外光谱仪( f t 取) 、x - 射j线衍射仪、热分析仪( t g d t a ) 以及i n s t r o n 强力仪测试了它们的外观形态、二级结构、结晶结构、热性能以及力学性能。静电纺再生虎纹捕鸟蛛丝纤维在水中具有良好的形态稳定性。静电纺再生大腹园蛛牵引丝纤维遇水则发生严重的收缩，对其用乙醇处理后，在水中的形态稳定性得到了改善，处理前后的纤维的分子构象并无改变，纤维的结晶度、耐热性能以及断裂强度均较原样有较大的改善。本文还初步探索了静电纺再生虎纹捕鸟蛛丝纤维的细胞相容性，研究发现该材料与大鼠间充质干细胞具有良好的细胞相容性。关键词：蜘蛛丝；静电纺丝；分子构象；形态结构；结晶结构；力学性能l i作者：刁均艳指导老师：潘志娟2 0 0 8 年5 月s t r u c t u r ea n dp r o p e r t i e so fo r n i t h o c t o n u sh l l w e n n as p i d e rs i l ka n dr e g e n e r a t i o no f t h ef i b e r sb ye l e c t r o s p i n n i n ga b s t r a c ta b s t r a c ts p i d e rs i l ki sak i n do fn a t u r ep r o t e i nf i b e rw i t ht h er e m a r k a b l em e c h a n i c a lp r o p e r t i e s i ti sa l s oab i o d e g r a d a b l ea n db i o c o m p a t i b l em a t e r i a l o r n i t h o c t o n u sh u w e n n ai sak i n do fs p i d e rt h a tc 趾b ec u l t u r e db yh u m a nb e i n g s i l kf i b e r ss e c r e t e db yo r n i t h o c t o n u sh u w e n n as p i d e r sp o s s e s sb e n i g np o t e n t i a la p p l i c a t i o n s h o w e v e r , t h ef i b e r ss h o u l db ep r o c e s s e df o rb e i n gu s e dd u et ot h et a n g l e s o m ef o r mo fn a t u r eo r n i t h o c t o n u sh u w e n n as p i d e rs i l k e l e c t r o s p i n n i n gp r o v i d e so n ee a s yw a yt op r e p a r eap i e c eo fr e g e n e r a t e ds p i d e rs i l kn o n w o y e n t h eo r n i t h o c t o n u sh u w e n n as p i d e rs i l ka n da r a n e u sv e n t 1 ，o c o m g ss p i d e rd r a g l i n es i l ka l ec o l l e c t e da so u rs t u d yo b j e c t t h ec o n t e n t sa l ef o l l o w i n g ：t h eb a s i cs t r u c t u r ea n dp r o p e r t i e so fo r n i t h o c t o n u sh u w e n n as p i d e rs i l k ：t h eb a s i cs t m c t u r ea n dp r o p e r t i e so fo r n i t h o c t o n u sh u w e n n as p i d e rs i l kw e r em e a s u r e da n dja n a l y z e db yc o m p a r i n gt oa r a n e u sv e n l v o c o s u ss p i d e rd r a g l i n es i l k t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eo r n i t h o c t o n u sh u w e n n as p i d e r ( o h s ) s i l kw i t hv e l v e ts u r f a c ea n ds a n e - s c a l ed i a m e t e r sc o n t a i n e dm u c hm o r ea l a n i n e ，s e r i n ew h i l e 晰t l ll e s sg l y c i n et h a nt h a to fa r a n e u sp e n l 、，o c o $ u $ s p i d e r ( a v s ) d r a g l i n es i l k o h ss i l kd o e sn o ts h r i n ki nt h ew a t e r t h em o l e c u l a rc o n f o r m a t i o n sw e r ea - h e l i xa n dr a n d o mc o i la sw e l la sn o t a b l e ，- s h e e ts t r u c t u r e o t h e r w i s e ，o h ss i l kh a dh i g h e rc r y s t a ld e g r e ea n dt h e r m a lr e s i s t a n c et h a nt h a to fa v sd r a g l i n es i l g s o l u b i l i t yo fn a t u r es p i d e rs i l k ：t h es o l u b i l i t yo fo r n i t h o c t o n u sh u w e n n aa n da r a n e u sv e n w i c o s u ss p i d e rs i l ki nd i f f e r e n ts o l v e n t sw e r ed i s c u s s e di no r d e rt of i n dac h e a p ，l o wt o x i cw i t hg o o ds o l u b l es o l v e n t t h es o l v e n tr a t i o n so fi na v s 函a g l i n es i l k9 m l i b r 、9 9 h f i pa n d8 8 f o r m i ca c i dw e r em o r et h a n9 0 ，w h i l et h es o l u b i l i t yo fo h ss i l kw a sw o r s e ，t h es o l v e n tr a t i o n sw e r e10 3 、7 4 9 a n d5 7 7 r e s p e c t i v e l y t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fr e g e n e r a t e ds p i d e rs i l kp r o t e i n ：t h em o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o no fa v sd r a g l i n es i l k f o r m i ca c i ds o l u t i o nw a sm e a s u r e db ys d sg e le l e c t r o p h o r e s i s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o nr a n g e df r o m5 0t o3 0 0 k d a t h ef t i rs p e c t r ao ft h er e g e n e r a t e ds p i d e rs i l kp r o t e i nf i l m sr e v e a l e dt h a tt h ei i is t r u c t u r ea n dp r o p e r t i e so f o r n i t h o c t o n u sh u w e n n as p i d e rs i l ka n dr e g a n e r a t i o no f t h ef i b e r sb ye l e c t r o s p i n n i n ga b s t r a c tm o l e c u l a rc o n f o r m a t i o n sw e r ea - h e ；l i x r a n d o mc o i la n d - s h e e ts 缸1 l c l 【u r e m o r e o v e r , t h ee f f e c t so fh f i pa n dl i b rw e r et h es a m e , w h i l et h es o l v e n tw a st h ef o r m i ca c i d ，t h ec h a r a c t e r i s t i cp e a ko f ，- s h e e tm o l e c u l a rw e r en o t a b l es t r o n g e ro fr e g e n e r a t e da r a n e u sv e n t r i c o s u ss p i d e rs i l kf i l m i nt h em a s s ，t h ef l - s h e e tm o l e c u l a rs t r u c t u r e so fr e g e n e r a t e ds p i d e rs i l kf i l m sw e r ew e a k e rt h a nt h a to f n a t u r es p i d e rs i l kf i b e r s t h es t r u c t u r ea n dp r o p e r t i e so fe l e c t r o s p u nr e g e n e r a t e ds p i d e rs i l k ：t h en o n w o v e nf a b r i co fr e g e n e r a t e do r n i t h o c t o n u sh u w e n n aa n da r a n e u sv e n t r i c o s u ss p i d e rs i l kw e r em a d eb ye l e c t r o s p i n n i n g 0 h sa n da v ss i l kw e r ed i s s o l v e di nh f i p , t h en l i x t u r eo fh f i pa n df o r m i ca c i dr e s p e c t i v e l ya n dt h e s o l u t i o n sw e r eu s e da se l e c t r o s p i n n i n gm a t e r i a l s t h em o r p h o l o g i e s ，s e c o n d a r ys t r u c t u r e s ，c r y s t a l l i n es t r u c t u r e s ，t h e r m a lp e r f o r m a n c ea n dm e c h a n i c a lp r o p e r t i e sw e r em e a s u r e db ym e a n so fs e m ，f t - i r ，x - r a yd i f f r a c t i o n ，t gt e s t i n ga n di n s t r o nt e s t i n gr e s p e c t i v e l y e l e c t r o s p u no r n i t h o c t o n u sh u w e n n as p i d e rs i l kh a dn i c e rm o r p h o l o g ya n ds t a b i l i t yi nw a t e r , w h i l ee l e c t r o n s p u na v sd r a g l i n es i l ks h r u n ks e r i o u s l yi nw a t e rw h i c hr e c e i v e di m p r o v e m e n ta f t e rb e i n gt r e a t e db ye t h a n 0 1 t h e r ew a sn oc h a n g ei nm o l e c u l a rc o n f o r m a t i o no ft h et r e a t e de l e c t r o n s p u na v sd r a g l i n es i l k ，b u tt h ec r y s t a ld e g r e e ，t h e r m a lr e s i s t a n c ea n db r e a k i n gs t r e n g t hw a se n h a n c e d t h ec e l lc o m p a t i b i l i t yo fe l e c t r o n s p u no r n i t h o c t o n u sh u w e n n as p i d e rs i l kw a sp r e l i m i n a r i l yr e s e a r c h e di nt h ea r t i c l e t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h er e g e n e r a t e ds p i d e rs i l kf i b e r sh a dg o o dc o m p a t i b i l i t yw i t hb i gr a tm e s e n c h y m as t e mc e l l k e y w o r d s ：s p i d e rs i l k , e l e c t r o s p i r m i n g ，m o l e c u l a rc o n f o r m a t i o n ，m o r p h o l o g y , c r y s t a l l i n es t r u c t u r e ，m e c h a n i c a lp r o p e r t i e s i vw r i t t e nb yj u n y a nd i a os u p e r v i s e db yp r o f z h i j u ap a nm a y 2 0 0 8苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材a料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。研究生签名：l 龃日期：立卑学位论文使用授权声明苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。研究生签名：导师签名：虎纹捕乌蛛丝的结构与性能及其静电纺再生加工第一章绪论第一章绪论蜘蛛丝是一种特殊的蛋白质纤维，它优良的综合力学性能是各种天然纤维和合成纤维所无法比拟的，其比模量优于钢而韧性优于k e v l a r 纤维【l 】，被认为是作为降落伞和防弹衣的理想材料。此外，蜘蛛丝的生物可降解性和生物相容性，也使其具有良好的医疗用途，如：可应用于生物医学的人造肌腱、人工器官、组织修复以及手术缝合线等。因而作为新一代的天然高分子纤维，蜘蛛丝以其优良的性能引起了世界各国科学家的兴趣和关注。关于天然蜘蛛丝和人工合成蜘蛛丝蛋白方面的研究很多，本章主要就与本课题的研究内容相关的部分，进行资料的综述和分析，；并提出本课题的研究目的和研究内容。1 1 天然蜘蛛丝纤维的概况1 1 1 概况蜘蛛丝是大自然几亿年进化中创造的奇迹，是蜘蛛捕食、筑巢、繁殖等基本生命活动必不可少的工具和手段。人们所见的蜘蛛网由多种蜘蛛丝构成，它们分别来自于蜘蛛体内的不同腺体。以结圆网蛛为例，其体内有七种专门生产蛛丝蛋白的腺体，这些腺体的一端封闭于体腔内，另一端连接于纺丝器( s p i i l l l e r e t ) ，不同的腺体分别连接于三对不同的纺丝器上，它们分别是前纺丝器( a n t e r i o rs p i n n e r e t ) 、中纺丝器( m e d i a ns p i n n e r e t ) 和后纺丝器( p o s t e r i o rs p i n n e r e t ) 。其中，连接于前纺丝器的有大囊状腺( m a j o ra m p u l l a t e ) 、梨状腺( p i r i f o r mg l a n d ) ；连接于中纺丝器的有小囊状腺( m i n o ra m p u l l a t e ) 、管状腺( c y l i n d d r i c a l t u b u l l f o r m e sg l a n d ) 和葡萄状腺( a c i n i f o r mg l a n d ) ；连接于后纺丝器的有集合状腺( a g g r e g a c eg l a n d ) 、毛状腺( c o r o n a t e f l a g l l i f o r m eg l a n d ) 1 2 。这些腺体内所储存的物质为液状丝蛋白，当液状丝蛋白从腺体至吐丝口之间的管形输送管流出时就形成了丝纤维，这期间发生了相应的物理化学作用【3 1 ，并且因腺体蛋白组成和腺体结构等的不同，而分别形成蜘蛛生命过程中所需要的各种具有不同性能的丝纤维。目前研究较多的有络新妇妇c l a v i p e s ) t 4 - 6 、十字园蚴翮p 搬d i a d e m a t u s )虎纹捕鸟蛛丝的结构与性能及其静电纺再生加工第一章绪论 7 - 9 1 、大腹园蛛( a r a n e u sv e n t v o c o s u s ) 1 0 - 1 2 1 和黑寡妇( l a t r o d e c t u s ) 1 1 3 - 1 5 】等蜘蛛所分泌的牵引丝，它们都有着相似的吐丝机理。2 0 0 6 年，g o r b 等【1 6 】在( n a t u r e ) 上发表了一篇关于狼蛛( t a r a n t u l a ) 的文章，这种蜘蛛分泌丝的过程不同于以上几种蜘蛛，它的丝是从蜘蛛脚上分泌出来的，关于这种蛛丝的成形原理目前还没有进一步的相关报道，只有a n d r e a s 等【1 7 j 首次用核磁共振成像( m r j ) 研究了该种蜘蛛的形态结构。虎纹捕鸟蛛( o r n i t h o c t o n u sh u w e n n a ) ，又名地老虎( 见图1 1 ) ，属蜘蛛目狒蛛科捕鸟蛛亚科，是个体较大的蜘蛛之一，雌雄外体形差别不大，体长一般为6 - 9 厘米，体重2 0 - 3 0 克，因身体多毛，头胸部背面有辐射状斑纹，腹部背面有虎纹状花纹而得名。这类蜘蛛仅存于北回归线以南的热带、亚热带山区和半山区，是一种大型穴居、不耐寒的剧毒稀有动物。在我国，虎纹捕鸟蛛主要分布于广西、云南、海南，是我国目前所发现的个体最大、单蛛产毒量最高( 1 m l 次) 的穴居毒蛛。由于这类蜘蛛的粗毒中含有透明质酶，碱性磷酸酶和d n a 酶等多种酶类，是研制新型药物的新药源，因而在广西等地有专门的蜘蛛养殖场饲养捕鸟蛛并从中提取毒素 1 8 - 2 1 1 。虎纹捕鸟蛛是一种地下穴居型蜘蛛，与结网蛛不同的是，除了产卵时，产包卵丝和少量附着丝外，平时会一边吸吮食物一边吐丝，因此，在每次饲喂食物后，即可以收集到一定量的丝纤维。在该蜘蛛的养殖期间，可得到大量的蜘蛛丝，在收集蜘蛛毒素的同时，如果能将这种蜘蛛丝纤维也利用起来，将可以产生良好的社会效益和经济效益。本文的主要研究对象之一就是这种可大量收集的虎纹捕鸟蛛丝。这也是首次在对这种丝纤维的基本结构和性能进行系统研究的基础上，提出将为提取毒素而饲养的虎纹捕鸟蛛的蛛丝，通过再生加工技术，制成为拟用作生物医用材料的纳米再生蜘蛛丝纤维制品。2虎纹捕鸟蛛丝的结构j 件能及e 静电纺儿生力t第一章绪论图1 1 虎纹捕呜蜘蛛的照片本文所用的另种蜘蛛丝是大腹同蛛牵引丝。大腹园蛛属蛛形纲蛛形目圆蛛科，体黑褐色，广泛分布于我国南北各地，为科- 常见的结圆网蛛，其个体较小，雌性蛛的个体只有2 0 2 5 m m 。国内研究人员已经就大腹同蛛牵引丝的形态结构、蛋白质组分、分子构象、聚集态结构、热学性质以及力学性能等做了大量的研究 1 0 - 1 2 , 2 2 - 2 6 j 。潘志娟等曾以h f i p 为溶剂，研究了不同的工艺条件对静电纺再生人腹园蛛包卵丝结构的影响f 2 7 - 2 8 1 。1 1 2 蜘蛛丝的超收缩性能结圆网蛛的牵引丝升i 溶于水，但当它接触水时就会发生超收缩现象，丰要表现为弹性增强，强度减弱，长度收缩到原有长度的一半左右，直径也相应大约变成原来的二倍，但这种超收缩丝仍能保持在网中的张力而并不影响网的支撑负载能力，具有机械完整性，这可能也是对f l 三存环境的一种适j 馥1 2 9 j 。关于蜘蛛丝的超收缩性能，国内外研究人员进行了部分研究。s h a o 等1 3 0 1 将四种不同蜘蛛的大囊状腺丝分别浸入四种不同的溶剂中，他们设想蜘蛛丝是。种硬弹性聚合物，得出了蜘蛛丝的超收缩性能是由f 分子链的取向发生了变化的结论。p l a z a 等”l j 认为蜘蛛丝在这种潮湿的环境f 所发生的这种现象实际f ：也是一种玻璃态向橡胶态转变的过程。h o l l a n d 等1 3 2 】认为当牵引丝浸水时，折叠区不发生链运动，而在富甘氨酸区和新分离丙氨酸螺旋区却发牛了较大的链运动。通过x 射线衍射t - j 以观察到，易变的闪氨酸区在化学转变中保持一致，排行成一个松散的螺旋环境，起着连接虎纹捕乌蛛丝的结构与性能及其静电纺再生加工第一章绪论结晶区与无定形区、促进结晶区重排的作用，也正是这种易变的丙氨酸螺旋区，使牵引丝发生超收缩，弹性增强。y a n g 等【3 3 】用1 3 c 和2 h 核磁共振( n m r ) 分别研究了n c l a v i p e s 大囊状腺丝，1 3 cn m r 的结果表明，当蛛丝浸入水中时，蛋白质主链上的甘氨酸、谷氨酸、酪氨酸、丝氨酸以及亮氨酸迅速的增加；2 hn m r 的研究结果表明，只有一个亮氨酸序列的子集受到水的影响，即高保守的y g g l g s ( 2 q ) q g a g r 区域在蜘蛛丝的超收缩过程中起着很重要的作用。l i u 等瞰】认为，y a n g 等只考虑了m a s p l ，并没有考虑到m a s p 2 ，因为n m r 的实验结果并没有提到脯氨酸的存在，可前期的实验结果表明n c l a v i p e s 的氨基酸组成中有脯氨酸，且存在于m a s p 2 中。l i u 等还认为，蜘蛛丝的超收缩性与脯氨酸的存在，即氨基酸序列g p g x x 有关，因为脯氨酸的侧链围绕着主链形成一个封闭的环，而这个环也阻止了和其它氨基酸链或水的氢键连接，因此，若蜘蛛丝中脯氨酸含量较少，则其超收缩性也将不会明显。这个理论对蜘蛛丝的仿生学具有重要的意义，因为蜘蛛丝的超收缩性一直也是其利用的障碍。1 1 3 蜘蛛丝的生物相容性生物相容性是指材料与人体之间相互作用产生各种复杂的生理、物理及化学反应，植入人体的生物材料必须是无毒、无致敏性的，对人体组织和血液、免疫等系统不产生不良反应【3 5 1 。蜘蛛丝作为种天然蛋白质纤维，引起了生物材料和组织工程领域研究人员的兴趣。事实上，蜘蛛丝作为医疗用品在民间已有很长的历史，主要用于包扎伤口，且有很好的杀菌作用。s r e e k a n t h 等【3 6 】将牵引丝植入老鼠体内发现；丝纤维对老鼠的纤维状巨细胞腺没有毒性反应，丝纤维植入皮下及肌肉内后，只有很小的体内反应，纤维表面仍然是光滑的，没有结构的畸形，说明有良好的阻止血栓形成的作用，该纤维浸入老鼠血浆中9 0 天后，纤维强度没有显著的变化，表面也没有血栓形成，该纤维对病原体和细胞有很大的阻抗作用，但没发现有抗生素作用。v o l l r a t h等【3 7 】的研究也表明，蜘蛛牵引丝植入猪的皮下后，在植入区周围没有异样的反应，不同种类的蜘蛛间也没什么差异。经过1 3 天后，伤口痊愈，表明完全被上皮细胞覆盖，没有发炎。a l l m e l i n g 等【3 8 j 将s c 细胞放到n e p h i l a 牵引丝上，1 5 分钟后发现细胞黏附在蛛丝上，2 4 小时后发现蛛丝纤维已紧紧地插入到细胞当中，且细胞呈现出双极化4虎纹捕鸟蛛丝的结构与性能及其静电纺再生加工第一章绪论的现象，实验还发现细胞在蛛丝上可正常地生长及增殖。c a o 等【3 9 】已成功的得到羟基磷灰石晶体在蜘蛛牵引丝表面的取向成核，这种矿化丝将结合蜘蛛丝优良的力学性能和羟基磷灰石的生物相容性的特点，可以作为骨植入物的理想生物材料。s t a r k 等【4 0 】将h e k 2 9 3 细胞放到经过重组得到的e a u s t r a l i s 蛛丝上，结果表明细胞可在上面正常生长。1 2 人造蜘蛛丝纤维的研究概况1 2 1 蜘蛛丝蛋白的人工合成天然蜘蛛丝优异的力学性能、与生物体之间良好的相容性，吸引着各国的研究者致力于开发与之相近的人造蜘蛛丝。基因工程技术在蜘蛛丝蛋白的人工合成方面发挥了巨大的作用，利用转基因技术向细菌、酵母、植物或动物等注入蜘蛛丝( 主要是牵引丝) 的部分基因片段，从而得到类蜘蛛丝蛋白质( r e c o m b i n a n ts p i d e rs i l kp r o t e i n ) ，再通过纺丝加工获得人造蜘蛛丝。1 2 1 1 微生物体系合成蜘蛛丝蛋白研究表明，蛛丝蛋白基因对微生物宿主的密码子有很大的偏爱性。l e w i s 等【4 1 1在e c o l i 中表达蛛丝e d n a ，表达量低，推测可能是由于密码子的偏好不同而引起的，因而在e c o i l 中使用频率较高的密码子重新设计了保守的氨基酸重复序列，利用p e t载体系统来生产牵引丝蛋白m a s p 2 ，表达水平明显高于前者。d o p o n t 公司f a h n e s t o c k等 4 2 4 3 1 合成类似s p i d r o i n l 和s p i d r o i n 2 的络新妇牵引丝蛋白基因，长度分别为中2 4和4 8 k b ，分别在e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 和p i c h a p a s t o r i s 中表达成功，两个表达体系相比，合成的基因在e c o l i 中表达时易出现合成终止的现象，表达产物出现梯度条带，最多只能表达1 0 0 0 个氨基酸。而p i c h a p a s t o r i s 作为宿主可表达分子量较高的重组蛋白，t氨基酸可达3 0 0 0 个，与天然蛛丝蛋白大小接近，而且没有发现蛋白质合成提前终止的现象，比e c o l i 的产量高2 倍。但用细菌发酵的重组蜘蛛丝蛋白纺出的丝纤维，由于蜘蛛丝蛋白基因高度的重复结构以及不寻常的m r n a 的二级结构，导致不能有效地转译，最终得到的丝纤维比较脆。近年来国内在基因重组蛛丝蛋白的研究上也取得了较多的成果。2 0 0 1 年解放军虎纹捕鸟蛛丝的结构与性能及其静电纺再生加工第一章绪论军需大学和福建师范大学的研究人员分别进行了防弹生物钢性蛋白和基因重组蛛丝蛋白的研究，利用p c r 技术对n e p h i l ac l a v a t e 主腺体牵引丝蛋白e d n a 序列进行扩增并对克隆片段进行序列分析，获得了n e p h i l ac l a v a t e 牵引丝蛋白s p i d r o i n 2 的e d n a片段】。中科院遗传所牛恒尧等在大肠杆茵中表达了来源于十字园蛛a d f 3 基因与g s t 融合蛋白【4 5 】。解放军军需大学柳增善等通过i 汀一p c r 克隆大腹园蛛鞭毛状腺体丝蛋白基因，利用反转录一置换法构建成了大腹园蛛大囊状腺体蛋白d n a 文库并从中筛选到a v f l 和a v f 2 两个丝蛋白基厌q t 4 6 。福建大学的李敏等【4 7 】人制备了重组r g d 蛛丝蛋白基因工程菌p n s r - 1 6 的表达产物，通过摇瓶培养确定p n s r - 1 6 生长和表达的最优化条件，并在此基础上进行高密度培养，最终使p n s r - 1 6 发酵菌体o d 6 0 d 达到5 7 1 5 ，重组丝蛋白表达产物占总蛋白量的2 0 。8 。2 0 0 7 年，福建大学的章文贤等【4 8 】以p n s 2 为重组蛛丝蛋白的表达菌株，采用溶氧反馈分批补料的高密度发酵方法，在培养过程中保持溶解为3 0 , - - 4 0 ，成功地进行了工程菌的高密度培养，最终菌体o d 6 0 0 达5 1 2 ，菌体干重2 4 1 9 l ，重组蛛丝蛋白表达率2 2 1 ，并采用金属亲和层析对重组蛋白进行了有效纯化，但他们并没有做蜘蛛丝蛋白溶液成丝性能方面的研究。1 2 1 2 植物体系合成蜘蛛丝蛋白利用植物的存储器官，如：种子和块茎来表达异种基因蛋白质已有很长的历史，研究人员用此方法得到大量蛛丝蛋白的氨基酸。s c h e u e r 等【4 9 】以4 2 0 3 6 0 0 b p 的合成蛛丝蛋白基因在烟草和马铃薯中实现了表达，表达产物与天然蛛丝蛋白比较，具有9 0 的同源性，并提取到占总蛋白2 的蜘蛛丝蛋白。与微生物体系不同，植物表达系统有其优势，植物不仅能从初始原材料制造自身氨基酸，转入植物中的蜘蛛丝蛋白不易发生重组丢失，且其蛋白质产量也比前者多【5 0 。5 1 1 。研究人员估计，在转基因植物中制造蜘蛛丝的成本仅及细菌遗传工程的十分之一到二分之一，但是目前用这种植物中提取的蜘蛛丝蛋白纺丝并不成功。6虎纹捕鸟蛛丝的结构与性能及其静电纺再生加工第一章绪论1 2 1 3 动物体系合成蜘蛛丝蛋白研究人员假设在哺乳细胞体系中产生的蛋白与蛛丝腺体细胞所分泌的丝蛋白非常相似，因而尝试了蛛丝蛋白在该系统中的表达。2 0 0 0 年，n e x i a 生物技术公司的研究人员从蜘蛛中提取一些牵引丝基因，将其注入到山羊的乳腺细胞中，由此生产含有蜘蛛丝蛋白的羊奶，再从羊奶中提取含有蜘蛛丝蛋白的乳液，然后将这种丝蛋白纺制成丝。利用转基因山羊技术生产的高性能轻型纤维材料被命名为“b i o s t e e l ，这种蛋白质纤维具有与天然十字园蛛牵引丝相似的断裂比功，但其断裂强度较小，断裂伸长大 5 2 4 3 】。这是目前为止最成功的利用基因技术得到的人造蜘蛛丝。基于蚕与蜘蛛有许多相似之处，其丝在成分上均为蛋白质纤维，且结构和性能也具有一定程度的相似性，因而许多科学家试图将蜘蛛的基因转入到蚕的体内，利用基因技术使蚕“吐”出类蜘蛛丝，弥补蚕丝的易变形、易折皱等缺附5 4 1 。上海生化所的科技人员目前已解决了转基因蚕的基因导入、活性基因鉴定及传代育种等难题，但未见后续工作【5 5 】。2 0 0 5 年9 月份，我国浙江大学利用家蚕核多面体病毒表达体系表达了大d x 为3 7 k d a 的鞭毛丝蛋白【5 6 1 。2 0 0 7 年1 1 月份，日本信州大学的研究人员成功的将n e p h i l ac l a v a t a 蜘蛛丝基因注入到蚕卵内，利用毛虫来孵育带有部分蜘蛛丝基因的蚕卵，以期通过蚕吐丝来得到一种强度更强、更持久耐用、更软的丝【5 7 1 。1 2 2 人造蜘蛛丝纤维的研究现状蜘蛛丝不像蚕丝那样容易获得，科学家们希望采用适当的纺丝技术将天然的丝蛋白或人工丝蛋白转化成具有高弹性、高强度等性能的丝纤维，研究集中在再生蜘蛛丝或重组蜘蛛丝的开发方面。1 2 2 1 再生蜘蛛丝蛋白的人工纺丝最早研究再生蜘蛛丝的纺丝方法的是a n d r e a n ss e i d e l 等【5 酊，他们将c l a r k e 牵引丝溶解在六氟异丙醇( h f i p ) 溶剂里，得到的纺丝液浓度为2 5 ，以丙酮作为凝固浴，t对形成的再生丝与天然牵引丝进行电镜扫描与c p m a sn m r 分析表明，在纺丝的过程中仅有少量的丙氨酸残基形成了d 折叠结构，含量比天然的蜘蛛丝低，因此脆性较大，于是他们将初生丝浸泡于室温下的水中2 d , 时，随后干燥一晚，再在真空4 0 c 下虎纹捕鸟蛛丝的结构与性能及其静电纺再生加工第一章绪论加热l d , 时，结果发现处理后的丝纤维的p 折叠分子链中丙氨酸残基的含量为初生纤维的3 倍。s l l a o 等【5 绷将脚办妇p 咖，西牵引丝溶解于盐酸胍缓冲液，用g 2 5 脱去盐酸胍，收集到的再生丝蛋白浓度为0 0 8 w w ，室温下滴到载玻片上，干燥，用针接触溶液表面，轻轻挑起并拉伸成丝，再生的丝纤维表面较粗糙，沿纤维轴方向有皱纹，但其直径相对较均匀( 9 1 m a ) ，直径比天然牵引丝大。1 2 2 2 重组蜘蛛丝蛋白的人工纺丝l e w i s 掣4 1 j 将纯化的重组蛛丝蛋白以2 , - 4 m g m l 溶于甲酸，通过标准规格的针孔挤入甲醇中成丝，干丝表面光滑但有破损。a r c i d i a e o n o 等【6 0 】将大肠杆菌表达的重组蛛丝蛋i 兰t n c d s 与【( s p d 4 ( s p i i ) 1 】4 制成丝纤维。n e d s 与 ( s p i ) 4 ( s p i i ) 1 4 的分子量分别为4 2 9 k d a ，5 5 k d a ，用甲醇作凝固浴，n e d s 形成的丝纤维直径：为6 0 1 m a ，沿纤维轴方向具有分子取向。以 ( s p i ) 4 ( s p i i ) i 4 为原料，采用不同的纺丝液浓度进行纺丝，发现纺丝液浓度不同，则形成的丝纤维的双折射性也不同，但丝纤维移出凝固浴后脆性大。a r c i d i a c o n o 和n e x i a 生物技术公司的l a z a r i s 等【5 3 】使用哺乳动物细胞表达的重组蛛丝蛋白a d f 3 h i s ，制备了浓度为2 8 8 3 的纺丝液，得到的丝纤维的直径为8 2 3 p m ，不溶于水且脆性大；对表达的重组丝蛋白a d f 3 ，制备了浓度为1 0 - - 2 8 的纺丝液，结果表明纺丝液的浓度超过2 3 时，形成的丝纤维具有较好的性能，在凝固浴中形成的k初生纤维的平均直径为4 0 1 t m ，拉伸后的丝纤维的平均直径为2 0 1 m a ，当纤维完全干燥时就不能再拉伸了。他们主要还研究了纺丝后拉伸对这种丝纤维性能的影响，对初生纤维分别进行单倍拉伸和双倍拉伸。单倍拉伸在7 0 8 0 的甲醇溶液中进行，双倍拉伸的纤维首先在甲醇溶液中进行第一次拉伸，随后在水中进行第二次拉伸。结果发现，强度随拉伸倍率的增大而增大，当拉伸倍率增大到5 时，平均强度从0 0 2 6 c n d t e x 增大到1 6 5 c n d t e x ，同时纤维直径变细。丝纤维的最大强度值为2 2 6 c n d t e x ，低于天然牵引丝的强度值( 7 1 l e n d t e x ) ，和再生蜘蛛牵引丝的强度相近。在7 5 的甲醇溶液中拉伸的纤维的平均断裂比功的最大值为o 6 4 5 c n d t e x ，经双倍拉伸的纤维，其平均断裂比功的最大值为0 8 9 5 e n d t e x ，最高平均模量为1 1 0 6 c n d t e x 。s t a r k t 4 0 1 等在e c o l i 中表达e a u s t r a l i s 牵引丝蛋白，利用p e t 3 2 载体系统来生产m a s p l ，2 得到的c d n a 序列富含4 个聚丙氨酸甘氨酸区域，对重组的丝蛋白溶液进行纺丝，最终得到的丝纤维的平虎纹捕鸟蛛丝的结构与性能及其静电纺再生加工第一章绪论均直径大约为8 0 t a n ，平均断裂强度、平均弹性模量以及平均屈服应力分别约为0 2 g p a ，7 g p a ，15 0 n 口a 。目前人造蜘蛛丝的研究还在实验阶段，纺出的丝纤维性能和天然蛛丝相比还有一定的差距，要生产出具有优异性能的仿真纤维，实现蜘蛛丝的工业化生产还需要持续不断的努力，而日益受到人们关注的静电纺丝为人工生产纳米级的蜘蛛丝提供了有利的条件。1 3 蜘蛛丝蛋白溶液的静电纺丝1 3 1 静电纺丝的基本原理静电纺丝是一种不同于常规方法的纺丝技术，它使高分子溶液或熔体带电，并置于喷丝口与接受屏之间的高压电场中。当高压电场所产生的电场拉伸力克服了液滴的表面张力后，该带电液滴形成了喷射流，然后该喷射流在电场中得到进一步的拉伸，同时内含水分不断挥发，最后以螺旋状到达接收器，凝固而形成非织造布状的纤维毡或其它形状的纤维结构物。这些纤维的直径通常远小于常规的天然纤维和合成纤维，达到纳米或亚微米级的尺寸范m 6 1 - 6 4 。1 3 2 蜘蛛丝蛋白溶液的静电纺丝近几年来，随着静电纺丝技术的发展，以胶原蛋白【珏蛔、蚕丝丝素 6 7 7 0 】等为原料，制备拟用作生物医学材料的纳米级纤维制品的研究较多，但关于蜘蛛丝蛋白的静电纺的报道并不多，最早的是美国科学家z a r k o o b 等【7 1 】以t - i f i p 为溶剂，将n e p h i l a蜘蛛牵引丝溶解在其中，得到了直径为8 2 0 0 n m 的纤维。国内的潘志娟等人以大腹园蛛丝为原料，h f i p 为溶剂，研究了一定浓度的再生蜘蛛丝溶液的静电纺丝技术，初步探索了电压、喷丝头与接收屏之间的距离( c s d ) 对静电纺蜘蛛丝纤维的直径、结晶结构以及纤维毡的力学性能的影响【2 7 2 8 1 。蜘蛛丝是一种天然蛋白质纤维，它具有的许多优异性能是其它天然纤维和合成纤维所无法比拟的。静电纺纤维的最主要特点是所得纤维直径很细，由这些纤维所形成的无纺布是一种有纳米级微孔的多孔材料，因此有很大的比表面积，这种高比表面9虎纹捕鸟蛛丝的结构与性能及其静电纺再生加工第一章绪论积及多孔隙的三维结构正是培养高密度细胞和组织所必需的，是应用于组织工程最有潜力的材料形式之一，因而采用静电纺丝的方法生产纳米级的蜘蛛丝产品，其在生物学领域必有广阔的应用与发展