（分析化学专业论文）离子液体介导免疫传感器的研制.pdf

摘要 摘要 离子液体作为一种新型绿色溶剂，具有独特的理化性质。近年来，离子液体作为介 质或催化剂被广泛应用于液液萃取、有机合成、非水生物催化等领域。然而，离子液体 在构建免疫传感器中的应用报道很少，开展离子液体介导免疫传感器研制具有十分重要 的现实意义。 采用“无溶剂和“逐步升温 等技术改进的方法合成1 丁基2 ，3 二甲基咪唑六氟 磷酸盐、1 戊基2 ，3 二甲基咪唑六氟磷酸盐、1 异辛基一2 ，3 二甲基咪唑六氟磷酸盐三种 新的离子液体，反应总转化率在8 8 和9 3 之间。离子液体粗品用丙酮稀释后，经活性 炭脱色制得无色离子液体，样品在4 0 0 8 0 0 n m 范围内未见吸收。离子液体的结构被红 外、核磁分析所证实。 考察离子液体的密度、电导率、粘度和在水中的溶解度等理化性质，发现密度和电 导率随离子液体中阳离子侧链烷基碳原子数的增加而降低，而粘度正好相反。我们基于 咪唑阳离子在2 1 l n m 处的吸光度与其浓度呈线性关系，建立了测定二甲基咪唑类离子液 体溶解度的分光光度法。该方法简单、灵敏和准确，它已用于1 戊基2 ，3 二甲基咪唑六 氟磷酸盐水溶性的测定，结果为2 8 1 3 m g m l 。 将四乙氧基硅在盐酸催化下水解形成的硅溶胶、离子液体和黄曲霉毒素b l ( a f b l ) 抗体混合后涂于玻碳电极表面制得非标记型a f b i 抗体免疫传感器。以f e ( c n ) 6 3 - 4 - 磷酸 缓冲溶液( p h 7 4 ) 为测试底液，采用交流阻抗和循环伏安法研究电极的电化学性能。 结果显示免疫反应后循环伏安图上的氧化还原峰电流减小，而交流阻抗值增大，这些表 明电极表面发生的免疫反应阻碍了f e ( c n i l 6 3 - 4 在电极表面的扩散。当采用交流阻抗监测 电极表面，发现传感器的电子转移阻抗随a f b l 浓度的增加而增大。对交流阻抗图进行 分析，结果表明电极表面的反应是一个受电子转移控制的过程。在新合成的离子液体中， 1 戊基2 ，3 二甲基咪唑六氟磷酸盐作为介质免疫传感器对a f b l 响应灵敏，且绝对阻抗 值最小而被选用。在最佳条件下，方法检出限为o 1 n g m l ( s n = 3 ) ，线性范围为 1 1 0 n g m l 。此免疫传感器具有良好的稳定性，4 。c 下保存2 5 天与新制备电极响应基本 一致，方法已成功应用于样品中痕量a f b l 的测定。 按黄曲霉毒素传感器相似的方法制得离子液体介导的虾抗体免疫传感器。采用交流 阻抗法研究了传感器在不同浓度的虾过敏原溶液中的电子转移阻抗的变化，结果显示电 子转移阻抗值随溶液中虾过敏原浓度的增加而增大，在虾过敏原浓度为1 - 1 2 n g m l 时呈 线性，检出限为o 1 n g m l 。此虾抗体离子液体免疫传感器的稳定性在3 周以上，方法已 用于虾制品中过敏原的测定，结果令人满意。 关键词：离子液体；免疫传感器；a f b l ；虾过敏原；交流阻抗 a b s t r a c t a b s t r a c t i o n i cl i q u i d sa san e wg r e e ns o l v e n th a v ee x c e l l e n tp h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s ，t h e s ew e r e w i d e l yi n v e s t i g a t e da n du s e da sm e d i u mo rc a t a l y s tf o rl i q u i d - l i q u i de x t r a c t i o n , o r g a n i cs y n t h e s i sa n d b o a - a q u e o u sb i o c a t a l y s i si nr e c e n ty e a r s h o w e v e r ，l i t t l er e p o r tr e f e r st of a b r i c a t i o no fi m m u n o s e n s o rw i t h i o n i cl i q u i da n dt h u ss t u d yo ni m m u n o s e n s o r su s i n gi o n i cl i q u i da sm e d i u mi so fp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e t h em o d i f i e dp r o c e d u r eu s i n gn o n - s o l v e n ta n dg r a d u a l l yh e a t i n gw a sd e v e l o p e df o rs y n t h e s i so fi o n i c l i q u i d sw i t ht h ey i e l di nt h er a n g ef r o m8 8 t o9 3 ，w h i c hi n c l u d el - b u t y l 一2 ，3 - d i m e t h y l i m i d a z o l e h e x a f i u o r o p h o s p h a t e ，1 - a m y l 2 ，3 - d i m e t h y l i m i d a z o l eh e x a f l u o r o p h o s p h a t e ，l i s o o c t - 2 , 3 一d i m e t h y l i m i d a z o l e h e x a f l u o r o p h o s p h a t e a f t e rt h ec r u d ep r o d u c t sw e r ed i l u t e db ya c e t o n e ，t h e yw e r ed e c o l o r e dw i t ha c t i v a t e d c a r b o na n da l m o s tc o l o r l e s si o n i cl i q u i d sw e r eo b t a i n e d v i s i b l ea b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r yo fp u r i f i e d s a m p l e sw a sm e a s u r e do nt h eu l t r a - v i s i b l es p e c t r o m e t e r , n oo b v i o u sa b s o r p t i o np e a kw a sf o u n di nt h e w a v e l e n g t hr a n g eo f4 0 0 - 8 0 0 n m m o r e o v e r , t h er e s u l t so ft h ei ra n d1h - n m ra n a l y s i sc o n f i r m e dt h e s t r u c t u r eo ft h ei o n i cl i q u i d s t h ed e n s i t y , v i s c o s i t y , c o n d u c t i v i t ya n ds o l u b i l i t yi nw a t e ro fi o n i cl i q u i d sw e r ei n v e s t i g a t e d , r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e n s i t ya n dt h ec o n d u c t i v i t yo fi o n i cl i q u i d sd e c r e a s e dw i t l l i n c r e a s i n gt h ec a r b o nc h a i no ft h es u b s t i t u t eg r o u p h o w e v e r ar e v e r s i b l el a ww a so b s e r v e da b o u tt h e v i s c o s i t y a ss o l u b i l i t yi nw a t e ro fi o n i cl i q u i d sw a si m p o r t a n tt oi t sa p p l i c a t i o n , an e ws p e c t r o p h o t o m e t r y w a sd e v e l o p e da n da p p l i e dt om e a s u r es o l u b i l i t yo fi o n i cl i q u i d si nw a t e rb a s e do nt h ea b s o r b a n c eo f i m i d a z o l ec a t i o na t21ln ml i n e a r l yi n c r e a s i n gw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no ft h ei o n i cl i q u i di nw a t e r i tw a s f o u n dt h es o l u b i l i t yo fl a m y l - 2 ，3 - d i m e t h y l i m i d a z o l eh e x a f l u o r o p h o s p h a t ei s2 813 m g m l s i l i c a s o lw h i c hw a sh y d r o l y z e df r o mt e t r a e t h o x y s i l i c a n ei np r e s e n c eo fh y d r o c h l o r i ca c i d ，i o n i cl i q u i d a n da f l a t o x i nb i ( a f b oa n t i b o d yw e r em i x e da n dw e r ed r i p p e do n t ot h es u r f a c eo fg l a s sc a r b o ne l e c t r o d e t of a b r i c a t en o n - l a b e l e di m m u n o s e n s o r i nt h i s s t u d y , c y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n de l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) w e r ea p p l i e dt oi n v e s t i g a t et h ee l e c t r o c h e m i s t r yp e r f o r m a n c eo fe l e c t r o d ei n w h i c hf e ( c n ) 6 - p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n ( p h 7 4 ) w a se m p o l y e da sb a s es o l u t i o nf o rt e s t t h er e s u l t s s h o w e dt h a ta f t e rt h ei m m u n o r e a c t i o nt h er e d o xp e a k sd e c r e a s e dw h i l ee i si n c r e a s e d t h i si n d i c a t e dt h e i m m u n o r e a c t i o nh i n d e r e dt h ed i f f u s i o no ff e ( c n ) 6 忡o c c u r r e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c e w h e nm o n i t o r i n g t h ee l e c t r o d es u r f a c eb ye i s ，t h ee l e c t r o nt r a n s f e rr e s i s t a n c eo ft h es e n s o ri n c r e a s e dl i n e a r l yw i t hi n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o no f a f b i b a s i n go nt h ea n a l y s i so fe i sp l o t , w et h i n kt h er e a c t i o no nt h es e n s o rs u r f a c ei sa e l e c t r o nt r a n s f e rl i m i t e dp r o c e s s i nt h e s en e w l ys y n t h e s i z e di o n i cl i q u i d s ，1 - a m y l - 2 ，3 - d i m e t h y l i m i d a z o l e h e x a f l u o r o p h o s p h a t ew a ss e l e c t e da sm e d i u mo fi m m u n o s e n s o rf o ri t sg o o de l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s ea n d t h es m a l l e s te l e c t r o nt r a n s f e rr e s i s t a n c e u n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h ei m m u n o s e n s o rw a sh i g h l ys e n s i t i v e t oa f b lw i t had e t e c t i o nl i m i to f0 1n g m l ( s n = 3 ) a n dt h el i n e a rr a n g ew a sf r o mlt olo n g m l t h e i m m u o m e n s o rh a dv e r yg o o ds t a b i l i t ya n dc o u l db ep r e s e r v e df o r2 5d a y su n d e r4 c i tw a ss u c c e s s f u l l y a p p l i e dt od e t e r m i n ea f bl i ns e v e r a ls a m p l e s t h em e t h o ds i m i l a rt ot h o s ea p p l i e dt op r e p a r ea f b ia n t i b o d yi m m u n o s e n s o rw a se m p l o y e dt o p r e p a r es h r i m pa n t i b o d yi i n m u n o s e n s o r e i sw a se m p l o y e dt oi n v e s t i g a t ec h a n g e so fe l e c t r o nt r a n s f e r r e s i s t a n c eo fi n l m u n o s e n s o ri nd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fs h r i m pa l l e r g e n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e e l e c t r o nt r a n s f e rr e s i s t a n c eo ft h es e n s o ri n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no fs h r i m pa l l e r g e n t h e l i n e a rr a n g ew a sf r o mlt o12 n g m lw i t had e t e c t i o nl i m i to f0 1n g m l t h ei m m u n o s e n s o rc o u l db e p r e s e r v e da tl e a s t3w e e k su n d e r4 c i tw a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e dt od e t e r m i n es h r i m pa l l e r g e ni ns e v e r a l s a m p l e s k e y w o r d s ：i o n i cl i q u i d ；i m m u n o s e n s o r ；a f b i ；s h r i m pa l l e r g e n ；e i s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是拳人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： i 壬忠、云 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：i 王怎云导师签名：季柱 e 1 期： 第章绪论 第一章绪论 民以食为天，食以安为先，食品安全关系到千家万户。近年，食品安全特大恶性事 件频繁发生( 如“三鹿婴儿奶粉事件和“苏丹红事件) ，致使人们对我国食物质的 安全性担扰和普遍关注度在不断增加，食品安全已成为社会不稳定的又一诱发因素。为 此，世界各国纷纷将食品安全提升到国家公共安全的高度加以重视，并颁布系列用于规 范食品加工和市场行为的法规和法令，我国也在近期出台了第一部食品安全法。在 我国的大宗农产品中，伴随作物生长而天然产生的真菌毒素和过敏原影响最为广泛，每 年造成巨大的经济损失并对人们身体健康构成严重威胁。 1 1 黄曲霉毒素 1 1 1 给人类健康带来巨大危害 真菌毒素( m y c o t o x i n ) 是常见于农产品和食品中的一类污染物，是由真菌产生的次生 代谢产物【l 】。它在农产品、食品和饲料中的分布范围非常广泛，包括花生、稻米、玉米、 小麦、大豆等粮油产品。黄曲霉毒素( a f a t o x i n s ，a f ) 作为真菌毒素中一类十分重要的毒 素，主要有六种类型，包括a f b i 、a f b 2 、a f g 卜a f g 2 、a f m i 、a f m 2 ，它们的化学 结构式如图1 1 所示。黄曲霉毒素的基本结构由二呋喃环和香豆素组成，前者是与毒性 有关的结构，后者为致癌性的结构。在上述六种黄曲霉毒素中，以a f b l 毒性最大，致 癌性最强，危害最为严重。经测定，a f b l 的半致死量为0 3 6 m g k g 体重，属剧毒类，其 毒性是砒霜的6 8 倍，氰化钾的1 0 倍【l 】。a f b l 可以通过多种途径污染粮油等农产品、食 品和饲料等，直接或间接进入人类食物链，成为威胁人类健康的巨型杀手。 a f b l 的急性中毒部位是在肝脏，表现为呕吐、发热、肝腹水等症状。它对人体的 毒性表现在可阻止酶、蛋白和凝血因子的合成；还能引起免疫抑制，d n a 损伤，肝脂 肪退化和抑制葡萄糖、脂肪酸的代谢；除了对人体具有巨大毒性外，对细胞的毒性主要 表现在干扰d n a 和r n a 的合成，从而干扰蛋白质的合成，导致动物全身性损害【2 】；当 它与t r n a 结合后，所形成的加成物会抑制t r n a 与某些氨基酸结合，而这些氨基酸往 往是蛋白质生物合成过程中所必需的氨基酸，如赖氨酸、精氨酸、亮氨酸等【3 4 j 。除毒性 以外，a f b l 更具有强烈的致癌性【5 1 。据报道，它的致癌性是二甲基亚硝胺的7 5 倍，奶 油黄的9 0 0 倍，苯并芘的4 0 0 0 倍【l 】。通过对其致癌性机理的研究发现，它之所以可以最 终造成对d n a 的损伤，是因为a f b l 可由肝粒体酶活化为亲电子的a f b i 2 ，3 环氧化物， 而环氧化物的c 2 可以与d n a 的鸟嘌呤酮基结合形成a f b i d n a 加合物，加和物经过 去嘌呤反应又会形成a f b l - n 7 鸟嘌呤，导致了d n a 分子上在鸟嘌呤位置无缺口。所以 可以理解为a f b l 干扰信息核糖核酸和脱氧核糖核酸的合成过程是在翻译水平上千扰了 蛋白质的生物合成，影响了细胞代谢，因而它与人类及动物的许多疾病存在着千丝万缕 的联系。 江南大学硕士学位论文 南拱南辨 h 黄曲零毒囊b l 置 黄曲霉毒褰b l 书势书茁 黄曲蓐毒囊e 。黄曲霉毒囊岱 战南磐 h 黄曲每毒素i 。 黄曲霉毒囊l 图1 - 1 黄曲霉毒素b l 、b 2 、g l 、g 2 、m l 、m 2 的结构图 f i g 1 1t h es 仃u c t u ：他o f a f b t 、a f b 2 、a f g i ，a f g 2 、a f m i 、a f m 2 1 1 2 快速发展的检测方法 a f b l 检测方法概括起来可以分三大类，包括生物鉴定法、仪器分析法和免疫分析 法。生物鉴定法是最传统的分析方法，它虽然对样品纯度要求低且仪器简单，但是专一 性不强，灵敏度也不如薄层层析法，一般只能作为化学分析方法的验证，而且此方法所 需时间较长，费用较高，并需要特殊的操作技巧。 仪器分析法主要包括薄层色谱( t h i nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , t l c ) 、荧光光度 ( f l u o r e s c e n c e ，f l ) 、高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h p l c ) 和高 效毛细管电泳( h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，h p c e ) 等方法。t l c 是应用最 早最广泛的真菌毒素分析检测技术，不但具有分离、制备功能，还可以进行定性以及定 量的分析，设备简单，但灵敏度不高且操作繁琐，一般为目测定量所以受主观影响较大。 f l 检测技术是基于a f b l 在4 2 5 n m 处发出蓝色荧光而建立的一种采用荧光分光光度计 检测样品溶液中a f b l 的快速检测方法。近年，通过与免疫亲和技术的结合，如免疫亲 和柱净化技术，其专一性和灵敏度得到了较大提高。目前，我国食品中黄曲霉毒素的标 准测定方法就包括免疫亲和层析净化荧光光度法。这种方法处理比较简单，检测速度快， 灵敏度也比传统检测方法有所提高。但是f l 方法因为不具备分离功能，导致不能同时 进行a f t 总量和a f b l 分量的测定，大大限制了该方法的应用。当前国内外检测a f b l 最权威的方法是高效液相色谱法。它不仅可实现分析自动化，灵敏度高，而且有很大灵 敏度提高的空间【6 1 。应用h p l c 法进行a f b l 的检测已有很多报道，范围涉及食品、农 产品、饲料、中药等多个领域【7 1 1 1 。它具有准确率高、分辨率强的特点，但操作复杂、 技术水平要求高，比较适合专业检测实验室使用。至于新兴的h p c e 技术，它兼具了色 2 第一章绪论 谱技术和电泳技术的长处，具有高效、高灵敏度、高分析速度、样品用量少和溶剂需要 量少等仪器分析技术所要求的优点。尽管如此，传统的检测器仍无法满足检测痕量a f b l 的要求。近年来，一些以激光为基础的检测器的出现使得h p c e 的检测系统得到了较大 程度的改善，实现了痕量物质的高灵敏度检测分析，极大地增强了荧光检测的信噪比， 提高了检测技术的灵敏度。但是激光检测器通常为气体激光器，不仅价格昂贵，而且体 积十分巨大，更重要的是激光器输出波长的选择性小，与a f t 的吸收光谱适合性差， 影响了a f b l 检测灵敏度的提高。因此，有关运用h p c e 技术分析a f b l 的报道并不多 见【1 2 , 1 3 】。 免疫分析法包括免疫层析法( i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y ，i c ) 、放射免疫测定法 ( r a d i o i m m u n o a s s a y ，r i a ) 、酶联免疫吸附测定法( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ， e l i s a ) 、免疫亲和色谱与仪器结合测定法及时间分辨荧光分析方法( t i m e r e s o l v e d f l u o m i m m u n o a s s a y ，t r f t a ) 等。i c 法的特点在于方法操作简单、快速、也不需要特殊 的仪器设备，很适于对大量样品进行初筛，也可实现实时测定。目前，研究较多的是金 标记免疫层析法即胶体金【l 训。但此法不能进行准确定量，因而只适用于定性或或半定量 的样品筛选。r i a 法虽然灵敏度高，选择性好，但是检测中使用有放射性污染的标准品 且标准品寿命短，必须与液体闪烁计数器等昂贵仪器联合使用，放射性废弃物的处理也 很复杂，更给环境造成了很大负担。因此用r i a 分析技术检测a f b l 的研究报道目前非 常少见。e l i s a 法是7 0 年代开始发展起来的免疫测定技术，其灵敏度高，是t l c 法的 2 0 0 倍，而且具有回收率高、选择性强、提取方法简单等特点，可以进行定性和定量测 定，应用较为广泛。该方法国际上发展十分迅速，我国自9 0 年代也开始了这方面的研 究，而且取得了一定的成果，建立了较多的快速检测方法，如a f b l 试剂盒( 如无锡市 生物技术公司的e l i s a 试剂盒等) 、a f b l 试纸等。此方法的不足就在于所用试剂不易保 存，易失活，酶的活性容易受反应条件影响，并且国际上对a f b l 的限量标准越来越严 格，所以常规e l i s a 方法的检测灵敏度己无法满足超痕量a f b l 检测的需要。近年兴起 的t r f i a 检测技术是一种适于超微量检测领域的检测方法【i5 。t r f i a 方法建立的试 剂盒不仅灵敏度高、标准曲线量程宽，而且操作流程短、应用范围广，但它为了减少干 扰，非常注重样品的前处理，整套方法检测时间很长。另外t r f i a 的结果对仪器的依 赖度高，必须由专有的时间分辨荧光仪器读出，使用的范围十分有限。 1 2 食品过敏原 1 2 1 日益严重的食品过敏原问题 过敏原是指能刺激机体发生过敏反应的物质，一般为具有酸性等电点的蛋白质或糖 朊，分子量一般小于7 0 0 0 k d 1 6 】。食物过敏反应是由于过敏原入侵人的体内，使致敏机 体再次接受相同的过敏原刺激后，由i g e 介导的体液免疫反应，i g e 抗体在胃肠中与食物 中的抗原蛋白结合，产生超敏反应i l6 t 1 7 j 。 f d a 报告的8 类常见过敏食品包括牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类、花生、大豆、坚果类 及小麦，占到了所有能引起过敏反应食品的9 0 以上。在这些产品中，虾及其制品是重 江南大学硕士学位论文 要的一类【1 6 , 1 8 , 1 9 】。尤其近些年，随着人们生活水平的不断提高，有关食用或加工虾及其 制品导致过敏的报道层出不穷【2 0 - 2 2 】。对各种不同品种虾的过敏原的性质进行深入研究后 发现，各种品种虾的主要过敏原都是分子量3 6 k d 的组分，且其氨基酸的组成、顺序十 分相似【2 3 l 。通过更深入的研究发现，此过敏原为存在于肌肉的肌原纤维中的原肌球蛋白， 它和肌钙蛋白一起结合在f 肌动蛋白上形成细丝。原肌球蛋白糖基的含量约4 0 ，为 等电点在4 5 的酸性糖蛋白。研究还发现它的结构中酪氨酸和苯丙氨酸含量少且氨基酸 组成上无色氨酸。2 0 0 4 年，赖等报道了中国罗氏虾除具有原肌球蛋白外，还含有分子量 为7 8 2 k d 、6 6 2 k d 、4 6 5 k d 的几种过敏原，据有关专家推测可能是虾种差异引起的 2 4 1 。 随着人们饮食环境的极度拓宽以及生活方式的转变，特别是食品种类的增多和转基 因食品的大量涌现，致使与食物过敏直接相关的过敏疾病发病率日益增高。在发达国家， 每年有超过2 0 的人受过敏性疾病的困扰【2 5 1 。据不完全统计，我国过敏疾病的发病率要 高于发达国家。过敏疾病已经成为当今世界性的重大卫生问题之一，食物潜在的过敏活 性已经成为了国际国内急需研究的新课题1 2 6 1 。 1 2 2 检测技术现状 食品过敏原的检测主要分为体内和体外检测。体内实验包括皮肤试验( s k i np r i c k t e s t i n g ，s p t ) 和双盲对照食物激发实验( d o u b l e - b l i n d e dp l a c e b o - c o n t r o l l e df o o dc h a l l e n g e s ， d b p c f c ) 。相比于体内实验而言，体外实验更安全。目前体外实验主要应用i g e 测定、 组胺释放( h i s t m a l n er e l e a s i n gt e s t ，h r t ) 实验的方法。 双盲实验被称为鉴定食品过敏原的“金标准 ，m a y 等最早报道了此方法【2 7 1 。同时 被欧洲变态反应和临床免疫学会评定为诊断食物过敏反应的标准方法【2 8 1 。实验中最重要 的就是要控制安慰剂和实验剂量，以能掩盖食物的气味、质地为限，并尽量消除被检食 物与安慰剂的细微差别，这样可能限制了食物的实验剂量，可以通过提取食物中的有效 成分弥补这一缺点。d a u l 等【2 9 】将相当于5 0 0 9 虾中的1 2 8 种被检测物质进行了伪装，但 其结果受众多因素影响，甚至包括心理反应在内，且实验剂量及安慰剂等环节也有待完 善。 s p t 在过敏原诊断中应用的极为普遍【3 们。此法虽然操作简便，但有时需要甚至数十 次针刺，对试验者身心造成较大的创伤和痛苦【3 1 1 。此外，实验条件也十分苛刻，要求病 人皮肤完好及未使用对皮肤反应有极大影响的药物，实验物质必须保证没有传染性或毒 性而只具有过敏原性。皮肤实验有时还存在结果与病史并不完全一致，阴性结果可能出 现了过敏反应，而阳性则无症状出现。因此s p t 方法在实际应用中受较大的限制且阳性 率偏高。 h r t 实验是i g e 介导的超敏反应，可以引起体内释放大量组胺，而组胺含量可应用 荧光放射免疫方法等进行测定，与适当的参比进行比对后，确定组胺释放率阳性标准， 从而进行过敏原活性鉴定或测定的一类方法1 3 2 1 。组胺释放实验中生物胺如腐胺、尸胺等 可能会对荧光法测定组胺存在干扰，因此有文献报道利用玻璃纤维包被的微量滴定板 ( g l a s s 肋r e c o a t i o d l t l i c r o t i t e 印la t | e ) 来分离组胺与干扰成分【3 3 l 。由于组胺测定必须在抽血后1 天内完成，限制了该技术在食物过敏原检测与评价方面的应用，而且体外细胞组胺释放 4 第一 绪论 的影响因素多而复杂，且测定方法也较为繁琐，因此很大程度上限制了该方法的推广使 用。 过敏原发挥生物活性的关键就在于过敏原与i c e 的结合，因此测定过敏原特异性l g e 在过敏症诊断及过敏原评价中具有重要地位p 2 1 。其中，最为常用方法就是放射过敏原吸 附抑制实验( p a s t 抑制实验) 口“、酶标记过敏原吸附抑制实验技术( e a s t 抑制实验) 3 5 1 、免疫印迹实验( w e s t e r nb l o t t i n g ) , _ j 酶联免疫吸附实验( e l i s a ) 。p a s t 抑制实验和 e a s t 抑制实验最大不足在于它们对于人血清的依赖性，而血清是很难保证一致的，因 此这两种方法难以标准化。而e l i s a 的酶活易受影响且比较费时。此外，p c r 分析、 过敏原指纹图谱1 3 6 】以及生物信息学评价技术也开始应用于食物过敏原的初步鉴定。 1 3 免疫传感器 生物传感器是用固定化的生物体成分( 酶、抗原、抗体、激素等) 或生物体本身( 细胞、 微生物、组织等1 为敏感元件，再与适当的能量转换器结合而成的器件【3 ”。免疫传感器 是生物传感器的一种，它是将传统的免疫测试法与生物传感技术融合在一起用以检测抗 原抗体免疫反应的生物传感技术。免疫传感器具有耐用、可携带、易操作、低成本等 特点，是目前开发研究的热点。 1 3 1 工作原理及分类 免疫传感器的概念是1 9 9 0 年t f l h e n r y 等提出的口”。免疫传感器由感受器( a ) 、转换 器( b ) 、电子放大器( c ) 和显示器( d ) 组成，如图1 2 所示。图中感受器a 为抗体，它将信号 传递给传感器。感受器a 在存在其他干扰的情况下，与待测物质选择性的通过化学亲和 力紧密结合【3 9 1 。然后通过与直接相连的第二个元件转换器的转换后，感受器a f l j 物理信 号或者生物化学信号，即抗体抗原发生免疫反应所产生的信号被转换成电信号，通过电 子放大器c 将信号放大并输出给显示器d m j 。 图1 - 2 免疫传感器的构造示意图 f i 9 1 - 2s c h e m a t i co f t h es t r d c i m r e o f i m m u n o s e n s o r 根据所使用转换器的不同，免疫传感器可分为：光学免疫传感器、电化学免疫传感 器、质量敏感免疫传感器及热量检铡免疫传感器等【椰l 。其中，电化学和光学免疫传感器 发展较快，而光学免疫传感器由于反应时间较长试剂易遗漏，还可能遇到外界光线的 干扰等问题，太规模生产的费用也通常比一般的电化学装置高，一定程度上限制了其应 用。电化学分析设备简单，测试不受样品颜色、浊度的影响( 即样品可以不经处理，不 需分离) ，因此近年发展较快。前景看好。 电化学免疫传感器根据测量电化学性质的不同可分为电位型、电流型、电导型和阻 江南大学硕士学位论文 抗型。它们的发展历程和应用简要评述如下： ( 1 ) 电位型 1 9 7 5 年j a n a t a 第一次利用电位型免疫传感器来监测免疫化学反应。它是根据待测物 浓度与膜电位变化值成对数，然后进行换算，即可求出待测物浓度1 4 。1 9 8 0 年，s c h a s f o o r t 第一次在免疫传感器中引入离子敏感性场效应转换器( i s f e t ) 技术，用于检测抗原抗体 复合物形成后导致的电荷密度与等电点变化，检测限达到l 1 0 。7 m o l 4 2 j 。到2 0 0 4 年， 袁若等通过乙肝表面抗体( 舳s a b ) 的氨基阳离子与吸附在铂电极表面n a t i o n 膜中的带 负电的磺酸基之间存在的静电作用将h b s a b 固定在电极表面制得电位型免疫传感器， 电位变化大，结果较满意【4 3 1 。电位型免疫传感器的不足在于背景干扰较严重而且选择性 差，所以实际应用不多。 ( 2 ) 电流型 19 7 9 年a i z a w a 首次报导了电流型免疫传感器，用来检测人绒毛膜促性腺激素( h c o ) m 。此后的电流型免疫传感器一般都用酶进行标记。2 0 0 0 年，m e d y a n t s e v a 等将包埋了 胆碱酯酶的的硝化纤维膜固定在银电极表面，制得了电流型免疫传感器用于致病真菌的 检测，检出限达到1 1 0 j 5 m g m l t 4 5 1 。2 0 0 5 年z h u o 等在金电极表面修饰辣根过氧物酶 和纳米金，制备出用于检测待测样品中的乙肝表面抗原的电流型免疫传感器，检出限达 到0 8 5 n g m l t 4 6 1 。 ( 3 ) 电导型 1 9 9 2 年s a n d b e r g 描述了一种由聚合物制备的电导型免疫传感器，它的基本原理与 e l i s a 的相似，但这种电导型免疫传感器的结果不是通过颜色来显示，而是通过电信号 即电导率来显示【4 7 1 。由于这类传感器同时受到缓冲液电容变化和待测样品离子强度的影 响且溶液的电阻是由全部离子移动决定的，因此不得不考虑非特异性吸附问题，以上问 题导致电导型免疫传感器的发展缓慢。 ( 4 ) 阻抗型 2 0 世纪6 0 年代初，荷兰物理化学家s l u y t e r s 首次在电化学研究中运用了交流阻抗 谱( e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ，e i s ) 方法。自此，e i s 分析方法在电化学、生 物科学、物理学、材料科学等学科有了较快发展，但在免疫检测方面起步较晚。直到1 9 9 6 年，r i c k e n 等将抗口蹄疫病毒固定在电极表面，利用非法拉第交流阻抗法进行测定，实 验表明可以根据电容变化值进行抗体固定量的分析【4 引。一般而言，当在电极表面形成大 量生物复合物的情况下，法拉第阻抗谱表现的更为灵敏，此时一般以【f e ( a 彤6 】3 - 4 - 作为 氧化还原电对。当法拉第电流在电极表面形成时，表现为阻抗谱中阻抗实部z r e 变化。 z h a n g 等将层层修饰的功能化的纳米金与抗体通过共价键耦合固定至电极表面，运用交 流阻抗法检测溶液中的阿朴脂蛋白，结果表明随着溶液中阿朴脂蛋白抗原浓度的增加， 阻抗r e t 明显增加，方法检出限达到5 0 p g m l l 4 9 1 。李等建立了一种采用电化学阻抗技术 快速检测大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的电化学免疫传感器，它是通过石英晶体金电极表面附着 的一层蛋白a 膜用来固定抗体的。试验结果表明石英晶体金电极表面的电子传递阻抗 随抗体的固定量以及大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 与抗体的结合量的增加而增加，在 6 第一章绪论 f e ( c n ) 6 】3 埘氧化还原电对存在的情况下，用电化学阻抗谱进行阻抗测量，该免疫生物 传感器的检测限达到1 0 3 c f u m l ，石英晶体金电极的电子传递阻抗变化值和大肠杆菌 0 1 5 7 ：h 7 的浓度在一定范围内呈线性关系，检测时间少于1 0m i n 5 0 l 。w u 等在利用压 电石英免疫传感器检测血吸虫的同时，应用交流阻抗法验证金膜电极抗体固定、抗原抗 体复合物形成及压电质量放大效应的动力学过程，所得结果与压电频率变化结果相一 致，从而证实了阻抗结果的可靠性1 5 。 1 3 2 抗体或抗原的固定化 生物大分子的固定化技术是制备传感器的关键因素。一个灵敏的免疫传感器客观上 要求g 被固定化的生物大分子仍具有良好的生物活性，生物膜要有良好的稳定性和耐用 性，固定化层与转换器需接触紧密并且应尽量能适应多种测试环境，应避免或减少生物 膜中生物组分的相互作用以保持其原有的高度选择性。常用的固定化方法有：吸附固定 法，包埋固定法，自组装法以及共价键合固定法。 ( 1 ) 吸附法 利用物理吸附法将生物免疫组分固定在转换器表面上是一种较为简单的固定化方 法【5 2 , 5 3 】。它是将修饰后的电极放在抗体溶液中浸泡或者涂覆，利用抗体表面的活性基团 与修饰层之间的分子间力直接将抗体固定在电极表面，形成具有识别功能的生物大分子 敏感层。此法制备过程简单，对抗体等生物组分活性影响小，但是固化层的结合量少， 易受外界条件变化的影响，稳定性差，易脱落。 ( 2 ) 包埋法 包埋固定法是通过把抗体或者抗原生物分子包埋在聚合物的微小格子里，从而将生 物分子固定在转换器上的一种固定化方法【5 4 , 5 5 1 。该方法的特点在于膜孔径形状和大小可 进行调节且固化条件温和，能牢固的包埋抗体或者抗原至电极上。包埋法所用的基底材 料也十分丰富，包括电聚吡咯、环氧树脂、硅溶胶凝胶、固体石蜡、烯醋酸聚合物等。 ( 3 ) 自组装法 自组装法是分子通过化学键相互作用自发吸附在固液或气固界面，形成热力学稳 定和能量最低的有序膜的方法【5 6 1 。除了巯基自组装单层膜( s a m ) 技术发展较早，应用 范围较广以外，其他的单层膜如巯基丙酸、巯基乙醇也已经应用于固定抗体、抗原生物 分子1 5 刀。近年，也有不少报道电化学聚合成膜法应用于传感器膜的构建【5 引。这种聚合物 膜有很多优点，包括厚度易控、稳定并且