内皮脂酶单基因多态性与冠心病的关联研究.doc

北京协和医学院博士学位论文内皮脂酶单基因多态性与冠心病的关联研究姓名：张黎申请学位级别：博士专业：临床医学指导教师：严晓伟20090601 ，、肝脂酶著负相关。白细胞介素瓸，等可使内皮脂酶表达增加。因而推测可能参与了的形成和发展。目前， 关性。芯慷韵罂崭小时后采取静脉全血，抗凝，转离心分钟位点进行基因分型，对上述两个位点的基因型进行遗传学分析；冠心病的甀、瓹组低于对照组，以上指标在两组之间均存 ， ， 瑂痚 甌 瑀， 瓺甌 疭瓺 ，瑀甌 痚痠， 瓾痠 痚琀篹， 姆载脂蛋白甀冠状动脉粥样硬化性心脏病冠状动脉造影胆固醇酯转运蛋白焦碳酸二乙酯糖尿病游离胆固醇高密度脂蛋白一胆固醇猵瓹 脂蛋白脂酶氧化低密度脂蛋白陈旧性心肌梗死经皮冠状动脉介入治疗聚合酶链式反应右冠状动脉不稳定型心绞痛 引言冠心病易感基因的研究方法病的易感基因。在关联研究中显示出广阔的应用前景。尽管有学者建议以关联分析进行全基因组扫描定位复杂疾病易感基因，但其可究者的共同选择。 水平每升高，可以降低男性患缦，降低女性患缦篶琇，嗲宓婪蚴芴錓琒琒瓸，三磷酸腺苷结合盒转运体甀，生长激，； 促进单核细胞与血管内皮细胞的黏附】，方玉强等人研究发现抗体呈剂量依赖基因敲除，并且和同窝小鼠进行比较。结果在两组实验中，实验组和对照组的 国汉族人群中痚位点与冠心病的关联研究，但二者研究样本仍然较小，且未得到一致的结论】。目前，针对内皮脂酶多态性的研究还处于初始阶段，尚无大样本的研究结论。因此，针对基因多态性与冠心病的关联性，开展更大规模的病例对照研究将具有重要的意义。基于以上研究现状，本研究选取了大样本中国汉族人群作为研究对象，对内皮脂酶单基因多态性与冠心病的关联性展开研究。 体检中心的体检人群，所有研究对象经过知情同意。明确的甲亢等甲状腺疾病；年龄与冠心病组匹配的汉族人；无冠心病病史和心绞痛症状；心电图正常或冠脉造影正常；无恶性肿瘤和严重肝肾功能不全；无明确的免疫性疾病。主要试剂和试剂盒 北京赛百盛公司北京全式金生物技术有限公司引物中国北京奥科生物技术有限公司中国北京奥科生物技术有限公司中国大连宝生物公司北京全式金生物技术有限公司电泳仪美国甊公司甊分光光度计恒温水浴箱中国北京市长风仪器仪表公司 计美国公司美国应用生物系统公司主要试剂配制兰坠星电速缓独遗：用移液管移取去离子水后，充分混匀。 冠心病家族史定义为一级亲属冠心病发病；岁；记录临床资料：记录一般资料以及冠心病传统危险因素，包括：年龄、性别、民族、职业、 记录身高、体重、血压、空腹血糖腔:斓鞍、记录应用药物情况：抗血小板药物，硝酸酯类，血管紧张素转化酶抑制剂拮抗剂，他汀类，贝特类，烟酸类，口服降糖药，胰岛素。非高密度脂蛋白胆固醇狧；总胆固醇与高密度脂蛋白胆固醇比值疕； 计数资料以频数俜直表示，采用检验：入组样本总数倒； 心病组均明显高于对照组。异。对血脂进行计算后比较，结果示冠心病组蚅疕水平高 作。年，热艘个黑人对照、龈逪鹊陌兹撕个正肫渌个功能位点相比，具有较高的等位基因频率，且在脂酶的功能。因此，痚位点逐渐成为人们研究的热点。名男性进行研究，发现在女性人群中痚热艘名成年日裔美国人为研究对象，研究了启动子区域捅嗦肭鳦饬礁鯯位点构成的单体型，发现该单体型与痚位点变异可能影响到瓹的水平，这种影响可能是通过与其他变异位 点联合作用或者受环境因素缫影响来实现。热朔值个坏阒小，经多元回归校多态性。率存在显著性差异；带有任换虻娜巳旱腍矫飨愿哂贑纯合基因型人群，采用的方法均为限制性片段长度多态性方法，而该方法容易受到附近变异位点的影响而引起结果不准确。同时，以上两例工作采用的样本数量还比较少，且二者的结果还存在不一致的地方，有待进一步扩大样本量进行研究。因此，开展基因多态性与冠心病的大样本、多地域、多民族广泛深入的协同研究，将有可能为冠心病的风险预测、预防和治疗提供一条新的线索和途径。 实验方法转离分钟，分离血浆和血细胞，血细胞置于一保存，血浆置于裂解液离心管中，颠倒次，并倒置轻弹管壁，确保充分混匀；小心吸取上清笤到一个新的的离心管中；怪狈胖美胄墓埽冒咨踝碊沉淀自然沉到管底后，胄分尤雔 掉管底沉淀周围和管壁的残留乙醇，空气晾干沉淀几分钟；度和浓度，计算公式如下：慷戎翟笥冶冉虾甮畉稀释倍数反应条件优化： 反应产物的检测称取碇牵糜锥形瓶中；用量筒量取的溶液，摇匀后将溶液倒入混合均匀，加入到凝胶的加样孔中；将豯 物公司进行测序；该公司先对霾锝写炕缓笫褂肁进行双向测序，比对；分型试剂盒定制目的片断扩增和等位基因鉴别对稀释到指定浓度的样本进行秸敕分型，使用去离子水；从遄叭朊拦蒙锵低彻褂肁前荧光信号；扩增程序，扩增条件如下： 谌砑衅拦澜峁凶远疭分型；噶C庖呶椒测血浆内皮脂酶浓度临用前配制副臧迳细材嫖略小时； 蛐推德屎偷任换蚱德什捎没蚣剖料以频数俜直表示，采用检验：珻表示；及其以非条件性正念分却的计量资料使用相关性分析：使用紫外分光光度计测量舛龋峁砻鳎崛镜腄浓度基因目的片断检测结果 痚位点不同基囡型峰图型秸敕分型荧光定量荢软件对坏愕姆中徒峁直鹑缤 平衡检验够大的随机婚配群体中，如果不考虑群体间的流动以及突变和自然选择的作用，将 表对照组和冠心病组 表冠心病患者与健康对照组基因型的显性及隐性模型比较 表冠心病不合并糖尿病患者与正常对照组基因型及基因频率比较 表冠心病非心梗患者与健康对照基因型及等位基因频率比较照组之间无显著性差异。 冠脉中重度狭窄与非中重度狭窄冠心病患者之间的比较 不同性别冠心病一对照组基因型和等位基因频率比较在谛牟颊咧校行怨谛牟颊例，女性冠心病患者辉名正常对照人群中，男性对照远哉例。根据不同性别分别进行冠心病对照组进行基因型以及等位基因频率比较分析，内皮脂酶基因痚及痚駽痠位点连锁不平衡检验及单体型分析： 瓹蚑痠位点变异的计量资料比较痚位点变异的计量资料比较基因痚位点在冠心病组中不同基因型的生化指标比较 生化指标 基因痚位点在女性人群中不同基因型的生化指标比较 ，根据样本的值。喙叵凳R 本研究采用回顾性调查研究的方式，收集了中国汉族人群冠心病患者和健康体检人群的临床资料。其中，大部分人群居住地为北京及周边地区，生活环境大体一致，样本种族均一。在资料收集过程中，采用冠脉造影和心梗作为冠心病人群的筛选标准，入组标准明确；正常对照组人群选取年龄与冠心病患者匹配的体检人群，但由于无法得到其冠脉造影的检查结果，因此，要求对照组人群入组必须无心绞痛症状和动脉粥样硬化疾病病史，而且心电图正常；为了平衡传统危险因素对冠心病发病的影响，正常对照组不排除患有高血压、糖尿病或血脂异常的人群。通过对这两组人群的危险因素和临床资料进行分析，结果显示传统危险因素在冠心病组的分布明显高于对照组，与众多冠心病危险因素的研究结论一致。该结论说明本研究的样本具有代表性。，与疾病的关联研究方法分析内皮脂酶牍谛牟南喙匦裕直鹪谀谄富虻号外显子瑀；其中，根据是 究。 单核苷酸多态性与冠心病的关联研究由于存在样本量少、冠心病评价方法和敏感性不同、实验方法误差等原因，结果往对照组腃嗵浴，结果表明中国汉族人群中存在基因的的研究则得出相关性结果。相近，而朱劲草研究结果中对照组的任换蚱德式鑫，比本文研究结果要长度多态性方法，但得出对照组的任换蚱德史直鹞和矣隒 坏鉉蛐偷腁礁哂赥秃蚑停獵蚑痠两水平有关【盋 难芯啃楹虲的研究小组于年的最新文献报道【事实上，冠心病本身是一种多基因复杂疾病，单个位点的多态性变异并不足以心病之间有显著相关，可能表明这两个位点在汉族人群中不是功能位点，或者尚需进一步扩大样本量进行研究。同时，在多基因复杂疾病的发病过程中，基因与环境的相互作用显得也非常重要，然而本研究未能得到研究人群的生活方式、饮食习惯、体力活动等方面的资料。因此，采用多个位点进行联合分析，并深入研究基因与环境的作用，或许能够有新的发现。浓度分别与、收喙兀喙叵凳直鹞琍；浓度与或许，内皮脂酶在我们所看到致动脉粥样硬化的作用外，还有其抗动脉粥样硬 本研究的创新、局限和展望此研究在国内首次采用了大样本的病例对照关联分析方法，探讨研究了内皮脂了新的观点和证据。同时，在研究过程中，本文作者建立了协和医院心内科冠心病但是，本研究尚存在一定的局限性，在样本入组方面，对照组男性人群比例低于冠心病组，男性人群有其独特的特性，性别匹配偏差可能会影响研究结果。因此，在后续针对该样本的研究中，尚需补充对照组中的男性人群，以使性别及人数匹配，增加统计力度。同时，本研究所选择测定的内皮脂酶基因上的多态性位点较少，内皮脂酶作为脂质代谢中的关键酶，单个位点的变异对内皮脂酶的功能影响有限，在后续研究中，可利用现有资料进行前瞻性、多位点的联合分析。另外，在内皮脂酶基因多态性以及浓度与降墓叵捣矫妫写徊椒治鯤中的亚组份 脂和脂蛋白具有显著相关性；型；=珽扔隩、瓹之间有显著相关性。 甆：【緼，甋，畒秄珹琑瓹：瓸篠【緽珽，琒，珺，琩： ，；：瓸瓹： 【甃 篹 瓹，【】 【， 籺，【 综述内皮脂酶的研究现状脂酶是人体内一种水溶性的酶，它在血浆脂质代谢过程中起着重要作用。脂酶通过水解甘油三酯、磷脂和胆固醇酯等一些非水溶性物质中的酯键，将脂肪酸释放出来并加以直接利用、重新包装转运到靶器官或储存起来，对食物中脂肪的吸收、平衡能量和血浆脂蛋白的代谢起着重要的作用，并且血浆中脂质的代谢与动脉粥样硬化性疾病相关。，、肝脂酶内皮脂酶 ，。在对人和小鼠的构的推测分析，的帽状结构可能覆盖住了一个具有催化活性口袋，使得对底在体外实验中，内皮脂酶是在血管内皮细胞表达而被发现的，在培养的人肝细胞、巨噬细胞、骨肉瘤细胞也均有表达。在成人体内，的分布广泛，在冠状动脉、肝脏、肺、肾脏、肾上腺、睾丸、甲状腺、卵巢黄体均有丰富表达，然而在这些器官中，谋泶锼胶艿突蛭薇泶铩喾矗贚表达丰富的器官，如心脏、骨骼肌、脂肪细胞，却没有检测到的表达。同样作为甘油三酯脂酶家族的成员，尽管其基因序列和蛋白结构有着很大程度上的相似，但分布部位的不同说明的功能也将与众不同。另外，胎盘中的表达也相当丰富，这可能表明在胚胎的发育中也有着重要意义。免疫组化和原位杂交数据表明在肝脏中由内皮细胞合成，而在实质细胞无表达捌。 的酶活性作用甘油三酯脂酶家族成员均具有不同程度的甘油三酯脂酶活性和磷脂酶活性。究相符。同时，等人研究发现在小鼠中过度表达人类基因导致肝素化后介导的礁谋涞淖钪匾5幕剖撬拇呋钚浴】。当缺失时，脂期望帕笮虴钚源嬖谀嫦喙亍捎贓种贫餒颗粒大小增加的 目前，人们对结构和功能的关系已经进行了广泛的研究。利用不同相关脂酶【牵庖环直砻鱁際水平乃至冠心病具有重要的相关性。利用多克隆抗体抑筇迥贓谧焙驢水平明显升高咏，同时伴随着明显的变化【俊庑峁砻鳎贓蚯贸蠛虴灰种坪蟮男筇迥贖有趣的是，在体外实验中还发现能够水解蚅，但是尚不清楚在体内如何调节含的脂蛋白代谢。在非酶作用上文提到给小鼠注射不同剂量的已转染基因的腺病毒载体，导致剂量依赖性通过对结构的分析表明，具有肝素结合位点和疏水区域，通过硫酸乙酰因此，可能作为一种脂蛋白颗粒的配基，介导了通过细胞表面受体的脂蛋白摄取 目前的研究表明，的表达受到多种因素的调节，但关于表达调节的相关异；这种差异包括单个碱基的缺失和插入，但更多的是单个碱基的置换。根据在基 单核苷酸多态性最早是作为一种基因组作图的遗传标记，随着研究的进一步深年，热搜芯縏个无血缘关系的高瓹水平人群【捌，对其高茸榇锏，在白人高瓹水平人群和对照人群中，该等位基因等人通过对岁的日本青少年研究单基因多态 间外，其余两两之间均存在连锁不平衡。在这鯯中，通过多元回归，发现著性差异。针对痚又进一步在在名中等瓹水平显著相关。年，热嗽诙岳醋杂赒蚁笛芯恐械哪炅湓曛涞与较喙兀琓亢献踊蛐偷腍瓹水平高于带有野生型等位基因的人群，多不饱和脂肪酸饮食的带有任换虻呐匀巳褐衋甀水平高于野生型纯中影响中蚢甀的水平。较灾喙亍。研究表明，接牍谛牟嬖谀嫦喙匦浴馐怯捎诟呙芏戎鞍颗粒在胆固醇逆向转运扮演重要角色，它们将胆固醇从周围细胞缇奘上赴转 中。基因的多态性。嗵灾械腃蛑翲水平升高，但未发现年，等在关于基因多态性与急性心梗患者的研究表明：通过检测毙孕墓；颊吆例对照者的基因上的嗵浴引，以及分析其他热艘訥研究中的兹四行院名白人女性为研究对象，研多态性的进行关联研究，未发现等人对基因多态性的研究未发现 和年代，先后提出关于发生的“损伤应答假说。该理论认为，当血管内皮受到机械、化学、免疫、生物等因素作用后，内皮细胞结构功能被破坏，引发单核细间发现的形成。这主要是因为与脂质代谢以及炎症介质等密切相关。脂质代谢 以及血管壁张力和剪切力等均使内皮脂酶表达增加，而内皮脂酶又通过增加年，等人对敲除基因的小鼠和同时敲除和基因的小高脂饲料的雄性小鼠，同时敲除和基因后的斑块面积比只敲除基因 为了研究与冠心病的关联性，除了从宏观角度进行流行病学调查外，还需 要从微观角度进行冠心病易感基因的研究。基于病例一对照方法的群体关联分析是冠心病易感基因研究中最常用的方法之一，它通过比较无血缘关系的患病个体与非患病个体的标记等位基因、不同基因型以及不同单体型之间频率的差异，来推测候选基因是否为疾病的易感基因。随着人类基因组测序工作的完成，单核苷酸多态性献调研表明，国内关于中国汉族人群中该基因突变情况的研究报告也仅有两例，但二者样本数量较小，而且结果彼此并不一致。因此，针对基因多态性与冠心病的关联性，开展更大规模病例对照研