（光学专业论文）拉曼光谱在咖啡因及癌细胞检测中的应用研究.pdfVIP

1 n a v o 摘要 i i i i iiul ii iiiq ui iiiiii y 18 5 5 118 d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e r d e g r e eo f s o u t hc h i n a n o r m a l u n i v e r s i t y 拉曼光谱在生物碱及癌细胞检测中的应用研究 摘要 专业名称：光学申请者姓名：康健导师姓名：谷怀民 拉曼光谱被称为物质分子的“指纹特征 ，是一种无损、制样简单、快速有 效的测试手段。表面增强拉曼光谱( s e r s ) 具有极高的检测灵敏度，能够从分 子水平上获取物质详细的结构和化学组成信息，因此拉曼光谱非常适用于生物分 子的测试研究。本文中利用拉曼光谱技术主要选取在生物物理领域具有代表性的 生物小分子咖啡因，及活体h e l a 细胞进行研究。主要内容如下： 咖啡因( 1 ，3 ，7 三甲基黄嘌呤) ，属于嘌呤类，是最重要也是最常用的生 物碱。在不同p h 条件下，人体对其吸收。在胃中p h = 2 ，在血液或者体液中， p h 为中性。所以研究不同p h 条件下咖啡因的变化，有着现实的科学意义。然 而关于这方面的研究相对较少，结论也不全面。因为咖啡因的溶解度很低，所以 在以前的研究中，很难获得咖啡因水溶液的常规拉曼光谱；通常情况下都是使用 傅里叶变换拉曼光谱或者表面增强拉曼光谱进行研究。在本文中，为了研究p h 值对咖啡因拉曼光谱的影响，先测得不同p h 值下咖啡因的表面增强拉曼光谱及 常规拉曼光谱，再进行分析。同时为了更好地分析咖啡因的拉曼光谱，弄清楚咖 啡因拉曼光谱谱峰的振动模式，本文选用d f t 计算方法来优化咖啡因的形态， 并计算出无水咖啡因的拉曼光谱。研究表明，通过影响咖啡因分子与银溶胶表面 的再定位，p h 值可以明显改变咖啡因的表面增强拉曼光谱；振动模式主要为 i n - p l a n e 振动模式的谱峰，更容易被p h 值影响；在酸性溶液中获得的咖啡因表 面增强拉曼光谱，比在碱性溶液中获得的表面增强拉曼光谱，更加接近咖啡因水 摘要 溶液的常规拉曼光谱。 在拉曼光谱检测中，水是最为常用的溶剂。本文简单探讨了水溶液对固体样 品拉曼光谱的影响。实验中测得同一样品不同浓度的拉曼光谱，以及不同样品及 其水溶液的拉曼光谱。通过对比同一样品不同浓度的拉曼光谱，发现在水溶液中 样品浓度并不能影响其拉曼光谱谱峰的半高宽。而对比样品及其水溶液的拉曼光 谱，则发现当样品溶解到水溶液后，拉曼光谱的谱峰半高宽有明显改变：多数谱 峰的半高宽变宽。同时伴随着拉曼谱峰的位移，既有红移又有蓝移。这可能是由 于样品溶解到水中时，其晶格结构遭到破坏，一些样品从原子态变成为离子态。 这些结构的变化引起谱峰半高宽的改变及谱峰的位移。结果表明：水溶液可以显 著影响固体样品的拉曼光谱；通过对比固体咖啡因的常规拉曼光谱与咖啡因水溶 液的表面增强拉曼光谱，发现表面增强拉曼光谱技术可以减小水溶液对固体样品 拉曼光谱的影响。 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，它 在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。目前检 测细胞凋亡的方法有很多，但是这些检测方法都只能定性的分析细胞是否凋亡以 及凋亡的细胞所处的细胞周期，无法获知细胞凋亡的内部变化及细胞凋亡的真正 原因。在本文中，选用h e l a 细胞进行检测，金标记后分别使用s e r s 及l s c m 技 术对h e l a 细胞进行检测，提出了一种实时检测癌细胞凋亡的有效方法。依据 l s c m 图像，可以明显观察到h e l a 细胞的形态变化。依据h e l a 细胞的表面增强 拉曼光谱，可以得到表面增强拉曼光谱谱峰的位移及强度变化。对比在不同时间 点测得的h e l a 细胞表面增强拉曼光谱，可明显观察到随着凋亡过程的进行，一 些表面增强光谱谱峰发生了位移，其强度变化也非常明显；并且在凋亡末期会有 一个新的谱峰出现。这说明h e l a 细胞的组份变化可以通过表面增强拉曼光谱反 映出来。两种技术相结合使得我们在实时检测癌细胞凋亡过程中，既可以获得活 体癌细胞的内部结构及组份变化，又可以获得其形态变化。 关键词：拉曼光谱；表面增强拉曼光谱( s e r s ) ；咖啡因分子；h e l a 细胞； p h 值；细胞凋亡；激光共聚焦显微镜( l s c m ) ；水溶液。 i i a b s t r a c t t h e s t u d y o na l k a l o i dm o l e c u l a ra n di n - v i v oc a n c e rc e l lb yr a m a n s p e c t r o s c o p y m a j o r ：o p t i c sn a m e ：k a n g j i a n s u p e r v i s o r ：g uh u a i m i n a b s t r a c t r a m a ns p e c t r o s c o p yk n o w na st h e f i n g e r p r i n t o ft h e s u b s t a n c e s ，w h i c hi s n o n - d e s t r u c t i v e ，s i m p l ep r e p a r a t i o no fs a m p l e s ，r a p i d ，i se x t r e m e l ys u i t a b l ef o rt h e s t u d yo fb i o l o g i c a lm o l e c u l e s s u r f a c e - e n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p y ( s e r s ) 、 ，i n l l l i g hs e n s i t i v i t yi nt e s t i n gt h es u r f a c em a t e r i a l s ，c a l lo b t a i nt h ed e t a i l e di n f o r m a t i o no n t h es t r u c t u r ea n dc o n f o r m a t i o no ft h es u b s t a n c e sa tt h em o l e c u l a rl e v e l i nt h i sp a p e r , c a f f e i n ea so n eo ft h em o s tp o p u l a rb i o l o g i c a lm o l e c u l a rw a sd e t e c t e db yr a m a n s p e c t r o s o c p y a n dt h e nt h ei n - v i v oh e l a c e l lw a sa l s od e t e c t e db ys e r s t h em a i n w o r ki sa sf o l l o w s c a f f e i n e ( 1 ，3 ，7 - t r i m e t h y l x a n t h i n e ) i sac o m m e r c i a l l yi m p o r t a n ta l k a l o i dw h i c h b e l o n g st ot h ef a m i l yo fp u r i n ea l k a l o i d s c a f f e i n ei s o n eo ft h em o s tw i d e l y c o n s u m e dd i e t a r yc h e m i c a l s i t sa b s o r p t i o ni nt h eh u m a nb o d yt a k e sp l a c ea td i f f e r e n t p hv a l u e s ，e g p h = 2i ns t o m a c h ，u s u a l l ya tn e a r l yn e u t r a lp nv a l u e si nb l o o da n d h u m a np l a s m a h o w e v e r , t h ep r e v i o u sr e s e a r c hi nt h i sa r e ai sv e r yl i t t l ea n du n i l a t e r a l ， a n dt h ec o n c l u s i o ni sa l s ou n a p p a r e n t i na d d i t i o n , t h el o ws o l u b i l i t yo fc a f f e i n e m a k e si tv e r yd i f f i c u l tt oo b t a i nh i g hq u a l i t yn o r m a lr a m a ns p e c t r u mo fc a f f e i n e a q u e o u ss o l u t i o ni nt h ep a s t t h ec a f f e i n es o l u t i o nw a sm o s t l yd e t e e t e db yf tr a m a n s p e c t r o s c o p ya n ds e r s i nt h i sw o r k ，i no r d e rt om a k ec l e a rt h ee f f e c to f t h ep hv a l u e f o rc a f f e i n e ，t h ep hd e p e n d e n ts e r sa n dn o r m a lr a m a ns p e c t r ao fc a f f e i n es o l u t i o n w e r eo b t a i n e da n da n a l y z e d i no r d e rt oi m p r o v et h ep r e v i o u sv i b r a t i o n a la s s i g n m e n t s i nt h er a m a ns p e c t r o s c o p ya n dp r o v i d ear e l i a b l e ，d e t a i l e da n a l y s i so ft h er a m a n s p e c t r a , d e n s i t y f u n c t i o n a lt h e o r y ( d f t ) c a l c u l a t i o nw a su s e dt o o p t i m i z e t h e g e o m e t r yo fc a f f e i n ea n dc a l c u l a t et h er a m a ns p e c t r u mo fa n h y d r o u sc a f f e i n e i tc a n i i i a b s t r a c t b ec o n c l u d e dt h a tp hv a l u ec a l ld r a m a t i c a l l yc h a n g et h es e r ss p e c t r ao fc a f f e i n e m a i n l yt h r o u g hi m p a c t i n gt h er e o r i e n t a t i o no ft h em o l e c u l et ot h ea gc o l l o i ds u r f a c e t h eb a n d s ，w h i c hv i b r a t i o n a lm o d e sa r ea t t r i b u t e dt oi n - p l a n em o d e s ，a r ee a s i e r a f f e c t e db yp hv a l u et h a no t h e rb a n d s t h es e r ss p e c t r ao b t a i n e di na c i dm e d i aa r e m o r ec l o s et ot h en o r m a lr a m a ns p e c t r u mo fc a f f e i n es o l u t i o nt h a nt h o s eo b t a i n e di n n e u t r a la n da l k a l i n em e d i a t h ee f f e c to f a q u e o u ss o l u t i o ni nr a n l a ns p e c t r o s c o p yw a s r e s e a r c h e ds i m p l e l y b y c o m p a r i n gt h er a m a ns p e c t r ao fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s ，a n db yc o m p a r i n gt h e r a m a ns p e c t r o s c o p yo fs a m p l e s 、 ，i t l lt h er a m a ns p e c t r o s c o p yo ft h e r ea q u e o u s s o l u t i o n s ，w ec a nf i n do u tt h ev a r i a t i o nb e t w e e nt h er a m a ns p e c t r o s c o p yo fs a m p l e s a n dt h e r ea q u e o u ss o l u t i o n s ，a n dw o r ko u tt h ep o s s i b l er e a s o no ft h ev a r i a t i o n w h e n t h es a m p l ew a sd i s s o l v e di n t ot h ew a t e r , t h ef w h mo fr a m a ns p e c t r o s c o p yc h a n g e d o b v i o u s l y , a n ds o m er a m a nb a n d ss h i f t e de v i d e n t l y b yc o m p a r i n gt h er a m a n s p e c t r o s c o p yo fc a f f e i n e 晰mt h es e r so f c a f f e i n ea q u e o u ss o l u t i o n ，i ti sc o n c l u d e d t h a ts e r sc a nr e d u c et h ee f f e c to fa q u e o u ss o l u t i o no nt h er a i n a ns p e c t r o s c o p yo f s o l i ds a m p l e a p o p t o s i si sd e f i n e da st h em a i n t e n a n c eo fh o m e o s t a s i s ，t h eg e n e sc o n t r o l l i n gc e l l d e a t hi n d e p e n d e n t l yi no r d e r ；i tp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h ee v o l u t i o no fo r g a n i s m s ， h o m e o s t a s i sa n dt h ed e v e l o p m e n to fm u l t i p l es y s t e m s a p o p t o s i sw a sd e t e c t e d c o r r e s p o n d i n gc o m m o n l yu s e dm e t h o d sw h i c hc a no n l yq u a l i t a t i v ea n a l y s i so f w h e t h e rt h ec e l l sa p o p t o s i sa n da p o p t o s i so fc e l l sa l et h ec e l lc y c l e ，a p o p t o s i sc a nn o t b ei n f o r m e do fc h a n g e sa n da p o p t o s i sw i t l l i nt h er e a lr e a s o n i nt h i sp a p e r , h e l a c e l l sw e r eu s e df o rt h ee x p e r i m e n t a f t e rg o l dn a n o p a r t i c l e s ( g n p s ) u p t a k e ，h e l a c e l l sw e r ed e t e c t e d r e s p e c t i v e l yb y s e r sa n dl s c m t h ev a r i a t i o no ft h e m o r p h o l o g yo fh e l ac e l l sc o u l db eo b s e r v e di nt h el s c mi m a g e s i na d d i t i o n , t h e v a r i a t i o no fi n t e m a ls t r u c t u r e sa n dc h e m i c a lc o n s t i t u e n t sc o u l db ew o r k e do u t , a c c o r d i n gt ot h es h i f t so fr a m a ns i g n a la n dt h ef w h m o fm o s tr a m a n s i g n a lp e a k s k e yw o r d s ：r a m a ns p e c t r o s c o p y ；s e r s ；c a f f e i n em o l e c u l a r ；h e l ac e l l ； p hv a l u e ；c e l la p o p t o s i s ；l s c m ；a q u e o u ss o l u t i o n i v 目录 目录 摘要i a b s t r a c t 1li 目录v 引言1 第一章拉曼光谱技术3 1 1 常规拉曼光谱技术3 1 1 1 拉曼光谱技术发展历程3 1 1 2 拉曼光谱的基本原理3 1 1 3 拉曼散射的产生4 1 1 4 拉曼光谱系统5 1 1 5 拉曼散射的特点6 1 2 表面增强拉曼光谱( s e r s ) 技术7 1 2 1s e r s 技术的发展历程7 1 2 2s e r s 的特点8 1 2 3 表面增强拉曼光谱( s e r s ) 的增强机制9 1 2 4s e r s 的物理类模型1o 1 2 5s e r s 的化学类模型11 1 2 6s e r s 活性基底的制备及应用12 第二章激光共聚焦显微镜技术( l s c m ) 17 v 目录 2 1 激光扫描共聚焦显微镜的原理1 7 2 2 激光共聚焦显微镜的生物学应用1 8 2 2 1 组织和细胞中荧光标记的分子定位、定量分析18 2 2 2c a 2 + 、p h 及其他细胞内离子浓度及变化定量测定18 2 2 3 三维图像重建19 2 2 4 荧光光漂白及恢复技术19 2 2 5 长时程观察细胞迁移和生长19 第三章不同p h 值咖啡因水溶液的常规拉曼研究2 0 3 1 引言2 0 3 2 实验材料与方法2 1 3 2 1 样品制备2 1 3 2 2 实验仪器装置2 1 3 2 3 拉曼光谱测定2 2 3 3 结果与讨论2 2 3 3 1 结构优化2 2 3 3 2 拉曼光谱2 3 3 4 结论3 1 第四章水溶液对固体样品拉曼光谱的影响3 3 4 1 引言3 3 4 2 实验材料与方法3 3 4 2 1 样品制备3 3 4 2 2 实验仪器装置3 4 v i 目录 4 2 3 拉曼光谱测定3 4 4 3 结果与讨论3 5 4 3 1 不同样品的拉曼光谱3 5 4 4 结论3 8 第五章表面增强拉曼光谱及激光共聚焦显微镜技术相结合 探测癌细胞凋亡过程4 0 5 1 引言4 0 5 2 实验材料与方法4 1 5 2 1 样品制备4 1 5 2 2 实验仪器装置4 2 5 2 3 拉曼光谱测定4 3 5 3 结果与讨论4 3 5 。3 1l s c m 图像4 3 5 3 2h e l a 细胞的拉曼光谱研究4 5 5 4 结论4 7 结束语4 8 参考文献5 0 致谢5 9 v i i 拉曼光谱在生物碱及癌细胞检测中的应用研究 引言 拉曼光谱技术因其可以获取样品内部结构及组份信息，已广泛应用于化学、 材料、生物、医药卫生等诸多领域。但是拉曼光谱自身仍存在一定的缺点，例如 拉曼散射截面小、散射信号强度弱，并且拉曼信号容易受到荧光背景的干扰，不 易获得高质量的拉曼光谱。这些缺点很大程度上限制了拉曼光谱的应用。随着表 面增强拉曼光谱的出现，极大地提高了拉曼光谱的检测灵敏度；尤其经过近几年 的发展，拉曼光谱已广泛应用到生物分子检测领域。如今拉曼光谱领域的研究热 点，一方面是生物分子的检测，包括氨基酸、缩氨酸、嘌呤、嘧啶碱基等生物小 分子，以及蛋白质等生物大分子；另一方面是单体活细胞的检测，包括酵母细胞， 癌细胞等。 本文选取在生物小分子中最具代表性，且最为常用的嘌呤类生物碱咖啡因作 为研究对象。咖啡因结构简单，在水溶液中没有互变体，结构稳定。由于咖啡因 以食物、饮料等形式进入人体内，在不同的酸性条件下被人体吸收，所以研究不 同p h 值条件下咖啡因的变化，有着现实的科学意义。但是咖啡因的低溶解度， 使得在以往的研究中很难获得咖啡因水溶液的常规拉曼光谱，通常都是使用傅里 叶变换拉曼光谱或者表面增强拉曼光谱进行研究。国外i p a v d 研究组取得了在 不同p h 条件下的咖啡因s e r s 光谱，并提出了p h 值影响咖啡因表面增强拉曼 光谱的可能原因，但是没有明确提出其影响机制。国内鲜有利用s e r s 光谱研究 咖啡因的报道，陈晓敏研究组利用咖啡因分子作为探测分子，进行了氯离子与 p h 值在s e r s 光谱中的相互影响的研究。在本文中，为了弄清楚p h 值对咖啡因 拉曼光谱的影响，获得了不同p h 值条件下咖啡因的常规拉曼光谱，同时得到了 不同p h 值条件下咖啡因的表面增强拉曼光谱，结合d f t 计算出的结果，进行分 析。准确提出了p h 值对咖啡因拉曼光谱的影响机制。 在拉曼光谱检测中，水溶液是最为常用的溶剂；但是水溶液对于固体样品的 拉曼光谱中的影响方面的研究却非常少。通常认为，对于同一样品，它本身的拉 曼光谱与其水溶液的拉曼光谱没有区别。但在实验过程中，发现两者有明显不同。 通过比较同一样品不同浓度的拉曼光谱，以及不同样品及其水溶液的拉曼光谱： 简单探讨了两者之间的不同，及可能的影响机制。 拉曼光谱在生物碱及癌细胞检测中的应用研究 同时选取癌细胞中形态较大的活体h e l a 细胞作为研究对象，利用s e r s 及l s c m 技术对于h e l a 细胞的凋亡过程进行实时检测。目前常用的检测细胞 凋亡方法包括：形态学观察方法，d n a 凝胶电泳，酶联免疫吸附法( e l i s a ) 核 小体测定以及流式细胞仪定量分析。而这几种检测方法都只能定性的分析出细胞 是否凋亡以及凋亡的细胞所处的细胞周期，无法获知细胞凋亡的内部变化及细胞 凋亡的真正原因。国内利用表面增强拉曼光谱技术对于癌细胞进行研究，几乎没 有，而国外几乎所有相关的研究都只是针对癌细胞本身进行检测，并没有对于癌 细胞的凋亡周期变化进行研究。本文中提出了一种实时检测癌细胞凋亡的有效手 段，即利用拉曼光谱技术获得癌细胞内部的相关结构和成分信息，利用激光共聚 焦显微镜技术获得癌细胞凋亡过程中的形态变化。两种技术相结合使得我们在实 时检测癌细胞凋亡过程中，既可以获得活体癌细胞的内部结构及组份变化，又可 以获得其形态变化。 2 拉曼光谱在生物碱及癌细胞检测中的应用研究 第一章拉曼光谱技术 1 1 常规拉曼光谱技术 1 1 1 拉曼光谱技术发展历程 早在1 9 2 3 年，a s m e k a l 等人便从理论上预言：光通过介质时，由于它们之 间的相互作用，可以观测到光频率发生变化，相位也发生无规律的变化【l - 4 1 。1 9 2 8 年，c vr a m a nk 和s k r i s h i m a n 首先在实验中观察到了散射光频率的改变1 5 】。 由于拉曼光谱与分子的振动能级相对应，拉曼光谱中的频率位移、偏振状态和拉 曼谱峰强度等参数深刻地反映了分子的结构和振动状态，这使得拉曼光谱成为仪 器分析中的重要手段而为广大科研工作者所采用。但因拉曼光谱本身存在着信号 微弱、容易受荧光干扰这一缺点，使得拉曼光谱学在其创立后不久就一度停滞。 直至二十世纪6 0 年代，激光器的问世使拉曼光谱学和拉曼光谱技术得到了迅猛 发展。但在以后的十几年间，拉曼光谱仍未得到广泛应用。1 9 8 6 年，h i r s c h f e l d 首次报告了固体和液体的近红外傅里叶变换拉曼光谱( f t - r a m a n ) ，f t - r a m a n 光谱仪的问世又一次极大地推动了拉曼光谱技术的发展，使拉曼光谱在无机和有 机分析化学、生物化学、高分子化学、石油化学和环境科学等众多领域中受到了 广泛重视1 6 4 1 。 1 1 2 拉曼光谱的基本原理 电磁波与物质相互作用时会发生吸收、反射、散射等。其中，散射光包括弹 性散射和非弹性散射，前者散射光频率与入射光频率相同，即瑞利散射( r a y l e i g h s c a t t e r i n g ) 后者散射光频率与入射光频率不同，称为斯托克斯散射，包括拉曼 散射和布里渊散射。在此仅介绍拉曼散射。 1 9 2 8 年，印度科学家拉曼等首先发现了一种非弹性散射现象。当一束频率 为d 0 的单色光入射到物质上时，物质中的分子会对入射光产生散射，散射光的频 率为v o ，即在激发线两侧分别存在一条谱线，在低频一侧频率为v o y 的谱线 拉曼光谱在生物碱及癌细胞检测中的应用研究 称为斯托克斯线( s t o k e s ) ，在高频一侧频率为+ ，的谱线称为反斯托克斯线 ( a n t i s t o k e s ) 。这种散射现象因此而被称为拉曼散射( r a m a ns c a n e 血g ) 9 - 1 1 。 1 1 3 拉曼散射的产生 光具有微粒性。光子与样品分子间的相互作用，可以用光子与样品分子之间 的碰撞来解释。光入射到样品上时，入射光子与样品分子之间发生碰撞。如果碰 撞时只发生运动方向的改变而未发生能量的交换即发生了弹性碰撞，此时光子的 能量不变。如碰撞时光子除发生运动方向的改变外还发生了能量的变化，此时入 射光子与样品分子之间便发生了非弹性碰撞，碰撞过程中一部分能量在光子与样 品分子之间交换，致使光子的能量有所增减，则光的频率发生改变。 光亦具有波动性，因此也可以从光的波动性角度分析拉曼散射产生的原因。 电磁波的交变电场可以用e = e oc o s ( 2 n v o t ) 来表示，其中e 是任意时刻t 的电场强 度，厶为交变电场的振幅，为频率。样品分子的电荷分布在交变电场的作用 下会发生改变，其正电荷与负电荷的中心会发生位置上的相对移动或分离，产生 诱导偶极矩p ，j l l = a e o ，其中磊为入射光的交变电场强度，口是分子的极化率。 光子与样品分子之间的作用还可以从能级跃迁角度分析。样品分子处于电子 振动能级的基态，入射光子的能量远大于振动能级跃迁所需要的能量，但又不足 以将分子激发到电子能级激发态。这样，样品分子吸收光子后被激发到一种准激 发态，又称为虚能态。但样品分子处在虚能态不稳定，将跃迂回到电子基态。若 分子回到能级基态，则光子的能量未发生改变，即发生了瑞利散射。如果样品分 子回到电子基态中的较高振动能级，则跃迁过程中产生的光子能量将小于入射光 子的能量，即散射光子频率低于入射光子频率。此时，散射光谱的瑞利散射谱线 较低频率一侧将会出现一条拉曼散射光的谱线，将其称为斯托克斯线( s t o k e s l i n e ) 。与入射光子作用前的瞬间，如果样品分子不是处于电子能级基态的振动基 态，而是处于电子能级基态中的某个振动能级激发态，则入射光子使之跃迁到虚 能态后，退激发回到电子能级基态的振动基态，此时散射光的能量大于入射光的 能量，其谱线位于瑞利谱线的高频率一侧，称为反斯托克斯线( a n t i s t o k e sl i n e ) 。 s t o k e s 线与反s t o k e s 线位于瑞利谱线的两侧，间距相等( 如图1 1 所示) 。 4 拉曼光谱在生物碱及癌细胞检测中的应用研究 电子能级 激发态 l- - - - j _ - - jl v 0伤一矿伤 v ov o v 0 + 1 ， s t o k e s 线 反s t o k e si 拉曼散射 瑞利散射拉曼散射 图1 1 拉曼散射和瑞利散射的能级图 1 1 4 拉曼光谱系统 级 最初的拉曼光谱仪仅能收集和检测与入射光成直角的散射光。散射光的强度 非常低，致使拉曼光谱的应用和发展受到了极大制约。2 0 世纪6 0 年代激光器出 现后，拉曼光谱仪以激光作为光源，激发光的单色性和强度都得到很大程度提高， 拉曼散射的信号强度也因此显著增强，此后拉曼光谱技术得到了迅速发展。 现代拉曼光谱仪主要由激发光源、样品照明和散射光收集系统、样品池、单 色仪或摄谱仪以及信号探测处理系统五部分组成。 1 激光是拉曼光谱仪的理想光源，具有高亮度、极强的方向性、单色性、 极低的发散度等优点。新型激光器的不断涌现，已经能够满足从紫外到红外波段 范围内任意波长的要求，极大地方便了一些特殊拉曼光谱的研究需要。新型固体 激光器因其稳定性、方便性、低功耗等优点也得到了日渐广泛的应用；连续可调 谐染料激光器适用于研究样品的共振拉曼效应；脉冲激光器也越来越多地用于研 究时间分辨拉曼散射以及一些超快过程。 2 样品照明和散射光收集系统所起的作用是有效利用光源强度、分离出所 需要的激光波长、减少光化学反应和杂散光以及最大限度地收集拉曼散射光。 3 由于在可见光区域内，拉曼散射光不被玻璃吸收，因此拉曼光谱的一个 优点是样品可以放在玻璃制成的各种样品池中进行测试。样品池的形状根据样品 形态和实验要求可以有多种形式，例如固态的晶体或粉末可以放在烧瓶、试剂瓶 等常规样品池，或者用k b r 压片；液体、气体样品可以放入密闭的玻璃管或毛 5 拉曼光谱在生物碱及癌细胞检测中的应用研究 细管中，根据样品的稳定性、挥发性等特点做出具体选择。 4 单色仪或摄谱仪是拉曼光谱仪的关键部件，其作用在于把不同频率的拉 曼散射光分光并减弱瑞利散射光和其它杂散光。 5 信号探测处理系统对不同频率的拉曼散射光进行放大、记录和分析处理， 包括探测器、放大器和输出设备。由于拉曼信号十分微弱，信号的探测灵敏度具 有重要意义，目前主要有两类设备用于探测装置，光电倍增管( p h o t om u l t i p l i e r t u b e ，简称p m t ) 和电荷耦合装置( c h a r g ec o u p l e dd e v i c e ，简称c c d ) 。它们 把检测到的散射光信号转换成电信号以后，经信号放大，再由计算机分析处理就 可以得到样品的拉曼光谱【1 2 1 。 1 1 5 拉曼散射的特点 拉曼光谱与红外吸收光谱均为分子光谱，但其产生机制不同。偶极矩变化的 分子具有红外活性，而极化率变化的分子才具有拉曼活性。一般来讲，极性基团 的振动、分子的非对称振动使分子的偶极矩发生变化，分子具有红外活性；而非 极性基团的振动、分子的全对称振动使分子的极化率发生变化，因而分子具有拉 曼活性1 3 ，1 4 1 。大多数有机分子一般具有不完全对称性，既表现出红外活性，又 具有拉曼活性，在红外和拉曼光谱中都有所反映。极性基团与分子的非完全振动 产生红外吸收谱，些强极性基团，如羟基、酮等在红外光谱中具有吸收带，但 是检测不到其拉曼光谱；非极性但易于极化的基团，如二烯烃、双硫键等，则具 有明显的拉曼光谱而不产生红外光谱。由此可见，拉曼光谱与红外光谱是相互补 充的，结合使用这两种技术，可以获得丰富的分子结构信息。 与红外光谱相比较，拉曼散射效应具有以下特点以及独特的优势： l 。每一种物质分子都有其自身的特征拉曼光谱，因而拉曼光谱可以用来表征 这一物质分子，拉曼光谱也因此而常被称为物质分子的“指纹”特征。 2 拉曼光谱的频率位移不受单色光源频率的影响。可以根据样品的不同特点 来选择不同的单色光作为激发光源。 3 激光的方向性好，光束发散角小，可聚焦在很小的面积上对极微量的样品 进行测定。 4 拉曼光谱是一种非破坏性的检测方法，并且样品制样简单甚至无需样品制 6 拉曼光谱在生物碱及癌细胞检测中的应用研究 备，一般样品可置于毛细管内或载玻片上直接测定。 5 激光的单色性好，用激光作为激发光源，拉曼光谱的谱带通常比红外谱带 更尖锐，分辨性好。由于拉曼光谱研究的是谱线位移，故用一台普通的拉曼光谱 仪便可方便地测量从几十到几千波数范围内的谱图，这是单独的红外光谱无法完 成的。 拉曼光谱因为具有以上的诸多优点，并能够从分子水平上获得各种物质详细 的化学结构信息，所以已经在化学、材料、生物、医药卫生等诸多领域得到了广 泛的应用。已有报道采用拉曼光谱研究细胞在有丝分裂不同时期的分子成分的变 化 1 5 , 1 6 1 ，并对正常细胞和凋亡细胞的成分进行比较【1 7 1 。此外，拉曼光谱较高的空 间分辨率，结合光纤，利用内窥镜技术，不但可以应用于体表的肿瘤探测，还可 以进行体内的原位测量。 然而，拉曼光谱自身仍存在一定的缺点。例如拉曼散射截面小、散射信号强 度弱，并且拉曼光谱容易受到荧光背景的干扰，不易获得高质量的拉曼光谱；此 外，对于痕量物质检测，特别是生命科学领域，分子浓度通常非常低，此时常规 拉曼光谱便很难满足测试需要。比如在测量癌细胞凋亡过程中h e l a 细胞的拉 曼光谱信号，常规拉曼光谱就无法测得。表面增强拉曼散射( s e r s ) 光谱克服 了常规拉曼光谱检测灵敏度低的缺点，极大地拓展了拉曼光谱的应用范围。 1 2 表面增强拉曼光谱( s e r s ) 技术 1 2 1s e r s 技术的发展历程 像其它科学领域的发展一样，表面增强拉曼光谱( s e r s ) 也经历了一个发现、 确认、发展的过程。1 9 7 4 年，英国科学家f l e i s h m a r m 等在研究粗糙的a g 电极 上吸附吡啶体系的表面拉曼光谱，想将使用的银电极经过电位多次氧化还原处 理以后，使其表面粗糙程度加大以增加其表面积，来增加表面被吸附分子的数目， 以获得较强的拉曼信号强度。他却意外地发现：吸附在银电极表面吡啶分子的拉 曼散射信号强度大大地增强了【l 引。但f l e i s h m a n n 当时并没有意识到这是一种新 的现象，而是简单地将所观察到的现象归因为较大的吸附表面导致的吸附分子数 目的增加。直到1 9 7 7 年，j e 锄m a i r e 【1 9 1 和c r e i g h t o n t 2 0 】等人分别独立地研究了 7 拉曼光谱在生物碱及癌细胞检测中的应用研究 f l e i s h m a n n 等人的实验，得到了相同的结果。经过分析后他们认为，仅靠简单地 增大电极表面不足以解释所观测到的增强程度，认定这是一种新的现象，并把它 归结为一种全新的表面光化学效应一表面增强拉曼散射，简称s e r s 。 所谓表面增强拉曼散射效应，是指当一些分子吸附到经特殊处理或制备的粗 糙金属或胶体表面时，它们的拉曼光谱强度会增加1 0 4 1 0 6 倍。1 9 9 7 年，n i e 小 组川和k n e i p p 小组【2 2 1 分别报道了纳米a g 粒子上1 0 1 4 倍的s e r s 增强信号，实 现了表面吸附物种单分子检测。s e r s 技术的出现，同时也促使了其它相关领域 研究工作的复兴与发展，如经典电磁理论、溶胶体系的研究等。同时也极大地推 动了表面科学、材料科学等重要研究领域的迅猛发展。 1 2 2s e r s 的特点 s e r s 的显著增强作用吸引了广大科学工作者的注意，使得s e r s 技术得到 r p 。 迅速发展。在过去三十多年的时间里，已经有很多的专著及综述介绍s e r s 的增 强机理、实验技术以及应用1 2 3 堋。但是，由于s e r s 的增强机制十分复杂，到目 前为止仍没有形成一种普遍的，可适用于各种情况的s e r s 理论。经过众多科学 工作者的研究发现，s e r s 具有以下主要特点： 1 只有在某些经过特殊处理的表面，才具有s e r s 效应，并且增强还有一 定的分子选择性。常见的具有s e l l s 效应的物质均为金属，主要包括a g 、a u 、 c u 、碱金属如l i 、n a 、k 以及一部分过渡金属【2 7 捌。 2 这些特殊的表面通常要有一定亚微观或微观的粗糙度，一般为几到几十 纳米，才能显示s e r s 效应。 3 增强有长程效应( 分子距表面几纳米甚至几十纳米仍有增强效应) 和短 程效应( 仅第一层有显著的增强) 两种类型，s e r s 强度会随着分子与金属基底 表面距离的增加而迅速降低。 4 常规拉曼光谱中，拉曼峰的出现完全遵守拉曼跃迁的选择性定则，即仅 有红外活性的振动模式将不会在拉曼谱图中出现。而在s e r s 光谱中，选择性定 则被放宽，一部分常规拉曼中为非活性的光谱也能够在s e r s 光谱中观察到。 5 化合物的s e r s 光谱，大多数拉曼峰的频率稍有变化，但相对强度却有 很大差别，即分子的不同振动模式增强因子不同。 8 拉曼光谱在生物碱及癌细胞检测中的应用研究 6 常规拉曼光谱信号的强度与激发光频率t o 的四次方成正比，但s e r s 强 度却不遵循这一规律。s e r s 强度和激发光频率的关系与金属基底有关，a g 基底 对不同频率的激发光都有较好的s e r s 效应，s e r s 强度的极大值在黄光或红光 区。 7 在单分子层吸附的情况下，s e r s 强度与覆盖度的关系是非线性的。并非 吸附在粗糙金属基底表面的分子都能产生s e r s 效应，大部分的增强效应是由一 小部分吸附在金属基底表面活性位置的分子产生的。 8 许多化合物特别是生物分子有较强的荧光，在检测此类化合物的常规拉 曼光谱时，往往受到很强的荧光干扰而得不到理想的光谱。而在s e r s 实验中， 许多化合物的荧光被淬灭，能够得到质量很好的s e r s 光谱。 9 s e r s 的增强因子与所选用的增强基底及基底的表面特征之间存在密切的 联系，而且其变化范围很大。 1 0 在电化学体系中，吸附物s e r s 的增强因子一般与电极电位以及激发光 的频率有关。对于胶体体系，如果固定激发波长，则增强与胶体的凝聚程度有着 密切的关系。 1 2 3 表面增强拉曼光谱( s e r s ) 的增强机制 为了弄清表面粗糙度影响拉曼散射增强因子的原因，进一步了解引起s e r s 的原因，找到一个合理解释s e r s 效应的理论模型，多年来，人们不断补充修正 已经提出的理论，或者提出新的模型，力图彻底弄清s e r s 的机理。总的来说， 所有的理论