（水产养殖专业论文）鱼源fab噬菌体抗体库的筛选、鉴定及抗sas抗体的可溶性表达.pdf

l i i i ii if i l1 i l li l l illl y 17 9 9 3 5 1 华中农t 大学学位论文独龟性声明及使用授权书 耵r 可蕊磊磊丌下丁丁 ! 独雹4 性南暖 ； | 式j i 每穆眵呈变挚谚爰羲分，。套导辑携晕了避行蜂瞬笺二髂瑗酝辱蟪蛩雹廖； ：象。墨莪黔镪豫了文审譬襞弦疆椽爱和黟澎姥适弯毒一论趸中不冬台箕笼歹。经警 表瘦誊写爱势磅茏我爱照耳：篷台老黟辱缮搿农亟囊掌或甍他荔旁撬擒鲸掌 王轰i 三叠l i 薅谚垮鬟筻嚏罨警鼍缓曝震诧爱 了京龙。，鼍我一霹互等蟛焉考瓷豢磅笺妒麓醇譬： ；箕零麓蟛三。老逢串散了臻硗掳遵8 1 荨袭示? 谖枣 笺熏篓鬈：茂蚴 野喝：函弦冬6 露；荔 ；掌馒论文使用授投书 l 零，j 、宪奎j 缪挚中裘立发掌关亏缳每，饶_ | ； j 雩馁论文魄规定，印掌生必芬东照7 享 ；籁簧褒凌文学位论戈鹭露霉：j 军留鬯予版末：学投孝弦强存鬟瓷论文盼e ? 氍缓和毫于绽， ；劳鬟镁器捻露面蕊毪甄秀，霹曩象臻彰零。缨苓或蕾缮萋鬟餐手段缳謦、五麓雩羔 瓷支。攀7 、霉蹙孥书农囊罗：学夏臻琴麓方式在弓萄燕像，三受袤。筵掺掌毡论天弗蚤 ；舔轰篡囊荔。霹霹零? 、侄誊壹箕他援像数豪论了：麴缓力。 ；菠：缳密学位论文( 簿涉及技采秘密，锈监秘密或搴馕专剩等潜在甏耍旋交像整麓论 ；文) 鑫麓壅詹适用予零援缓带。 i ! 掌佳论璐秀篓毫：t 闺蘸，豢 导蟠签冬： 三p 渺囊 7 【。； ；参笔譬鬻：扣每互；篓垫喜西餐：d 影每易霉乡鏊 鱼源f a b 噬菌体抗体库的筛选、鉴定及抗s a s 抗体的可溶性表达 目录 中文摘要1 a b s t r a c t 3 英文缩略词表5 1 文献综述7 1 1 噬菌体抗体库技术7 1 2 噬菌体抗体库表达载体系统8 1 3 抗体库分类8 1 4 噬茵体抗体库技术的特点9 1 5 噬菌体抗体库的筛选1 0 1 6 噬菌体抗体库技术的应用1 1 i 7 噬菌体抗体库技术在水产养殖上的应用价值1 2 2 研究的目的与意义1 3 3 材料与方法1 4 3 1 实验材料1 4 3 1 1 菌株一1 4 3 1 2 工具酶、m a r k e r 及试剂盒1 4 3 1 3 主要试剂和培养基1 5 3 1 4 主要仪器1 6 3 2 试验方法l6 3 2 1 辅助噬菌体敏感宿主菌的制备1 6 3 2 2 辅助噬菌体的扩增1 6 3 2 3 辅助噬菌体滴度测定1 7 3 2 4 抗体库的扩增1 7 3 2 5 包被板的制备17 3 2 6 噬菌体抗体库的筛选17 3 2 7 单克隆噬菌体抗体的制备18 3 2 8 噬菌体单抗的e l i s a 鉴定一1 8 3 2 9e l i s a 阳性的噬菌粒的酶切鉴定1 8 3 2 1 0f a b 段的可溶性表达载体构建1 9 3 2 1 1 感受态大肠杆菌的制备2 0 3 2 1 2 可溶性表达载体转化大肠杆菌2 0 3 2 ，1 3 可溶性表达载体在大肠杆菌内表达2 1 3 2 1 4 可溶性f a be l i s a 鉴定21 华中农业大学2 0 1 0 届硕十研究生学位论文 3 2 1 5s d s p a g e 电泳2 1 3 2 1 6w e s t e r n b l o t 分析2 2 3 2 1 7d n a 测序2 3 4 结果与分析2 3 4 1 辅助噬菌滴度测定2 3 4 2 抗体库滴度测定一2 4 4 3 抗体库的筛选一2 4 4 4 单克隆抗体的e l i s a 鉴定2 5 4 5 酶切鉴定片段插入2 6 4 6 可溶性表达载体构建一2 7 4 7 可溶性f a be l i s a 鉴定一2 8 4 8 可溶性f a bs d s p a g e 鉴定2 9 4 9w e s t e r n b l o t 分析2 9 4 1o 抗体重链和轻链可变区d n a 序列的测序分析31 5 讨论一3 2 5 1 辅助噬菌体的扩增与定量3 2 5 2 噬菌体抗体库的筛选3 4 5 3 噬菌体f a b 抗体在大肠杆菌内的表达3 5 6 小结3 8 参考文献3 9 附表一4 6 附表二4 7 附表三4 8 致 谢4 9 i i 鱼源f a b 噬菌体抗体库的筛选、鉴定及抗s a s 抗体的可溶性表达 中文摘要 抗体因其独特的重组类型和基因结构形成巨大的多样性，不仅可以通过结合抗 原来有效保护机体，同时也是生物技术、临床诊疗、药物检验检测等许多科学研究 中的重要工具。噬菌体抗体库技术因其能够高效快速的制备高亲和力的特异性抗体， 被誉为功能抗体研究史上的巨大变革。目前，该技术已在医学、基础理论研究、药 物制造生产、残留检测以及病害防治等方面发挥了重要的作用。但是，在发展相对 滞后的水产领域，该技术的应用研究还少有报道。基于斑点叉尾鲴抗体基因信息已 比较清晰，所以，本试验对本室自建的斑点叉尾鲴天然f a b 噬菌体抗体库( 赵琳， 2 0 0 9 ) 进行筛选、鉴定并对筛得抗体进行可溶性表达。具体工作如下： 1 抗体库筛选： 以偶联卵血清蛋白的磺胺甲氧嗪( s u l f a m e t h o x y p y r i d a z i n e ，s m p ) 和磺胺甲恶唑 ( s u l f a m e t h o x a z d e ，s m z ) 为固相包被抗原，将包被板处理后，对自建的斑点叉尾鲴 天然f a b 噬菌体抗体库进行筛选，经过5 轮“吸附洗脱扩增”的筛选过程，获得 特异性较强的f a b 抗体，并对抗体进行鉴定。主要结果如下： 1 ) 从f a b 噬菌体抗体库中经过5 轮“吸附一洗脱扩增”的筛选，分别得到抗s m p 阳性克隆株9 个，抗s m z 阳性克隆株1 0 个。经e l i s a 检测，结果证明所筛得抗 体具有一定特异性。 2 ) 分别经s a c i + x b a i 、s p e i + x h o i 双酶切鉴定后，证实所得到的片段大小与预想目 的片段大小一致。 2f a b 段的可溶性表达： 挑选噬菌体抗体阳性克隆感染大肠杆菌x l l b l u e ，扩增提取质粒d n a ，经双 酶切构建f a b 可溶性表达载体p 3 m h s a ，转化大肠杆菌x l l 一b l u e ，经i p t g 诱导， 收集培养液及菌体裂解液上清。进行e l i s a 、s d s p a g e 和w e s t e r nb l o t 检测。结果 如下： 1 ) e l i s a 结果显示在菌体裂解液上清及培养液中均可检测到可溶性抗体f a b 段的 表达，与理论上是一致的。且该抗体分别与偶联蛋白的磺胺甲氧嗪和磺胺甲恶唑 可特异性结合。 2 ) s d s p a g e 及w e s t e r n b l o t 结果证明，抗s m z 克隆分别有4 个克隆、抗s m p 克 隆有3 个克隆在4 8 k d 处出现明显条带，与理论计算值相符，说明表达成功。 华中农业人学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 3 ) 通过对表达较好的阳性克隆的可变区进行g e n b a n k 检索d n a 序列分析，证实该 克隆轻链可变区、重链可变区氨基酸序列与g e n b a n k 中斑点叉尾鲴免疫球蛋白轻链、 重链同源性均在8 0 9 0 。通常同一基因家族的同源性在8 5 以内，因此可以断定 我们所获得的轻链和重链基因均来自斑点叉尾鲴且v h 属于斑点叉尾鲴免疫球蛋白 v h 3 基因家族，轻链v 区属于斑点叉尾鲴免疫球蛋白v k l 基因家族。 本研究从自建的斑点叉尾鲴天然f a b 噬菌体抗体库中成功筛选得到抗两种磺胺 类药物的抗体，并证实了此抗体的有效性，希望噬菌体抗体库及相关技术可以成为 一种有效的制备鱼源单抗的方法，在水产动物的基础研究及实际应用上发挥作用。 f a b 噬菌体抗体库；筛选；基因表达 2 鱼源f a b 噬菌体抗体库的筛选、鉴定及抗s a s 抗体的可溶性表达 a b s t r a c t a n t i b o d yi se x t r e m e l yd i v e r s ew i t hi t su n i q u eg e n e t i cs t r u c t u r ea n dr e o r g a n i z a t i o n i t c a np r o t e c tt h eb o d ye f f e c t i v e l yt h r o u g ht h ec o m b i n a t i o nw i t ha n t i g e n ，a n da l s oi ti sa n i m p o r t a n tt o o lf o rb i o t e c h n o l o g y , c l i n i c a lt r e a t m e n ta sw e l la ss c i e n t i f i cr e s e a r c h p h a g e d i s p l a yt e c h n o l o g yc a np r e p a r eh i 曲一a f f i n i t ya n t i b o d yr a p i d l ya n de f f i c i e n t l y , k n o w na st h e g r e a tr e v o l u t i o nt of u n c t i o n a la n t i b o d yi nt h eh i s t o r y c u r r e n t l y , t h et e c h n o l o g yh a sp l a y e d m o r ea n dm o r ei m p o r t a n tr o l ei nm e d i c i n e ，f u n d a m e n t a lr e s e a r c h ，d r u gp r o d u c t i o na n d d i s e a s ed e t e c t i o n h o w e v e r , t h er e s e a r c ha b o u tp h a g ea n t i b o d yl i b r a r yh a sn o tb e e n r e p o r t e di na q u a t i ca r e a s b a s e do nt h ei n f o r m a t i o no ns t r u c t u r ea n df u n c t i o no fc h a n n e l c a t f i s hi m m u n o g l o b l i n sh a db e e nk n o w n ，w es c r e e nf a ba n t i b o d i e sa g a i n s ts a sf r o m p h a g e d i s p l a y e dl i b r a r yc o n s t r u c t e db yu sa n di d e n t i f y 、e x p r e s s i ta ss o l u b l ep r o t e i n s t h e r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 s c r e e n i n go ff a bp h a g ea n t i b o d yl i b r a r i e s s u l f a m e t h o x y p y r i d a z i n e ( s m p ) a n d s u l f a m e t h o x a z o l e ( s m z )c o n j u g a t e de g g a l b u m i nw e r ec o a t e d t h ep h a g e d i s p l a y e dl i b r a r yc o n s t r u c t e dw e r es e l e c t e d a f t e rf i v e r o u n d ”a d s o r p t i o n e l u t i o n a m p l i f i c a t i o n ”b i o p a n n i n g t h ep o s i t i v ec l o n e sw e r ep i c k e du p a n ds t r o n gs p e c i f i cf a ba n t i b o d yw e r eo b t m n e d t h ea n t i b o d yw e r ei d e n t i f i e d t h em a i n r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 ) a f t e rf i v er o u n d ”a d s o r p t i o n e l u t i o n - a m p l i f i c a t i o n ”s c r e e n i n g ，p o s i t i v ec l o n e s w e r eo b t a i n e df r o mt h ef a bp h a g ea n t i b o d yl i b r a r y , t h en u m b e ro fa n t i - s m pi s9a n d t h ea n t i s m zi s10 t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ep o s i t i v ec l o n e si d e n t i f i e db y e l i s ah a dac e r t a i ns p e c i f i c i t y 2 ) t h ef r a g m e n t ss i z eb ys a c i + x b a i ，s p e i + x h o id o u b l ed i g e s t i o nw e r em a t c h e d w i t ht h a tw ee x p e c t e d 2 e x p r e s s i o n o ff a ba n t i b o d yi ne c o l i ： w ec o n s t r u c t e dt h e e x p r e s s i o np h a g e m i d sp 3 m h s aa n dt r a n s f o r m e d e c o l i x l1 b l u et oe x p r e s ss o l u b l ea n t i b o d y , c o l l e c t e dt h eb a c t e r i a lc u l t u r es u p e r n a t a n ta n dc e l l 1 y s i sa n dt e s t e db ye l i s a a n dw e s t e r nb l o t t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 3 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 1 ) s o l u b l ef a bw a se x p r e s s e db o t hi nt h eb a c t e r i a lc u l t u r es u p e m a t a n ta n dc e l ll y s i s t h e s u p e r n a t a n ta n dc e l ll y s i ss h o w e dc l e a rr e a c t i v i t yt os m p a n ds m z a n t i g e nb u tn o t r e a c tw i t hb s a b ye l i s a 2 ) f o u rc l o n e sa n t i - s m za n dt h r e ec l o n e sa n t i - s m po ft h o s ee x p r e s s e dt h es o l u b l e a n t i b o d ys u c c e s s f u l l y w e s t e r nb l o t t i n gd e m o n s t r a t e dt h es i z eo fp r o t e i ne x p r e s s e di s a b o u t4 8 k d 3 ) d n af r a g m e n t sf r o mt h ep o s i t i v ec l o n e sw e r es e q u e n c e d t h es e q u e n c ea n a l y s i s s h o w e da l lo ft h eh e a v yc h a i nf dg e n ea n d l i g h tc h a i ng e n e sw e r e c e i v e da r ed e r i v e d f r o mc h a n n e lc a t f i s h t h eh o m o l o g yw a s8 0 - 9 0 c o m p a r e dw i t ht h eh e a v yc h a i n v a r i a b l er e g i o na n dl i g h tc h a i nv a r i a b l er e g i o ni ng e n b a n k a n dt h ev l g e n es e g m e n t d e r i v e df r o mt h ev k g e n ef a m i l ya n dt h e v hg e n es e g m e n tw a sf r o mv i - 1 3g e n ef a m i l y t h es u c c e s so fi s o l a t i n ga n t i - s m pa n da n t i s m zf a bf r o mc h a n n e lc a t f i s hp r o v et h e u s e f u l n e s so fp h a g ed i s p l a ys y s t e mi nf i s ha n t i b o d yp r e p a r a t i o n p h a g ea n t i b o d yl i b r a r i e s a n di t sr e l a t e dt e c h n o l o g i e sc a nb ea ne f f e c t i v em e t h o d st op r e p a rm o n o c l o n a la n t i b o d yo f f i s h p h a g ed i s p l a yt e c h n o l o g ym a y b eu s e f u la sm o l e c u l a rt o o l st ot h ep r a c t i c a la p p l i c a t i o n a n db a s i cr e s e a r c hi na q u a t i ca n i m a l s k e yw o r d s ：p h a g ea n t i b o d yl i b r a r y ；s e r e e n i n g ；g e n ee x p r e s s i o n 4 鱼源f a b 噬菌体抗体库的筛选、鉴定及抗s a s 抗体的可溶性表达 英文缩略词表 a b b r e v i a t i o n s 5 鱼源f a b 噬菌体抗体库的筛选、鉴定及抗s a s 抗体的可溶性表达 1 文献综述 自1 9 世纪末，用抗原免疫动物来获得抗血清的途径一直是制备抗体的经典方 法。1 9 7 5 年m i l s t e i n 和k o h l e r 建立了b 淋巴细胞杂交瘤技术，成为抗体制备史上的 一次重大技术革命( k o h l e re ta 1 ，1 9 7 5 ) 。该技术的普及使众多科学家可以通过细胞 工程在体外定向制备各种单克隆抗体( m o n o c l o n aa n t i b o d y , m c a b ) 。然而，m c a b 的 鼠源性极大的限制了其在人体内的应用。为克服m c a b 的异源性反应，8 0 年代中期 人们开始尝试利用基因工程的方法改造鼠源m c a b ，即鼠源m c a b “人源化” ( h u m a n i z e da n t i b o d y ) ，同时，考虑到完整的抗体分子过大，不利于发挥“药物”的作 用，所以就利用基因工程的方法使之小型化，如单链抗体( s i n g l ec h a i na n t i b o d y ) 。 真正以基因操作的方式制备人源抗体是始于1 9 8 9 年由英国剑桥s c r i p p s 研究所 l e m e r 小组与w i n t e r 小组创造性的运用p c r 方法克隆机体全部抗体基因并重组于原 核表达载体中，以标记抗原筛选到相应抗体，当时称之为组合抗体库技术。9 0 年代 初，该技术得到进一步发展，即将抗体基因( f d 或v h ) 与单链噬菌体的外壳蛋白 融合并表达于噬菌体载体表面，再以固相化的抗原经多轮吸附筛选得到相对应的噬 菌体抗体，即噬菌体抗体库技术( p h a g ed i s p l a ya n t i b o d yl i b r a r yt e c h n i q u e s ) 。该技术 以其强大的体外筛选功能被誉为功能性抗体研究史上一次重大的技术革命( w i n t e re t a 1 ，1 9 9 4 ) 。到目前为止，它已作为一个技术平台，在医学、基础理论研究、药物制造 生产以及病害防治、药物检测等方面发挥越来越重要的作用，同时也受到众多学者 及生物公司的极大重视( g a oe ta 1 ，1 9 9 9 ；s c h l e b u s c he ta 1 ，1 9 9 7 ；i t o he ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 1 1 噬菌体抗体库技术 继1 9 8 8 年s m i t h 首次阐明噬菌体表面表达技术以来，抗体分子是噬菌体表面表 达的第一个具有其天然蛋白质功能的蛋白质分子。通过噬菌体表面表达技术，将抗 体分子f a b 段基因或f v 基因通过与噬菌体外壳蛋白i i i ( p l i i ) 或蛋白v i i i ( p v i i i ) 基因连接以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面，从而形成噬菌体抗体。从b 淋巴细 胞中扩增全套抗体的轻链和重链基因文库，经噬菌体表面展示系统表达后形成的噬 菌体抗体文库即为噬菌体抗体库( p h a g ea n t i b o d yl i b r a r y ) 。对噬菌体抗体库经过多轮 “吸附一洗脱一扩增”的淘筛，便可富集到所需的特异性抗体( b e n g t r ne ta 1 ，1 9 9 4 ； b e n g t r ne ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 噬菌体抗体库技术作为近年来发展起来的一项分子生物学新技术。它具有简 单、快捷、库容量大以及可以模拟天然免疫选择系统制备高亲和力抗体等优点。它 华中农业人学2 0 1 0 届硕上研究生学位论文 的产生主要基于3 项实验技术的发展：p c r 技术的发展。p c r 技术使人们可以利 用一组引物( i g 可变区骨架的保守序列) 克隆机体全套免疫球蛋白可变区基因。可 以在大肠杆菌内成功表达有生物活性的免疫球蛋白分子片段( s k e r r ae ta 1 ，1 9 8 8 ) 。 噬菌体表面表达技术的建立和发展。 1 2 噬菌体抗体库表达载体系统 噬菌体抗体库技术所用表达载体主要有九噬菌体( p h a g e s ) ( h u s ee ta 1 ，1 9 9 8 ) 、单 链丝状噬菌体( f i l a m e n t o u sp h a g e ) ( g l a s e re ta ，2 0 0 0 ) 及噬菌粒( p h a g e m i d ) ( h u s ee t a 1 ，2 0 0 1 ) 等三种系统。前者是九噬菌体载体，后两者为丝状噬菌体展示载体。h u s e 等( 1 9 9 8 ) 人最早利用九噬菌体载体系统构建了未经免疫小鼠的f a b 组合抗体库， 并从中淘筛到抗n p n ( n e u r o p i l i n ) 的f a b 抗体。目前，来自大肠杆菌单链丝状噬菌 体衍生的载体系统应用最位广泛。s m i t h 等( 1 9 8 5 ) 人首先利用这种系统构建了多肽 库，w i n t e r 等( 1 9 9 4 ) 将其用于表达抗体库。 1 3 抗体库分类 根据抗体基因来源不同，抗体库可分为非免疫库和免疫库。前者包括天然抗体 库、半合成抗体库和全合成抗体库( 董志伟等，2 0 0 2 ) ： 天然抗体库( n a i v ea n t i b o d yl i b r a r y ) 对来源于未经免疫的人体或动物体内血样、 骨髓、脾和扁桃体等分离的b 淋巴细胞，提取r n a ，通过r t - p c r 获得抗体轻链和 重链可变区基因，随机组装成f a b 或s c f v 后将此抗体片段在噬菌体或噬菌粒载体中 表达呈现，构成天然抗体库( v a u g h a n e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。天然抗体库库容量越大，越易获 得高亲和力抗体。它可用于一些有毒物质、非免疫原性的以及自身抗原等多种不同 抗原的筛选；而且筛选周期在2 周左右，只经过2 - - 4 轮淘选便可淘筛到针对某一抗 原的特异性抗体。其缺点在于：建库过程较繁琐，并受个体发育的限制，而且库容 量较小时，不利于高亲和力抗体的获得( g r i f f i t h se ta 1 ，1 9 9 3 ；m a r k se ta 1 。1 9 9 1 ) ； 半合成抗体库( s e m i s y n t h e t i ca n t i b o d yl i b r a r y ) ：该抗体库主要基于天然抗体库 中框架区和抗体重链可变区基因片段中的互补决定区( c o m p l e m e n t a r i t yd e t e r m i n i n g r e g i o n s ，c d r ) c d r l 和c d r 2 ，c d r 3 是人工随机合成的编码4 1 2 个氨基酸的随 机序列( w u a 1 ，1 9 9 3 ) 。该库最大的优点就在于库容量较大，可达1 0 1 2 ，但是抗体 亲和力相对偏低，而且c d r 3 随机序列可能会增加抗体免疫原性。 合成抗体库( s y n t h e t i ca n t i b o d yl i b r a r y ) ：是根据抗体基因库信息而设计的纯人 鱼源f a b 噬菌体抗体库的筛选、鉴定及抗s a s 抗体的可溶性表达 工合成抗体库。主要是在v 基因组装时，利用循环多次p c r 、错配p c r ，插入人工 合成的随机c d r s 序列，在c d r 区或v 区诱发随机点突变，从而构建噬菌体抗体 库。目前最成功的是由德国m o r p h o s y s 公司建立和拥有的h u c a l 人源重组抗体库。 此种库的多样性及v 基因区域的可变性都是可操控的。但是，在c d r 区内存在一 部分要求特殊的氨基酸，他们在建库时很难合成有效的抗体分子；同时由1 0 , - - , 3 0 个 氨基酸构成的c d r 3 在合成中所产生的数量巨大的随机组合已远远超过了目前建库 的能力。 免疫抗体库( i m m u n i z e da n t i b o d yl i b r a r y ) ：是指通过某种抗原免疫动物来构建 的抗体库。由于经历了免疫系统选择和成熟过程，该抗体库中必定存在比例较高的 编码识别特定抗原的功能性抗体基因，而且合成的抗体也具有较强的亲和力和特异 性( b u r t o ne ta 1 ，1 9 9 1 ) 。目前已报道的此种抗体库库容多数为1 0 6 1 0 8 水平，且可 以从中筛选到高亲和力的抗体( c a ie ta 1 ，1 9 9 5 ；l ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 。此种库的缺点在于建 库时免疫动物过程繁琐；部分抗原由于自身因素不能进行免疫；同时机体的免疫应 答也具有不确定性；针对每种新抗原都需要建立一个与之对应的新抗体库。 1 4 噬菌体抗体库技术的特点 噬菌体抗体库技术将抗体的基因型与表型联系在一起，表达的噬菌体抗体可用 于功能性检测，扩增噬菌体并抽提d n a 即可获得相应抗体基因，便于测序或进一 步的基因操作；其次，该技术库容量大、效率高。一般认为，1 0 7 个特异性的抗体分 子便可以识别9 9 的抗原决定簇，所以理论上1 0 8 库容的组合噬菌体抗体库可以包 含所有的抗体分子( 王希良等，2 0 0 0 ) 。相对于单克隆和多克隆抗体来讲，噬菌体抗 体库技术可以模拟天然免疫选择过程，不经免疫系统和免疫步骤，摆脱了细胞融合 等复杂操作，直接利用抗原筛选出特异性抗体，过程简单快速，适合大规模工业化 生产。已有人采用细胞内组合的方法建成了具有1 0 m 潜力的噬菌体抗体库( 张春莉 等，2 0 0 1 ) 。此外，该技术还可直接改善抗体的性能，可以根据需要加入不同的标签 和构建小分子抗体，因其通透性好，易于达到靶位，从而满足了检测分析和导向治 疗等不同方面的要求。目前，利用该技术所得到抗体有抗病毒抗体( h ee ta 1 ，2 0 0 2 ； s c h o f i e l de ta 1 ，2 0 0 2 ；o s t r o w s k ie ta 1 ，2 0 0 2 ；l i a n ge ta 1 ，2 0 0 3 ) ，抗肿瘤抗体( v i t a l i t ie t a 1 ，2 0 0 4 ；b a r t he ta 1 ，2 0 0 4 ；j o h ne ta 1 ，2 0 0 6 ) ，抗细菌抗体( r e i c h ee ta 1 ，2 0 0 2 ) ，自 身抗体( b a n g a l ee ta 1 ，2 0 0 2 ；d i t z e l ，2 0 0 3 ) ，以及一些抗激素抗体( v a l j a k k ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 9 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 等，因此，在分子生物学和制药、科研等领域噬菌体抗体库技术具有极其广阔的应 用前景。 1 5 噬菌体抗体库的筛选 噬菌体抗体库技术能够迅速发展，重要一点还在于它高效率的筛选能力。所以 筛选手段的正确选择与合理应用是能否从抗体库中获得预期抗体的第一步。筛选方 法的改进是抗体库技术发展的动力( o s b o u m 2 0 0 3 ) 。 筛选策略需要根据抗原的性质而定，目前主要的筛选方法大致有以下几种： 固相化抗原筛选法：目前所报道的筛选特异性抗体多数是由此法得到的 ( o s b o u m ，2 0 0 3 ) 。通常是将纯化抗原包被在固相介质表面，如亲和柱层析住，免 疫试管，酶标板等，再加入噬菌体抗体库进行孵育筛选，通过多次淘筛，可使特异 性噬菌体抗体得到富集。此法最简单也最经典，所获的阳性克隆的比例也较高，富 集可达上千乃至10 9 倍( p a r m l e y ，19 8 8 ) 。但此法在筛选过程中纯化抗原需求量较大； 固相化还有可能损坏某些抗原表位；不利于根据抗原和抗体库的性质进行量化处理 ( b e n h a re ta 1 ，2 0 0 0 ；b r a d b u r ye ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 液相筛选法：即将被标记生物素的抗原固定在包被有链亲和素的磁珠上，再借 助磁场作用进行噬菌体抗体的筛选；或者是将被标记生物素的抗原在液相体系中先 与抗体库结合，然后再通过与标记有链亲和素的磁珠相互作用，从而富集所需噬菌 体抗体( w a t a n a b ee ta 1 ，2 0 0 2 ；z a m p i e r ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。此方法筛选效率较高，利于拷贝 数较少的抗体的富集，并且筛选体系也可根据抗原纯度、相对分子质量及库容等进 行灵活调整( 王刚等，2 0 0 1 ；g r i f f i t h se t a l ，1 9 9 8 ) 。但是此筛选体系相对较复杂，对 抗原的标记也有可能造成抗原表位的改变( e n d r e se ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 细胞筛选法：对于一些难以纯化的抗原，如某些组织、癌细胞表面受体或是经 疾病等诱导出现在细胞表面的新型标志物，传统方法就不再适用( h e g m a n s 。2 0 0 2 ) 。 目前已有文献报道，直接用细胞或体内生长的实体瘤等复杂抗原也可以筛选到特异 结合的抗体( f o ye t a l ，2 0 0 2 ) 。目前已有学者从单链抗体库中利用细胞系筛选与细胞 表面受体特异结合的噬菌体抗体获得成功( k o me ta 1 ，2 0 0 4 ；k u p s h e ta 1 ，1 9 9 9 ) 等人。 申勇梅等( 2 0 0 9 ) 也成功构建针对b 细胞淋巴瘤d a u d i 细胞系的噬菌体抗体库并从 中筛选到特异性抗体。但是此法最大的问题就是背景值高，细胞表面复杂的成分也 会造成很多非特异性吸附。与固相筛选法相比，此法富集速度慢，多轮筛选易造成 特异性抗体的丢失。 1 0 鱼源f a b 噬菌体抗体库的筛选、鉴定及抗s a s 抗体的可溶性表达 组织筛选法：利用冰冻组织切片筛选抗体库的方法，利于临床应用。t o r d s o n 等( 1 9 9 7 ) 报道用转移黑色素瘤的冰冻组织切片筛选，可能由于抗原量的缘故，筛到 体内筛选法是将低剂量经标记的抗体库注射入动物体内，收集目标组织或靶器 官，洗脱噬菌体，以此来获得特异性抗体( j o h n se ta 1 ，2 0 0 0 ) 。此法适用于分离组织 特异性标志物的抗体。与体外筛选相比，这种组织和细胞是在自然的三维微环境中， 其筛选的结果更为真实。但体内筛选效率低、筛选难度大、对库的要求也更高，同 时还要尽量减少空噬菌体( 无插入片段) 的含量。 选择性感染筛选抗体库( 董志伟等，2 0 0 2 ) ：选择性感染噬菌体( s e l e c t i v e l y i n f e c t i v ep h a g e s ，s i p ) 筛选系统是利用噬菌体病毒蛋白p 3 的结构功能特点，把筛选 和扩增合为一步，只有能与抗原特异结合的噬菌体才能感染宿主菌扩增，而非特异 性的则不能。这样不仅仅可以简化筛选的步骤，也可以大幅度提高筛选的效率。此 法筛选效率较高，适用于大容量文库的筛选，但缺点是系统建立较复杂。( a m d te t a 1 ，2 0 0 0 ) a 8。 乒 镶 霪一莎生一莩氐 l 缎撒嗽瑟 墼 x l 。i - b l i e i 一一一舞矿 l 生室量一l i l 鼍蕊j ； 图1 - 1 ：噬菌体抗体库的抗原筛选 f i gl - 1 ：s c r e e n i n ga n t i g e n si np h a g ea n t i b o d yl i b r a r y 1 6 噬菌体抗体库技术的应用 表位( e p i t o p e ) 研究：表位即免疫学中决定配体折叠状态及结合特点的一段氨 基酸残基，传统的表位研究通常都是通过合成一系列来源于抗原的肽段或是测定某 抗原经特定处理之后所得到的片段与相关抗体的结合活性而分析得到的，过程繁琐。 噬菌体抗体库技术的引入使这一过程得到大大简化。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 抗体药物或疫苗的开发和研制：分子生物学的发展使人们能够从分子水平上阐 述细胞间的作用机制，噬菌体抗体库的引入让这个阐述更加精细，更进一步的了解 了细胞表面的信息。受体作为细胞与外界联系的通道，配合各种生物因子从而产生 相应的生物学效应。利用噬菌体抗体库的多样性，筛选出针对不同细胞受体的特异 性噬菌体多肽，分析其结构，合成药物从而作用于细胞受体。f o l g o r i 等( 1 9 9 4 ) 人 首先提出并证实了能与病人阳性血清特异结合的噬菌体模拟肽具有疫苗的价值。有 学者从自建的人源噬菌体抗体库中富集筛选到了抗h b s a g 的f a b 抗体，为研制基 因工程重组全人乙型肝炎病毒表面抗体打下基础( 王琰等，1 9 9 5 ；张爱华等，2 0 0 5 a ) 。 导向诊断和治疗：噬菌体抗体库技术在对疾病的导向性诊断和治疗方面拥有巨 大的价值。噬茵体抗体库技术采用细菌克隆代替b 细胞克隆表达抗体，可以不经细 胞融合，制备出针对任何抗原的抗体分子，同时由于其制备的都是小分子抗体，具 有抗原性低、穿透性强、靶向性高，易于携带靶向药物进行诊断和治疗( e l g g i v i s te t a 1 2 0 0 6 ；p a c i f i c oe ta 2 0 0 6 ) 。k u p s c h 等( 1 9 9 9 ) 从噬菌体抗体库中筛选出与黑色素 瘤细胞特异性结合的抗体，为进一步对肿瘤进行导向性治疗及影像学研究奠定了实 验基础。 1 7 噬菌体抗体库技术在水产养殖上的应用价值 相对于其他领域来讲，水产领域的抗体研究相对滞后，噬菌体抗体库技术作为 一项新兴技术在水产领域的报道也相对较少，但根据水产领域的实际发展需要，噬 菌体抗体库的引入必然会对其产生深远的影响。鱼类，特别是软骨鱼类，生物进化 史上较早具备较完全免疫功能的有颌动物，由于其最早出现获得性免疫反应 ( a d a p t i v ei m m u n er e s p o n s e ) ，所以在高等动物的免疫系统发育研究中它占有相当 重要的意义( h s ue ta 1 ，1 9 9 4 ；r a s te ta 1 ，1 9 9 5 ) 。许多免疫进化学者将其作为模型材料来 研究哺乳动物的免疫进化系统。而单克隆抗体是人们在分子水平上认识和研究免疫 系统及其功能的重要工具( h a w k ee ta 1 ，1 9 9 9 ) ，在水产领域鼠源单抗的应用虽然发 挥了相当的作用，但是我们要获得具体编码的基因还需要通过其他途径。噬菌体抗 体库技术的引入使我们可以直接高通量的获得鱼源单抗，从而能够进一步了解鱼类 自身免疫系统的组成、发育及其功能，为高等动物免疫系统的探索奠定基础 ( p i c c h i e t t ie ta 1 ，1 9 9 7 ) 。此外，不同种养殖鱼类的免疫球蛋白相差较远，噬菌体抗 体库技术可以让我们针对不同鱼