（基础兽医学专业论文）IL18和IL18BP融合蛋白在不同载体中的表达和纯化.pdf

独创性声明 本人声明，所里交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独 立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致 谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。 与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢 意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： q 节 日期： d 金l 3 ，。 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。吖 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：砻、1 珥匆 日期： 膳zi s 指导教师亲笔签名：日期：如驴，步 福建农林大学硕士研究生毕业论文 摘要 白细胞介素1 8 是白细胞介素1 家庭的一位独特的家族成员。它与白细胞介素l 在 结构上很相似，都是需要c a s p a s e 1 才能使之前体变成有活性的因子。i l 1 8 作为一种 细胞因子可以诱生i f n - f 、增强n k 细胞细胞毒性作用、增强帐细胞活性、增强t h l 型 免疫反应、抗肿瘤作用等多种生物功能。白介素1 8 结合蛋白( 1 l 1 8 b p ) 是新近发现的 一种糖蛋白，属免疫球蛋白超家族成员，目前已发现有6 种i l 8 b p 的同工蛋白。 i l 1 8 b p 可以在体内外有效抑制i l 1 8 的作用，因而被认为是i l 1 8 的天然拮抗剂。 以往对i l - 1 8 和i l - 1 8 b p 的研究分析只限于某个载体，没有专门针对原核系统、没有 专门为了获取融合性蛋白而进行的。也没有在诱导表达和纯化的过程中，对i l - 1 8 和i l - 1 8 b p 这两个天然拮抗剂进行专门的统一的分析，没有把他们的缓冲环境、融合蛋白诱导条件和洗 杂、洗脱环境总结为共同的一个模式。i l - 1 8 和i l - 1 8 b p 都存在于动物体内，因此对同一环 境下的研究就显得十分有意义。本次实验对原核系统进行了表达和纯化，并以获得融合蛋白 为目的，不断的探讨能够表达出融合蛋白的方法，同时对i l - 1 8 和i l - 1 8 b p 表达、纯化条件 进行比较，是一个纵向从p c r 到纯化，横向从i l - 1 8 到i l - 1 8 b p 的新的研究方法。它们在结 构上虽然有一定程度的相似。但是还是相差很远，对它们表达和纯化的共同模式的摸索可能 对它们作用机理、在动物体内的相互作用制衡的研究提供帮助。i l - 1 8 b p 是i l - 1 8 的天然拮 抗剂，由于他们都具有免疫的双向调节作用，所以在疾病的过程中通过两者的平衡，到达治 疗和预防疾病的作用，那么本次实验的研究可能会对二者在共同的环境一动物体内平衡的研 究具有一定程度上的意义。同时也将为基础兽医学和兽医免疫学提供新的科学研究依据，产 生重要的影响。 实验研究采用p c r 扩增出人白细胞介素1 8 和人白细胞介素1 8 结合蛋白的d n a ，克隆到 原核表达载体p e t 2 8 a 和p g e x 一6 p l 中，转化大肠杆菌b l 2 1 ，在原核系统( b l 2 1 ) 中表达并纯 化人白细胞介素1 8 和白细胞介素1 8 结合蛋白。探讨了p c r 、酶切、连接、转化、诱导表达 和纯化方面的实验过程和注意事项，从而展示了原核表达系统从p c r 到纯化更加清晰的思 路，同时也对蛋白序列进行了一定的分析，通过分析得出消光系数等数据，再同层析系统所 提供的数据结合，计算出了蛋白的浓度，最后将蛋白进行浓缩，保存在一8 0 ( 2 。也从菌中提取 了重组质粒，保存起来，以便日后方便使用。 。 实验运用g e n er t l i l l l e r 软件设计好了引物，根据基因的特点和性质，选择了b a m hi 和 e c o r i 两个酶切位点，因为它们有共同的缓冲环境，进而确定了p e t 2 8 a 和p g e x 一6 p - l 作为 i 福建农林大学硕士研究生毕业论文 载体。根据菌体的性质，优化了质粒提取的效率。实验为了提高连接的效率，采用过夜连接， 确保连接的成功。转化过程避开了震动，热击时间过长等一系列的干扰因素，使得实验能够 顺利进行。诱导表达时严格控制时间，菌液的0 d 值等，避免了表达过程可能丢失重组质粒、 噬菌体干扰，其他菌类的滋长等情况的发生。对于最佳的诱导浓度的摸索，采用了纵横交叉 的梯度摸索，尽可能的找到诱导出融合蛋白的条件。为了避免在上层析系统时r n a 对吸收峰 的影响和蛋白的降解，事先在缓冲液中加入了p , n a 酶和还原剂。根据层析系统所得到的信息， 进一步提纯蛋白。 白细胞介素1 8 ( i 卜1 8 ) 和白介素1 8 结合蛋白( i l - 1 8 b p ) 的研究对肿瘤疾病、自身免疫 性疾病感染性疾病、移植物抗宿主病、代谢综合征、过敏性疾病的治疗和它们的发病机理都 有很大的帮助。纯化出来的蛋白无论去做免疫活性的测定、单克隆抗体的制备，上细胞实验、 上动物实验，还是用于疾病的治疗以及疾病研究都具有很广阔的意义。为疾病治疗尤其是肿 瘤治疗提供了新的途径。为基础兽医学和兽医免疫学提供新的科学研究依据，产生重要的影 响。 关键词：白细胞介素1 8 ；白细胞介素1 8 结合蛋白；原核系统；纯化；融合蛋白 2 福建农林大学硕士研究生毕业论文 a b s t r a c t 也1 8i sas p e c i a lm e m b e ro ft h ei l - 1f a m i l y w h i c hc l o s e l yr e l a t e dt oi l - li ns t r u c t u r ea n d r e c l u i mc a s p a s e - 1a sa na c t i v i n ga g e n t i n t e r l e u k i n ( i l ) - l sw a si d e n t i f i e da sa nc e l lf a c t o rt h a t i n d u c e st h ep r o d u c eo fi n t e r f e r o n - g a m m a ，e n h a n c e sn kc e l lc y t o t o x i c i t y , m p r o v et h ea c t i v i t yo f n a t u r a lk i l l e rc e l l sa sw e l la st h li m m u n o r e a t i o nt y p ea n da n df u l l so fa n t i c a n c e re f f e c t sa n ds o o n i n t e r l e u k i n - 1 8 b i n d i n gp r o t e i n ( i l - 1 8 b p ) i san o v e lg l y c o p r o t e i na n db e l o n g st ot h e i m m u n o g l o b u l i ns u p e r f a m i l y s of a r , s i xi l - 18 b pi s o f o r m sh a v eb e e nf o u n di nv a r i o u sc d n a l i b r a r i e s i l - 18 b pi sr e g a r d e da san a t u r a la n t a g o n i s tf o ri l 18w h i c he f f i c i e n t l yi n h i b i t st h e b i o l o g i c a lf u n c t i o n so f i h 8i nv i t r oa ndi nv i v o f o r m e r l y , t h er e s e a r c ha n da n a l y s i so f i l - 18a n dt h ei l - 18 b pw e r eo n l yr e s t r i c t e di ns o m e v e c t o r , h a sn o tc a r r ys p e c i a l l y0 na i m m i n ga tt h en u c l e u ss y s t e m , a n da tg a l n n i n gt h ef u s i o n p r o t e i n , a l s oh a sn o tc a r r ys p e c i a l l yo nu n i f i e da n a l y s i st ot h e s et w on a u l r a la n t a g o n i s t c o m p o u n d s - i l 一18a n di l 18 b pi nt h ei n d u c t i o ne x p r e s s e sa n dp u r i f i c a t i o n , h a sn o ts u m m a r i z e m i x e d 恤 i r sc u s h i o ne n v i r o n m e n t , i n d u c t i n gc o n d i t i o no ft h ef u s i o np r o t e i n ，w a s h e s , t h ee l u t i o n e n v i r o n m e n tf o rac o m m o np a t t e r n i l - 18a n di l 18 b pe x i s ti na n i m a l sv i v o ，t h e r e f o r ei ta p p e a r s v e r ym e a n i n g f u lt or e s e a r c hu n d e rt h ei d e n t i c a le n v i r o n m e n l t h ee x p e r i m e mu s e sa n a l y s i s v e r t i c a l l ya n dh o r i z o n t a l l y , l o n g i t u d i n a li sf o r mp c r t ot h ep u r i f i c a t i o n , c r o s s w i s ei sf o r mi l - 18t o i l - 18 b p , a l t h o u g ht h e yh a st h ec e r t a i ns i m i l i t u d ei ns t r u c t u r e ，b u tt h e i rd i f f e r e n c ei sv e r yf a r , t h e s c r a b b l eb e t w e e nt h e mt h a tc a nu s et h ec o m _ r f l o np a t t e r ni sp o s s i b l yt op r o v i d et h eh e l pf o rt h e i r a c t i o nm e c h a n i s m , t h er e s e a r c hw h i c hk e e p si nb a l a n c ei nt h ea n i m a li nv i v o si n t e r a c t i o n i l - 1 8 b pi st h en a r l l a la n t a g o n i s tc o m p o u n do f l l - 1 8 ，b e c a u s et h e yh a v et h ei m m u n eb i d i r e c t i o n a l a 哇j u s ta c t i o n , t h e r e f o r ei nd i s e a s e sp r o c e s st h r o u g hb o t h sb a l a n c e d , a c h i e v et h et r e a t m e n ta n d p r e v e n td i s e a s e sf u n c t i o n , t h e nt h i se x p e r i m e n f sr e s e a r c hi sp o s s i b l yt oh a v et h ec e r t a i ne x t e n t s i g n i f i c a n c ei nt h ec o m m o ne n v i r o n m e n t - b a l a n c eo fa n i m a li nv i v o s i m u l t a n e o u s l y ，i ta l s ow i l l p r o v i d et h en e ws c i e n t i f i cr e s e a r c hb a s i s 如r 恤f o u n d a t i o nv e t e r i n a r ys c i e n c ea n dt h ev e t e r i n a r i a n i m m u n o l o g y , w i l lh a v et h ei m p o r t a n ti n f l u e n c e t h ee x p e r h n e n l 【a ls t u d yu s e dp c rt or e p l a yt h ec d n ao fh u m a ni n t e r l e u k i n18a n d i n t e r l e u k i n - 18b i n d i n gp r o t e i na n dt h e nt h a tw e r ec l o n e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rp e t 2 8 aa n d p g e x - 6 p - 1 ，t r a n s f o r m e di n t ot h ee c o l ib l 2 1 e x p r e s s e da n dp u r i f i e dt h er e c o m a b i n a n th u m a n 3 福建农林大学硕士研究生毕业论文 i n t e d e u k i n1 8a n di n t e r l e u k i n - 1 8b m d i n g p r o t e i ni np r o k a r y o f i cs y s t e m ( b l 2 1 ) t h i sa r t i c l ed i s c u s s e x p e r i m e n t a lt e c h n i q u ea n dm a t t e r sn e e d i n ga t t e n t i o ni ne x p e r i m e n tp r o c e s sa b o u tp c 民也e e l l z y m ec u t e d c o n n e c t i o n , t r a n s f o r m a t i o n , i n d u c t e d e x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o n t h u s ，i t d e m o n s t r a t e sc l e a r e r m e n t a l i t y f o r mp c rt o p u r i f i c a t i o na b o u tp r o 妇 y o f i cs y s t e m , s i m u l t a n e o u s l yi th a sa l s oc a r r i e do nc e r t a i l la n a l y s i st ot h ep r o t e i ns e q u e n c e ，o b t a i n sd a t aa n ds o o i le x t i n c t i o nc o e f f i c i e n t t h r o u g ht h ea n a l y s i s , a g a i nd a t au n i o nw h i c hp r o v i d e sw i t ht h e c h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i ss y s t e m , c a l c u l a t e dt h ep r o t e i nd e n s i t y , f i n a l l yc a r r i e do nt h ep r o t e i nt h e c o n c e n t r a t i o n , p r e s e r v a t e di n 8 0 i th a sa l s ow i t h d r a w nt h ec l o n ef r o mt h e f u n g u s ， p r e s e r v e s ，w i t ht h ea i mo ff a c i l i t a t i n gi nt h ef u t u r eu s e s t h ee x p e r i m e n th a sd e s i g n e dt h ep r i m e r st h r o u g ht h es o f l w a r e - g e n e g l l n l l e r , a c c o r d i n gt o t h eg e n ec h a r a c t e r i s t i ca n dt h en a t u r e , c h o s et w oe n z y m e st oc u tt h ep o s i t i o ns p o t - b a m h ia n d e c o r i b e c a u s et h e yh a v et h ec o m m o nc u s h i o ne n v i r o n m e n t , t h e nw eh a dd e t e m 证e d 也砒 p e t 2 8 aa n dp g e x - 6 p 。1 副蟹t h ev e c t o 瑙a c c o r d i n gt om y c e l i u m 。sn a t u r e , w eo p t i m i z e dt h ec l o n e s e x t r a c t i o ne f f i c i e n c y t h ee x p e r i m e n tt oe n h a n c et h ec o n n e c t i o n se f f i c i e n c y , u s e st h eo v e rn i g h t c o n n e c t i o n , g u a r a n t e e st h ec o n n e c t i o nt ss u c c e s s i o n t h et r a n s f o r m i n gp r o c e s sa v o i d e dt h e 、，i b r a t i o n , t h eo v e rt i m eh e a t ss t r u c k i n ga n ds oo i las e r i e so fd i s t u r b a n c e 自c t i d r ，e n a b l e dt h e e x p e r i m e n tt ob ea b l et oc a r r yo ns m o o t h l y w h e ni n d u c t i n ge x p r e s s i o n ，w ec o n t r o l l e dt h et i m e s t r i c t l y , t h ev a c c i n eo dv a l u ea n ds oo n , a v o i d e ds o m et i n g si nt h ee x p r e s s i o np r o c e s st h a ti ti s l o s i n gt h ec l o n e ，t h eb a c t e r i o p h a g ed i s t u r b a n c e ，o t h e rf u n g u sc a t e g o r i e sd e v e l o p e da n ds oo n s i t u a t i o no c c u l t c f l c e s r e g a r d i n gt h eb e s ti n d u c t i o nd e n s i t y sf u m b l e ，w eu s e dv e r t i c a l l ya n d h o r i z o n t a l l yt h eo v e r l a p p i n gg r a d i e n tt ot r yt of r e do u ta sf a ra sp o s s i b l et h ec o n d i t i o n t h a ti n d u c e s t h ef u s i o np r o t e i n i no r d e rt oa v o i dt h ei n f l u e n c eo f t h ea b s o r b i n gp e a kt or n aa n dt h e p r o t e i n sd e g e n e r a t i o nw h e n w eu s e dt h e 曲嗍a 1 吨，a p l l i c a l l ya n a l y z e ss y s t e m , w eh a d j o i n e dt h e r n ae n z y m ea n dt h er e d u c i n ga g e n tb e f o r e h a n di nt h eb u f f e rs o l u t i o n a c c o r d i n gt oi n f o r m a t i o n w h i c ho b t a i n sf o r mt h ec h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i ss y s t e m , w ec a nd e p u t e st h ep r o t e i nf u r m e r t h er e s e a r c ho fi n t e r l e u k i n - 1 8a n di n t e r l e u k i n - 1 8b i n d i n gp r o t e i nh a sv e r yb i gh e l pi nt h e t r e a t m e n to ft u m o rd i s e a s e ，o w i li m m u n i t yv i g o r o u ss i c k n e s s , i n f e c t i o u sd i s e a s e , t r a n s p l a n t a n t i - h o s ts i c k n e s s ，m e t a b o l i s ms y n d r o m e ，a l l e r g i cd i s e a s ea n dt h e i rp a t h o g e n e s i s t h ep u r i f i e d p r o t e i nr e g a r d l e s so fm a k e i n gt h ei m m u n i t ya c t i v ed e t e r m i n a t i o n , s p e c i f i cm o n o c l o n a la n t i b o d i e s p r e p a r a t i o n , u i n gi nt h ec e l le x p e r i m e n t , u s i n gi nt h ea n i m a le x p e r i m e n t a t i o n , a sw e l la s , u s e i n g 4 ， 福建农林大学硕士研究生毕业论文 i nt h ei l l n e s st r e a t m e n ta n dt h ei l l n e s sr e s e a r c ht h a tg e t ss i c kh a st h ev e r yb r o a ds i g n i f i c a n c e t r e a t i n gd i s e a s es p e c i a l l yt h et u m o rt r e a t m e n t ，i tp r o v i d et h en e ww a y k e y w o r d s ：i n t e r l e u k i n - 1 8 ；i n t e r l e u k i n - 1 8b i n d i n gp r o t e i n ；p r o k a r y o f i cs y s t e m ；p u r i f i c a t i o n ； f u s i o np r o t e i n 5 - 福建农林大学硕士研究生毕业论文 1 前言 第一章研究动态和研究意义 1 1 白细胞介素i8 干扰素诱导因子y 是新鉴定出的一种细胞因子，早期它是从注射了短棒杆菌一痤疮丙酸杆 菌( p a c n e s ) 并激发了细菌脂多糖( l p s ) 而诱发了内毒素休克的小鼠的血清中分离得到一种 类似i l - 1 2 的因子，具有诱导产生i f n - y 的活性n 1 干扰素诱导因子y 和i l - 1 8 的命名的提 出也是依据它们与人i l - i 在结构上的同源性和i g i f 罕见的生物学功效。最初发现该因子 能够诱导辅助性t 细胞产生i f n y ，还能增强脾t 细胞增殖能力及脾腿细胞活性，所以 i n t e r l e u k i n - 1 8 最早被命名为i f n - y 诱生因子( i f n - yi n d u c i n gf a c t o r ，i g i f ) 1 9 9 6 年u s h i o 等以鼠i g i f ( m l g i f ) 为探针克隆了人类i g i f ( h l g i p ) 的c d n a ，并在大肠杆菌( e c o l i ) 中表达，鉴于i g i f 的氨基酸序列与已知数据库中的任何蛋白均不相同，并且它不仅能诱导 i 阱y 的产生，还有其他多种生物学活性，因此重新命名为i l 一1 8 嘲。i n t e r l e u k i n - 1 8 生物 活性与白细胞介素1 2 ( i l - 1 2 ) 非常相似，但诱生y 干扰素( i f n - y ) 的能力要强于i l - 1 2 。 它主要是由活化的巨噬细胞和肝脏枯否氏细胞产生，其前体须经白介素- i b 转化酶( i c e 也 称c a s p a s e - 1 ) 的酶解，才能分泌出胞外，发挥生物活性“1 。i n t e r l e u k i n - 1 8 是i l - 1 家族 里的一个成员，i l - 1 8 和i l - i 具有相同的信号氨基酸片段及其结构基因的相似性，都具有 含c a s p a s e - 1 的前体体1 。 巨噬细胞、k u p f e r 细胞、角质化细胞、关节网细胞、滑膜细胞、格根包尔氏细胞都能合 成白细胞介素1 8 1 另外，在小鼠的表皮角化细胞、成骨细胞、肠上皮细胞以及大鼠的肾上 腺皮质网状带和束状带细胞均可表达。i l - 1 8 主要是由单核巨噬细胞产生。 i l - 1 8 不仅能促进t 细胞和n i 【细胞产生i f n y 、i l - 2 和伽塌f ( 粒细胞一巨噬细胞集落 刺激因子) 等细胞因子，并能增强t h l 细胞和瞰细胞表达f a s 配体。过去认为i l - 1 8 不能活 化t h 2 细胞钉，但2 0 0 1 年n a k a n i s h i 等。1 研究提示i l - 1 8 也可增强t h 2 细胞因子的产生并 促进i g e ( 人体的一种分泌型免疫球蛋白，起结构是由两条轻链和两条重链组成。) 的合成。 另外，i l - 1 8 还可能通过激活a p l ( a c t i v a t o rp r o t e i n - l - a p l 转录因子，结合于5 - g t g a g c t c a g _ 3 序列) 、信号转导和转录活化因子( s i g n a lt r a n s d u c e ra n da c t i v a t o ro f t r a n s c r i p t i o n ，s t a r ) 、n f _ a t ( n u c l e a rf a c t o ro fa c t i v a t e dtc e l l s ) 等发挥其多元化 的纽胞功能。对不同种类的细胞，i l - 1 8 激活的核因子种类及其活性程度可能有所不同引。欠 6 - 福建农林大学硕士研究生毕业论文 m o r e l 簪1 0 研究表明，i l - 1 8 作为一种促炎性细胞因子，本身能诱导表达i l _ 1 8 受体( i l - 1 8 r ) 的细胞产生c x c 和c c 型化学趋化因子( 趋化因子从结构上可分为四类：c o 型、c x c 型、c x 3 c 型和c 型) ，引起巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞释放i l - 1 8 。i l 一1 8 ra ：是曾被称为孤 儿受体的i l 一1 r r p ( i l 一1r e c e p t o r r e l a t e dp r o t e i n ) m 1 ，为i l - 1 8 的主要结合亚基。 i l 一1 8 信号转导途径与i l _ l 信号转导途径相似b z i l 一1 2 能诱导i l 一1 8 r 的表达1 。 1 2il - 18 的分子结构 ，i n t e r l e u k i n - 1 8 是i l - i 家族里的一个成员，i l - 1 8 和i l - i 具有相同的信号氨基酸片段 及其结构基因的相似性，都具有含c a s p a s e - 1 ( i c e ，一种半胱氨酸蛋白酶) 的前体。i l 一1 8 与i l - 1 有很多相似之处，都具有与i l - 1 相似的9 三叶草空间结构，它们的前体都要经过 i l _ lb 转化酶的裂解。小鼠i l - 1 8 c d n a ，通过白细胞介素一l8 转移酶在箱a s p - = a s n 处裂解一 个含3 5 个氨基酸的前导序列后，成为成熟的有活性的i l - 1 8 ，而人的c d n a 约1 1 k b ，编码 1 9 3 个氨基酸的无活性前体多肽，也通过i c e 在 * a s p - 3 7 t y r 处裂解一个含3 6 个氨基酸的前 导序列后，成为成熟的有活性的i l - 1 8 1 4 oi l - 1 8 的两个受体i l - i r r p 、a c p l 也都是i l - i 家族成员，并也类似于i l - i 受体复合物，i l - i r r p 与i l - 1 8 的亲和力低需在a c p l 的作用下， 传递完整的信息引起生物学效应。在细胞信号转导途径中两者需要激活相同的第二信使，如 i l 1 受体相关激酶( i l - ir e c e p t o ra s s o c i a t e d k i n a s e ，i r a k ) 、p 3 8 有丝分裂原活化的蛋白 激( m i t o g e n - - 一a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s em a p k ) 、核转录因子k b ( n u c l e a rf a c t o r kb ，n f xb ) 等，但i l - 1 8 与i l - 1 2 具有相似的生物学功能。， 自小鼠克隆到的i l - 1 8c d n a 编码由1 9 2 个氨基酸残基组成的无性前体多肽，含一个由 3 5 个氨基酸残基组成的引导序列。i l 1 8 都缺乏传统的疏水性信号肽，缺乏n - 糖基化位尉搐1 。 i l - 1 8 有4 0 个疏水片段。i l - 1 8 分子内无二硫键存在，但含4 个半胱氨酸残基，故很可能巯 基( - s h ) 就是其活性中心功能性i l - 1 8 是含有1 5 7 个氨基酸残基的多肽( 一个切除了前导 序列的单肽) ，其分子量约为( 1 8 - 1 9 ) * i 0 3 ( 1 8 3 k u ) ，等电点为4 8 。以小鼠i l - 1 8 的c d n a 作为探针从人肝脏c d n a 文库中钓取了人i l - 1 8c d n a ，含一个由3 6 个氨基酸残基的组成引 导序列，和小鼠的相应序列具有6 5 的同源性n 帕。编码i l - 1 8 的基因在人类位于第1 1 号 染色体( 1 l q 2 2 2 - q 2 2 3 ) 上，包含6 个外显子和5 个内含子，i l 1 8 基因有两个启动子，分 别位于1 号外显子( p 1 ) 和2 号外显子( p 2 ) 上游，它们均有基础性表达，且均可被脂多糖( l p s ) 诱导。i l - 1 8 的启动子区缺少t a t a 盒，3 端无富含a u 的序列，而该序列的存在常可以促使 m r n a 的降解，这也许可以解释i l 1 8 可在许多细胞中持续性表达的原因n n 。已发现4 个i l _ 1 7 福建农林大学硕士研究生毕业论文 家族成员与i l - l a ，i l - 11 3 ，i l - r a 和i l - 1 8 有明显的相似性。根据i 卜1 家族不同成员的关 系分为3 个超家族，i l - l a ，i l - 11 3 和i l - 1 8 为第一超家族。i l - 1 8 分子中g l u - 4 2 和l y s 一8 9 在i l - 1 8 与细胞表面的受体结合和i l - 1 8 信号转导过程中起关键作用，编码这两个氨基酸的 密码子突变后，i l - 1 8 就失去生物学活性n 力。 通过检测注射了蛇根碱的大鼠的肾上腺检测到新的综合性的i g i fm r n a ，然后通过反转 录作用分离到两个转录体，经过鉴定，这两个转录体与小鼠在核苷酸和氨基酸水平上具有高 度的同源性，达9 1 n 叮。i l - 1 8 在结构上与i l - l 相似，二者前体分子n 端都没有疏水信号肽 序列，而代之以一段无功能的前导序列。在p i r 或s w i s s o - p r o t 等数据库中并没有找到与 i l - 1 8 氨基酸序列相同的蛋白质，但h l l - 1 8 和m i l - 8 的氨基酸序列中包含一段i l - i 信号样 序列。h l l 一1 8 与h l l l a 、h l l - ib 以及i l 一1 r 拮抗物的序列同源性仅为1 5 一1 8 n 盯。h l l - 1 8 和m i l - 1 8 的引导序列都无糖基化位点及疏水性信号肽。人和鼠i l - 1 8 的c d n a 都显露出信 号肽的缺失，这也预告着i l - 1 8 的前体能够被i l - i b 转化酶c a s p a s e 一1 ( i c e ) 所切开，而 产生具有生物活性的分子n 帕 1 3ll - 18 的受体 i l - 1 8 r 属于i l - 1 受体t o l l 样受体。将惜i 标记i l - 1 8 在1 8 种人的造血细胞株上筛选 到i l - 1 8 受体( i l - 1 8 r ) ，发现来源于t 、b 细胞和骨髓单核细胞的白血病株如u 9 3 7 、p e e r 及l 4 2 8 等细胞表达i l - 1 8 r ，其中何杰金病细胞系i a 2 8 细胞表面可表达大量的i l - 1 8 r ，其 解离系数( k d ) 为1 8 5n m o l l l 。t o r i g o e 等伽就是采用了人何杰金病细胞系l 1 4 8 表面蛋白 的抗体，从l 1 4 8 细胞中纯化到了i l - 1 8 受体( i l _ 1 8 r ) 该蛋白质的相对分子质量为 6 0 - 1 0 0 k d ，其氨基酸序列与以往发现的i l - i 受体相关蛋白( i l i r r p ) 的同源性为1 0 0 。 t o r i g o e 等啪1 发现来源于t 、b 细胞和骨髓单核细胞的白血病株如u 9 3 7 、p e e r 及l 4 2 8 等细 胞表达i l - 1 8 r ，其中i a 2 8 细胞表达水平最高，其解离系数( k d ) 为1 8 5n m o l l ，每个细 胞可结合1 8 0 0 0 个i l - 1 8 分子。当表达i l - i r r p 基因缺陷时，i l - 1 8 诱导的信号无法转导， 促进i f n - y 生成的作用消失。i l - i r r p 在c o s - i 细胞表达后能与伪i - i l - 1 8 结合，其胞内段 具有对i l - 1 8 刺激诱导结合n f - k bd n a 的能力，表明i l - 1 8 为i l - 1 r _ , v 的配体并通过该受体 介导i l - 1 8 的n f - g b 信号途径。因此，i l - 1 8 r 的功能成分可能是i l - i r r p 与i l 一1 r 一样具 有信号传递的功能，i l - 1 8 r 具有信号传递的功能乜1 1 y o s h i m o t o m j 等发现，在小鼠原代t 细 胞上存在高亲和性( 0 4 n m o l l ) 和低亲和性( 4 0 n m o l l ) 两类结合位点，提示在i l - 1 8 r 复合物 屯还存莅i l - i r r p 以外的结合肽链。， 8 口 福建农林大学硕士研究生毕业论文 i l - 1 8 的多种生物学功能是通过与细胞表面的i l - 1 8 r 的作用实现的。已知的i l - 1 8 r 有 下列3 种：i l 一1 8 r a 、i l _ 1 8 r 9 、i l - 1 8 b p 1 3 1il - 1 8 ra i l - 1 8 rq 为i l - 1 8 的主要结合亚基，属于i g 超家族成员i l - 1 8 r a 也称为i l - i r 相关蛋 白( i l - i r r p ) ，它和i 型i l - i r 高度同源，直接结合i l - 1 8 。h i l - 1 8 rq 与m l l 一1 8 ra 前体含 有5 4 1 a a 和5 3 7 b s 个蛋白质，具有6 5 a a 同源，信号肽1 8 a a ，成熟蛋白分别有5 2 3 a a 和5 1 9 a , a 。 胞质结构域有3 6 - 4 4 m 同源，胞外结构域有2 0 - 2 7 a a 同源，并含有3 个i g 结构域和6 个c y s i l - 1 8 r a 主要存在于t 、b 和髓样单核细胞来源的人白血病细胞系里。可由何杰金氏病细 胞系i a 2 8 产生大量的i l - 1 8 r a ，1 8 0 0 0 个结合部位细胞，分子量为6 0 - 1 0 0k d 。r n a 印迹 分析表明，i l - 1 8 r am r n a 产生于脾、胸腺、自细胞、肝、肺、小肠、大脑、前列腺和胎盘； 睾丸和卵巢弱产生i l 一1 8 ram r n a 绷。 1 3 2il - i8 rb i l - 1 8 rb 与i l - 1 r 辅助蛋白( i l - i r a c p ) 同源，故被称为i l - 1 r a c p 样受体( i l 1 r a c p l ) ， 它不直接结合i l - 1 8 ，但它和i l - 1 8 r a 形成复合物后可增加i l - 1 8 r a 与i l - 1 8 的亲和力，且 具信号转导作用，也属于i g 超家族成员。a c p l 为i l - 1 8 r 复合物的亚单位，为介导i l 一1 8 信号转导所必需，h i l - 1 8 rb 和m l l - 1 8 rb 即前体分别为6 0 0 a a 和6 1 4 a a 蛋白，有2 5 匏个同 源，信号肽有1 4 a a ，成熟蛋白分别为5 8 6 a a 和6 0 0 a a ，存在4 个糖基化部位嘲。 i l - 1 8rb 和i l - 1 8 r a 有相似的组织分布。h i l - 1 8 rbm r n a 能在外周血淋巴细胞、脾、肺 和n l 【细胞里产生，主要带型约为3 8k b ，次要带型约为2 6 k b 和8 0k b 胸腺、前列腺、 睾丸、卵巢、小肠、心脏、脑、肾和肌内都不能产生i l - 1 8b9 m r n a 啪 。 1 3 3i l _ 18 b p 1 4il _ 18 的信号转导 i l -