（植物学专业论文）大豆类受体蛋白激酶基因gmsark和gmrlck的功能和表达特异性研究.pdfVIP

摘要 我们前期研究中发现g m r l c k 基因在大豆的生长发育以及衰老过程中的始终都 保持稳定的高表达 本文利用生物信息学方法对g m r l c k 基因进一步进行了功能 预测和系统发生学分析 为了进一步研究这两个基因的表达调控特点 分析它们在大豆发育和响应 环境刺激等信号的传导路径中的功能 我们利用基因组d n a 步行技术分别克隆 了g m s a r k和g m r l c k 基因5 启动子序列 构建了启动子驱动的报告基因g u s 融合基因的双元表达载体 利用农杆菌介导的方法转化拟南芥和微型番茄 m i c r o t o m 在稳定遗传的转基因植物中 通过组织化学染色和g u s 荧光活性的 测定 分析g m s a r k 和g m r l c k 基因的启动子活性和表达调控模式 对g m s a r k g u s 转基因植物研究结果发现 g m s a r k g u s 可以在黑暗诱导 的转基因植物黄化苗中表达 在转基因m i c r o t o m 植株的主根中检测不到明显的 g u s 表达 但在侧根发生部位和抽生的侧根中有较高g u s 活性 在发育成熟茎 的维管束中 g m s a r k g u s 可以 在的韧皮部中高表达 在转基因 植物叶片发育 过程中 叶片中的g u s 活性随着叶龄的增加逐渐增强 并在衰老的叶片中保持 着较高水平的g u s 活性 进入生殖生长后 转基因m i c r o t o m 的警片中始终保持 较高水平的g u s 活性 随着花的开放 花器宫的逐渐成熟 柱头 雄蕊和花瓣 的边缘出现不同程度的g u s 染色 在转基因拟南芥的花茎 芬片和果荚中也有 较高的g u s 活性 在mi c r o t o m 果实发育过程中 幼果中检测到的g u s 活性较低 但在接近成熟的绿果中g m s a r k g u s 基因的表达水平很高 随着果实的成熟 g u s 的活性大幅度下降 至成熟红果降到最低 用不同激素处理后发现 i a a s a j a 可以显著促进转基因植物中g m s a r k g u s 的表达活性 g a 3 乙烯和b r 显著抑制g m s a r k 启动子活性 另外 6 b a 对g m s a r k g u s 的表达有显著的抑 制作用 与我们前期研究发现外源6 b a 延缓大豆叶片衰老过程中g m s a r k 表达 的结果相一致 a b a 对g m s a r k g u s 的表达没有明显的影响 伤害 黑暗 高 盐 干早 淹水等外界环境刺激都显著促进转基因植物中的g u s 活性 g m s a r k g u s 的表达在的 4 低温处理后明显降低 但3 7 高温胁迫对其影响不 大 对g m r l c k g u s 转基因植物的研究结果发现 g m r l c k g u s 在转基因 mi c r o t o m的幼苗在根 茎 叶片和花中都有表达 但与g m s a r k g u s 的表达 模式有很大差异 在叶片中g m r l c k g u s 的表达不随叶片的发育进程改变 表 现出组成型表达特点 这与前期的r t p c r 表达结果相一致 摘要 通过对基因功能和表达调控特点的分析 我们认为g m s a r k 可能作为植物 衰老信号传导过程的上游组分 感知或传递发育信号 植物激素和外界环境刺 激等信号 通过调节叶绿素降解代谢关键基因的表达参与大豆叶片衰老过程的 调控 g m s a r k 所介导的信号可能还参与了侧根以 及花和种子等生殖器官的发 育调控过程 g m p l c k 基因编码的胞质类受体激酶 在植物叶片发育过程中表现 出组成型表达特点 暗示其发育中可能参与了植物体某种重要的基础功能调节 过程 与g m s a r k 相比 两者可能有着不同的生理功能和调控路径 但是在植 物体发育的某些阶段 它们所参与的信号传递可能在一些组织或器官中有着相 似或着交叉重叠的路径 本课题的研究对揭示高等植物叶片衰老的分子机制和 生长发育过程中信号转导途径具有重要的理论意义 关键词 叶片衰老 类受体蛋白 激酶 表达特异性 启动子 报告基因g u s 大豆 微型番茄mi c r o t o m拟南芥菜 ab s tr a c t 一一 一 ab s t r a c t r e c e p t o r l i k e p r o t e in k i n a s e s r l k s h a v e b e e n f o u n d t o b e i n v o l v e d i n m a n y d e v e l o p m e n t a l a n d e n v i r o n m e n t a l s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s i n h i g h e r p l a n t s b y u s i n g r t p c r m e t h o d w e h a v e p r e v i o u s ly i s o l a t e d s e v e r a l p r o t e i n k i n a s e e n c o d i n g c d n a f r a g m e n t s fr o m s e n e s c e n t s o y b e a n l e a v e s t h e r a c e m e t h o d w a s u s e d t o o b t a i n t h e f u l l l e n g t h c d n a s o f t h e s e g e n e s a p r e l im i n a ry s t u d y r e v e a l e d t h a t t h e e x p re s s i o n o f o n e o f t h e m w h i c h t u rn s o u t t o e n c o d e a r l k w it h 9 l r r l e u c i n e r i c h r e p e a t u n i t s i n i t s r e c e p t o r d o m a i n w a s a s s o c i a t e d w i t h s o y b e a n l e a f s e n e s c e n c e t h i s g e n e w a s d e s i g n a t e d g m s a r k g ly c i n e m a x s e n e s c e n c e a s s o c i a t e d r e c e p t o r k i n a s e g e n b a n k n o a y 6 8 7 3 9 1 a n o t h e r o n e a l s o e n c o d e s a me m b r a n e s a s s o c i a t e d r l k b u t h a s n o o b v i o u s e x c e l l u l a r d o m a i n a n d b e l o n g s t o r l c k s u b f a m i l y t h u s d e s i g n a t e d g m a l c k g ly c i n e m a x r e c e p t o r li k e c y t o p l a s m i c k i n a s e g e n b a n k n o a y 6 8 7 3 9 0 t h e r n a i n t e r f e r e n c e r n a i m e d i a t e d k n o c k i n g d o w n o f g m s a r k d r a m a t i c a l l y re ta r d e d s o y b e a n l e a f s e n e s c e n c e a n d o v e r e x p r e s s i o n o f t h e g m s a r k g e n e g r e a t l y a c c e l e r a t e d t h e s e n e s c e n c e p r o g r e s s i o n o f c a mv 3 5 s g m s a r k t r a n s g e n i c p l a n t s t h e s e re s u l t s s t r o n g l y s u g g e s t e d t h e i n v o l v e m e n t o f t h i s l r r r l k i n re g u l a t i o n o f s o y b e a n l e a f s e n e s c e n c e m a y b e v i a r e g u l a t i n g c h l o r o p h y l l a c c u m u l a t i o n a h o m o l o g o f m a i z e l l s i l e t h a l l e a f s p o t 1 g e n e w h i c h h a s b e e n s u g g e s t e d t o e n c o d e a k e y e n z y m e c a t al y z i n g c h l o r o p h y l l b r e a k d o w n w a s i s o l a t e d fr o m s o y b e a n a n d n o m i n a t e d g m l l s i g e n b a n k n o d q 1 5 4 0 0 9 t h e e x p r e s s i o n o f g m l l s i w a s p o s i t i v e l y c o r r e l a t e d w it h t h e al t e r a t i o n o f g m s a r k m r n a l e v e l i n t h e g m s a r k r n a i a n d c a mv 3 5 s g m s a r k t r a n s g e n i c s o y b e a n l e a v e s f u rt h e r m o r e t h e n e c r o t i c l e s i o n p h e n o t y p e w h i c h f e a t u r e d t h e i ls l m u t a n t s w a s d e t e c t e d o n t h e g m s a r k r n a i t r a n s g e n i c s o y b e a n l e a v e s a l l t h e s e r e s u l t s s u g g e s t e d t h a t g m l l s i m a y b e a n o r th o l o g u e o f m a i z e l l s i a n d e n c o d e p h e i d e a o x y g e n a s e p a o i n s o y b e a n a n d g m s a r k m a y p a rt i c i p a t e i n t h e r e g u l a t i o n o f s o y b e a n l e a f s e n e s c e n c e v i a c o n t r o l l i n g e x p r e s s i o n o f g m l l s i d u r i n g c h l o r o p h y l l m e t a b o l i s m m u l t i p l e ab s t r a c t f u n c t i o n s o f g m s a r i iy b e s i d e s i t s re g u l a t i o n o f l e a f s e n e s c e n c e w e re a l s o d e t e c t e d a n d d i s c u s s e d q u it e d i ff e r e n t fr o m g m s a r k g m r l c k e x h i b i t e d a c o n s t i t u t i v e e x p r e s s i o n p a tt e rn d u r i n g s o y b e a n l e a f s e n e s c e n c e p r o c e s s t h e p o t e n t i a l fu n c t i o n s o f t h i s r l c k g e n e w e r e p r e d i c t e d b y u s i n g b i o in f o r m a t i c s a n d p h y l o g e n e t i c m e t h o d s p c r b a s e d g e n o m i c d n a w a l k i n g m e t h o d w a s u s e d t o c l o n e t h e 5 fl a n k i n g re g i o n s o f g m s a r k a n d g m r l c k g e n e s t h e p r o m o t e r s w e r e t h e n f u s e d w i t h g u s r e p o r t e r a n d i n t r o d u c e d i n t o a r a b i d o p s i s a n d o r m i c r o t o m t o p r o d u c e p r o m o t e r g u s t r a n s g e n i c p l a n t s re s p e c t i v e l y h i s t o c h e m i c a n d fl u o ro m e t r i c s t u d y o f t h e g m s a r k g u s t r a n s g e n i c p l a n t s r e v e a l e d g u s a c t i v i ty i n d a r k g e r m i n a t e d s e e d l i n g s a n a l y s i s o f l i g h t g r o w n tr a n s g e n i c m i c r o t o m s e e d l i n g s s u g g e s t e d t h a t g m s a r k g u s w a s h i g h l y e x p r e s s e d i n b r a n c h r o o t s b u t n o t i n t h e t a p r o o t s s tr o n g g m s a r k p r o m o t e r a c t i v i ty w a s a l s o f o u n d in p h l o e m a l o n g w i th th e i n c r e a s in g l e a f a g e t h e g m s a r k p r o m o t e r d e r iv e d g u s a c t i v i ty w a s u p r e g u l a t e d i n t h e g m s a r k g u s t r a n s g e n i c l e a v e s t h e p r o m o t e r a c t i v i ty w a s a l s o f o u n d i n t h e r e p r o d u c t i v e o r g a n s b e s i d e s i n t r a n s g e n i c s e p a l s t h e e x p r e s s i o n o f g m s a r k g u s i n t h e d e v e l o p i n g t r a n s g e n i c s t i g m a s s ta m e n s a n d p e ta l s w e r e a l s o d e t e c t e d g m s a r k g u s w a s a l s o h i 酗y e x p r e s s e d i n t r a n s g e n i c a r a b i d o p s i s fl o r e s c e n c e s t e m s s e p a l s a n d s i l i q u e s d u r i n g fr u i t s d e v e l o p m e n t t h e h i g h e s t g u s a c t i v i ty w a s d e t e c t e d i n t h e tr a n s g e n i c m i c r o t o m m a t u r e g r e e n fr u i t b u t i n r e d fr u i t t h e g u s a c t i v i ty d e c r e a s e d t o t h e l o w e s t l e v e l t h e g m s a r k g u s e x p r e s s i o n i n t r a n s g e n i c m i c r o t o m l e a v e s w a s u p r e g u l a t e d妙 e x o g e n o u s tr e a t m e n t s o f p l a n t h o r m o n e i a a s a a n d j a a n d w a s d o w n r e g u l a t e d b y 6 b a g a 3 b r a n d e th y l e n e t re a t m e n t s h o w e v e r a b a tr e a t m e n t h a d n o e ff e c t o n t h e p r o m o t e r a c t i v ity i n a d d i t i o n g m s a r k p r o m o t e r w a s f o u n d t o p o s i t i v e l y re s p o n d t o w o u n d i n g d a r k n e s s h i g h s a l t o s m o t i c s tr e s s a n d a n o x i c s tr e s s t h e d a r k n e s s i n d u c e d g m s a r k g u s e x p r e s s i o n c o u l d b e s u p p r e s s e d b y l o w t e m p e r a t u r e tr e a t m e n t b u t h i g h t e m p e r a t u r e tr e a t m e n t d i s p l a y e d n o o b v i o u s e ff e c t s o n t h e g u s a c t i v ity g u s a c ti v i ty a n a l y s i s r e v e a l e d h i g h e x p r e s s i o n o f g m p l c k g u s i n tr a n s g e n i c r o o t s s t e m s l e a v e s a n d f u l l y o p e n e d fl o w e r s d i ff e r e n t t o g m s a r k g u s d u r i n g ab s tra c t t r a n s g e n i c m i c r o t o m l e a f d e v e l o p m e n t p r o c e s s g m r l c k g u s k e p t re l a t i v e l y h i g h e x p r e s s i o n l e v e l a n d e x h i b i t e d a c o n s t i t u t i v e e x p r e s s i o n p a t t e rn i t i s t h e r e f o r e m o re l ik e ly t h a t g m s a r k m a y a c t a s a n u p s t r e a m c o m p o n e n t i n s e n e s c e n c e s i g n a l i n g p a t h w a y s i t m a y p e r c e i v e a n d o r t r a n s d u c e m u l t i p l e d e v e l o p m e n t a l h o r m o n al a n d e n v i r o n m e n t a l s i g n a l s a n d c o n t r o l l e a f s e n e s c e n c e p r o c e s s v i a r e g u l a t i n g c h l o r o p h y l l r o l e s in p l a n t s e x u a l r e p r o d u c t i o n m e t a b o l i s m g m s a r k m a y a l s o p l a y i m p o r ta n t b r a n c h r o o t s d e v e l o p m e n t w h i l e g m r l c k g e n e wh i c h e n c o d e s a c y t o p l a s m i c k i n a s e a n d e x h i b i t s e x p r e s s i o n p a t t e rn d u r i n g le a f d e v e l o p m e n t p r o c e s s m a y p a rt ic i p a t e s i g n a l p a t h w a y s d u r i n g s o y b e a n g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t p r o c e s s e s c o n s t i t u t i v e i n d i ffe r e n t k e y w o r d s l e a f s e n e s c e n c e r e c e p t o r l i k e p r o t e i n k i n a s e e x p r e s s i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o n p r o m o t e r r e p o r t e r g e n e g u s s o y b e a n m i c r o t o m a r a b i d o p s i s 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了 解南开大学关于收集 保存 使用学位论文的规定 同意如下各项内容 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版 并采用影印 缩印 扫描 数字化或其它手段保存论文 学校有权提供目 录检索以 及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务 学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版 在不以赢利为目 的的前 提下 学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动 学位论文作者签名 脉 而 寻 习 年 1 月3 9 日 经指导教师同意 本学位论文属于保密 在年解密后适用 本授权书 指导教师签名 学位论文作者签名 解 密 时间 年月日 内部 5 年 最长5 年 可少于5 年 秘密 1 0 年 最长1 0 年 可少于1 0 年 机密 2 0 年 最长2 0 年 可少于2 0 年 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师指导下 进行 研究工作所取得的成果 除文中己 经注明引用的内容外 本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的 已 公开发表或者没有公开发表的 作品的内容 对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体 均已在文中以明确方式标明 本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担 学位论文作者签名 奋 闪 年 1 1 月 3 日 第一章前言 第一章前 言 第一节植物的衰老 衰老 s e n e s c e n c e 是有机体发育的最后阶段 是导致死亡的一系列衰退 过程 它可以发生于行使不同功能的 不同 组织的发育过程p 1 近年来随着植 物分子生物学的进展 人们发现植物的衰老 死亡不仅仅是外界环境影响的 结果 而是一种程序性死亡或称编程死 亡 p r o g r a m m e d c e l l d e a t h p c d 过程 所谓程序性死亡是指 植物的死亡不是由于环境因子 如物理 化学和生物 等 直接作用的结果 而是植物通过感受外界信号 经过一定的信号传递途 径 激活与衰老相关的基因 再由这些基因的蛋白质使植物植株或器官发生 衰老死亡的过程 另一方面 衰老也是一种对环境的适应 衰老程序的启动 也被环境因子所诱导 叶片是高等植物进行光合作用主要器官 叶片的衰老进程直接影响到 整个植株生长发育 植物叶片衰老的研究是植物衰老研究的重要内容 也是 现代植物发育分子生物学的研究热点 1 1 1 调控植物衰老的因素 衰老是细胞 器官乃至整个植物体发育的最后阶段 是一个受到多种发 育和环境信号调控的程序化发育退化过程 遗传控制衰老是植物遗传控制的 受内外因子影响的 主动的细胞程 序性死亡过程 有其固有的调控元件和信号传导途径 衰老进程中 发生一 系列的细胞学和生物化学及分子生物学事件 2 3 1 现代植物分子生物学的发 展 尤其是对不衰老突变体的筛选和研究 更提供了特定基因表达控制衰老 的证据 目前人们在用植物绿叶和衰老叶片 m r n a构建 c d n a文库和一些 m i c r o a r r a y 数据的基础上 己 经分离 克隆到很多个与叶片衰老相关的基因 植物激素作用植物体内存在多种激素 内源激素含量及其平衡是调 控植物生长发育的重要因素 研究表明 植物正常衰老时 促进衰老的激素 会增加 而延缓衰老的激素会减少 用外源激素处理 可明显促进或延缓衰 老 己发现的五大类激素中 i a a c t k和g a可以延缓衰老 a b a和乙烯 第一章前言 可促进衰老 g a在衰老中的作用一般认为是起延缓衰老作用 但最近p a u l 等 0 1 1 9 9 9 发 现g a可以 启 动 大 麦 糊 粉层的p c d 这 样 看来g a可能 并 不 只 是延迟衰老 其详细作用有待于进一步研究 a b a在衰老中的作用目前也 存在争议 l e s h e m等认为 a b a是一种抵御胁迫和衰老的 激素 k e l l y和 d a v i e s 1 9 8 8 却认为a b a是 仅次于乙 烯的 衰老促进剂 目 前仍难断定 a b a在衰老中的确切作用 它的作用只能同其它激素一起讨论 营养竞争关于衰老的早期理论认为由 于生殖器官是竞争力很强的 库 使植物体内同化物再分配 大量养分从营养器官运入生殖器官被再 利用 致使营养器官衰老 单次开花植物在开花结实后 通常导致叶片等营 养体衰老 死亡 如一年生的大豆去花或物理限制豆英的生长 可一定程度 延迟叶片和整株植物的衰老 其叶片衰老表现出典型的营养相关控制 6 7 1 但这不足以解释衰老的所有现象 叶片作为植物的营养器官与植株个体生殖 生长有着重要的关系 此外 同株植物上不同叶位和 或叶龄的叶片发育也 存在所谓的 库 与 源 的相关性 衰老的叶片作为多种营养物质的 源 而刚开始发育的新生叶则成为这些物质的 库 在叶片衰老的衰退阶段 碳水化合物等成分就从 源 流向 库 活性氧伤害植物体在正常代谢过程中可通过多种途径产生影响衰老 的自 由 基如 轻自 由 基 o h 烃氧基 r 0 超氧 化物阴 离子自 由 基 0 2 超氧 物自 由 基 1 1 0 2 r o o 单 线 态氧 o z 等 统 称为活 性氧 它们对植 物产生氧化伤害 包括促使重要的酶降解 如 1 5 一 二磷酸核酮糖狡化酶 加 氧酶 r u b i s c o 等 诱导脂质过氧化反应 而影响膜的结构和功能 加速乙烯 的生成而促进衰老 大多数活性氧对细胞的伤害研究主要集中在活性氧所引 发的膜脂过氧化方面 膜脂过氧化即非脂性自由基对类脂中不饱和脂肪酸引 起的一系列自由基反应 一般被认为是活性氧对细胞膜系统伤害的原初机 理 许多研究指出膜脂过氧化是引起衰老的一个直接而重要的原因 在植物 体内 存在自 由基清除剂 如超氧物歧化酶 s o d 过氧化氢酶 c a t 过氧 化物酶 p o d v e v c 和谷肤甘肤等 正常情况下 这些自由 基清除剂随时 清除所产生的自由基 一旦植物体内抵御氧化伤害的机制效率下降 或产生 活性氧的能力增加 二者失去平衡 自由 基积累 就会加速衰老1 8 1 1 1 2 植物的叶片衰老 第一章前言 高等植物的叶片是进行光合作用的主要器官 其衰老进程直接影响到整 个植株生长发育 植物叶片 衰老的 研究是植物衰老研究的 重要内 容 叶片衰 老是植物叶片发育的最后阶段 是一种受遗传和外界因子 如高温和干早等 逆境 日照长短 激素 病害等 影响的高度有序的程序化过程 在植物发 育到一定阶段 叶片的衰老在内部发育信号和外部因子的综合作用下启动 老的叶片光合作用功能下降进入衰老程序 将物质运出 被新生的器官再利 一用 并最终走向死亡 从结构上 衰老的叶片细胞出现最早而且非常明显的变化就是含叶片蛋 白7 0 以上的细胞器即叶绿体的崩溃 从代谢上 叶片的碳同化作用 光合 作用 被取而代之为叶绿素及蛋白质 膜磷脂 核酸等大分子的分解代谢以 达到营养物的再分配利用 分子遗传学的分析进一步表明 叶片衰老是植物 生存所必需的 由很多生理变化和分子事件组成的 受多种因素影响和控制 的植物发育进程 1 1 2 1 植物叶片衰老的进程 叶片衰老有它固有的发育模式 根据叶片衰老进程的特点 n o o d d n等 人把叶片衰老进程分为三个主要的阶段即 起始 i n it i a t i o n 衰退 d e g e n e r a t i o n 和 终 止 t e r m i n a l 阶 段 9 1 在起始阶段 糖类作为光合作用的重要产物在衰老的诱导过程中起着重 要的作用 最早发现 糖浓度降低诱发了衰老程序的启动 1 0 随后的生理 学和遗传学分析进一步发现 糖浓度的提高也可以诱导叶片衰老 如在烟草 叶片中 糖的积累诱导了 衰老 0 一 3 1 在拟南芥和其他一些物种中 也观察到这 种现象 1 0 1 4 1 通过转基因方法研究表明 在转基因番茄和拟南芥中过表达己 糖 激酶 h x k 可以 加 速植株 衰 老 1 1 5 1 而 在拟 南芥中 反 义 抑制 h x k 或者 在 h x k 的突变体中则出现延缓衰老的表现型1 1 6 1 7 1 叶片衰老过程中糖的水平也受其他因子比如氮的浓度 光照条件和发育 阶 段的 影响 19 1 o r e 4 o r e s a r a 4 编码 一个 质体 核 糖体小 亚 基蛋白 它的 突 变 会导致光合作用能力的下降 在拟南芥 o r e 4突变体中表现出年龄依赖的衰 老被延迟 光系统i 的活性比 野生型要低 叶子的鲜重只有野生型的7 5 1 1 6 1 而反义抑制r u b i s c o 表达的转基因烟草中有相似的表现型 1 9 这种通过降低 代谢速率或者降低碳水化合物的产量能延缓植物衰老 与著名的线虫限食理 第一章前言 压 论 可 能 片 相 似 之 处 2 01 关 于 叶 片 衰 老 如 何 被 启 动 诱 导 并 进 行 一 系 列 的 衰 退甚至死亡过程还远未研究清楚 这需要大量的实验来进一步证明 叶片衰老的程序一旦被启动 就进入了 衰退阶段 细胞组分开始降解营 养物质被重新利用 叶片的叶绿体成分 叶绿素 蛋白质 类囊体膜 尤其 是r u b p 狡化酶也出 现不同 程度下降 各 种蛋白 降 解系统也被激活 3 2 1 2 2 1 其中 泛素蛋白降解系统在这一衰退过程中发挥了重要的作用 泛素基因的 表达加强 与之 祸联的 各种酶活性增强 e2 3 1 o r e s 编码 个f b o x 蛋白 是 s k p l c u l l i n c d c 5 3 f b o x s c f 蛋白 复 合体的 一个组分 1 盆 8 s c f 是泛素 蛋白降 解系统中的 泛素连接酶 e 3 复合物 研究发现 在拟南芥o r e 9 突变体 中 年龄依赖的衰老以及暗诱导和激素诱导的衰老都被延迟 暗示着o r e 9 可能 通 过 介 入蛋白 的降 解 调 控 叶 片 衰老 d 1s l d e l a y e d l e a f s e n e s c e n c e l 是 拟南芥的 一个衰 老延迟型突变 体 2 0 l d ls l 突变 体缺失了a t a t e i 基因的功能 该基因编码了一个精氨酸转移酶 是蛋白降解通路的一个重要组分 可以把 精氨酸转移到谷氨酸和天冬氨酸结尾的蛋白 末端 靶定位这些基因 进行泛 素依赖的蛋白降解 这也进一步说明 泛素依赖的蛋白降解系统在叶片衰老 中可能起重要作用 另外 脂类的降解也促进了衰老 研究发现磷酸酷酶介 入了 激素 诱导的叶片衰老中 2 5 1 拟南芥s a g i 0 1 基因 编码一个酞基水解酶 可以水解甘油酷释放油酸 该基因在衰老的早期阶段被诱导表达 一直持续 到衰老的晚期 反义抑制该基因延缓衰老 而过表达该基因则促进了衰老 2 6 1 经过一系列衰退与降解事件 叶片开始由绿变黄 当完全变黄时 就进 入了叶片衰老的终止阶段一细胞死亡 在这一阶段 可以检测到凋亡的显著 特征 例如染色质 浓缩和d n a片段 化等等 19 1 暗示了叶 片衰老中 存在类似凋 亡的细胞死亡过程 1 1 2 2 植物叶片衰老过程中的变化 植物叶片衰老是一种器官水平上的程序化死亡过程 p r o g r a m m e d d e a t h 2 7 2 8 1 包括了 大量 有 序 事 件的 发生 如在 亚 细 胞结 构 上的 叶 绿体 和其 它细胞器的有序衰退 代谢水平上的细胞内大分子的降解 动员 基因水平 上的一系列与衰老相关基因的激活和表达 最终保证叶片内养份被最大程度 的高效利用 第一章前言 1 细胞水平的变化在衰老的过程中 器官及组织中细胞的结构逐渐解 体 例如 植物叶片衰老所表现出的叶绿体完整性丧失 可以观察到叶绿体 肿胀 嗜锹颗粒数增加 生物脂膜相变 外被膜的结构变化和逐渐脱落 基 粒数减少 间质类囊体经囊泡化作用而失去其完整性 基粒类囊体肿胀 进 一步的发生分子重排 这种形态学上的改变正好反映了位于间质和基粒类囊 体的p s i p h o t o s y n t h e s i s s y s t e m i 活性的 下降 比 主要位于基粒类囊体的 p s i i p h o t o s y n t h e s i s s y s t e m i i 的 活 性下降 要 早 2 9 3 2 1 事 实 上叶 绿素的 损失 伴随叶绿体的破坏和光合电子传递能力下降 常用来作为衰老的指标 而后 核糖体和粗糙内质网急剧减少 失去蛋白 质合成能力 随着组织的衰老 内 质网膨胀 功能减退 线粒体是较为稳定的细胞器之一 到衰老后期 线粒 体峭扭曲至消失 最后液泡膜溶解 其中的各种水解酶散布到整个细胞中 同时细胞质的p h质降低 酸性介质的水解酶活跃 消化所有的细胞器 包 括细胞核解体 在某些组织细胞中 可看到核质穿壁现象 最后膜完全破坏 细胞自溶解体 2 生理生化变化在衰老叶片组织细胞中 发生了一系列生理生化变 化 最明显的标志是叶片失去绿色而呈现出红色 褐色或金黄色 也就是叶 绿素降解 光合作用迅速下降 呼吸作用较平稳 但叶片变黄时 出现类似 果实的呼吸跃变现象 常出现抗佩呼吸 细胞膜过氧化作用加强 核酸总量 下降 r n a含量下降 r n a含量在某些植物叶片的衰老后期又略有增加 细胞内蛋白质分解大于合成 可溶性氮有所增加 氨基酸不再被继续用来合 成蛋白质 而是从衰老的叶片中被运输到新生器官 如发育的种子中 大部 分有机物和矿质元素向外撤退 转运到幼嫩的叶片被再度利用 3 3 1 3 衰老相关基因表达变化植物衰老是遗传程序控制的主动发育进程 在叶片衰老过程中有许多基因的表达水平发生变化 其中仅在衰老特定发育 阶 段 表 达的 基 因 称为 衰 老 特 异 基因 s e n e s c e n c e s p e c i f i c g e n e s s s g s 衰 老 特 异基因根据在功能器官中表达的调控模式分为衰老上调基因 u p r e g u l a t e d 和衰老下调基因 d o w n r e g u l a t e d 叶片中多数r n a水平显著下降 如编码 与光合作用有关的多数蛋白质基因 其表达随叶片衰老而急剧下降 这些降 低表达的基因称衰老下调基因 另一类基因是被衰老诱导表达的基因 称衰 老相关基因 s e n e s c e n c e a s s o c i a t e d g e n e s a g 或者说其表达是衰老上调的 u p r e g u l a t e d 所以在叶片衰老过程中也有新蛋白质的合成 许多酶活性增 第一章前言 加 包括降解生物大分子的酶 如核搪核酸酶 蛋白酶 脂酶 叶绿素酶 纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶等 这些酶的活跃使细胞从以合成代谢为主转 向降解代谢 尤其是催化乙 烯生物合成的a c c合成酶和a c c氧化酶基因的 表达 产生大量乙烯 还有参与降解物转化与再分配的谷氨酞胺合成酶等 2 3 3 4 3 5 1 另外 还 包括转移 营养功能的 基因 如 谷氨酸 胺合成酶 基因 g l u t a m i n e s y n t h e t a s e g e n e s g 习 3 6 1 等 对 衰 老 延 缓的 突 变 体 筛 选 和 研 究 更 提 供了 特 定 基因表达控制衰老的证据 1 3 植物叶片衰老的分子遗传学研究 叶片衰老是受到严格调控过程 包括一系列严格有序的细胞生理 生化 和基因表达水平上的变化 因此 衰老过程的分子遗传分析对于我们更好的 理解这一过程是十分必要的 以往人们对叶片衰老的形态 结构 生理生化 等方面进行了广泛深入的研究 取得了不少成就 但在分子水平上对叶片衰 老的本质 调控了解仍较少 近几年通过分子和遗传学方法 模式植物拟南芥中一些遗传突变体和可 能的衰老调节组分相继被鉴定 并利用m i c r o a r r a y 技术对叶片衰老过程中基 因表达变化进行了全面分析 这对于我们从分子遗传学角度更好的理解衰老 这一复杂的现象及其调解机制将有很大帮助 1 1 3 1 叶片衰 老相关 基因 s e n e s c e n c e a s s o c i a t e d g e n e s a g 所谓衰老相关基因一般是指叶片自 然衰老过程中表达量增加的基因 3 7 1 研究表明 叶片 衰老是 一个主动的 受特定基因调 控的 过程 有许多基 因的表达水平发生变化 大多数基因在衰老过程中受到抑制而表达水平逐渐 降低直至完全不表达 而参与衰老过程的基因呈现衰老上调 3 8 3 9 1 这些衰 老相关基因主要包括参与转录和代谢调节 生物大分子 蛋白 质 核酸 脂 类等 降解 氮碳等营养元素再动员以及防御反应相关基因等 b u c h a n a n w o l l a s t o n 等 2 1 利 用m i c r o a r r a y 分 析 拟 南 芥 衰 老 过 程 中 基 因 表 达 变 化 并把获得的8 2 7 个衰老上调基因从功能上进行了分类 图 1 1 1 2 3 1 1 调节基因 叶片衰老过程中 基因的表达模式和新陈代谢功能发生显著的改变 这 可以从一些相关的调节因子表达丰度的大大增加得到很好的反映 第一章前言 x a 2 1 19 4 1 1 4 1 等一些r l k基因 功能的 研究已 经比 较深 入 一些r l k的 上 下 游组分相继被鉴定 以及对某些 r l k的基因表达模式和生物化学分析等 也都为r l k功能研究提供了一些更为详细的资料 研究结果表明r l k广泛 参与了植物生长发育调控 激素信号感知 自交不亲和 抗病以及环境刺激 应答反应等多种信号传导过程 在植物生命活动中发挥着重要的生物学功 能 7 7 1 1 5 1 植物r l k按功能可以 划分为两大类 一类参与调控植物的生长发 育 另一类参与植物一 微生物的互作和抗逆性反应 1 2 2 1 调节生长和发育 植物发育是通过感知外界的发育信号来启动相应的内源发育相关的基 因 植物类受体激酶庞大的数量和结构的多样性决定了其必然广泛的参与植 物发育信号的感知和传导 许多参与的植物发育调控的r l k已 经被鉴定出来 其中对拟南芥c l v i 的研究较为深入 拟南芥有一类突变体c l a v a t a 其茎