（环境科学专业论文）关键环境因子对利玛原甲藻的生长和产毒的影响研究.pdf

a b s t r a c t d i a r r h e t i cs h e l l n s hp o i s o n d s p i sag r o u po fi m p o n a mm a r i n eb i o t o x i n sp r o d u c e db y h a r m 龟l 甜g a e d u et ot h ep o t e n t i a li m p a c t so fd s pt o x i n so ns e a f o o ds a f e t ra n dh u m a i lh e a l t h d s ps t u d i e s 撇c tm u c ha t t e n t i o n 疔o mr e s e a r c h e r s p a n i c u l a r l yo nt h em e c h a n i s mo fd s pt o x i n p r o d u c t i o n m 脱p z 护堋z 加口c a np r o d u c ed s pt o x i l l s a n dc a nb ec u l t u r e di nm el a b s oi t b e c o m e st h em o s ti m p o r t a n t0 唱a n i s mf o rt h es t u d y0 fd s pt o x i np r o d u c t i o n 1 no r d e rt o 丘n do u t t h ee 虢c t so fk e ye n v i r o n m e n t a lf a c t o r so nt h eg r o w t ha n dt o x i np r o d u c t i o no f 尸 砌口t oo p t i m i z e t h ec u l t u r ec o n d i t i o n s 嬲w e l l 舾c o l l e c t i n ge n o u g h 尸 妇竹口c e l l sf o rt h ep 嘶f i c a t i o no fd s pt o x i n s w es t u d i e d c h a r a m e r i s t i c so f 尸z 切加o nt h eg r o w t ha n dt o x i np r o d u c t i o nu n d e rd i f f e r e n t c o n d i t i o n d so fl i g h ti n t e n s i 以t e m p e 咖r e s a l i n i 劬n u t r i e m 锄dd i s t u r b a n c e t h er e s u l to ft h em u l t i f a c t o re x p e n m e n to nt h el 谵h t t e m p e r a t u r e 孕1 1 ds a l i n i t s h o w e dt h a tt h e s a l i n i 妙h a ds i 印i f i c a n ti n f l u e n c eo nm eg r o w c ho f 尸 d 厂d c p z 护删砌z 口 w h i l et e m p e r a t u r ea n dl i 曲t i n t e n s 时h a dn os i g n i f i c a n te 毹c t s w h e nt l l es a l i n 时i s2 8 t h eg r o 叭hr a t ei su pt ot h em a i m u m i nt 1 1 ee x p e r i m e n tt os t u d ym ee 仃e c t so fn p 瞰i o n i 仃o g e nt op h o s p h o r u s 0 nt h eg r o w t ho fp 胁 口 i tw 鹤f o u n dt h a tt h ec e l ld e n s i t yo fp 胁行口a tt h es t a t i o n a 叫s t a g er e a c h e dt h em a x i m u m 0 h e nn l en pr a t i ow a sb e m e e n1 2 锄d1 6 h o w e v e r t h en pr a t i oh a dl i t t l ee f i 宅c to nt h e 铲o w t h 豫t eo f p 锄口 g r o u p sa t 廿l ee x 仃e m tn pr a t i oc o n d t i o n s i nw h i c h 户砌口c e l l sw e r eu n d e n u t r i e n tl i m i t a t i o no fe i t h e rno r 只h a de l e v a t e dd s pt o x i nc o n t e n ti nt h ec e l l s t h r o u 曲也e c o m p a r a t i v es t u d i e so nt h e 伊o w t ha n dt 0 x i np r o d u c t i o n p r o p e n i e su n d e rt h e c o n d t i o n s o f d i s t u r b a c ea n ds t a t i cc o n d i t i o n w ef o u n dt h a t 只z i m 口h a dah i 曲e r 酽o w t hr a t eu n d e rt h e d i s t u r b 肌c ec o n d i t i o n a n dt h et i m en e e d e df o rt h ea l g a et oe n t e r l o g a r i t h m i cs t a g ea n ds t a t i o n a d s t a g ew 弱m u c h l e s st h a nt h a tc u l t u r e du n d e rt h es t a t i cc o n d i t i o n nw a sa l s of o u n dt h a tt h ec e l l u l a r t o x i nc o n t e mo ft h e 尸胁 口c e l l sc u l t u r e du n d e rd i s t b a n c ec o n d i t i o nw a sm u c hh i 曲e rt h a tt h a t c u l t i r e du n d e rt h es t a cc o n d i t i o n i ns u m m a r y w ec a l ls e et h a te n v i r o n m e n t a lf a c t o r sh a v es i g n i f i c a n ti n n u e n c eo nt 1 1 e 伊o w t ha n d t o x i np r o d u o no f 尸胁挖口 u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n so fs a l i n i t l i g h t 锄dt e m p e m r e t o c u l t u r et h e 尸 砌口c e l l su n d e rt h en u t r i e n tl i m i t a t i o nc o n d i t i o nb yd i s t u r b a n c e w o u l db eb e n e n c i a l f o rt h ep r o d u c t i o no fd s pt o x i n s t h e s er e s u l t s p r 0 0 i d et e c h n i q u e sa n dm e t h o d sf o rt h e o p t i m i 铆i o no ft h ec u l t u r ec o n d i t i o n sf o rp 胁以口a n do b t a i nm o r ep m 矽c p z 伊姗zz 砌口c e i l s a n d p r o v i d ef u n d a n l e n t a l 1 a t af o rt h e 如r t h e ra n a l y s i so fd s pt o x i np r o d u c t i o nm e c h a n i s mi n 户励卵口 k e y p 阳阳c p z 矿z 册砌獬 d i a r r h e t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g 伊 叭h t o x i np r o d u c t i o n 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含未获得 注 如遗直墓丝盂薹挂别直明的 奎拦亘窒 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意 学位论文作者虢符在签字胁彤年 月匆日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用 影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到 中国学位论文全文数据库 并通过网络向社会公 众提供信息服务 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位敝作者硌詹瘩 翩野气秣 关键环境冈子对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究 0 前言 赤潮 r e dt i d e 也称红潮 是指一些海洋微藻 原生动物或细菌在水体中过 度繁殖或聚集而引起水体变色的一种生态异常现象 藻华 a l g a lb l o o m 有时称 水华或藻花 是指水体中藻类大量繁殖的一种现象 习惯上将水体中藻类繁殖 聚集达到一定密度后的藻华称作赤潮 有相当一部分赤潮 藻华是无害的 但是 随着人类活动对近海环境影响的日益加剧 能够产生毒素和其它危害效应的赤潮 藻华近年来频频爆发 对社会经济发展和人类健康构成了巨大的威胁 这一类 赤潮 藻华通常被称为有害赤潮 h 黝如lm g a lb l o o m s n t2 l 作为一种海洋灾害 有害赤潮会给人类社会和海洋生态带来严重的损害口 3 1 使有害赤潮研究成为国 际社会共同关注的涉及全球变化的海洋环境科学研究重要领域之一h 1 有害赤潮的危害之一就是可以产生毒素 进而对生物生存和人类健康与经济 发展造成巨大的潜在的危害 腹泻性贝毒是赤潮藻毒素中危害比较大 分布比较 广的一种毒素 其成分0 a 和d t x 毒素能够诱导蛋白质的超磷酸化 不仅会使 中毒患者出现腹泻等症状 而且会诱导细胞凋亡 同时o a 具有促进肿瘤形成的 长期毒性效应 对水产品造成很大的损失 因此受到广大研究学者的关注 而其 产生机制更是研究中的重点 利玛原甲藻因是研究腹泻性贝毒的主要和基础材 料 故对其展开研究是十分有必要的 为进一步研究腹泻性贝毒奠定基础 关键环境因子对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究 1 文献综述 1 1 赤潮形成的原因与危害 1 1 1 赤潮形成的原因 赤潮是一种复杂的生态现象 赤潮爆发是由许多因素 包括物理因子 化学 因子和生物因子的综合作用引起的 人类活动和气候变化对于赤潮的发生也有影 响 不同类型 不同海域的赤潮爆发机制有明显差别 但是 大部分赤潮的爆发 与以下几种因素有密切关联乜 纠1 1 1 赤潮生物的存在及其快速增殖 目前 全球发现有3 0 0 多种浮游生物可 以引发赤潮 并且有逐渐增加的趋势 已发现的赤潮生物包括蓝藻门 硅藻门 甲藻门和金藻门中的藻类 其中硅藻门和甲藻门中的藻类居多 我国沿海海域分 布有1 4 8 种赤潮生物 其中4 3 种曾引发赤潮呻3 在这些赤潮生物的分布区域 如果环境条件适合 藻类增殖到一定密度就会导致赤潮的爆发 2 适合赤潮形成的环境条件 这包括化学 物理和气象等不同因素 化学 因素主要是指赤潮生物生长所必须的营养盐 海水中的营养盐是浮游植物生长的 基础 因此 水体中的营养盐为赤潮爆发提供了重要的物质基础 是赤潮形成的 首要条件 由于城市工业废水和生活污水大量排入海中 同时 近海养殖业向水 体中添加大量的饵料 使水体中营养物质浓度上升 结构改变 引起海域富营养 化 促进赤潮生物的大量繁殖 物理因素主要是包括温度 盐度和水文条件等有 可能影响赤潮藻类生长 繁殖和分布的因素 赤潮生物的增殖需要适宜的温盐环 境 即存在适应其生理需要的温度 盐度生态幅 因而不同的温度和盐度条件下 发生赤潮的生物种类也存在差异 影响赤潮的水文因素包括浪 潮 流 锋面及 水体稳定性等方面的物理海洋因子 其影响赤潮的实质是流动水体将赤潮生物孢 囊 营养细胞或其赖以生长繁殖的营养物质基础带入特定海域 亦或改变该海域 的温度 盐度 影响海水层化和透光度 从而为赤潮的形成提供了合适的水体理 化条件 气象因素主要包括降雨 风向 风速 光照 气温和气压等 以往研究 发现一些赤潮容易在闷热 风平浪静的夏季出现 降水后营养盐浓度和盐度的改 变也会诱导一些赤潮的发生 2 关键环境因子对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究 3 海水养殖等人类活动的影响 在一些海域 水产养殖产生的自身污染是 诱发赤潮的原因之一 随着全国沿海养殖业的大发展 尤其是对虾养殖业的蓬勃 发展 养殖业自身污染问题日渐突出 在对虾养殖中 人工投喂大量配合饲料和 鲜活饵料 由于养殖技术陈旧和不完善 往往造成投饵量偏大 池内残存饵料增 多 严重污染了养殖水质 另 方面 由于虾池需要定期换水 因此 会有大量 污水排入海中 这些带有大量残饵 粪便的水中含有氨氮 尿素 尿酸及其它形 式的含氮化合物 加快了海水的富营养化 从而为赤潮生物提供了适宜的生物环 境 使其增殖加快 诱发赤潮 1 1 2 赤潮的危害 赤潮主要发生在近海海域 面积可达几百至上万平方公里 波及的海水深度 可达数十米 赤潮形成后 对海洋生态系统和水产养殖会带来巨大的破坏 其主 要危害方式包括 赤潮生物分泌粘液 粘附于鱼类等海洋动物的鳃上 妨碍 其呼吸 导致窒息死亡 赤潮生物分泌有害物质 如氨 硫化氢等 会造成 海水p h 值升高 粘稠度增大 改变浮游生物的生态系统群落结构 赤潮生物 分解大量消耗氧气 并产生硫化氢和甲烷等 导致使生物缺氧或中毒致死 赤 潮生物吸收阳光 遮蔽海面 使其它海洋生物因得不到充足的阳光而死亡赤潮生 物一般密集于表层几十厘米以内 使阳光难于透过表层 水下生物因得不到充足 阳光而影响其生存和繁殖 赤潮生物产生毒素 这些毒素直接毒死生物或者 随食物链转移进入人体 引起人类中毒 损害人类的健康甚至导致死亡 据统计 全世界因赤潮毒素的贝类中毒事件约3 0 0 多起 死亡3 0 0 多人n4 1 因此 海洋赤潮 的发生不但对海洋沿岸的水产养殖以及人类健康都有直接的危害 对海洋生态系 统也有巨大的危害瞳 们 1 2 赤潮藻毒素 赤潮藻毒素是由有害赤潮藻类产生的一类生物活性物质的总称 通常认为是 由藻类产生 但也有证据表明藻类所附着或共生的海洋细菌也能产生同样的毒 素 在海洋浮游微藻中 有3 3 0 多种能形成赤潮 根据s o a m en 韧在1 9 9 5 年的统计 其中能够产生毒素的藻约有6 0 7 8 种 约占海洋中微藻种类总数的1 8 1 9 这 关键环境因子对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究 一数目随着人类对有毒藻认识的增长还在不断增加 目前已发现约有8 0 多种微藻 能产生毒素 其中甲藻最多 占6 5 7 3 n5 1 6 1 由于人们开始时不了解毒素的真正 来源 往往根据引起人类中毒的海洋生物称它们为贝毒或鱼毒而不是赤潮藻毒素 1 7 赤潮藻毒素具有毒性高 作用快 防治困难等特点 不同毒素结构差别也很 大 既有复杂的多 聚 醚类化合物 也有简单的氨基酸类化合物 根据毒素对人 类的危害机制和毒素主要存在的有毒生物类型 即p s o 锄e sm r a c i 法 主要包括 麻痹性贝毒等六种毒素 1 麻痹性贝毒 p a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o l l i n g p s p p s p 是目前为止几种主 要藻毒素中分布最广 危害最大的毒素 p s p 是一类四氢嘌呤的衍生物 现在己 经发现的此类毒素有3 0 多种 根据同一取代基位置上基团的不同可分为4 类 氨基甲酸酯类毒素 c a r b 锄a t et o x i n s 包括石房蛤毒素 s t x 新石房蛤毒素 n e o s t x 和膝沟藻毒素1 4 g t x l 4 n 一磺酞氨甲酰基类毒素 n s u l f o c a r b 锄o y l t o x i n s 包g t x 5 b 1 g t x 6 b 2 c 1 4 脱氨甲酰基类毒 素 d e c a r b a m o y lt o x i n s 包括d o s t x d e n e o s t x d e g t x l 4 脱氧脱氨甲酰基 类毒素 d e o x y d e c a r b a m o y l t o x i n s 包括d o s 似 d o g t x 2 和d o g 3n 引 p s p 呈碱 性 水溶性高 可溶于甲醇和乙醇 产生p s p 的藻种主要有甲藻中亚历山大藻属 裸甲藻属中的一些种 淡水蓝 藻中的一些种类也能产生p s p 我国已发现能产生p s p 的藻种有塔玛亚历山大藻 以z 蹦d z 咖i 聊f a m a r e 凇e 链状亚历山大藻 c a f e 聆e z 蛐 微小亚历山大藻 0 聊觑 胁所 等n 引 麻痹性贝毒中毒主要症状表现为面部 肢端麻木 严重的会 因呼吸肌麻痹而导致死亡 麻痹性贝毒的活性成分石房蛤毒素及其衍生物在作用 机制上与河豚毒素类似 都是通过选择性阻断电压门控n a 十通道 使神经及肌肉 细胞n a 内流导致动作电位无法形成n6 2 0 1 2 腹泻性贝毒 d i a n h e t i cs h e l l f i s hp o i s o i l i n g d s p 在2 0 世纪7 0 年代 y a s 啪o t o 将这类由鳍藻引起的中毒事件称为腹泻性贝毒乜 腹泻性贝毒毒素的 主要来源于甲藻中的鳍藻属和原甲藻属n 们 目前发现有十多种 研究发现 在日 本 倒卵形鳍藻是产生d s p 的主要藻种 在欧洲 渐尖鳍藻及具尾鳍藻 d f 船印枷括 4 关键环境冈了对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究 阳 如幻 则是主要的产毒藻种乜2 2 3 l 在我国 黄海 东海和南海发现都曾发现倒 卵形鳍藻 渐尖鳍藻和具尾鳍藻等潜在有毒藻种 腹泻性贝毒主要分为3 大类 大 田软海绵酸 o k a d a i ca c i d o a 及其衍生物鳍藻毒素 d i n o p h y s i s t o x i n s d t x 等酸 性毒素成分 大环内酯类毒素等中性成分 p a l y t o x i n p t x 以及磺化毒素 y e s s o t o x i n y t x 等带有磺酸基团的毒素成分 人食用d s p 毒素污染的海产品后 可引起多种不适反应 包括腹泻 腹痛 恶心 呕吐等 但目前尚无人类死亡的 报道出现 另外 大田软海绵酸等d s p 毒素成分是肿瘤促进剂 其长期毒性效应 值得关注 3 记忆缺失性贝毒 加n n e s i as h e l l f i s hp o i s o m n g a s p 此类毒素发现的比 较迟妇引 中毒者会出现肠道症状和神经紊乱 严重的会有短暂的记忆丧失现象 事后研究表明 引起a s p 的活性成分是软骨藻酸 d o m o i ca c i d d a 它是一种强 烈的神经毒性非蛋白氨基酸 一种先前在红藻中分离得到的氨基酸类物质 能够 产生软骨藻酸的硅藻主要是p s e u d o i l i t z s c l l i a 属中的一些种类 软骨藻酸与它的生 化类似物红藻氨酸 谷氨酸等都是热稳定化学物作用于中枢神经系统相同受体位 点 能导致短期记忆功能长久损害乜引 a s p 中毒会引起胃肠失调和神经错乱 胃 肠炎 常常在误食a s p 之后的2 4 h 内快速发作 症状包括恶心 呕吐 腹泻 严重 的会出现神经错乱 定向力障碍 短期记忆丧失 呼吸困难 麻木等 4 神经性贝毒 n e u r o t o x i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g n s p n s p 是目前为止危害 范围较小的一类毒素 主要分布在美国墨西哥湾地区 主要成分为短裸甲藻毒素 b r e v e t o x i n s 而短裸甲藻 g y m 聆d 旃 z f 聊6 p v p 是目前为止已知唯一能产生n s p 的赤潮生物瞳6 神经性贝毒可以作用于细胞膜上的钠通道使之关闭 抑制动作电 位的产生 使乙酞胆碱不能释放 从而导致神经麻痹瞳 引起n s p 中毒的途径有两 条 一是经贝类传递 进入人体 进而人食用后表现出神经中毒的症状 另外当 短裸甲藻赤潮发生时 波浪运动形成的有毒气溶胶可能进入人的呼吸系统引起类 似气喘的症状 除对人类的影响之外 短裸甲藻毒素还导致了大量的鱼类死亡事 件 5 西加鱼毒 c i g u a t e r af i s hp o i s o n i n g c f p 它通常是由生活在热带地区的 甲藻产生的毒素 被热带或亚热带食草性鱼类蓄积并在鱼体内被氧化成的一类强 5 关键环境因子对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究 毒性毒素 通常认为西加鱼毒素和赤潮的关系并不密切 常见的西加鱼毒素包括 西加毒素 c i g u a t o x i n c t x 刺尾鱼毒素 m a i t o t o x i n m t x 鹦嘴鱼毒素 s c a r i t o x i n c t x 为脂溶性物质 可以打开细胞膜上电压依赖性钠通道 引起细 胞膜去极化乜8 西加鱼毒素中毒的症状包括温度感觉逆转 腹泻 呕吐 呼吸异 常 神经功能失调等 中毒严重者会发生休克 痉挛等 该毒素中毒最具特点的 症状是被称为 干冰感觉 的热感颠倒 即当触摸热的东西时会感觉凉 将手放 入水中时会有触电或摸干冰的感觉乜9 1 6 溶血毒素 溶血毒素是被认为是类似于洋地黄皂到甙 d i g i t o n i n 的物质 啪1 能使动物红血球细胞溶解破裂引起动物死亡 主要成分为糖脂 双半乳糖等 但也有人鉴定为聚氧多烯聚醚化合物 3 2 1 近几年较多的研究b 3 3 3 认为溶血毒素 由5 种组分组成 其中溶血毒素i i i 被认为是单或双半乳糖甘油脂 它们的毒素 活性分别是商品型d i g i t o m n 活性8 0 和2 5 而毒素 一v 的毒素活性分别是商 品型d i g i t o i l i n 活性的1 0 0 9 和2 倍 除了i i i 以外 其它3 种毒素的结构还不 清楚 小定鞭藻 尸渺刀p s f 删阳州绷 是典型的可产生溶血毒素的藻类 赤潮毒素会对生物造成不同程度的伤害和损害 但是 随着人们对其研究的 深入和认识的加深 赤潮毒素的潜在应用价值也开始受到人们关注 例如 在医 学方面 由于赤潮毒素与钠离子通道的特异性结合 已成为分子生物学研究的重 要工具 被用来测定钠离子通道的数目和亲和力 1 3 腹泻性贝毒研究现状 腹泻性贝毒最早于2 0 世纪7 0 年代末发现于日本 随后发现在荷兰发生的中毒 事件也是由腹泻性贝毒引起 在很长一段时间里 有关腹泻性贝毒的报道主要来 自日本和欧洲 但近年的研究显示 在北美 远东其他海域也有贝类沾染腹泻性 贝毒的报道 腹泻性贝毒是y a s u m o t o 口订首先从紫贻贝的肝胰腺中分离出来的一 种结构复杂的生物活性物质 之后不久 毒素成分被进一步确认 分子式为 c 4 4 h 6 8 0 1 3 口引 这一毒素成分最早从海绵胁泷乃d z d f 口d 幽如f 和h 聊p 肠 2 d 如c 砌中发 现 蜘 腹泻性贝毒会导致人类产生恶心 呕吐 腹泻和腹痛等症状 但与其它毒 素相比 腹泻性贝毒的毒性相对较低 因此尽管中毒事件发生得比较频繁 但迄 6 关键环境因子对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究 今为止没有人因腹泻性贝毒中毒死亡 1 3 1 腹泻性贝毒的来源 许多学者经研究发现 早期引起人们中毒的原因种不是由贝类 海绵自身合 成的 而是由与海绵等生物共存的甲藻产生 6 l 能够产生腹泻性贝毒的藻类很多 主要有鳍藻属和原甲藻属 鳍藻属的藻类是浮游植物群落中所占比例较少的生 物 极少有因鳍藻大量繁殖导致水体变色的报道 目前己经检测到鳍藻属能够产 生腹泻性贝毒的主要有7 种 其中能够产生o a 的藻种是d 砌印枷括加 f 以 d 口c 砌 d 口c m f 2 口幻 能够产生d t x 的藻种是d 加r 疗f d 聊f 臼馏 d d f 2 如尬 d 锣i p o s d a c 珏l 俚帮d m o n e 酉c 一心 除了这七聃藻类外 d c 口u d m q d h a s t n t e d s 口c c 淞 也被怀疑能够疑能够产生毒素 但尚未得到普遍认可n 叫 原甲藻中 能够产生毒素的藻种通常是底栖型的藻种 主要有尸阳加c p z 护 聊z 砌口 p n c 口v 聊 尸膨咖p 砌 p 阳阳c e 2 护 垅办d 厅锄口疗 2 砌玎 聊等 在我国主要分布的有渐 尖鳍藻 具尾鳍藻 倒卵形鳍藻 f 玎叩枷括加r f j 利玛原甲藻 p r d m c e 玎f r m z f 2 矽 n 聊f 肌l d d v p c 口 ds 口c c 甜 淞和df 印 等 1 这些藻类被其它贝类 鱼类或其他海洋动物滤食后 导致d s p 的积累和转化 从而引起食用者腹泻性中 毒 常见的能够积累d s p 毒素的贝类有日本栉孔扇贝 c 协帅确矽d 疗甜西 口砌z 舢 凹线蛤蜊 胁c 纽j 胁幻勉 沙海螂 蚴肠口陀疗口r 妇 紫贻贝 坳f f 7 螂 p 幽凰 牡砺 伪抛口s p 蛤仔缺 研印鲫p 办 忉觑卵 动 斧文蛤 a 庇旭驴觑 肠聊口愆办f f 中国蛤蜊 勿c 臼 口如砌p 珊括 海扇 p 肠c d p p c 纪 zm 铅肌珑f c 螂 凤螺 阳聊6 淞s p 和锦蛤 却p s j 印0 1 1 i c a 等吻 2 3 4 羽 在产生腹泻性贝毒的藻类中 鳍藻的种类很多 但是由于其在实验室内很难 培养口引 近两年来虽然有所突破n 朝 但要依靠现有技术实现对鳍藻d f 2 叩枷括卿 的大量连续培养仍然存在问题 因此不能进行有效的实验室研究 而利玛原甲藻 尸阳 o c g 2 护 聊z f 聊口d o d g e 实验室培养简单易行 只需平常的f 2 培养基即可 因 而被作为腹泻性贝毒素的毒藻模型 广泛用于研究腹泻性贝毒产生动力学的研 究 并成为0 a d l 毒素的可靠来源h 钔 目前 人们对于利玛原甲藻 厅d 厂d c p 肋一材聊 砌口d o 畦e 的研究主要集中在毒物及毒理学 生理生态学 检测方 法等方面 7 4 纠7 1 关键环境冈子对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究 1 3 2 腹泻性贝毒的成分及毒理学特性 腹泻性贝毒是一类聚醚类或大环内酯类化合物 不溶于水 能溶于甲醇 乙 醇 丙酮 氯仿等有机溶剂 属于脂溶性物质 不吸收紫外线 对一般加热较为 稳定幢制 根据其成分碳架结构的不同 将其分为三类 1 酸性成分的o a 及其 天然衍生物鳍藻毒素 d t x 卜3 2 中性成分的聚醚内酯毒素 p e c t e n o t o x i n s p t x s p t x1 7 p t x 2 s a 7 e p i p t x 2 s a 3 带有磺酸基的其它毒素成分 y e s s o t o x i n s y t x 8 4 2 椰3 其化学结构如下图 3 4 4 引 4 7 a 恕r c 心r 拳h 蹦 q 式m b e 心 口 口 r t t h 嘶c 心 图卜1 腹泻性贝毒酸性成分的化学结构 f i g1 1c h e m c i a ls t m 咖eo f0 k 田a i ca c i d 弛di t sd 甜v a t i v e s p t 1 只 c h 2 0 h c 一7 rp 1 r 2 r c h 3 c 一7 lrp 1 3 r c h o c zr f y t x 4 r c h 2 0 h c zsp 1 x 6 r i c o o h c 一7 r f 叮 7 r i c 0 0 h c zs p 1 x 一2 s a c 一7 r7 一皇p p t 一2 s a 7 s 图卜2 腹泻性贝毒中性成分的化学结构一 f i g l 一2c h e m c i a ls 1 m c t u r eo fp e c t e n o t o x i n si nd s p r 关键环境因子对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究 r 幻 承 h l 饼l 亿一瓣 图卜3 腹泻性贝毒其他成分的化学结构1 4 f ig1 3c h e m c i a l 蛐n j c t u r eo fy e s s o t o x i n s 腹泻性贝毒种类多 结构复杂 目前已证实大田软海绵酸o a 和鳍藻毒素 d t x s 是导致腹泻性贝毒的主要毒素类型 毒素系长链聚醚毒素 分子中有羟基 和羧基基团 o a 的分子量为8 0 4 5 和d t x s 是同系物 无色晶体 熔点1 5 6 1 5 8 以小鼠为生物实验对象 l d 5 0 和l d 9 9 均为2 0 吮g k g d t x l 是白色无定性 固体 熔点1 3 4 l d 5 0 和l d 9 9 分别为1 6 6 1 6 吮g k g d t x 一3 是无色固体 l d 5 0 和l d 9 9 均为5 0 吮g l g 它们都易溶于甲醇 丙酮 氯仿 二氯甲烷 二甲亚砜 等有机溶剂口8 4 叫 r 0 9 艮 胁之 关键环境因子对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究 i a 一 矿 f 矿 l x 八厂 哆 4 丫 八 人 铷h 一 2 o o a 5 0 h b c r r p a 一殳v n h o o 大田软海绵酸的二元酵酯衍生物 b 图卜4 大田软海绵酸及鳍藻毒素结构h 们 f i g1 4 t h e 蛐r l l c t u r eo f o a 锄dd t x s 表1 1 大田软海绵酸及鳍藻毒素的种类1 4 叫 t 山l e1 1 t h es p e c i e so f o aa n dd r x s 略锄一 l o 关键环境因子对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究 蛋白丝苏氨酸磷酯酶 p r o t e i ns e r i n e t l l r e o n i n ep h o s p ha 眺e s 催化磷酸丝氨酸 或磷酸苏氨酸残基去磷酸化 根据这些酶对抑制剂的敏感性 对阳离子的需求性 和体外底物特异性可将其分为p p 1 p p 2 p p 2 b 和p p 一2 c 等h 引 1 9 8 7 年 t a l a i 呻3 等发现 o a 是一种强有力的磷酸酯酶抑制剂 可特异性地抑制p p 1 c 和 p p 2 a c 使蛋白质过磷酸化 能够对生物的多种生理功能造成影响 如导致小 肠上皮细胞的腹泻性退化和促进癌变等 d t x l 具有和o a 一样的抑制作用 o a 导致腹泻的机制可能与霍乱弧菌相似 先激活腺苷酸环化酶 a d e n y l a t ec y c l a s e a c 引起一系列导致c a m p 增加的事件 c a m p 进一步激活c a m p 依赖性蛋 白激酶 使某些调节小肠钠盐分泌的蛋白磷酸化而诱导腹泻陆 o a d t x l 和d t x 3 都是肿瘤促进因子佑羽 0 a 的促癌活性是通过活化丝裂 原激活蛋白激酶 m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e m a p k 信号转导通路来实现 的 o a 通过激活m a p k 激酶 进一步促使细胞活化与转化 在d n a 复制完成 前 促使分化的神经细胞进入有丝分裂期 引起细胞凋亡 同时 还有报道认为 o a 具有遗传毒性 可导致d n a 加合物的形成畸3 1 由于对磷酸酶的抑制 可能 影响到d n a 复制和修复过程中的酶活性 从而带来致畸效应 此外 o a 可通过 改变细胞内第二信使c a 2 的浓度发挥作用 强烈增加心肌细胞中l 型c a 外内流和 气管平滑肌细胞上c a 2 依赖性k 通道开放状态的概率 由于其潜在的生理活性 毒理机制和药理作用 o a 被列入十大海洋生物毒素之列晤制 已经受到医药领域 学者的关注和青睐 在生物医药研究的应用方面存在广阔的应用前景 同时 也 引起了细胞生物学和分子生物学研究学者的广泛关注 1 3 3 腹泻性贝毒的检测与分析方法 近年来 腹泻性贝毒备受学者关注 对d s p 毒素的检测分析也日益受到重 视 目前 腹泻性贝毒的分析检测方法主要包括生物测试方法和化学分析方法 1 3 3 1 生物测试方法 1 生物毒性试验 小白鼠测试法 小鼠法是早期常用的赤潮藻毒素检测方法 目前我国渔业 商检部门等已使 用了该方法隋5 1 方法的原理是对不同的毒素 采用适宜的提取方法 将样品中的 关键环境冈子对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究 毒素转移到提取液中 通过向固定种系和体重的小白鼠腹腔注射样品提取液 记 录小白鼠的存活时间以计算样品毒素的量 其检测结果以鼠单位 m u 表示 然后 由鼠单位估算藻毒素的含量 该法适用于所有毒素的检测 具有可靠性强 使用 广泛 有历史数据 能表达出样品中实际毒性 不需复杂设备等优点 被许多国 家接受和采用作为藻毒素检测与管理的标准方法 我国商检系统即使用此方法 但该方法存在着很多不足和缺陷 如不够灵敏 假阳性高 准确性和重现性差 相 对标准偏差 2 0 分析时间长 仅能给出样品毒性的大小 无法确定毒素的组 成和含量 所测得的毒性和小鼠的品系有关 可比性较差 必须进行标准毒素的 校准才有可能相比 操作要求较高技巧 需要受过专门训练的操作人员 而且对 脂溶性的d s p 样品提取液中所存在的游离脂肪酸将影响检测结果 2 酶联免疫吸附试验 e l i s a 日本于2 0 世纪9 0 年代初率先研制出检测o a 的 竞争e l i s a 免疫试剂盒 采用以细胞融合杂交瘤技术研制出的抗软海绵酸单克隆 抗体包被于9 6 孔板作为固相 酶标记的o a 标准品和样品中待测的游离软海绵酸 与之竞争结合 以检测样品中0 a 的含量 该方法快速 灵敏 检出限可达 1 0 n g m l 可自动化检测大量样品 操作人员易培训 方法易掌握 3 细胞毒性检测 c e 玎b i o a s s a y 该方法是利用d s p 毒素对细胞的毒性作用来 分析毒素存在与否的一种技术 分为两种 1 测定鼠肝细胞经贝毒萃取物处理后 的乳酸脱氢酶渗漏状况 该法尚不成熟 需进一步研究后方可用于毒性检测 2 l 1 2 1 0 鼠白血病细胞的生长抑制法 用血清培养l 1 2 1 0 鼠白血病细胞 加入毒物萃 取物 测定其细胞生长受抑制的情况判断其毒性大小瞄5 1 4 蛋白磷酸酶抑制试验 d s p 毒素的主要成分o a 和d t x l 具有抑制丝氨酸 苏氨酸类蛋白磷酸酶p p 1 和p p 2 a 的活性 蛋白磷酸酶抑制实验就是在此基础上 建立发展起来的嘞 5 7 1 初期建立的实验是以硝基苯磷酸盐 p n p p 为底物 比色 法检测 假阳性高 进一步改进后 以磷酸甲基馓酮 m u p 或二磷酸荧光素 f d p 一为底物 荧光法检测 具有灵敏 1 g 1 0 0 9 准确 快速 样品处理简单等优点 睛8 制 但该方法需要特殊的试剂及检测仪器 在我国基层普及有一定的难度 5 肠回路分析 i n t e s t i n a l l o o pa s s a y d s p 溶解后 注射于兔或鼠的肠回路中 1 2 其主要是用1 的吐温一6 0 生理盐水将 根据富集的流体体积 m l 与肠回路的 关键环境因子对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究 长度 c m 的比值确定样品是否染毒 若大于1 0 即可认为样品有毒 肠回路分析法 比较简便 但存在敏感性差 精确度低 重现性差的缺憾 1 3 3 2 化学分析方法 1 高效液相色谱法 h i 曲一p e 怕m a i l c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h p l c d s p 毒素的h p l c 方法最早是l e e 等1 9 8 7 年建立起来的旧1 其主要是利用毒素分子上的 羧基与荧光物质反应 生成强荧光性物质 再经柱分离和荧光检测哺 该法灵敏 准确 可靠 能确定各种毒素成分 使用广泛 易于校正 而且需要的样品量少 我国在1 9 9 8 年建立了o a 的h p l c 检测方法 并应用到贝类样品的检测中 最低检 测浓度达0 1 g 1 0 0 9 3 2 气相色谱法 g a sc h r o m a t o 莎a o h y g c 可用于分离和检测o a 系裂的毒 素 首先用乙醚萃取产毒藻类或可疑贝样 用硅胶渗透色谱和反相分离色谱分离 和纯化 通过氢焰检测分析毒素的三甲硅油衍生物 化学分析检测法除了包括h p l c 和g c 还包括液相色谱一质谱联用 1 i q u i d c l d m a t o 聊h y m a s ss p e c t r o m e t 巧 l c m s 毛细管电泳法 c 印i l l a 巧 e l e c n o p h o r e s i s c e 及胶束毛细管电动色谱 m i c e l l a re l e c 仃o b n e t i cc 印i l l a r y c l m a t o 伊a p h y m e k c 等旧哪 h p l c 与喷射离子 i o n s p r a y 质谱相结合的方法 l c i s m s 是目前最好的检测方法 删 只是由于价格昂贵 远不如h p l c 常用 b o 诚c h a 阳7 1 首先用毛细管胶束电动电泳 紫外检测器检测贻贝中的o a 与d t x 2 但由于缓冲液等问题 效果不是十分理想 1 3 4 腹泻性贝毒的产生机理 腹泻性贝毒产毒藻在全球的分布非常广泛 它们所产生的d s p 毒素能够在贝 类等海洋生物中累积 传递 对人类的健康造成严重的危害 因此 微藻产生 d s p 的机理备受关注 但是 影响d s p 的因素太多 各因子对d s p 毒素产生的影 响还不清楚 至今d s p 的产毒机理还没有明确 许多研究显示 o a 可能是在甲藻叶绿体中合成并贮存于叶绿体当中 很可 能是甲藻光合作用的直接产物 引 但有人认为 o a 及其衍生物是贮存于胞质周 围的液泡中h 0 细胞中o a 的量与细胞脂质水平 叶绿素浓度密切相关n 细胞 关键环境因子对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究 内毒素含量通常随培养时间的延长逐渐增加 至静止期时达到最高 这与p s p 产 生情况有所不同 后者在对数生长初期最大口2 l 毒素的产生个体差异很大 来自 不同区域 甚至同一地区的不同藻株 其毒素组成和水平可能并不相同扫7 7 驯 这 种差异有可能是缘自遗传差异n 引 也可能源于藻类生理状态上的差异 d s p 合成 后以低毒性的硫酸盐形式d t x 4 贮存于胞内 然后以酸性活性形式o a 分泌于水体 盯朝 从而构成细胞对o a 毒性的自我保护体系 s e l f p r o t e c t i v es y s t e m d s p 分子 中的所有碳均来自乙酸盐和乙醇酸盐n 副 其碳骨架通过聚酮化合物合成酶 p k s 合成 非常独特 与放线菌 a c t i n o m y c e t e s 多醚的合成不同 o a 的生物合成中 可能存在一氧化机制 o x i d n m e c h a l l i s m 7 引 存在b a e y e r v i l l i g e r 氧化m 1 1 4 环境因子对藻类生长和产毒的影晌 在海洋中 氮 磷 硅及微量元素等构成了藻类生长所需的营养基础 同时 盐度 温度 光照等物理因素又为藻类的生长繁殖创造了必要的物理环境 各种 环境因素相互关联 共伺影响藻类的生长 同时 一些藻类可以产生毒素 藻毒 素的产生与这些环境因子之间也存在着一定的关系 1 4 1 氮 磷对藻类生长和产毒的影响 海洋中藻类的生长离不开环境中的营养元素 对海洋中的许多藻种来说 氮是影响其生长的重要限制因子 但是 在河口 海湾等受人类活动影响显著的 海域 随着大量氮营养物质的输入 磷也有可能成为藻类生长的限制因子 许多 研究表明 除营养盐的浓度和种类会对藻类的生长产生影响外 营养盐比例的改 变所引起的营养盐限制也会对藻类的生长造成很大的影响 r e 瓶e l d 1 9 5 8 指 出 浮游生物的平均氮磷比 原子比 接近于1 6 1 因此 很多研究者认为当 海水中的氮磷比为1 6 时 将最适合藻类的生长 氮磷比低于1 6 1 时受到氮 限制 而氮磷比高于1 6 1 时受到磷限制h 9 舳3 根据t i l i i l a n 睛 删的资源竞争理论 藻类对限制性营养的竞争是决定浮游植物群落组成的重要因素 在营养限制条件 下 那些对限制性资源需求最低或者利用能力最强的藻类会在竞争中胜出 因此 营养盐比例发生变化的海域 其浮游植物的群落组成也会改变 在以往的研究中 由于对最适氮磷比的理解有一定的差异 在研究藻种最 关键环境因子对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究 适氮磷比时所用的实验方法也不尽相同 因此 实验得到藻类的最适氮磷比有很 大差异 对于假微型海链藻 砌口7 船s f d 5 f 朋筇p 砒聆口聆口觑l s 跆p rh p j 聊如z j 2 来说 在n p 比为1 6 下 其最大比增长率最高 平均倍增时间最短 叶绿素a 含量 最高 因此氮磷比为1 6 是其最适氮磷比 而裸甲藻 6 1 聊 2 d 历 2 f 聊s p 在n p 比为6 下达到最佳的生长 其最