（微生物学专业论文）脂肪酶工程菌发酵条件优化及脂肪酶的定点突变.pdf

福建师范大学黄平硕士学位论文 福建师范大学学位论文使用授权声明 2 0 0 5 9 1 0 的论文 论文题目 脂肪酶工程菌发酵条件优化及脂肪酶的定点突变 是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果 本人了解福建师范大学有关保留 使用学位论文 的规定 即 学校有权保留送交的学位论文并允许论文被查阅和借阅 学校可以公布论文的全部或部分内容 学校可以采用影印 缩印或其他 复制手段保存论文 保密的论文在解密后应遵守此规定 r 学位论文作者签名1 孵指导教师学位论文作者签名堋 彳指导教师 签名日期丝 皇么 望三 签名张懈 摘要 摘要 在构建扩展青霉脂肪酶 p e l 一 二 三 四等多拷贝基因工程菌 g s p a 0 8 1 5 1i p 的基础上 从接种量 诱导剂量 p h 值 发酵时间等方面对其进行 摇瓶发酵条件优化以及7 升全自动发酵罐发酵工艺的初步摸索 有效地提高了扩展 青霉脂肪酶在毕赤酵母中的表达水平 本研究还利用定点突变技术对p e l 进行了分 子突变 获得一株最适作用温度降低5 0 热稳定性略有提高的突变体脂肪酶 1 p e l 多拷贝工程菌的发酵条件优化 从接种量 诱导剂量 p h 值 发酵时间等方面对基因工程菌进行摇瓶发酵条件 优化和7 升全自动发酵罐发酵工艺的初步摸索 包括调整培养基成分 甲醇流加控 制等 初步确定了该工程菌的摇瓶发酵条件 诱导起始菌体密度为1 0 o d 甲 醇诱导浓度为1 5 诱导起始p h 为7 0 8 0 诱导培养时间为1 2 0 h 使用d m g y 培 养基 发酵罐培养6 0 h 酶活可达1 2 5 0u m l 目的蛋白表达量为0 9 2 m g m 1 发酵酶 活提高至本课题组最初构建的脂肪酶工程菌的4 8 倍 2 p e l 的定点突变 采用重叠延伸p c r 法对p e l 基因进行了q 1 7 6 v y 2 0 4 d 定点突变 将突变基 因转入毕赤酵母g s l l 5 中表达 构建了2 种突变体 对两种突变体的酶学性质研究 结果表明 与野生型相比 突变体p e l q 1 7 6 v g s 最适作用温度下降5 0 c 热稳定 性 m 提高0 7 c 摇瓶发酵9 6 h 酶活可达3 9 2 u m l 脂肪酶表达量约为3 0 0 u g m l 突变体p e l y 2 0 4 d g s 在橄榄油板上不能形成透明的水解圈 蛋白电泳未检测到目 的蛋白条带 关键词 扩展青霉脂肪酶 发酵条件优化 定点突变 a b s t r a c t a b s t r a c t i no r d e rt oi n c r e a s et h ee x p r e s s i o nl e v e l t w o t h r e ea n d f o u r c o p yl i p a s ee x p r e s s i o n v e c t o r sw e r ec o n s t r u c t e da n di n t r o d u c e di n t ot h ey e a s tc e l l s s o m ec o n d i t i o n sr e l a t e dt o c e l lg r o w t ha n dl i p a s ee x p r e s s i o ns u c ha st h em e d i u mi n g r e d i e n t c e l ld e n s i t y m e t h a n o l f e e d i n g m e d i u mi n i t i a lp ha n dp e r i o do ft h ef e r m e n t a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e db yc u l t i v a t i n g c e l l si ns h a k e rf l a s k sa n da7l f e r m e n t o r t h eh i g h e r l e v e le x p r e s s i o no fl i pw a sa c h i e v e d i np i c h i ap a s t o r i s s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i so fp e lw a sc a r r i e do u ta n do n em u t a n t s h o w st h a tt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ew a sl o w e r5 0 ca n dt h e r m o s t a b i l i t yw a sb e t t e rt h a n t h a to fw i l dt y p e 1 o p t i m i z et h ee x p r e s s i o nc o n d i t i o no fm u l t i c o p ye n g i n e e r e ds t r a i n s s o m ec o n d i t i o n sr e l a t e dt oe e l lg r o w t ha n dl i p a s ee x p r e s s i o ns u c ha st h em e d i u m i n g r e d i e n t c e l ld e n s i t y m e t h a n o lf e e d i n g m e d i u m i n i t i a l p ha n dp e r i o do ft h e f e r m e n t a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e db yc u l t i v a t i n gc e l l si ns h a k e rf l a s k sa n da7lf e r m e n t o r t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h es u i t a b l ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nf o rt h er e c o m b i n a n tc e l la n d l i p a s ee x p r e s s i o ni sb e l o w t h em e d i u mi n i t i a lp hi sa b o u t7 0t o8 0 t h et e m p e r a t u r ei s2 8 d e gc f o rc e l lg r o w t ha n d2 6d e gcf o rl i p a s ee x p r e s s i o n t h em e t h a n o li n d u c i n gs h o u l db e s t a r t e da tac e l ld e n s i t yo f1 0 o d 6 0 0 t h em e t h a n o lf e e d i n gi si nav o l u m er a t i oo f1 5 t ot h em e d i u mp e rd a y a n dt h ef e r m e n t a t i o nt i m ei s1 2 0 h i na7 lf e r m e n t o rc u l t i v a t ef o r 6 0 ht h el i p a s ey i e l di s0 9 2 m g m l 1 2 5 0 u m 1 t h ea c t i v i t yw a sa b o u t4 8 f o l d sh i g h e rt h a n t h a to ft h ep r e v i o u sc o n s t r u c t e ds t r a i n s 2 s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i so fp e l q 1 7 6 v y 2 0 4 do fl i pw e r em u t a n t e db yo v e r l a pe x t e n s i o np c r r e s p e c t i v e l y t h e m u t a n tg e n e sw e r ee x p r e s s e di np c h ap a s t o r i sa n dt w om u t a n t sw e r eo b t a i n e d 1 t h e o p t i m u mt e m p e r a t u r eo ft h em u t a n tp e d q l 7 6 v g sw a s5 00 cl o w e rt h a nt h a to fp e l g s w h i l et h et h e r m o s t a b i l i t yw a s0 7 ch i g h e r t h ee x p r e s s i o nf i e l dw a sa b o u t3 0 0 z g m l t h e s e c r e t e da c t i v i t yw a sa b o u t3 9 2 u m l 2 n ol i p a s e a c t i v i t ya n dy i e l dw a sd e t e c t e di n s u p e r n a t a n to ft h em u t a n tp e l q 1 7 6 v g s k e y w o r d s p e n i c i l l i u me x p a n s u ml i p a s e o p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s i i 中文文摘 中文文摘 扩展青霉脂肪酶的酶学特性优良 在洗涤剂 面粉加工 废纸脱墨 生物柴油 转化 单酯转化中均有很好的适用性 目前 本课题组已完成对扩展青霉脂肪酶 p e l 基因c d n a 序列 1 和基因组 d n a 序列 2 的克隆和序列分析 并实现了该基因在大肠杆菌 酿酒酵母和毕赤酵母 中的表达 3 4 1 其中 毕赤酵母脂肪酶基因工程菌摇瓶发酵9 6 h 酶活可达2 6 0 u m l t 4 1 为进一步提高p e l 基因在毕赤酵母中的表达量 我们在构建了几种多拷贝基因工程 菌的基础上 进行发酵工艺优化 使脂肪酶的表达水平有显著的提高 同时 为改善 p e l 的稳定性和进一步探讨其结构与功能的关系 还进行了p e l 的分子突变工作 获得了一株热稳定性略有提高 最适作用温度降低5 o 的突变体脂肪酶 1 p e l 多拷贝工程菌的发酵条件优化 工程菌g s p a 0 8 1 5 1 i p 经摇瓶发酵 甲醇诱导表达9 6 h 发酵液经s d s p a g e 分析表明 4 个多拷贝工程菌均可分泌表达脂肪酶 分子量约2 8 k d a 表达蛋白可 占分泌总蛋白的9 5 以上 为工程菌的主要分泌蛋白 各多拷贝工程菌发酵上清液 在橄榄油鉴定板上均能形成清晰的透明圈 说明外源蛋白在毕赤酵母中获得了正确 的表达和修饰 具脂肪酶活性 可以水解橄榄油 其中 3 拷贝的表达效果最好 因 此对其进行发酵工艺优化 以期获得最适的发酵条件 为大规模工业化生产应用扩 展青霉脂肪酶奠定基础 分别以不同的诱导起始菌体密度 甲醇诱导浓度 培养基起始p h 值 诱导时间 对3 拷贝工程菌进行摇瓶发酵条件优化 结果表明 发酵培养基最适起始p h 为7 5 最适的甲醇诱导起始菌体密度为1 0 o d 6 0 0 最适甲醇诱导浓度为1 5 最适诱导 时间为1 2 0 h 以摇瓶发酵优化结果及d m g y 培养基进行上罐发酵 甲醇诱导6 0 h 酶活可达 1 2 5 0u m l 目的蛋白含量为0 9 2 m g m l 实验结果分别将扩展青霉脂肪酶发酵酶活和 蛋白表达量提高至最初课题组构建的毕赤酵母产扩展青霉脂肪酶的4 8 倍和2 倍 t t t 中文文摘 并将甲醇诱导周期缩短为摇瓶发酵的i 2 2 p e l 的定点突变 本研究采用定点突变的方法 对p e l 进行稳定性及最适作用温度的改造 根据 具有特殊稳定性蛋白的结构特征和p e l 空间结构模拟 选择了扩展青霉脂肪酶的1 7 6 位和2 0 4 位氨基酸进行定点突变 采用重叠延伸p c r 法对p e l 基因进行q 1 7 6 v y 2 0 4 d 的定点突变 突变基因l i p q 1 7 6 v 及l i p y 2 0 4 d 回收后与经 d r v 线性化的克隆质粒p s k 相连 转化e c o l it o p l 0 f 感受态细胞 经含有x g a l 和i p t g 的a m p 板蓝白斑筛选 重组质粒酶切鉴定后 获得的重组质粒p s k l i p q 1 7 6 v p s k l i p y 2 0 4 d 以e c o ri 酶 切 回收片段与经e c o ri 酶切并去磷酸化的表达质粒p a 0 8 1 5 进行连接 转化e c o l i t o p l 0 f 感受态细胞 重组质粒酶切鉴定后 获得表达载体p a 0 8 1 5 1 i p q 1 7 6 v p a 0 8 1 5 1 i p y 2 0 4 d 所获得的含突变基因的表达载体以s a li 酶切线性后 电转化毕 赤酵母g s l l 5 经过y p o m 板 p c r 鉴定 筛选阳性重组子 重组子甲醇诱导表达 9 6 h 发酵液经灿烂绿 橄榄油鉴定板 s d s p a g e 分析 结果表明 1 个突变基因 在毕赤酵母中获得了成功的表达 1 突变体p e l q 1 7 6 v g s 应用重叠延伸p c r 法将1 7 6 位的谷氨酰胺转换成缬 氨酸而获得的突变体 p e l q 1 7 6 v g s 发酵酶活约为3 9 2 u m l 表达量约为 3 0 0 o p g m l 其最适作用温度为3 5 o 比p e l g s 下降了5 0 c t m 约为4 2 1 c 热稳定性较野生型略有提高 而突变体的热稳定性的提高可能是由于1 7 6 位的谷氨 酰胺位于p e l 表面一段无规则卷曲与一段q 螺旋的交界处 将其替换为更加倾向形 成q 螺旋的缬氨酸有利于提高蛋白的热稳定性 2 突变体p e l y 2 0 4 d g s 将2 0 4 位的酪氨酸转换成天冬氨酸而获得的突变体 p e l y 2 0 4 d g s 摇瓶发酵9 6 h 整个过程检测不到脂肪酶活性 蛋白电泳结果显示 没有目的蛋白的表达 可能是由于该位点对于酶的空间结构维持具有重要的作用 突变导致酶分子的空间结构受到较大的影响 因而脂肪酶在毕赤酵母得不到成功的 修饰和表达 i v 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 课题背景 扩展青霉脂肪酶是一种酶学特性十分优良 工业应用潜力巨大的脂肪酶 它在洗涤 剂 面粉加工 废纸脱墨 生物柴油转化 单酯转化中均有很好的适用性 近年来 本课题组完成了扩展青霉脂肪酶 p e l 基因的克隆和序列分析 得到了 完整的c d n a 序列n 3 和基因组d n a 序列乜1 并实现了该基因在大肠杆菌 酿酒酵母和 毕赤酵母中的表达口叫 该基因在毕赤酵母中的表达效果最好 摇瓶发酵9 6 h 酶活可达 2 6 0 u m l 在此基础上 本课题组应用定点突变技术对p e l 进行了分子改造 初步改善 p e l 的最适作用温度和热稳定性 袁彩获得了一株低温脂肪酶 其最适作用温度下降 1 5 c 热稳定性下降啼1 陈国仁通过改造使突变体的最适作用温度和热稳定性得到提高 1 陈木妹通过改造使突变体的最适作用温度提高了5 c 口1 国外对脂肪酶的研究主要在不同来源的脂肪酶基因克隆与表达 结构与功能 作用 机理 空间构象 蛋白质改造等方面 并取得了一系列的重要进展 而国内的研究主要 集中于菌种选育 酶学特性 发酵特性等 分子水平的研究相对较少 毕赤酵母是一种能够高效表达外源重组蛋白的表达系统 外源蛋白在毕赤酵母中表 达的影响因素很多 如基因拷贝数 整合位点 密码子偏好性 宿主菌 培养基 培养 条件等 提高基因在毕赤酵母中的拷贝数可以有效地提高外源蛋白的表达量晒 1 2 j 目前 国内脂肪酶市场主要由丹麦的诺和诺德公司垄断 若能实现扩展青霉脂肪酶 的产业化 获得具有自主知识产权的脂肪酶产品 打破国外脂肪酶的长期垄断地位 能 为我们国家获得巨大的社会和经济效益 为此 本文进行了以下两个方面的研究 1 从接种量 诱导剂量 p h 值 发酵时间等方面对基因工程菌进行摇瓶发酵条件优化 和7 升全自动发酵罐发酵工艺的初步摸索 实现p e l 在毕赤酵母中更高效的表达 2 采用重叠延伸p c r 法对p e l 基因进行q 1 7 6 v y 2 0 4 d 的定点突变 以获得最适作 用温度和热稳定性得到改善的脂肪酶 1 2 基因工程研究概况 1 2 1 概况 福建师范人学黄平硕士学位论文 当今 以基因工程为核心的生物技术已经成为世界性高技术革命浪潮的重要组成部 分 这是一场正在蓬勃发展的高新技术革命 它正以前所未有的速度推动着工业革命的 进程 目前 人类社会正面临着人口增加 食品短缺 资源匮乏 环境污染加剧等重大问 题 这些问题的解决都在不同程度上依赖于生物技术的进展情况 因为生物技术能利用 生物资源的可再生性 节约能源和资源 减少环境污染 能创造动植物优良新品种 增 加粮食生产 开辟食物新来源 解决疑难病的治疗并能对相关的传统行业技术改造和产 业结构调整产生极其深远的作用 所以生物技术蕴藏着巨大的经济潜力和社会效益 生 物技术仅以2 0 多年的发展历史 就在世界范围内给医学带来了一场革命性的变化 给农 业带来了新的绿色革命 使轻工 食品 环保 海洋 能源开发等有关领域得到了前所 未有的发展 为了加速基因工程的产业化 我国各省市的经济开发区 高技新术开发区都极其重 视生物技术产品的开发 以 8 6 3 计划中生物技术领域为例 为了促进成果转化为生 产力 加速生物技术的产业化 在国内建设了不少产业化基地用于基因工程药物的研究 与开发上 正在筹建的生物技术研发基地有转基因动物基地 转基因实验动物基地 农 作物设计中心 抗体工程基地 组织器官工程基地 药物筛选基地 生物信息中心 生 物芯片工程中心等 十五 重点研究和突破的关键技术有基因组学技术 基因操作技 术 生物信息技术 纳米技术 干细胞工程技术等 相信 随着人类基因组测序工作的 完成 后基因组时代的到来 在机遇和挑战面前 在 加强创新 促进产业化 的原则 下 我国的基因工程产业必将跻身于世界的先进行列 1 2 2 基因工程常用的表达系统 1 2 2 1 大肠杆菌表达系统 自上世纪7 0 年代以来 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统 尽管 基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母 昆虫 植物及哺乳动物细胞 并且近年 来出现了很多新型的真核表达系统 但是大肠杆菌仍然是实现外源基因表达的重要工 具 与其它系统相比 大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚 操作简便 可以大规模发 第1 章绪论 酵培养的优点 是现阶段最常用的表达系统 但在外源基因表达过程中 还可能存在着 表达效率不高 活性不够 表达产物容易形成不溶性包涵体以及缺乏真核细胞翻译后修 饰加工能力等问题 但基因的表达是一个十分复杂困难的过程 它涉及基因的转录 翻译 翻译后加工 细胞的代谢以及细胞内基因与蛋白 蛋白与蛋白之间的相互作用 因此 大肠杆菌被优 先作为研究蛋白组学 基因功能 蛋白质网络等新课题的模型 揭示了很多基因表达的 未知问题 进入后基因组时代 有关蛋白结构以及功能研究的开展 对基因表达的要求 更高 特别是伴随分子生物学新技术的发展以及对大肠杆菌表达系统研究的不断深入 大肠杆菌势必在实验研究及工业生产重组蛋白的应用中发挥更大的作用 在可预见的未 来 大肠杆菌表达系统在重组蛋白的生产研究中仍将占有一席之地 1 2 2 2 乳酸菌表达系统 乳酸菌 1 a c t i ca c i db a c t e r i a l a b 是一类能够利用碳水化合物产生乳酸的革兰 氏阳性菌的通称 它包括乳杆菌属 乳链球菌属等2 0 多个属 作为公认的安全 g r a s 食品级微生物n 副 乳酸菌早已广泛应用于食品 饮料和微生态制剂等行业中 乳酸菌产 生的一些酶 抗微生物多肽n 4 1 等物质能使食物美味可口并且可以长久保藏 乳酸杆菌可 以通过重建肠道菌群平衡 使人类及其它一些动物宿主提高健康状态 与其他微生物如大肠杆菌 酵母菌相比 学者们对乳酸菌的分子水平的研究开始较 晚 近年来 有关乳酸菌的一些调控元件 代谢机制已研究清楚并建立了一系列优秀的 乳酸菌表达系统n 豇1 6 1 包括糖诱导的表达系统n6 i 噬菌体 3 1 爆发式诱导表达系统n 7 h 引 乳链球菌素调控表达系统n9 刎 温控表达系统乜卜2 3 3 等 这些表达系统的质粒或其他d n a 片 段 如转座子 噬菌体d n a 不以抗生素作为选择标记 并且可以使外源蛋白的表达量提 高数十甚至上百倍 已经形成了很多食品级的精密 安全的选择标记用于食品工业中心4 1 这些选择标记主要包括3 类 即糖类利用标记 营养缺陷标记和编码细菌素抗性或免疫 性的标记 与大肠杆菌相比 乳酸菌作为基因工程菌表达外源蛋白不会产生内毒素乜引 所以建立食品级的表达系统受到了学者们的重视 目前 很多非常复杂的乳酸菌表达系统 如苏氨酸一高丝氨酸缺陷型表达系统已经 福建师范大学黄平硕士学位论文 建立 并且日益显现其优越性 这些表达系统的建立和完善 对于深入了解乳酸菌的基 因功能和表达调控的规律提供了良好的材料 乳酸菌是肠道正常益生菌 通过改造乳酸 菌使其更适宜人体的需要 制成微生态制剂和活菌疫苗等保健品或药品 将为人类健康 做出更大贡献 乳酸菌工程菌及其表达产物还可以应用于食品 医药 保健业和工业等 领域 有巨大的应用前景和潜在的商业价值 1 2 2 3 利什曼原虫表达系统 利什曼原虫 l e i s h m a n i as p p 夕是锥虫科利什曼属的单细胞真核寄生生物 其生活 史可分为前鞭毛体和无鞭毛体两个时期 具有鞭毛的前鞭毛体利什曼原虫通过白蛉吸血 途径传染给哺乳动物 并被宿主的单核吞噬细胞吞噬 转变为无鞭毛体 近年来 国外以非致病性寄生虫作为蛋白表达系统的研究已逐渐成熟 利什曼原虫 是其中研究比较透彻并且应用较广泛的一种 由于利什曼原虫具有一些特殊的生物学性 质 使其在蛋白表达载体领域备受关注 第一 利什曼原虫细胞具有类似于哺乳动物细 胞的蛋白翻译后加工修饰的能力 表达的蛋白产物在结构和功能上十分接近天然哺乳动 物蛋白 第二 利什曼原虫细胞前鞭毛体容易培养 在普通细胞培养基中可以正常生长 在标准无血清培养基中也可以高密度生长 适合大规模发酵 第三 利什曼原虫只针对 哺乳动物巨噬细胞和树突状细胞 因此 在药物靶向领域具有潜在的应用价值 随着国外研究的深入和对利什曼原虫了解的增加 人们开始尝试利用利什曼原虫细 胞表达外源基因 早期的实验主要是在利什曼原虫细胞内表达一些细菌抗性基因 例如 l a b a n 等啪卫7 1 通过构建含有s l s 接受位点的质粒载体 在豚鼠利什曼原虫中稳定表达了 细菌氯霉素乙酰转移酶基因和新霉素抗性基因 迄今已有多种真核蛋白在利什曼原虫细 胞中成功表达 并且产物都具有生物学活性 其中包括p 5 3 蛋白 多种细胞因子 例如 i f n 7 i l 一8 等 重组人促红细胞生成素等啪 3 h a t a b u 等啪1 利用重组质粒在4 种利什 曼原虫细胞 亚马逊利什曼原虫 赤道利什曼原虫 杜氏利什曼原虫 婴儿利什曼原虫 中表达犬i l 一8 结果显示 在利什曼原虫胞内和培养基中都检测到了i l 8 并且具有生 物学活性 尤其值得一提的是 在亚马逊利什曼原虫和赤道利什曼原虫的细胞培养液中 检测到对狗和小鼠多形核白细胞很强的i l 一8 生物学活性 m i s s l i t z 等 1 利用质粒将外源 第1 章绪论 报告基因整合到墨西哥利什曼原虫的基因组小亚基核糖体r n a 基因座 结果这些报告基 因都获得了很好的表达 b r e i t l i n g 等 2 1 也利用同源重组方法 将外源基因插入细胞染 色体基因组 使其能够稳定地遗传与表达 并且通过提高插入基因的拷贝数大大提高了 外源蛋白的表达量 其表达的增强型绿色荧光蛋白 产量最高可达3 0m g l 对其表达 的重组人促红细胞生成素的分析表明 t a r e n t o a e 禾i j 什曼原虫具有类似哺乳动物的 糖基化能力 其产生的聚糖结构与天然糖蛋白的聚糖结构十分接近 在此基础上k u s h n i r 等 引 进一步构建了共表达t 7r n a 聚合酶和四环素诱导的蛋白表达系统 该表达系统能 够使绿色荧光蛋白的表达量提高到细胞总蛋白的1 以上 利什曼原虫表达系统之所以受到关注 是因为利什曼原虫细胞不仅有可观的表达能 力 而且具有相似于哺乳动物细胞的蛋白翻译后加工的能力 同时它的培养成本相对于 哺乳动物细胞来说要廉价得多 从利什曼原虫的特点来看 它十分有希望成为一种新型 的外源蛋白表达平台 相信在不久的将来 这个表达系统将会更加成熟 操作更加方便 1 2 2 4 昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达系统也是一类应用广泛的真核表达系统 它具有同大多数高等真核生 物相似的翻译后修饰 加工以及转移外源蛋白的能力嘲1 利用重组杆状病毒在昆虫细胞 系中表达外源蛋白是目前国内外较为流行的操作方法 而另一类新型的昆虫细胞表达系 统 则是建立在对果蝇等昆虫细胞进行稳定转化的基础之上的 在稳定性和表达效率方 面有着更为突出的优点 目前已经利用昆虫表达系统成功地生产了鼠源单克隆抗体 人 鼠嵌合抗体口渊1 单链抗体 3 9 删及人单克隆抗体h 5 1 等多种抗体分子 还将抗体分子与尿 激酶型纤溶酶原激活物等肿瘤相关蛋白进行了融合表达m 3 这些抗体分子大多数能正确 组装 完成糖基化过程并具有相当高的活性 昆虫细胞表达系统安全性较好 表达水平高 可进行翻译后加工及表达产物的异源 性小 是一种较为理想的真核表达系统 由于昆虫表达系统独特的生物学特性 日益受 到学者们的重视 目前已广泛地应用于基因工程 药物开发 疫苗生产 表达免疫活性 分子和某些致病毒蛋白以及基因表达调控研究等多个领域中 但是 该表达系统中杆状 病毒的感染性以及表达产物的致敏原性需要引起足够的重视 福建师范大学黄平硕士学位论文 1 2 2 5 毕赤酵母表达系统 1 2 2 5 1 毕赤酵母表达宿主菌 毕赤酵母表达系统是近年来发展起来的一种优秀的表达系统 巴氏毕赤酵母属甲醇 营养型酵母 能在以甲醇作为唯一的能源和碳源的培养基中生长h 甲醇能够迅速诱导 巴氏毕赤酵母合成大量的醇氧化酶 a o x 而甘油和葡萄糖则抑 j a o x 的产生 巴斯德 毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器 它是一个储存蛋白质的地方 因此对于外源 蛋白的表达十分有利 表达出的外源蛋白可被分拣到微体中而免受蛋白酶的降解 并且 使表达的外源蛋白对细胞不产生毒害 目前大多数宿主菌是通过对野生型石油酵母 y 1 1 4 3 0 进行突变改造而获得的 应用较为广泛的主要有三种表达宿主菌 它们的主要区 别在于a o x 一个基因或二个基因的缺失而造成对甲醇利用能力的改变 最常用的宿主菌是g s l l 5 它含a o x l 和a o x 2 基因 在含甲醇的培养基上能以野生型 速率生长 表型为m u t 而k m 7 1 宿主菌的a o x l 已被来自爱c e r e a v i s i a e 的a r g 4 替代 因 此 该宿主菌只能依赖a o x 2 基因合成a o x 在甲醇中缓慢生长 它的表型是m u t 5 第三 种宿主菌m c l 0 0 3 它的两个a o x 基因都被敲除 不能在含甲醇的培养基上生长 表型为 m u t 一 通过对上述宿主菌的改造还可得到其它衍生的宿主菌 女n s m d l l 6 3 s m d l1 6 5 和 s m d l l 6 8 是近来开发的一类蛋白酶缺失的宿主菌 它们为表达外源蛋白提供了一个减少 降解的环境 有广泛的应用价值h 8 1 表1 表1 常用的毕赤酵母表达菌株 1 2 2 5 2 毕赤酵母表达载体 毕赤酵母表达载体是一种既能在酵母中又能在大肠杆菌中繁殖 扩增的穿梭质粒载 体 由于毕赤酵母没有稳定的附加体质粒 所以一般用整合型质粒作为外源基因的表达 第1 章绪论 载体 也就是它不含有酵母的d n a 复制起始区 不能在酵母中进行自主复制 但它有整 合介导区 可将外源基因整合到酵母染色体上随染色体进行复制 载体通常含有5 7 a o x l 启动子 多克隆位点 m c s a o x l 转录终止序列 t t 筛选标记h i s 4 组氨醇脱氢酶基因 或z e o c i n 抗性基因 3 7 a o x l 非编码基因序列与可以在细菌中进行增殖而存在的必需序 列 女i a m p 抗性基因和大肠杆菌复制起点 c o l e l h9 j 如果是分泌型表达载体 在多克隆 位点的前面还有一段分泌信号和先导序列 s 整合表达载体转化宿主菌 酵母菌 时 可以和宿主菌染色体上的相应位点发生互换 从而整合到酵母菌染色体上 这种整合方 式称为同源重组 将整个载体连同外源基因整合入宿主染色体 通常有以下几种整合方式 1 双位 点置换 发生在染色体a o x l 区和表达载体的a o x l 及3 7 a o x i 非编码基因区 消化载体产 生的d n a 片段与a o x l 两端同源 从而替代基因组a o x l 即置换 使宿主的a o x l 结构基因 被外源基因表达盒所替换 因而使宿主失去大部分甲醇利用能力 表型变为m u t 3h i s 2 a o x l 单位点交换 发生在染色体和表达载体的a o x l 单位点 外源基因的表达框插入 在染色体a o x l 基因的上游或下游 并未破坏宿主的a o x l 结构基因 宿主菌的表型为m u t h i s 这一过程可重复发生 从而使更多拷贝的表达单位插入到基因组中 获得多拷贝 基因的整合 3 h i s 4 单位点交换 发生在染色体和表达载体的h i s 4 位点 使得一个或 多个表达单位插入在h i s 4 位点 产生的表型也是h i s m u t 驯 根据不同的功能需要现已开发出多种商业化的毕赤酵母表达载体质粒 如 1 带有 药物筛选标记的载体p p i k 3 k 和p p i c 9 k 含有k a n a r 抗性基因 用高浓度的g 4 1 8 可以筛选 获得多拷贝的转化菌株 2 含有印度斯坦链壁菌来源的基因s h b l e 的载体p p i c z 类 此 基因较小 3 7 5b p 能在ec o l l 酵母和其他真核生物中表达 对z e o c i n 有抗性 3 近年来发展起来的载体p g a p z 类 此类载体含有组成型启动子g a p 甘油醛脱氢酶基因 或y p t l 启动子 不同于a o x l 启动子 g a p 启动子具有很强的组成型表达能力 基本不涉 及甲醇 有利于食品工业使用 另据报道 在毕赤酵母中还有一种f l d l 甲醛脱氢酶 基因启动子 它与a o x l 启动子比较 具有相同强度甚至更高强度 能在甲醇或甲胺诱导 下表达 以甲胺无毒且不易挥发 使得毕赤酵母的应用范围扩大 因此 f l d l 启动子将 福建师范大学黄平硕十学位论文 有很好的推广前景佑 1 2 2 5 3 外源蛋白在毕赤酵母中表达 异源蛋白在毕赤酵母中表达包含以下步骤 1 将外源基因克隆至合适的表达载体 2 转化ec o l i 通过抗性标记筛选转化质粒 并鉴定外源基因是否存在及其方向 3 线性化重组载体 转化入合适的毕赤酵母表达宿主 4 筛选正确的转化子 5 用p c r 鉴定外源基因在宿主中的整合情况 6 诱导表达 7 检测表达产物 外源蛋白在毕赤酵母中表达的影响因素很多 它不仅受基因剂量 整合位点 信号 肽 转录水平和翻译效率等的影响 也受宿主菌 蛋白酶 蛋白的加工和修饰及培养基 的影响等 毕赤酵母载体在宿主染色体上大多为单拷贝整合 由于a o x l 在甲醇诱导下的 强启动性 以及稳定的整合 所以单拷贝也能获得较高的产量 然而在有些实例中 单 拷贝整合体却产生令人失望的表达产量 相比之下多拷贝数表达单元 1 0 可以产生令 人满意的效果 如人肿瘤坏死因子 破伤风毒素蛋白c 片段 百日咳p 6 9 和鼠表皮生长因 子的表达 提高整合拷贝数的方法主要有 不同的转化方法导致产生天然高拷贝转化子 巴 斯德毕赤酵母的转化方法有原生质法 电击转化法 氯化锂法等 其中原生质法转化产 生的多拷贝转化子频率相对较高 若使用g 4 1 8 检测拷贝数 则配合电激法转化的效果较 好 在载体上多次插入目的基因片段 但这种多拷贝整合通常不太稳定 且拷贝数有 限 将载体中目的基因两端连上来自宿主r d n a 或其它非必需高重复的基因片段 通过 同源重组而达到高拷贝整合的目的 该策略已在酿酒酵母中得到成功的应用 但在毕赤 酵母中还没有实验报道 外源蛋白在酵母分泌表达时可以使用异源信号肽或酵母自身的信号肽 有研究表 明 自身信号肽可能要优于异源信号肽 但外源蛋白在酵母系统中表达时选择一个合适 的信号肽是相当困难的 对于有些蛋白自身信号肽可以引导分泌表达 如人血清白蛋白 h a s 蔗糖酶和牛溶菌酶嵋2 5 朝 而以m f a 作为异源信号肽在酵母中分泌表达外源蛋白也 非常有效 尤其是对较小分子蛋白产物的分泌表达 如表皮生长因子 e g f 血液因子 单链抗体片段等阳阔 a n t o n i o 等发现用改造后的信号肽也可以提高外源蛋白的表 第1 章绪论 达量 如用经过修饰的人血清白蛋白天然信号肽也可使h a s 在毕赤酵母中高效表达晦引 因此 为了使外源蛋自在酵母中高效表达 可以尝试不同的信号肽 蛋白酶 由于毕赤酵母本身分泌的蛋白酶的降解作用 使得分泌的外源蛋白在培养 基中不稳定 可以采用以下三种对策 在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或 酪蛋白水解物等 一般认为酪蛋白优于蛋白胨 干扰产品的测定和回收 另外添加5 m m e d t a 至培养基中也可增加产品的稳定性 改变培养基的p h 值 适合毕赤酵母生存的p h 值范围是3 0 8 0 调p h 值为酸性 推荐为2 5 6 8 时 可有效抑制中性蛋白酶的活性 使用蛋白水解酶缺陷型宿主菌嘞1 发酵方案 为了提高外源蛋白的表达水平 人们也在研究 寻找最佳的发酵方案 目前值得推荐的有以下两种方案 两步发酵法 即将细胞生长和外源蛋白表达阶段分 开 在生物量增长阶段 只需加少量的抑制物 通常为甘油 就能满足细胞快速生长 a o x 的表达则被抑制 在表达阶段 只需耗尽剩余的甘油 然后加入甲醇 外源蛋白就能得 到诱导表达 这时酵母生长比较缓慢 一般甲醇诱导1 5 0 2 0 0 h 时外源蛋白的表达分泌达 到峰值 这种方法可得到高产量的重组蛋白 但较为费时 混合发酵法 即在扩增与 表达阶段加人 个过渡阶段 在过渡期内按生长限制的比例添加甘油 并在甲醇诱导阶 段加入甘油 这种甲醇一甘油共存的方法可使某些表达菌株生长更活跃 合成蛋白更迅 速 并且也相对缩短了表达阶段的时间畸7 l 重组蛋白的表达除了与上述因素有关外 还 与选用的宿主菌 培养条件和蛋白质本身等有关 即使同一种宿主菌的同一重组子 表 达量也往往不相同 因此筛选高表达菌株非常重要 此外 要优化培养条件来提高蛋白 的表达 总之 毕赤酵母表达系统是一类比较优秀的表达系统 它的应用将越来越广泛 但 它也有自身的一些缺点 如外源蛋白的糖基化程度还不能尽如人意 发酵时间长不利于 外源蛋白的表达与积累 以有毒的甲醇作为原料使得表达产物难以通过安全鉴定等 所 以 它还需要做进一步的研究和改造 1 2 2 6 小结 综上所述 原核表达系统和真核表达系统各有优缺点 前者是最早被采用 也是目 福建师范大学黄平硕十学位论文 前研究最为清楚的表达系统 其中大肠杆菌表达系统是外源基因表达的首选 真核表达 系统具有翻译后的加工修饰体系 表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质 因此 利用真 核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视 使用大肠杆菌表达系统能够在较短时间内获得表达产物 且所需的成本相对较低 但目的蛋白常以包涵体形式表达 产物纯化困难 且原核表达系统翻译后加工修饰体系 不完善 表达产物的生物活性较低 酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高 成本低 但翻译后加工修饰体系与哺乳动物不完全相同 哺乳动物表达系统产生的蛋白质更接近 于天然状态 但表达量低 成本高且操作复杂繁琐 因此 选择表达系统时 应充分考虑各种因素 如要表达蛋白的性质 生产成本 表达水平 安全性 表达周期等 随着对外源基因表达系统研究的不断深入 随着更多 表达机理和影响因素的发现 相信在不久的将来 原核与真核两种表达系统在重组蛋白 的生产研究中都将占有一席之地 并将出现更多更加完善的表达系统 1 2 3 毕赤酵母表达系统的优点 毕赤酵母 p i c h i ap a s t o r i s 表达系统是目前应用最为广泛的外源基因表达系统 唧1 目前已有许多毕赤酵母高效表达外源基因的实例 表2 大肠杆菌表达系统不能 表达结构复杂的蛋白质 表达的蛋白容易形成不溶性包涵体 杂蛋白多 表达产量低且 不具备真核细胞的翻译后修饰的功能 而哺乳动物细胞 昆虫细胞表达系统操作复杂 表达水平低 进行产业化生产成本昂贵 毕赤酵母克服了上述表达系统的不足而且具有 其它表达系统无法比拟的优越之处畸9 j 毕赤酵母表达系统具有强有力的醇氧化酶 a l o c h o lo x i d a s e a o x l 基因启动子 可严格调控外源蛋白的表达 同时 它作为真 核表达系统 能够对表达的外源蛋白进行翻译后的加工与修饰 从而使表达出的外源蛋 白具有生物活性 此外 巴斯德毕赤酵母营养要求低 培养基廉价 生长快 易于进行 操作和培养 其高密度发酵技术业已成熟 便于大规模工业化生产 表达量高 许多蛋 白的表达量可以达到每升克级以上水平 表达的外源蛋白可分泌到胞外 分泌的内源蛋 白少 外源蛋白分离纯化简便 外源基因通过质粒整合到基因组上 基因工程菌株遗传 稳定性好 胞内表达蛋白的分选和区域化 使得表达蛋白的稳定性增加 减少表达产物 第1 章绪论 对宿主菌的毒害作用 糖基化程度低 与酿酒酵母相比 毕赤酵母不产生过度的糖基化 所分泌的糖蛋白的免疫原性较低 更利于临床应用 表2 毕赤酵母高效表达外源基因的实例 1 2 4 毕赤酵母表达基因工程产物的研究进展 毕赤酵母表达外源蛋白不容易对自身产生毒副作用 且毕赤酵母基因工程菌很容易 从摇瓶培养扩大到发酵罐进行高密度发酵 这些特点决定了毕赤酵母具有高效表达外源 蛋白的巨大潜力呦3 但毕赤酵母对不同的外源蛋白的分泌表达水平差别很大 例如胞内 表达的巴西三叶胶腈水解酶产量高达2 2 9 l 阳1 j 胞外分泌表达的鼠明胶蛋白 m o u s e g e l a t i n 达1 4 8g l 6 刳 组织坏死因子 t i s s u en e c r o s i sf a c t o r 产量可达6g l 晦引 而报道的表达蛋白量最低的只有l m g l 相差1 0 0 0 0 倍以上 这种外源蛋白表达水平的差 异 一方面是由于外源基因本身的特性所致 另一方面发酵条件也对表达量起了极其重 要的作用 发酵条件主要包括培养基成分 温度 p h 溶氧 甲醇的流加方式以及其它 一些发酵工艺上的控制 1 2 4 1 培养基 在高密度发酵条件下 培养基的组成直接影响了细胞的生长和外源基因的表达乃至 工程菌的遗传稳定性 在毕赤酵母高密度培养时 大多数依然采用i n v i t r o g e n 公司提供 的培养基 如b m g y b m m y b m g b m m m g y m 等 其中b m g y b m m y b m g b 删培养基中包 括磷酸缓冲液 常用来表达分泌蛋白 适用于外源蛋白活性受p h 影响较大的情况 可以 维持在一定p h 范围内获得最佳的蛋白表达量 对于受蛋白酶比较敏感 容易受到降解的 福建师范人学黄平硕十学位论文 分泌型蛋白 一般就要采用含有蛋白胨和酵母提取物的培养基 或者添加1 酪蛋白水 解物 以降低目的蛋白的降解 如在表达m e g f 时 最终的表达量依赖于培养基的组成 在含酵母膏和蛋白胨的培养基中单拷贝转化子表达量为0 0 2 9 m l 但在不含酵母膏和蛋 白胨的培养基中表达量低至0 0 0 1 9 m l 随4 l 毕赤酵母发酵工艺手册上提供的f m 2 1 基础盐配成含4 甘油的发酵培养基 组成为 8 5 的h s p 0 42 6 7 m l c a s o 2 h 00 9 3 9 k z s o t1 8 2 9 m g s 0 4 7 h z 01 4 9 9 k o h4 3 1 9 甘油4 0 o g 加水定容至1l 发酵时流力h p t m l 微量元素盐 该培养基成分相对较为复杂 主要以盐类元素为主 营养单一 且价格相对较高 尤其是这类培养基不能混合高温灭 菌 否则容易形成沉淀 在高密度发酵时 当p t m l 微量元素盐含量过高时 也容易形成 沉淀 给发酵带来不便 有文献报道研究人员为了降低培养基的成本 简化培养基的制 作工艺 采用麦芽汁培养基来培养毕赤酵母 取得了很好的效果 进行细胞浓缩培养与 非浓缩培养时 培养基成本分别只有上述配方的1 1 9 8 7 8 和1 6 4 5 9 经济效益即产出 与投入之比分别是合成培养基 b m g y b m m y 的2 0 0 倍和6 6 倍 有效地降低了成本 大大 简化了培养基的制作工艺 1 2 4 2 温度 温度对毕赤酵母发酵产物的活性 发酵液的物理性质 溶氧量 基质的分解吸收速 率等 及生物合成方向等都有影响 从酶动力学角度看 温度升高 反应速率加大 生 长代谢加快 生产期提前 但温度过高 容易使酶因热而失去活性 温度越高 酶的失 活也越快 表现在菌体易于衰老 发酵周期缩短 影响产物的表达量 根据i n v i t r o g e n 公司的酵母手册 毕赤酵母的培养温度为2 8 c 一3 0 2 8 c 是酵母菌体生长的最适温度 而3 0 c 是外源蛋白表达的最适温度 如果诱