（中医骨伤科学专业论文）透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞周期与凋亡影响的研究.pdf

t 目录 jf l l f l li lli i i f f ii l ljijf y 18 0 3 7 7 9 中文摘要 1 英文摘要 3 正文 前言 一 0 00 000 一 7 月l j 吾 一 一 实验一透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞g 期调控基因影响的研究 目的 1 2 引言 1 2 实验材料 1 2 实验方法 1 4 结果 2 0 讨论 3 2 j 结 3 5 实验二透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞凋亡调控基因影响的研究 目的 3 6 引言 3 6 实验材料 3 6 实验方法 3 7 结果 4 3 讨论 5 0 小结 5 3 结论 5 4 参考文献 5 5 致谢 6 1 文献综述 6 2 作者简历 7 1 7 l 透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞周期与凋亡影响的研究 专业 中医骨伤科学 研究生 李西海 导师 刘献祥教授 中文摘要 目的 探讨透骨消痛胶囊含药血清影响软骨细胞周期与凋亡的作用机制 方法 1 新西兰大白兔6 0 只 抽签法随机分为空白组 0 9 生理盐水灌胃 对照组 壮 骨关节丸5m g m l 溶液灌胃 实验1 组 透骨消痛胶囊2 5m g m l 溶液灌胃 实验2 组 透骨消痛胶囊5m g m l 溶液灌胃 实验3 组 透骨消痛胶囊1 0m g m l 溶液灌胃 2 0 m l 次 2 次 天 连续3 天 腹主动脉采血 制备含药血清 2 新西兰大白兔3 2 只 取膝关节软骨建立体外培养的软骨细胞 甲苯胺蓝染色 r t p c r 检测c o l l a g e i im r n a 鉴定 第3 代软骨细胞同步化 抽签法随机分为空白组 对 照组 实验1 组 实验2 组 实验3 组 分别加入含1 5 各组血清d m e m 培养2 4h 4 8h 7 2 h m t t 检测软骨细胞的活性 流式细胞仪检测软骨细胞周期的分布 确定含药血清的有 效干预时间 第3 代软骨细胞同步化 抽签法随机分组分别加入含1 5 各组血清d m e m 培 养7 2h 荧光倒置相差显微镜 光学显微镜 透射电子显微镜观察软骨细胞的形态结构 r t p c r 检测软骨细胞c y c l i n d l c d k 4 p 2 1m r n a 表达 3 第3 代软骨细胞培养7 2h 抽签法随机分为凋亡1 组 s n p 终浓度0m m o l l 凋亡2 组 s n p 终浓度0 5m m o l l 凋亡3 组 s n p 终浓度1m m o l l 凋亡4 组 s n p 终 浓度2m m o l l 干预2 4h 荧光倒置相差显微镜观察软骨细胞的形态结构 h o c e h s t3 3 3 4 2 染色鉴定软骨细胞的凋亡 m t t 检测软骨细胞的活性 确定s n p 诱导软骨细胞凋亡的量效 关系 4 第3 代软骨细胞培养7 2h 抽签法随机分为空白组 对照组 实验1 组 实验2 组 实验3 组 分别加入含s n p 终浓度为1m m o l l1 5 各组血清d m e m 培养1 2h 2 4h 3 6 h m t t 检测软骨细胞的活性 确定含药血清的有效干预时间 第3 代软骨细胞培养7 2h l 抽签法随机分组分别加入含s n p 终浓度为1m m o l l1 5 各组血清d m e m 培养2 4h m t t 检测 软骨细胞的活性 h o c e h s t3 3 3 4 2 染色检测软骨细胞的凋亡率 荧光倒置相差显微镜 透射电子显微镜观察软骨细胞的形态结构 a n n e x i nv f i t c p i 检测软骨细胞的早期凋 亡 r t p c r 检测软骨细胞p 5 3 b c l 2m r n a 表达 比色法检测软骨细胞c a s p a s e 一3 c a s p a s e 9 蛋白活性 结果 1 原代 第2 代 第3 代软骨细胞甲苯胺蓝染色 胞浆内呈紫红色异染颗粒 原代 第2 代 第3 代 第4 代 第5 代软骨细胞c o l l a g ei im r n a 表达逐渐降低 原代 第2 代 第3 代明显高于第4 代 第5 代 p o 0 1 透骨消痛胶囊含药血清促进软骨细胞增殖的 有效作用浓度为1 5 有效作用时间为7 2h 干预7 2h 软骨细胞的表型稳定 软骨 细胞o d 值 对照组 实验2 组 实验3 组明显高于空白组 p o 0 5 软骨细胞c y c l i n d l c d k 4m r n a 表达 对照组 实验2 组 实验3 组明显高于空白组 p o 0 5 软骨细胞p 2 1 m r n a 表达 对照组 实验2 组 实验3 组明显低于空白组 p o 0 5 2 干预2 4h s n p 诱导软骨细胞凋亡的有效作用浓度为1m m o l l 透骨消痛胶囊 含药血清抑制软骨细胞凋亡的有效作用时间为2 4h 干预2 4h 软骨细胞o d 值 对照 组 实验2 组 实验3 组明显高于空白组 p 0 0 5 软骨细胞的凋亡率 对照组 实验 2 组 实验3 组明显低于空白组 p 0 0 5 软骨细胞p 5 3m r n a 表达 对照组 实验2 组 实验3 组明显低于空白组 p 0 0 5 软骨细胞b c l 一2m r n a 表达 对照组 实验2 组 实 验3 组明显高于空白组 p o 0 5 软骨细胞c a s p a s e 一3 c a s p a s e 一9 蛋白活性 对照组 实验2 组 实验3 组明显低于空白组 p o 0 5 结论 1 透骨消痛胶囊含药血清能上调软骨细胞周期正向调节因子c y c l i n d l c d k 4 表 达 下调负向调节因子p 2 1 表达 加速软骨细胞周期关键限制点g s 期的切换 促进软骨 细胞周期的进程 并能维持软骨细胞的表型稳定 2 透骨消痛胶囊含药血清能下调软骨细胞促凋亡基因p 5 3 c a s p a s e 一9 c a s p a s e 一3 表达 上调抗凋亡基因b c l 一2 表达 抑制软骨细胞线粒体凋亡通路的信号转导 关键词 骨性关节炎 中药疗法关节软骨含药血清软骨细胞细胞周 期细胞凋亡 透骨消痛胶囊 2 s t u d yo ne f f e c to fd r u g c o n t a i n i n gs e r u m o f t o u g ux i a o t o n g c a p s u l et oc h o n d r o c y t ec y c l ea n da p o p t o s i s m a jo r o r t h o p a e d i c sa n dt r a u m a t o l o g yo ft c m p h dc a n d i d a t e l ix i h a i t u t o r p r o f l i ux i a n x i a n g a b s t r a c t o b j e e t i v e t od i s c u s sm e c h a n i s mo fe f f e c to fd r u g c o n t a i n i n gs e r u mo ft o u g ux i a o t o n gc a p s u l e c h o n d r o c y t ec y c l ea n da p o p t o s i s m e t h o d s 1 6 0n e wz e a l a n dw h i t er a b b i t s w e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o5g r o u p s b l a n kg r o u p o 9 n o r m a ls a l i n eg a v a g e c o n t r o lg r o u p b o l u s5m g m ls o l u t i o ng a v a g e e x p e r i m e n t a l g r o u pl t o u g ux i a o t o n gc a p s u l e2 5m g m ls o l u t i o ng a v a g e e x p e r i m e n t a lg r o u p2 t o u g u x i a o t o n gc a p s u l e5m g m as o l u t i o ng a v a g e e x p e r i m e n t a lg r o u p3 t o u g ux i a o t o n gc a p s u l e 10m g r r as o l u t i o ng a v a g e 2 0m l t i m e 2t i m e s d a y 3c o n s e c u t i v ed a y s a b d o m i n a la o r t i c b l o o dc o l l e c t e da n dp r e p a r e dd r u g c o n t a i n i n gs e r u m 2 c a r t i l a g ew a si s o l a t e df r o mt h ek n e ej o i n to f3 2n e w z e a l a n dw h i t er a b b i t sa n du s e dt o e s t a b l i s hc u l t u r e dp r i m a r yc h o n d r o c y t e s c h o n d r o c y t e sw e r ei d e n t i f i e dw i t ht o l u i d i n eb l u e s t a i n i n g a n dt h em r n ae x p r e s s i o no fc o l l a g ei i b yr t p c r t h e3 r dg e n e r a t i o no f e h o n d r o c y t e sa f t e rs y n c h r o n i z a t i o n w e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ob l a n kg r o u p c o n t r o lg r o u p e x p e r i m e n t a lg r o u p1 e x p e r i m e n t a lg r o u p2 e x p e r i m e n t a lg r o u p3 w h i c hw e r ea d d e dt oe a c h g r o u pc o n t a i n i n g15 s e r u md m e m a n dc u l t u r e df o r2 41 1 4 8h 7 2ht od e t e c tt h ea c t i v i t yo f c h o n d r o c y t e st h r o u g hm t lc y c l ed i s t r i b u t i o no fc h o n d r o c y t e sw i t hf l o wc y t o m e t r yt o d e t e r m i n ee f f e c t i v ei n t e r v e n t i o nt i m e o fd r u g c o n t a i n i n gs e r u m t h e3 r d g e n e r a t i o n o f c h o n d r o c y t e sa f t e rs y n c h r o n i z a t i o n w e r ea d d e dt oe a c hg r o u pc o n t a i n i n g15 s e r u md m e m a n dc u l t u r e df o r7 2l l c h o n d r o c y t e sm o r p h o l o g yw e r eo b s e r v e du n d e rf l u o r e s c e n ti n v e r t e d 3 p h a s ec o n t r a s tm i c r o s c o p e o p t i c a lm i c r o s c o p ya n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p i c t h e m r n a e x p r e s s i o no fc y c l i n d1 c d k 4 a n d p 21b yr t p c r 3 t h e3 r dg e n e r a t i o nc h o n d r o c y t e sc u l t u r e df o r7 2l l w e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o a p o p t o s i s1g r o u p s n pf i n a l c o n c e n t r a t i o no f0m m o l l a p o p t o s i s2g r o u p s n pf i n a l c o n c e n t r a t i o no f0 5r e t o o l l a p o p t o s i s3g r o u p s n pf i n a lc o n c e n t r a t i o no f1m m o l l a p o p t o s i s4g r o u p s n pf i n a lc o n c e n t r a t i o no f2m m o l l a n df u r t h e rc u l t u r e df o r2 4h t h e i n d u c e d a p o p t o s i s a n dm o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o fc 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l t s 1 i d e n t i f i c a t i o no fc h o n d r o c y t e s i t l lt o l u i d i n eb l u es t a i n i n g t h ec y t o p l a s mw e r ep u r p l e m e t a c h r o m a t i cg r a n u l e si nt h eo r i g i n a lg e n e r a t i o n 2 n dg e n e r a t i o n 3 r dg e n e r a t i o n e x p r e s s i o n o fc o l l a g ei im r n a g r a d u a l l yd e c r e a s e df r o mt h eo r i g i n a lg e n e r a t i o nt o5 t hg e n e r a t i o n a n d t h eo r i g i n a lg e n e r a t i o n 2 n dg e n e r a t i o n 3 r dg e n e r a t i o nw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a n4 t h g e n e r a t i o n 5 t hg e n e r a t i o n p 0 0 1 t o u g ux i a o t o n gc a p s u l ec o n t a i n i n gs e r u mp r o m o t e c h o n d r o c y t e sp r o l i f e r a t i o ni ne f f e c t i v ec o n c e n t r a t i o no f15 e f f e c t i v et i m eo f7 2h a f t e r7 2 hi n v e n t i o n t h ep h e n o t y p i cs t a b i l i t yo fc h o n d r o c y t e s c h o n d r o c y t e so dv a l u e so fc o n t 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p r e s s i o no fb c l 2 a n di n h i b i tc h o n d r o c y t em i t o c h o n d r i a ls i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y o fa p o p t o s i s k e yw o r d s o s t e o a r t h r i t i s t c dt h e r a p y a r t i c u l a rc a r t i l a g e d r u g c o n t a i n i n g s e r u m c h o n d r o c y t e s c e l lc y c l e a p o p t o s i s t o u g ux i a o t o n gc a p s u l e 5 中英文缩略词表 英文缩写英文全称中文全称 b p o a o d e b i 玎 p i r p m r n a f b s s n p p c d c d k p c r p b s r n a s e d m s o g a g s d e p c d d h 2 0 c d c d n a d 脚 b a s ep a i r 碱基对 o s t e o a r t h r i t i s 骨性关节炎 o p t i c a ld e n s i t y光密度 e t h i d i u mb r o m i d e r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p r o l i f e r a t i o ni n d e x r o i l sp e rm i n u t e b on u c l e i ca c i d f o e t a lb o v i n es e r u m s o d i u mn i t r o p r u s s i a t e p r o g r a m m e dc e l ld e a t h c y c l i n d e p e n d e n tk i n a s e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e r i b o n u c l e a s e d i m e t h y ls u l f o x i d e g l y c o s a m i n o g l y c a n s d i e t h y p y r o c a r b o n a t e d o u b l ed i s t i l l a t e dw a t e r c y c l i n d e p e n d e n tk i n a s ei n h i b i t o r c o m p l e m e n t a r yd e o x y n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o n u e l e o s i d et r i p h o s p h a t e 溴乙锭 逆转录 增殖指数 每分钟转数 核糖核酸 优等胎牛血清 硝普钠 细胞程序性死亡 细胞周期依赖性蛋白激酶 聚合酶链反应 磷酸盐缓冲液 核糖核酸酶 二甲基亚砜 糖胺多糖 焦碳酸二乙酯 双蒸水 细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子 互补脱氧核糖核酸 三磷酸脱氧核糖核苷 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳 d m e m d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i u m 改良的e a g le 培养基 6 透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞周期与凋亡影响的研究 前言 骨性关节炎 o s t e o a r t h r i t i s o a 是中老年人常见的慢性 进行性骨关节疾病 也是影响中老年人身体健康 导致关节功能残疾的主要疾病之一 临床表现以慢性疼痛 为主 活动时加剧 属中医 痹证 范畴 正虚是发病的内在因素 外邪侵袭是发病的 诱因 素问 上古天真论 女子七岁 肾气盛 齿更发长 二七 而天癸至 任脉通 太冲脉盛 月事以时下 故有子 三七 肾气平均 故真牙生而长极 四七 筋骨坚 发长极 身体盛壮 五七 阳明脉衰 面始焦 发始堕 六七 三阳脉衰于上 面皆焦 发始白 七七 任脉虚 太冲脉衰少 天癸竭 地道不通 故形坏而无子也 丈夫八 岁 肾气实 发长齿更 k 肾气盛 天癸至 精气溢泻 阴阳和 故能有子 三八 肾气平均 筋骨劲强 故真牙生而长极 四八 筋骨隆盛 肌肉满壮 五八 肾气衰 发堕齿槁 六八 阳气衰竭于上 面焦 发鬓颁白 七八 肝气衰 筋不能动 天癸竭 精少 肾脏衰 形体皆极 八八 则齿发去 以女七男八为基数 阐述了不同年龄段 人的生理变化特点 明确指出人体生 长 壮 老 已的自然规律 中老年人的机体开始衰老 肝肾功能衰退 气血不足 致筋脉失养关节活动不利 又年老体虚 卫外不固 风寒湿之邪侵袭 痹阻经络骨节 气血运行不畅而为痹 景 岳全书 盖痹者闭也 以气血为邪所闭 不得通行而病也 肾主骨 肝主筋 肝肾 亏虚 不能充养温煦筋骨 筋骨失养易留邪不去 瘀血渐成 致痹证迁延不愈 素问 痹 论 所谓痹者 各以其时 重感于风寒湿之气也 时 指五脏气旺的季节 肾气 旺于冬季 寒为冬季主气 冬季感受三邪 肾先应之 故寒气伤肾入骨 使骨重不举 痹阻经络致气血不行 关节闭塞 筋骨失养 渐至筋挛 关节变形 不得屈伸 形成骨 痹 骨性关节炎疼痛病机 可分为虚实两类 肝肾亏虚 气血虚弱 致筋骨失于润养温 煦 即不荣则痛 属虚证 风寒湿邪的侵袭与结聚 致经络气血瘀阻不通 即不通则痛 属实证 总之 骨性关节炎属本虚标实 本萎标痹 病机是肝肾亏虚为病变之根本 风 寒湿邪是致痹外因 瘀血是病变过程中的病理产物 亦为致病因素 透骨消痛胶囊由巴戟天 白芍 川芎和肿节风组成 具有补肾柔肝 活血祛风 的功效 长期应用于临床 效果良好 是福建中医学院附属第二人民医院的院内 制剂n 1 透骨消痛胶囊以 肾主骨 肝主筋 为依据 针对骨性关节炎的发病机制 以巴戟天补肾为君药 白芍柔肝为臣药 川芎 肿节风活血祛风为佐使药 图1 巴 戟天辛 甘 微温 归肾 肝经 能补肾助阳 祛风除湿 白芍苦 酸 微寒 归肝 脾经 能益血敛阴 柔肝止痛 川芎辛 温 归肝 胆 心包经 能活血行气 祛风止 痛 为血中气药 肿节风苦 辛 微温 归心 肝经 能祛风除湿 活血通络 透骨消 痛胶囊配伍要点为心1 1 补肾柔肝 肝肾同源 肝肾同健痹自歼 白芍养血柔肝以 7 福建中医药大学博士学位论文 助固本 2 补肾活血 血行痹自解 川芎活血行血 血行风自灭 3 补肾止痛 痛解痹自停 川芎活血通络 白芍柔肝止痛 4 补肾祛风 风去痹自灭 肿节风祛风 除湿止痹痛 此外 白芍与川芎合用 养血 活血兼顾 活血而不伤正 柔肝 疏肝 并举 疏肝解郁而不损肝阴 图l 透骨消痛胶囊的配伍原理 本课题组前期研究表明 1 透骨消痛胶囊能有效抑制炎性细胞因子 m m p 一3 氧 自由基的生物学效应 延缓关节软骨的退变口1 2 透骨消痛胶囊通过调节软骨下骨 c f o s 1 3 一c a t e n i n r a n k l m m p 一1m r n a 的表达 调控成骨细胞与破骨细胞之间的动态 平衡 干预骨吸收一骨形成偶联的失衡 从而抑制软骨下骨的骨重塑h 1 3 透骨消痛 胶囊通过改善关节软骨的功能 减少异常应力的传导 降低了异常力学信号刺激产生的 骨小梁微骨折及骨形成机制的启动 从而抑制力学因素引起软骨下骨的骨重塑畸3 4 透骨消痛胶囊具有延缓关节宏观形态 软骨细胞及软骨基质的退变作用 1 5 透骨消 痛胶囊治疗早 中期骨性关节炎的疗效较好盯1 总之 透骨消痛胶囊能降低软骨下骨的 高转化率 早期抑制软骨下骨的骨吸收 中后期抑制软骨下骨的骨形成 从而有效调控 软骨细胞 软骨基质及软骨下骨三者降解和合成正常偶联的失衡 改善软骨下骨的骨重 塑 延缓关节软骨的退变 骨性关节炎是生物学和力学因素共同作用下引发软骨细胞 软骨基质及软骨下骨三 者降解与合成正常偶联失衡的结果 生物和力学因素的相互影响是发病的原因 软骨退 变是发病的根本 也是启动骨性关节炎病理进程的首要因素隅 9 1 关节软骨主要由软骨细 胞和软骨基质组成 软骨细胞能感受关节内微环境的变化而作出应答 调整软骨基质成 分降解与合成的动态平衡 从而维持关节内微环境的稳定n 0 1 1 1 软骨细胞的增殖 分化 凋亡在关节软骨的形成 新陈代谢及损伤修复过程中发挥重要的调控作用n 2 1 引 如何有 效调控软骨细胞的功能 维持关节软骨的正常生物学功能 是目前研究的难点之一 细胞周期 c e l lc y c l e 调控着细胞增殖 分化和凋亡的过程 是影响细胞功能的重 要因素之一 t 闭 细胞周期调控可分为外源性调控和内源性调控 外源性调控主要是细 胞因子和外界各种刺激因素引起 内源性调控主要是通过细胞周期蛋白 c y c l i n 细胞 周期蛋白依赖性激酶 c y c l i n d e p e n d e n tk i n a s e c d k 细胞周期依赖性蛋白激酶抑制 因子 c y c l i n d e p e n d e n tk i n a s ei n h i b i t o r c d k i 之间的相互协调 实现复杂的网络 调控作用 图2 c y c l i n 在细胞周期调控中发挥正向调节因子的作用 c d k 是决定细胞 8 透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞周期与凋亡影响的研究 是否继续增殖的关键因素 c d k i 在细胞周期调控中发挥负向调节因子的作用 正负调节 因子之间的稳定协调是调控细胞周期各时相顺利切换的关键因素n 6 1 引 细胞周期中存在 两个限制点 一个限制点在d n a 合成开始 即g s 限制点 另一个在有丝分裂开始 即g m 限制点 其中g s 限制点更为重要 细胞能否越过此限制点是决定细胞是否增殖的关键 口8 1 引 细胞周期调控的实质也就是细胞周期限制点的调控 是多因素参与的复杂信号转 导过程 因此 如何通过调控软骨细胞的周期 促进软骨细胞的增殖 可能是防治骨性 关节炎的一个潜在有效途径 gr o w t hf a c t o r s 图2 细胞周期 细胞凋亡 a p o p t o s i s 又称细胞程序性死亡 p r o g r a m m e dc e l ld e a t h p c d 是一 种在特定时间与空间中主动发生的 受基因严密调控的细胞程序死亡现象 细胞凋亡过 程分为凋亡信号的转导 凋亡基因的激活 凋亡的执行 凋亡细胞的清除四个阶段 是 一个复杂的信号网络调控系统脚 2 在正常情况下 软骨细胞也存在着凋亡的现象 软 骨细胞凋亡对维持关节软骨的形态结构功能发挥重要的调控作用 不同年龄组动物关节 软骨中细胞凋亡程度与年龄增长有关 软骨细胞的凋亡在成熟关节软骨形态结构的维 持 再建和更新过程中也发挥重要的调控作用 若软骨细胞的凋亡超出一定的范围 会 导致软骨细胞的数量减少 软骨细胞数量的变化不仅引起软骨基质合成与分泌的减少 而且还能引起维持软骨基质合成与降解酶系统平衡的紊乱 最终引起软骨基质的质与量 发生变化 软骨基质的这种变化又会促进软骨细胞的凋亡 如此形成恶性循环 从而导 致关节软骨退变的发生吻 船1 线粒体凋亡通路是软骨细胞凋亡的主要途径之一 图3 线粒体的功能障碍 不仅会导致兴奋性氨基酸释放增多 钙离子超载 自由基产生增加 9 福建中医药大学博士学位论文 引起软骨细胞的凋亡 还能直接诱导软骨细胞的凋亡 因此 如何有效调控线粒体凋亡 通路的信号转导 抑制软骨细胞的凋亡 延缓关节软骨的退变 可能为骨性关节炎的防 治开辟一个新视角 c e l l u l a rt a r l e t s 山 图3 线粒体凋亡通路 目前存在的主要问题 如何有效调控软骨细胞增殖 分化和凋亡信号转导通路的复 杂网络系统 如何有效防止软骨细胞的功能衰退 延缓关节软骨的退变 维持正常关节 软骨的生物力学功能 从而改善临床症状 提高生活质量 可能成为防治骨性关节炎的 新方向 传统中药具有多层面 多途径 多靶点的复杂调控作用 可通过机体的有效整 合 干预软骨细胞内信号转导通路 调节软骨细胞增殖 分化和凋亡的过程 改善软骨 细胞生存的微环境 从而调控软骨细胞的生物学功能 本研究采用新西兰大白兔关节软骨建立体外培养的软骨细胞 并运用细胞生物学的 研究方法 通过观察透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞的周期分布 周期调控基因 c y c l i n d l c d k 4 p 2 1 表达及凋亡调控基因b c l 一2 p 5 3 c a s p a s e 一3 c a s p a s e 9 表达的 影响 图4 探讨透骨消痛胶囊影响体外培养软骨细胞周期与凋亡的作用机制 可能为 中医药防治骨性关节炎提供科学的理论依据 l o 透骨消痫胶囊含药血清对软骨细胞周期与凋亡影响的研究 i 空白组 n s l 对照组 壮骨 l 钨 n 搿撕m 口啷州女锛够锄 搿糍辅 糍 鼎 井 镕 珊 女 谚 幽和蚓 g 一1 一 獭璧蔫篇搿 体外培养灵 竺竺 三 含药血清 软骨细胞 凋亡模型 缈 一 s o j 登望堂 l 塑 苎氅 黧塑挚曼 j 篓匀 含药血清干预j 吟 软骨细胞凋亡调控基因 鲰 隧 细胞l 细胞l 软骨细胞形态 i 基因 l 细胞 细胞 f 玟菁蓊翮悉1 基因 蛋白l 漱彩濑燃乙 璧携夔鳃j 溶刘潺蟛b 爨彭嘲到溶 瀵到 图4 实验技术路线 一高一飞 巫巫 验 每一 鼯 臣 豳吟 f l够 组z 龄一 2 l 丘 镕 一验 纠一 匦圜 透篓由一 傀 辁一 一验 哪一 匦匦 福建中医药大学博士学位论文 实验一透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞g 期调控基因影响的研究 目的 采用机械一酶消化法分离4 周龄新西兰大白兔膝关节软骨的软骨细胞 建立体 外培养的软骨细胞 甲苯胺蓝染色 r t p c r 检测c o l l a g ei im r n a 鉴