[2]GS与GH在氨基葡萄糖药代动力学及关节滑液浓度的比较研究.doc

硫酸氨基葡萄糖和盐酸氨基葡萄糖在氨基葡糖药代动力学及滑液氨基葡糖水平的比较作者姓名：M.Meulyzer DVM1, P.Vachon DVM2, Dipl A.C.L.A.M2, F.Beaudry2, T.Vinardell1, H.Richard1, G.Beauchamp2, S.Laverty M.V.B.1作者单位：1. 加拿大 Montreal大学 临床医学系 2. 加拿大 Montreal大学 生物医学系文献出处：Osteoarthritis and Cartilage 2008;16:973-979【摘要】目的：比较使用治疗剂量的硫酸氨基葡萄糖和盐酸氨基葡萄糖后，氨基葡糖的药代动力学及其滑液氨基糖水平的差异。方法：选择八匹成年雌性马为研究对象，按20 mg/kg标准静脉注射或者鼻饲硫酸氨基葡萄糖(意大利罗达生产)或者盐酸氨基葡萄糖。给药前及在给药后的5，15，30，60，120，360，480，720分采集血液标本。另外，在给药前48时及给药后的1，6，12时从受试对象的腕关节处采集滑液标本。液相色谱质谱连用技术分析采集标本中的氨基葡萄糖。结果：静脉注射或鼻饲两种氨基葡萄糖盐后的血浆浓度分别为50g/mL，1g /mL。口服给药后生物利用度中位数分别为9.4% （硫酸氨基葡萄糖）和6.1%（盐酸氨基葡萄糖）。硫酸氨基葡萄糖和盐酸氨基葡萄糖分别口腔给药，结果发现在给药后的1时，6时前者的滑液浓度明显高于后者。此外，给药后12时前者的血浆和滑液浓度仍然明显高于基值，但盐酸氨基葡萄糖则不然。结论：口腔给药后，与盐酸氨基葡萄糖相比，硫酸氨基葡萄糖用药后的滑液氨基葡糖水平明显较高。这种差异是否对关节组织的治疗具有临床意义有待阐明。关键词：氨基葡萄糖，软骨，骨关节炎，Neutraceutical，马引言骨关节炎的理想药品一方面既能要治疗疾病，另一方面又要有改善病情的效果，此外，还要副作用最小。几项调查研究表明，氨基葡萄糖恰能符合这个标准。然而，一些研究还未能发现其确切疗效。此外，氨基葡萄糖在骨关节炎方面的疗效还仍存争议。两项前瞻性持续3年的随机对照人类临床研究表明，口服可氨基葡萄糖以减慢骨关节炎的病情进展，这种结论恰好证实了硫酸氨基葡萄糖为改善骨关节炎病情药物的说法。骨关节炎动物实验模型结果表明，盐酸氨基葡萄糖具有改善病情的效果。然而该项试验研究强调，盐酸氨基葡萄糖该种疗效甚微，这是由于某些动物在接受氨基葡萄糖后关节软骨仍存在溃疡现象。尽管有关骨性关节炎的多中心双盲临床试验研究中使用的是硫酸氨基葡萄糖，但其在改善骨关节炎病情方面的效果还存在争议。氨基葡萄糖/软骨素关节炎干预试验（GAIT）最近研究结果表明，盐酸氨基葡萄糖500mg/次，3次/d，其效果与服用安慰剂并无差异。中度重度膝关节痛患者联合服用500mg盐酸氨基葡萄糖和400mg硫酸软骨素，每天服用三次，疼痛症状明显改善。相反，氨基葡萄糖动物模型研究委员会实验研究报道，每日服用1500mg硫酸氨基葡萄糖，Lequesne 指数明显提高。这两种实验结果的差异激起人们对氨基葡萄糖在骨关节炎疗效方面的争论。 欧洲国家，氨基葡萄糖专利制剂为医生处方药，而北美国家将其列为膳食补充剂。意大利罗达集团生产的一种硫酸氨基葡萄糖（(DonaR,Viartril-S, Xicil或其它商标) 按氨基葡萄糖，硫酸，氯，钠离子2:1:2:2配制而成。其它非处方形式的氨基葡萄糖制剂可能为硫酸氨基葡萄糖，盐酸氨基葡萄糖或N -乙酰氨基葡萄糖，但质量较差，成分含量也只有商标标示含量的百分之几。 有关氨基葡萄糖在吸收，药代动力学及滑液浓度方面的资料有限。Lavertyet al一项大的动物实验模型研究表明，在服用推荐摄入剂量的盐酸氨基葡萄糖后，氨基葡萄糖进入关节滑液。而同一时刻，滑液中氨基葡萄糖的浓度较血清中该成分的浓度低10%，这表明，吸收入体内的绝大部分氨基葡萄糖被代谢或者为其它组织所分解，因此不能充分利用血液循环运输至关节滑液。令骨关节炎患者不断服用临床治疗剂量的硫酸氨基葡萄糖，测定滑液中氨基葡萄糖的浓度，结果表明，滑液中氨基葡萄糖浓度仅比血浆中的浓度低23.5%。 荟萃分析中推测，不同的实验结果或许与使用的氨基葡萄糖制剂形式不同有关，大多素情况下，硫酸氨基葡萄糖对骨关节炎的治疗有正面影响作用。两种盐酸制剂的生物利用度与疗效的差异未知。也有论断：两种氨基酸盐吸收差别可由不同的盐类组成来解释。 本实验研究的目的：两种氨基酸盐类的药代动力学比较，及用药后滑液氨基葡萄糖水平的差异分析。方法材料意大利Rotta制药厂出产的硫酸氨基葡萄糖，盐酸氨基葡萄糖（产品编码：G1514，纯度99），内标准（茶碱）取自SigmaeAldrich（密苏里州圣路易斯，美国）。其它化学物质乙腈和甲酸购自日本烟草贝克（菲利普斯堡，新泽西州，美国）。动物研究选择八匹成年雌性马，平均体重45942 kg，平均年龄14.42.1岁，且均无关节炎症。持续治疗四周，第一周，所有马匹空腹12小时，鼻饲硫酸氨基葡萄糖，一周后再进行静脉注射同种药物。第三周，第四周分别鼻饲、静脉注射盐酸氨基葡萄糖。用0.9%的生理盐水溶解硫酸氨基葡萄糖（Dona）和实验中使用的盐酸氨基葡萄糖至100 mg/mL，调节PH至6.0。按20 mg/kg的标准鼻饲或者静脉注射。其中鼻饲剂量还包括服药后灌注的500 ml的0.9%无菌生理盐水。右颈内静脉插入导管筋脉注射，然后用20ml生理盐水冲洗导管以保证药物成分完全进入实验对象体内。对侧颈静脉插入导管，在用药前48时及用药后的5，15，30，60，120，360，480，720分时采集血液样本，并保存在乙二四乙酸（EDTA）中。采用无菌关节穿刺术，在用药前的48时的双侧腕关节及用药后的1，6，12时单侧腕关节抽取滑液。分别在鼻饲用药后的1时，12时于左侧桡腕关节，6时于右侧桡腕关节抽取滑液。静脉给药后重复相同的操作。使用离心机对采集到的滑液和血液标本以每分钟1000转的速度进行分离，持续转动20分钟，静置几分钟，弃除上层清夜并冷冻（80）保存，进行氨基葡萄糖分析。对马的骨关节症状进行观察，每隔两天干预一次，随之每隔一天进行一次干预。该实验经过了动物使用和保护委员会批准。血浆和滑液内氨基葡萄糖的定量测定结果采用液相色谱电喷雾串连质谱测定血浆和滑液中氨基葡萄糖的浓度。具体研究细则已出版报道。通过对氨基葡萄糖浓度为20, 40，60 ng/mL的血浆和滑液六份标本，及如图1所示的标准曲线进行分以析检测试验的可重复性。为保证实验结果的准确性，需要除去内源性物质水平。（%标准值=(测量浓度内源性物质浓度)/强化浓度100）。血浆和滑液观察值的精密度和准确性分别为5.3-11.3%，87.8-107.2%与6.2 -11.2%，85.5-113.1%。精密度范围5.28.2%,准确性范围90.8112.9%,。同样计算生理盐水标准液的精密度和准确性，并控制在15%。根据FDA在2001年5月发布生物分析指南，定量限控制在10 ng/mL，达到了可接受的精确度和准确度。药代动力学采用非房室模型的方法计算马血浆中氨基葡萄糖的药代动力学参数。利用线性梯形规则计算0-12h曲线下面积。采用血浆最低三种浓度标液计算受试机体最终消除率，半衰期=(ln 2)/kel 0-曲线下面积=AUC0-12h +Clast/kel,总消除率CL等于总消除速率常数dx/dt对全血或者血浆药物浓度C的比值。平均驻留时间（MRT）=AUMC/AUC。分布面积=CLMRT。表观清除率可由AUC0-inf面积分割得出。同样测定血浆峰值浓度及峰值时间。硫酸氨基葡萄糖和盐酸氨基葡萄糖的生物利用度（F）=(AUC0inf NG/AUC0-inf IV) (DoseIV/DoseNG).数据分析对于每个药代动力学参数，使用威氏符号秩次检验对每个受试组的中位值进行比较。 采用重复测量线性模型测量内源性氨基葡萄糖的水平，并进行比较（硫酸氨基葡萄糖和盐酸氨基葡萄糖），且把两种盐类作为重复变量因素。重复测量线性模型中把两种氨基酸盐作为不断重复的因子，分别在使用两种盐后的1，6，12时于滑液中测定氨基葡萄糖的浓度。先验对比检查每一时刻实验的差异。根据药效使服用剂量趋于正常化。结果整个实验过程中，实验动物的耐受性很好，并无副作用。仅一匹马出现沈郁质，在关节穿刺术之前给予镇静药。静脉给药后血浆氨基葡萄糖数值表1 静脉给药后血浆药物动力学参数比较硫酸氨基葡萄糖盐酸氨基葡萄糖均值（SD） 中位数（范围）均值（SD） 中位数(范围)AUC012h,mg/h/L 56.08(14.01) 53.71(41.1177.10) 51.16 (12.66) 53.62 (34.4566.99) AUC0inf,mg/h/L 57.64(14.42) 55.47 (41.4777.67 ) 52.28 (12.79) 55.41 (35.0567.55) T1/2, h 2.30 (0.40) 2.40 (1.702.90) 2.16 (0.35) 2.10 (1.682.60) CL, L/h/kg 0.29 (0.07) 0.29 (0.200.38) 0.34 (0.09) 0.30 (0.250.47) MRT, h 2.14 (0.53) 2.10 (1.483.10) 1.85 (0.34) 1.70 (1.432.37) Vd, L/kg 0.61 (0.17) 60 (0.300.81) . 62 (0.20) 0.66 (0.350.86)AUC012h为0-12h血浆药物浓度-时间曲线下面积； AUC0inf为服药后的血浆药物浓度-时间曲线下面积。T1/2半衰期；CL为清除率；MRT为平均滞留时间；Vd为表观分布容积图2为静脉给硫酸氨基葡糖和盐酸氨基葡萄糖后在选定时刻血浆氨基葡萄糖浓度均数标准差。从这两种酸盐的药代动力学分布图可以看出，在静脉给药的头2个小时血浆浓度内急剧下降，随后的时间内变化较为缓慢，用药后12时平均血浆浓度分别为：硫酸氨基葡萄糖433.3245.1 ng/mL；盐酸氨基葡萄糖305.0136.4 ng/mL。， 静脉给两种酸盐后的AUC0-12h 与AUC0-inf的差别均无统计学意义，药物代谢半衰期不同:硫酸氨基葡萄糖1.7h2.9h；盐酸氨基葡萄糖1.7h2.6h，但这种差别是与动物之间的个体差异有关。半衰期（T1/2），总清除率（CL），平均滞留时间(MRT) 及平均表观分布积Vd.差异均无统计学意义。 鼻饲给药后血浆氨基葡萄糖的定量数参数血浆氨基葡萄糖浓度在鼻饲给药后的30分钟-2小时内迅速达到最高值，平均最大血浆浓度分别为：硫酸氨基葡萄糖1077.8171.0 ng/mL；盐酸氨基葡萄糖935.7267.8 ng/mL，二者差异无统计学意义。血浆浓度达到峰值后随渐进性下降至平均值（用药后12时）：硫酸氨基葡萄糖131.0 52.1 ng/mL；盐酸氨基葡萄糖48.4 31.0 ng/mL。此刻，对盐酸氨基葡萄糖来说，血浆氨基葡萄糖水平和体内基值水平之间并无显著性差异，而硫酸氨基葡萄糖则不然（P 0.03）鼻饲给药后，血浆氨基葡萄糖浓度的一些药代动力学参数的描述性分布如表2。两种酸盐的半衰期中位数分别为：硫酸氨基葡萄糖：4.0 h（范围：2.84.7h）；硫酸氨基葡糖：3.0 h（范围：1.84.1）(P=0.055)。与盐酸氨基葡萄糖相比，鼻饲给药后硫酸氨基葡萄糖的血浆氨基葡萄糖浓度曲线下面积AUC0-12h与AUC0-inf相对较高(P=0.02，P=0.008)。而氨基葡萄糖的表观清除率CL/F，前者要高于后者（P=0.008）。二者生物利用度中位数之间无显著性差异（P=0.08）。口服生物利用度中位数分别为：硫酸氨基葡萄糖：9.4%；盐酸氨基葡萄糖6.1%。表2 鼻饲给药后血浆氨基葡萄糖水平比较硫酸氨基葡萄糖盐酸氨基葡萄糖均值（SD） 中位数（范围）均值（SD） 中位数(范围)AUC012h,mg/h/L 4.86 (1.42) 4.58* (3.297.76) 3.23 (0.79) 3.36* (1.864.27) AUC0inf,mg/h/L 5.61 (1.69) 5.08* (3.919.01) 3.47 (0.86) 3.60* (2.014.59) Cmax, mg/mL 1.08 (0.17) 1.13 (0.831.30) 0.94 (0.27) 0.90 (0.581.30) Tmax, h 0.86 (0.52) 0.80 (0.502.00) 0.81 (0.26) 1.00 (0.501.00T1/2, h 3.90 (0.70) 4.00 (2.804.60) 2.88 (0.80) 3.00 (1.804.10)CL/F, L/h/kg 2.99 (0.77) 3.09*(1.744.01) 5.10 (1.54) 4.62* (3.618.27)Bioavailability, % 10.80 (5.60) 9.40 (5.2021.70) 6.90 (2.10) 6.10 (3.9010.30)AUC012h为0-12h血浆药物浓度-时间曲线下面积； AUC0inf为服药后的血浆药物浓度-时间曲线下面积。 Cmax为最大血浆药物浓度； Tmax达到最大血浆药物浓度所需时间；T1/2半衰期；CL/F为表观清除率； *P 0.05 图2. 20 mg/kg静脉给药氨基葡萄糖的平均血浆浓度A:硫酸氨基葡萄糖B;盐酸氨基葡萄糖；20 mg/kg鼻饲给药后氨基葡萄糖的平均血浆浓度C：硫酸氨基葡萄糖D：盐酸氨基葡萄糖静脉，鼻饲给药后滑液氨基葡萄糖水平 鼻饲给药前滑液内硫酸氨基葡萄糖血浆浓度范围10 ng/mL24.6ng/mL.。其与内源性血浆氨基葡萄糖及其测得值之间并无显著性差异。 鼻饲给药：滑液内最大氨基酸葡萄糖浓度分别为：硫酸氨基葡萄糖：153.6 32.9 ng/mL；盐酸氨基葡萄糖：92.734.9 ng/mL。给药后12时滑液浓度分别降至为：硫酸氨基葡萄糖：36.4 25.0 ng/mL；盐酸氨基葡萄糖：12.3 6.2 ng/mL；鼻饲给药后的1时（P=0.0004）和6时(P=0.02)两种酸盐经代谢运输至滑液内的氨基葡糖浓度差异有统计学意义,，而12时（P=0.07）浓度差异并不显著。然而，口服硫酸氨基葡萄糖后此刻的滑液内氨基葡萄糖水平明显高于基值（P=0.03）。相反，盐酸氨基葡萄糖此刻的差异并不显著。静脉给药：滑液内最大氨基酸葡萄糖弄对分别为：硫酸氨基葡萄糖：1687.4 809.2 ng/mL；盐酸氨基葡萄糖：1487.7830.8 ng/mL，分别是最大血浆浓度的4.02，3.38%。静脉给药后不同试验组之间滑液氨基葡萄糖浓度无显著性差异。表3 静脉、鼻饲给药后滑液内氨基葡萄糖水平比较硫酸氨基葡萄糖盐酸氨基葡萄糖均值（SD） 中位数（范围）均值（SD） 中位数(范围)静脉给药1 1687.4(809.2) 1493.9(431.03169.0) 1487.7(830.8) 1565.4(299.52539.5)6 517.9 (266.8) 469.3 (126.31023.4) 505.2 (239.4) 521.7 (173.0801.612 500.7 (296.6) 409.2 (208.81153.0) 480.2 (251.8) 398.5(235.5890.0) 鼻饲给药1 153.6 (32.9) 158.3* (104.9199.5) 92.7 (34.9) 88.9* (50.0156.7)6 52.3 (17.3) 57.3* (21.469.9) 19.9 (10.3) 14.4* (10.435.812 36.4 (25.0) 24.2 (16.184.1) 12.3 (6.2) 10.5 (blq20.7)Blq 低于定量极限 (10 ng/mL).； *P 0.05.讨论 本次实验研究表明，鼻饲用硫酸氨基葡萄糖（Dona）和盐酸氨基葡糖后，滑液氨基葡萄糖浓度水平前者要明显高于后者，而静脉给药并不能得出该实验结论，这表明吸收或者代谢或许是该差异的原因。这还可用硫酸氨基葡萄糖的绝对生物利用度相对较高来解释。然而，二者在不管是在生物利用度还是平均最大血药浓度方面差异均无统计学意义。该次实验中口服生物利用度中位数分别为：9.4%，6.1%。先前的动物实验研究曾报道：分别给鼠，狗和马灌注盐酸氨基葡萄糖，结果发现硫酸氨基葡萄糖的生物利用度分别为19%，12%，2-5%。该结果差异或许与物种不同，及研究过程中使用的究方法，氨基葡萄糖的制剂形式，资料分析方法的不同引起。利用放射性标记的葡萄糖测得，人类硫酸氨葡萄糖的绝对生物利用度为44%。该研究方法保证了原型药物及其代谢产物之间的一致性，生物利用度测得值有可能偏高。氨基葡萄糖可在滑膜，及其它关节周围结构处发挥其生物效应。研究显示，服用一定临床剂量的盐酸氨基葡萄糖可以在一定程度上抑制关节炎患者软骨下骨改变。氨基葡萄糖血浆水平更能支持该论证。本次实验中，口腔给予两种酸盐药物，硫酸氨基葡萄糖的血浆药物浓度要高于盐酸氨基葡萄糖血浆水平，但两结果之间并无显著性差异。因此口腔给药后的最大血浆药物浓度并不能用来解释硫酸氨基葡萄糖的临床疗效高于盐酸氨基葡萄糖。鼻饲给药后硫酸氨基葡萄糖的血浆药物浓度时间曲线面积AUC0-12h 与AUC0-inf显著高于盐酸氨基葡萄糖，同时氨基葡萄糖的清除率前者要显著低于后者。但静脉给药后血浆药物浓度及清除率的差异均无统计学意义。以上数据提示，药物制剂形式或许是差异的根本原因所在。氨基葡萄糖盐酸盐纯度较高，并不能显著影响氨基葡萄糖的吸收和代谢。相反，市面上存在的硫酸氨基葡萄糖（Dona）还含有其它物质，诸如钠，氯，阿斯巴甜，柠檬酸，山梨醇，聚乙二醇400（聚乙二醇400）和苯等物质，增加了药物的适口性。但聚乙二醇400可能改变氨基葡萄糖的溶解性和溶出能力，从而影响其吸收，代谢及清除率。因此，硫酸氨基葡萄糖的生物效能在某种程度上可以归因于药物制剂形式及暴露在较高氨基酸葡萄糖浓度的时间，这使得药物充分渗透至关节处，引起滑液内较高的药物浓度。有趣的是，人类重复剂量硫酸氨基葡萄糖实验得出，平均最大稳态浓度为1601.9ng/mL (8.9 M)，这表明人类硫酸氨基葡萄糖的生物利用度较高。后期硫酸氨基葡萄糖的研究发现，用药48时后氨基葡萄糖血浆浓度仍然高于基值，采用每日一次，连续用药三天的服用方法，结果显示，硫酸氨基葡萄糖的药代动力学仍处于稳定状态。本次研究数据是在服用单一剂量氨基葡萄糖酸盐后得出。基于氨基葡萄糖的半衰期及消除时间，“稳态”是不可能存在的，除非不断增加药物剂量或服药频率。Biggee et al.的一次人类实验研究得出相同结论，但其以狗作为研究对象试验中，口腔给予盐酸氨基葡萄糖，单一剂量和重复剂量药代动力学之间并无显著性差异。鼻饲给药后，两种氨基酸葡萄糖的最大滑液浓度分别为：硫酸氨基葡萄糖：153.632.9 ng/mL (0.86M)；盐酸氨基葡萄糖：92.7 34.9 ng/mL (0.52M)，用药后的0-6时内滑液药物浓度存在显著性差异。然而，在鼻饲给药后，滑液内的药物浓度只有血浆浓度的10%。同时，之前的同一动物实验对盐酸氨基葡萄糖的研究也得到证实，只是使用了不同的荧光分析辅助糖电泳分析的方法，而另一人类硫酸氨基葡萄糖的研究中，滑液药物浓度之比血浆浓度低25%。后期研究发现，在每天口服1500毫克硫酸氨基葡萄糖，连续服用14天后，血浆和药物浓度均达到稳定状态。本次研究中，使用的是单一剂量氨基葡萄糖，其清除率数据表明，服用同一制剂及同一剂量药物要达到一个稳定状态，这是不能的。物种的差异可能用来解释人/马之间血浆和滑液水平差异。本次研究中以马为研究对象，这种实验模型的适用性及药代动力学早已被证实，并且实用性很强，这是因为不用灌洗就可得到大量滑液。Persiani et al还对硫酸氨基葡萄糖在关节炎患者中的药代动力学进行了研究。后期的研究揭示，氨基葡萄糖并不能滑液运输至关节腔。药物扩散的差异由物种的不同来解释很勉强。本次研究中实验马匹关节正常。炎性关节滑膜为慢性非特异性变化，轻度炎症。之前的动物研究揭示，滑膜处不同物质的通透性因炎症轻重不同而异。关节内氨基葡萄糖扩散大小的不同或许可由滑膜炎症的轻重来解释。然而，本次研究中并没有提到关节炎症的任何资料，相反， 同样可以有人断定，由炎症导致的中度关节肿胀可对检测的氨基葡萄糖有稀释效应。关节炎症与滑液内氨基葡萄糖水平之间的关联性值得去进一步研究。大多数氨基葡萄糖的生物疗效已在口服建议剂量氨基葡萄糖酸盐以达到较高血浆和滑液药物水平的体外实验研究得到证实。最近的研究表明，氨基葡萄糖对关节软骨也有一定生物效应。然而，后来的实验中氨基葡萄糖浓度和鼻饲后所得的血浆药物浓度大体相等，但要高于滑液内药物浓度水平。尽管给马鼻饲两种盐类后，滑液硫酸氨基葡萄糖的浓度要明显高于盐酸氨基葡萄糖，基于目前的体外实验研究，用滑液氨基葡萄糖浓度差异来解释硫酸氨基葡萄糖在人类关节炎的治疗疗效还是存在一定争议的。本次研究设计的不足之处就是氨基葡萄糖药代动力学的时间的不确定性。然而，从一开始实验测得的血浆和滑液内氨基葡萄糖基值水平之间无显著性差异可以表明本次实验设计还是很谨密的。另外一方面，每周一次的关节穿刺术可能诱导关节发炎，导致滑液内氨基葡萄糖水平是改变。但之前我们同时做的一次实验发现，反复关节穿刺与滑膜炎之间并无明显的关联性。另一项实验研究提出，关节穿刺术的时间和时间间隔将会影响关节处的生物标志物。综上所做实验结果，该动物实验模型中每周一次关节穿刺，并不会影响实验对象的炎症参数，因此也不可能改变关节的运动功能。总之，分别口服相同剂量的硫酸氨基葡萄糖结晶盐(Dona)与盐酸氨基葡萄糖后，前者滑液药物浓度明显高于后者。该种差异是否能转化为临床关节治疗疗效有待于进一步研究。利益冲突编者未曾收到任何商业财政支持，也未曾因为资金问题对本实验产生任何潜在冲突。鸣谢感谢Marie Lecocq 与 Maria Bouchgua在动物实验中给予的莫大技术支持。格鲁普马动物实验研究小组及加拿大关节炎网络等给予DrLaverty很大帮助，在此表示衷心的感谢。参考文献1. 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