动物食品中呋喃唑酮及其代谢物检测（论文）.doc

动物性食品中呋喃唑酮及其代谢物检测郭 桢*， 连瑾，吴淑君,（广州市农产品安全监督检验中心/广州市农业标准与监测中心 ，广东广州 510308）摘要：概述了呋喃唑酮代谢物的特点和毒性，介绍了呋喃唑酮残留物检测的研究现状。关键词：呋喃唑酮 ；检验；食品The Detection of Frazolidone and Its Metabolites in Foodstuff Originated from AnimalsGUO Zhen ,LIAN Jin , WU Shu-jun(Guangzhou Agricultural Products Quality and Safety Supervisory Center/(Guangzhou Agricultural Standard and Supervisory Center , Guangzhou Guangdong 510308)Abstract: The chemical characteristics , possible hazards and detection method of Frazolidone metabolite were briefly presented in this article.Key words: Furazolidone ; Detection; Foodstuff 呋喃唑酮（Furazolidone）（又称痢特灵）,属硝基呋喃类药物，为广谱抗生素，对革兰阳性及阴性菌均有一定抗菌作用。由于呋喃唑酮价格低廉且治疗效果好，所以被广泛应用于家禽、家畜、水产品的痢疾、肠炎、球虫病，以及火鸡黑头病的预防和治疗。在我国基层,呋喃唑酮一直被广泛应用。但研究证明硝基呋喃类药物及其代谢物具有相当大的毒性，有致畸胎副作用，且能诱发癌症1，这引起了人们高度重视。1990年7月欧盟颁布2377/90/EEC条例，将硝基呋喃类药物及其代谢产物列为A类禁用药物，规定在动物源性食品残留检测限为1.0ppb。因为对呋喃唑酮蛋白结合态残留物的安全性产生怀疑，从1995年起欧盟全面规定在动物食品中禁止使用呋喃类抗菌物质，在食品中呋喃类残留物的检出限为不得检出2、3；2004年美国FDA公布了禁止在进口动物源性食品中使用的11种药物名单，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。我国农业部文件:农牧发20021号规定食品性动物中呋喃唑酮的检出限为不得检出。1呋喃唑酮代谢物及其毒性当动物服用呋喃唑酮后，药品便进入动物的代谢系统，开始降解。研究表明：呋喃唑酮原药分子在动物体内迅速代谢，其在体内的稳定性不超过几个小时；在动物体内，其代谢的部分化合物分子与细胞膜蛋白结合成为结合态4，并在结合态下可长期保持稳定，从而延缓了原药在体内的清除速度。且蛋白结合态呋喃唑酮残留物非常稳定，普通的食品加工方法（如：烧烤、微波加工、烹调等）难以使其大量降解5。呋喃唑酮代谢产物会和细胞膜蛋白相结合4，且其蛋白结合态可能会释放出具有生物活性的残留物，那么食用含有蛋白结合态残留药物的肉制品，可能会对人体自身产生一定的毒副作用。研究表明：蛋白结合态的呋喃唑酮和呋喃它酮（furaltadone）残留物分别含有称为AOZ和AMOZ的完整侧链6，AOZ和AMOZ目前均有化合物可售（SIGMA公司）。在人体胃中的弱酸性条件下，这些测链可以从蛋白结合态的母体分子上解离下来7。AOZ可以代谢成为-羟乙基肼,该化合物是致突变和致癌化合物。AOZ和AMOZ分别具有和其母体化合物相一致的分子特性， 硝基呋喃类（Nitrofurans）药物常见有四种：呋喃唑酮（Furazolidone）、呋喃它酮(Furaltadone) 硝基呋喃托英(Nitrofurantoin) 硝基糠腙(Nitrofurazone)，代谢产物分别为AOZ、AMOZ、AHD、SEM。呋喃唑酮为硝基呋喃类药物中最具代表性的一种。由于动物肝脏为主要的药物代谢器官，蛋白质结合态的残留药物主要累积于此，呋喃唑酮残留研究常以肝脏作为研究材料8、9、10。研究者利用高效液相色谱和质谱技术检测猪肝样品中的呋喃唑酮和呋喃它酮发现：呋喃唑酮在猪肝中以生物活性代谢物的形式-结合态存在至少6个星期以上，从而也表明蛋白结合态的呋喃唑酮和呋喃它酮残留物可以在动物服用后长期存在15。2.动物性食品中呋喃唑酮原药分子及其代谢物检测测定动物源食品中的呋喃唑酮残留量的方法，目前国内外报道的检测方法主要有： HPLC1、8、11、12、13等，和LC-MS7、8、9、14、15 、酶联免疫方法，微生物检验方法报道还未见到。HPLC（高效液相色谱）和LC-MS（液-质联用）是目前国际上最常用的是用来测定呋喃唑酮的方法。应用高效液相色谱法等方法可测定食品、饲料中硝基呋喃类药物，但检测灵敏度不高，不能满足出口产品检测硝基呋喃类代谢产物残留限量的要求。HPLC和HPLC/MS检测的基本过程都是样品粉碎后利用有机溶剂或其它方法去除水分、再用有机溶剂（如乙酸乙酯）洗脱，然后浓缩、流动相溶解、净化、上机检测，只是中间各个环节具体操作有所变化。虽然目前有利用SPE11来进行浓缩后溶液的净化步骤，但其间仍然涉及到大量的有机溶剂处理过程，过程比较复杂，周期也比较长。HPLC/MS方法可以利用待测分子的结构来定性，因此可以排除酶联免疫方法和HPLC方法产生的假阳性结果，用以进行检测结果的确证。酶联免疫方法是动物性食品中呋喃唑酮的大量筛选方法。酶联免疫方法测定的基础是抗原抗体反应（双抗体反应）。目前也有采用呋喃唑酮衍生物AOZ的特异性抗体进行酶联免疫方法检测，精确度，更灵敏很高，检测时间大大缩短。用RIDASCREEN? 呋喃唑酮酶联免疫试剂盒可以测定肉类，鱼虾，肉（鸡、猪、牛）和牛奶中的呋喃唑酮药物残留。欧盟目前采用FoodBRAND方法检测呋喃唑酮以及其代谢物。我国目前虽然具有农业部颁布方法和商业检验检疫局标准12、13 来规定动物源食品中呋喃唑酮类药物残留的测定方法，但测定对象仅为呋喃唑酮原药分子，具有相当的局限性。因为硝基呋喃类药物在体内很快就能代谢，而在组织中蛋白结合态代谢产物则能存留较长时间，所以在分析此类药物的残留时必须分析其代谢后的产物才有实际意义，管理部门也可以以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃类真实残留量的目的。由于传统的酸消解方法很难把呋喃唑酮的代谢残留物从蛋白质结合状态解离出来，而且结合态呋喃唑酮代谢物和细胞膜化学结合方式比较复杂，因此分析结合态呋喃唑酮代谢物极为不易16。由于残留物和蛋白质两者的结合方式未知，导致残留药物和蛋白质相互解离的方法难以确定，自由态残留物分子及结合态残留物分子的数量也因此难以鉴定，这就需要研究出一整套分离结合态残留物分子、鉴定自由态残留物分子、以及确定结合态残留物分子数量的方法。W.Leitner等14利用LC-MS研究呋喃唑酮代谢物时首先利用酸性条件使AOZ或AMOZ从蛋白质结合物上解离下来，然后利用对硝基甲醛（NBA）把AOZ或AMOZ分别衍生生成NPAOZ或NPAMOZ。衍生时的第一步是：把AOZ或AMOZ侧链从基质上中分离出来，并避免解链后的侧链和蛋白重新结合在一起；第二步为：衍生生成含有生色基团，适于紫外检测器检测的衍生物。由于许多细胞膜大分子还含有活性氨基自由基，为保证AOZ/AMOZ的定量衍生需要加入的过量的NBA，那么组织提取反应物含有NPAOZ /NPAMOZ和未反应的过量NBA；过量的NBA会对低含量的NPAOZ/NPAMOZ液相色谱检测造成一定的干扰。所以在提取/衍生步骤完成后，进一步对样品进行纯化，然后进行分析。衍生后首先要进一步清除组织提取反应物中的过量的NBA，减少过量NBA对NPAOZ/ NPA -MOZ 的HPLC检测的影响，可以利用固相萃取柱（SPE）进行；然后用液-质联用技术对样品组织中的AOZ或AMOZ蛋白质结合物进行定性分析8、9。目前，和HPLC、HPLC-MS相关联的NPAOZ 和NPAMOZ的提取方法已经得到改良，并通过一系列的加标样品研究得以证实。Horne et al8、9等对检测猪肝中残留药物的蛋白质结合体解离下来的AOZ的方法进行研究，方法如下：（1）动物服用呋喃类药物后,在不同时间间隔取肝脏样品；（2）样品先用多个有机溶剂来处理（甲醇、乙醇），除去可提取残留物；然后酸解，把结合态残留药物解离下来；（3）加入NBA消化衍生形成硝基酚衍生物；（4）用乙酸乙酯提取衍生物，再用多次的正己烷洗涤除去过量的NBA；（5）最后用反相C18柱，通过HPLC或LC-MS检测最终提取物中的NPAOZ（或NPAMOZ）。（6）分析数据，研究自由（已经解离）AOZ和残留药物蛋白结合体的比率，从而确定是否可以把AOZ作为整个残留药物蛋白结合体的代谢标记。研究结果表明，利用HPLC和LC-MS方法测定呋喃唑酮的结果基本相同。另外，当动物服用呋喃唑酮后，呋喃唑酮即被代谢为各种不同形式的蛋白质结合残留药物，其中的许多代谢物并无毒性。因此，加标样品并不能实际模拟含有呋喃唑酮残留药物蛋白质结合体的样品组织，需要对加标样品和实际服用呋喃唑酮后所取样品的差异作以研究，并评估出：（1）食用组织中具有生物活性的残留药物的持续时间；（2）确定利用标记残留药物（例如用AOZ）分析具有生物活性残留药物时的有效性。研究者已经分析了多种动物性食品（如：猪肉、猪肝和其它内脏、牛肉、鸡肉、鸭肉、鱼、虾、蛋等鲜样和干制品）中的呋喃唑酮原药分子和呋喃唑酮代谢残留物。但需要注意的是：在分析水和普通非动物源食品基质时，由于存在呋喃唑酮代谢的可能性不大，因此分析呋喃唑酮原药分子即可。3展望迄今为止，由于我国仍有大量养殖户在使用呋喃唑酮，出口欧盟的水产品由于呋喃类药物检出而就地销毁的事件屡屡发生，且我国目前的动物性食品中呋喃唑酮检测标准仍是以呋喃唑酮原药分子为检测对象，并未对其代谢残留物检测做以规定，明显滞后于国际研究水平。对此，我们认为：首先，政府应加强对呋喃唑酮的生产使用监管力度，加快推行生产加工中标准化体系建设步伐，借鉴美国、欧盟等国家在畜产品生产和食品工业上实施良好的生产规范（GMP）、危害分析及关键控制点（HACCP）和全过程质量控制（IKB）等管理经验，并结合我国畜产品生产的特点，引入全过程质量控制的新理念，尤其在畜牧业、禽肉、鱼虾等的生产全过程实行监管，从而在生产源头控制呋喃唑酮残留超标问题。其次，我国农业部文件:农牧发20021号规定呋喃唑酮不得用于食品性动物，但未涉及到其代谢物的检测。在2004年底我国进出口食品检验检疫局对出口欧盟的肠衣及肉类产品中增加了硝基呋喃代谢物（呋喃唑酮、呋喃西林、喃喃它酮、呋喃妥因）项目的检测，但目前仍然未见官方颁布的呋喃唑酮代谢物检测标准方法。相关标准技术部门应加紧收集和跟踪国外涉及禽肉产品的规章和研究方法，加强国际合作与交流，加大兽药残留分析方法的技术研究和引进力度，制订和完善我国药物残留标准，缩小我国标准与国际标准之间的差距。检验部门应不断完善检验手段和设施，提高检验技术水平，及时掌握国外先进的检验方法，在检测方法上同国际接轨，使检验后的产品符合欧盟等国家的法规要求；确保国内动物性食品禽肉、鱼虾等的食用安全性，也提高我国农产品的国际市场竞争力，保证我国畜禽产品出口贸易的顺利进行。*作者简介：郭 桢（1972-），女，农艺师，博士，研究方向为农产品安全检测通讯地址：广州市海珠区新港东路127、129号 广州市农业标准与监测中心.电话O）参考文献：1 陈笑梅 鲍晓霞 HPLC法测定鳗鱼、猪肉和对虾中的痢特灵残留 分析测试学报 第13卷第3期 （1994.5） P78-81。2 Commission Regulation (EC)1442/95,Official Journal of the European Communities.- No.L143(1995)26.3 Commission Decision(EC)96/23,Official Journal of the European Communitie s,No.L221(2002)8.4 Vroomen,L.H.M.,Berghmans,C.J.,van Leeuwen,P.,van der Struijs,T.D. B.,de Vries,P.H.U. and Kuiper,H.A.Kinetics of C14-furazolidone in piglets upon oral administration during 10 days and its interaction with tissue macro-molecules.Food Additives and Contaminants,1986,3,331.5 R.J.MacCracken,D.G.Kennedy.The bioavailability of residues of the furazolidone metabolite 3-amino-2-oxazolidinone in porcine tissues and the effects of cooking upon residue concentrations .Food additives and Contaminants.14(1997)507-513.6 L.A.P.Hoogenboom,M.van Kammen,M.C.J.Berghmans,J.H.Koeman and H.A.Kuiper.The use of pig hepatocytes to study the nature of protein-bound metabolites of furazolidone;a new analytical method for their detection. Food and Chemical Toxicology 29(1991),321-328.7 R.J MacCracken ,D.G.Kennedy.Determination of furazolidone in animals feeds using liquid chromatography with UV and thermospray mass spectrometric detection. J.Chromatography A.771(1997)349-354.8 E.Horne,A.Cadogan,M.OKeeffe and L.A.P.Hoogenboom.Analysis of protein-bound metabolites of furazolidone and furaltadone in pig liver by high performance liquid chromatography and liquid chromatography-mass spectrometry . The Analyst,121(1996)1463-1468.9 Horne,E.,Cadogan,A.,O,Keeffe,M.and Hoogenboom,L.A.P.Analysis of protein-bound metabolites of furazolidone and furaltadone in pig liver by high-performance liquid chromatography with UV and mass spectrometric detection (Abstract).Irish Journal of Agricultural and Food Research,1997,36,294.10 Hoogenboom,L.A.P.,van Kammen ,M.,Berghmans,M.C.J.,Koeman,J.H.,and Kuipe- r,H .A.,1991.The use of pig hepatocytes to study the nature of protein-bound metabolites of furazolidone.Food and Chemical Toxicology,29,321-328.11 葛宝坤、王云凤 贺信 高效液相色谱法测定鸡肉、水产品中呋喃西林和呋喃唑酮残留量的研究 中国卫生检验杂志 2002年12月第12卷第6期 P661-66212 SN 0530-1996 出口肉品中呋喃唑酮残留量检验方法 液相