（动物遗传育种与繁殖专业论文）体细胞克隆猪胚胎制备及鉴定的研究.pdf

符号和单位说明 英文缩写英文全称 6 一d m a p b s a c b c h x c s f d m s o e s e s m e f m f c s h c g f s h i p 3 m a p k m p f m i i n e 从 n e b d n t p b s p c c 6 一d i m e t h y a m i n o p u r i n e b o v i n es e r u ma l b u m i n c y t o c h a l a s i nb c y c l o h e x i m i d e c y t o s t a ti cf a c t o r d i m e t h y ls u l f o x i d e e m b r y o n i cs t e mc e l l s e sc u l t u r em e d i u m f i b r o b l a s tm e d i u m f e t a lc a t t l es e r u m h u a m nc h o r i o n i cg o n a d o t r o p h i n f o l li c l e s t i m u l a t i n gh o r m o n e n o s i t 0 1t r i p h o s p h a t e 中文全称 6 一二甲基氨基嘌呤 牛血清白蛋白 细胞松弛素b 放线菌酮 细胞静止因子 二甲基亚砜 胚胎干细胞 胚胎干细胞培养液 成纤维细胞培养液 胎牛血清 人绒毛膜促性腺激素 促卵泡素 三磷酸肌醇 m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e促分裂原激活蛋白激酶 m a t u r a t i o np r o m o t i n gf a c t o r s成熟促进因子 s e c o n dm e i o t i cd i v i s i o n第二次减数分裂中期 n o n e s s e n t i a la m i n oa c i d ss o l u t i o n非必须氨基酸 n u c l e a re n v e l o p eb r e a k d o w n核膜破裂 n u c1e a rt r a n s f e r p h o s p h a te b u f f e r e ds a lin e 核移植 磷酸盐缓冲液 p r e m a t u r ec h r o m o s o m e sc o n d e n s e早熟性染色体凝集 p c r p f a p m s g s c n t z g a d h m l n r p m i u p 0 1 y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p a r a f o r m a ld e h y d e p r e g n a n tm a r es e r u mg o n a d o t r o p h i n s o m a t i cc e l ln u c l e a rt r a n s f e r z y g o t eg e n o m ea c t i v a t i o n d a y h o u r m i n u t e g r a m m i l l i g r 锄 m ic r o g r a m l i t e r m i l l i l i t e r m i c r 0 1i t e r m ic r o m e t e r m 0 1 a r li t e r m i l l i m o l a r l r e v 0 1 u ti o n sp e rm i n u t e i n t e r n a t i o n a lu n i t 聚合酶链式反应 多聚甲醛 孕马血清 体细胞核移植 合子基因组激活 天 小时 分钟 克 毫克 微克 升 毫升 微升 微米 摩尔 升 毫摩尔 升 每分钟转数 转 分 国际单位 酶活性 g g 1 l m m g m u 1 m u 虬 扬州大学硕士学位论文 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 5 2 一 本人声明 所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研 究成果 除文中已经标明引用的内容外 本论文不包含其他个人或集体已经发表 的研究成果 对本文的研究做出贡献的个人和集体 均已在文中以明确方式标明 本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名 1 俐l i 以易 叼吒 签字日期 年矿钿t 7 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档 允许论文被查阅和借 阅 本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 同时授权中国 科学技术信息研究所将本学位论文收录到 中国学位论文全文数据库 并通过 网络向社会公众提供信息服务 学位论文储弥 么缸导师躲磁乞 签字日期 占年 幻 日签字日期 年 月日 本页为学位论文末页 如论文为密件可不授权 但论文原创必须声明 刘吉宏体细胞克隆猪胚胎制备及鉴定的研究 三 体细胞克隆猪胚胎制备及鉴定的研究 研究生 刘吉宏 导师 李碧春教授 陈学进副教授 摘要 体细胞克隆猪在人的动物疾病模型和人类异种器官移植方面具有巨大的优势 和应用潜力 已成为当今体细胞克隆领域研究的热点 本研究的目的在于研究猪 体细胞核移植的技术条件 简化核移植方法及程序 提高核移植效率 建立高效 的体细胞核移植技术研究平台 为高效快速生产克隆动物 制作转基因克隆动物 打下基础 本实验通过对猪的卵母细胞的成熟 供体细胞的制备 体细胞克隆胚 胎的构建 胚胎移植和对出生克隆猪的鉴定等几个方面的研究 优化了实验条件 建立了比较完善的系统 成功的生产了上海首例克隆猪 研究结果如下 1 比较不同基础培养液对卵丘 卵泡复合体 c o c s 体外成熟的影响 结果显示 在n c s u 2 3 和m t c m 1 9 9 培养液中 c o c s 的成熟率较高 分别达到8 6 8 9 和 8 9 9 4 与t c m l 9 9 比较 成熟率7 5 3 7 差异显著 而前二者差异不显著 说 明n c s u 2 3 和m t c m 1 9 9 培养液是较为理想的成熟培养液 两种培养液均可应用 于c o c s 培养成熟 可获得较好的成熟率 2 比较了纺锤体观测 s p i n d l e v i e w 系统去核方法和盲吸法对猪卵母细胞的去核 率 结果显示 纺锤体观测 s p i n d l e v i e w 系统去核法 去核率为9 7 8 9 盲吸 法去核率为6 0 3 2 两者之间差异极显著 p 0 0 5 但是差异不显著 与t c m 1 9 9 组相比另外两组明 显高于此组 p 0 0 5 从表中可以看出m t c m 一1 9 9 是比较理想的成熟培养液 但 是与n c s u 2 3 对比并没有明显差异 因此两种培养液都可以应用于c o c s 成熟培 养中 并且可以获得较好的成熟效果 表1 不同基础培养液对c o c s 体外成熟培养的影响 注 同栏内上表字母不同表示差异显著 p o 0 5 6 讨论 体外培养最重要的就是培养基的选择 n c s u 2 3 和t c m l 9 9 是当前应用最广 也可以说是最成功的两种培养基 在实验过程中我们采用了3 种成熟培养液进行 卵母细胞体外成熟 采用m t c m l 9 9 成熟培养液的培养效果最好 略高于n c s u 2 3 但是没有明显差异 但是采用t c m l 9 9 成熟培养液的效果明显不如前面两组 此 外还有一种较好的培养基n c s u 3 7 这个结果与h 恤结果相近 他们认为 m t c m l 9 9 和n c s u 2 3 两种成熟培养液的效果接近 但是也有人认为m t c m l 9 9 效果要好于n c s u 2 3 这可能是跟大家所用的激素以及生长因子或者添加的卵泡 液不同有一定的关系 来自大卵泡的p f f 支持卵成熟比来自小卵泡的效果好 r n t c m l 9 9 和t c m l 9 9 两种成熟培养液的区别在于 在h l t c m l 9 9 中添加了 0 9 1 m m 丙酮酸钠 0 5 7 m m 半胱氨酸 0 5 4 9 9 l 葡萄糖 o 1 p v a 成分 两种成 熟培养液在使用的时候都添加了 p f f l h f s h 和e g f 但主要起作用的还是半 胱氨酸因为半胱氨酸是谷胱甘肽 g s h 的组成成分 谷胱甘肽是细胞内的主要 自由巯基 在细胞生长 氨基酸转移及d n a 和蛋白质合成中起到重要的生理作用 并且可以减轻氧压力 抗氧化的作用 3 7 1 刘吉宏体细胞克隆猪胚胎制备及鉴定的研究 实验二供体细胞的准备 核移植包括一系列复杂的程序 供体细胞培养 卵母细胞的体外成熟 去核 细胞核移植 融合 激活 重构胚的体外培养和胚胎移植 任何一步不理想 都 会影响到克隆胚胎或动物的发育 目前 人们已经利用胎儿成纤维细胞 肾脏细胞 心脏细胞 颗粒细胞 成体猪皮肤成纤维细胞等成功得到了克隆猪 其中胎儿成纤 维细胞应用最广 使用动物的胎儿成纤维细胞作核移植供体细胞 这主要是因为 胎儿成纤维细胞在体外生长寿命长 易培养 并可承受一定程度的遗传修饰筛选处 理 本研究比较了胎儿成纤维细胞 耳成纤维细胞和颗粒细胞建系的方法和细胞 系特征 目的在于为核移植提供合适的供体细胞 1 实验材料 1 1 主要仪器耗材及试剂 1 1 1 仪器 液氮罐 成都金凤液氮容器有限公司 y d s 3 5 1 2 5 型 拉针仪 n a r i s h i g ec o t d 照相相差显微镜 l e i c a 公司 0 9 0 1 3 2 7 0 6 荧光倒置显微镜 n i k o n 公司 0 2 0 7 0 0 2 型 显微镜温控仪 北京伟力新世纪科技发展有限公司 普通显微镜 o l y m p u s c k 2 h 19 3 5 3 1 p h 计 瑞士m e t t l e rt o l e d o 公司 m p 2 2 0 l 2 0 0 0 便携式防水型热电偶温度计 e n o v i h a n n a 北京哈纳科仪科技有限 公司 离心机 s i g m a 公司 3 k 3 0 c 型 低温冰箱 s i e m e n s k g 2 1 e 6 6 t 1 压力蒸汽灭菌器 上海华线医用核子仪器有限公司 y x q s g 4 1 2 8 0 微量移液器 n i c l l i p e te x 公司 e 0 9 0 1 17 5 2 系列 扬州大学硕士学位论文 电子天平 瑞士m e t t l e rt o l e d o 公司 0 0 0 0 1 9 精度 a g 2 4 5 电热恒温水浴锅 上海医疗器械三厂 h h s2 1 4 型 m l 9 0 2 定时恒温磁力搅拌器 上海浦江分析仪器厂 c 0 2 培养箱 n a p c o 公司 5 4 0 0 系列 p n 0 0 3 7 0 0 6 8 不锈钢网筛 上海精网筛滤器材有限公司3 0 0 目1 0 0 目 1 1 2 耗材 0 2 2 m 微孔滤膜 上海亚东核级树脂有限公司 一次性微孔滤膜器 m i l l i p o r eb e d f o r d s l g p r 2 5 k s 细胞培养瓶 t 2 5 c o s t a rc o n l i n g u s a f a l c o n b d f r 趾c e 细胞培养皿 3 5 i i u l l 6 0 r n m 1 0 0 i n m f a l c o n b d f m c e 细胞培养板 6 孔 2 4 孔 c o s t a rc o m i n g u s a f a l c o n b d f 啪c e 细胞冻存管 1 5 m 1 c o s t a rc o m m g u s a 离心管 15 m 1 5 0 m 1 f a l c o n b d f r a n c e 1 1 3 试剂 脂质体l i p o f e c t a i l l i l l e2 0 0 0i n v i 仃d g e n d m e m 粉末 高糖 质粒提取试剂盒 h e p e s n a h c 0 3 丙酮酸钠 胰蛋白酶 1 2 5 0 f b s 青链霉素 g i b c o t i a n g e n a m e r e s c 0 a m e r e s c 0 s i g m a h n e r e s c o 山东银香伟业 山东鲁抗医药公司 刘吉宏体细胞克隆猪胚胎制备及鉴定的研究 葡萄糖 秋水仙素 n a c l 1 1 4 溶液配制 国药集团化学试剂有限公司 上海化学试剂采购供应站 国药集团化学试剂有限公司 1 7 d m e m 高糖 g i b c o 溶液 将d m e m 粉末溶于9 0 0 m l 三蒸水中 按产品说明 要求加3 7 9 的n a h c 0 3 后 再另外添加0 1 1 9 丙酮酸钠 3 5 7 9 h e p e s 6 6 m g 青霉素和 1 0 0 m g 的硫酸链霉素 调p h 至7 2 7 4 然后定容至1l 0 2 2p m 滤膜过滤除菌 分 装后储于4 备用 使用前添加1 0 2 0 的f b s 构成细胞完全培养基 无钙镁h a l l 玉圆液 d h a r 墩s 分别取0 4 0 lk c1 0 0 6 9 lk h 2 p 0 4 8 0 0 l n a c l o 1 2 9 ln a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 0 3 5g ln a h c 0 3 1g l 葡萄糖 溶于9 0 0 m l 三蒸 水中 调p h 至7 2 7 4 然后定容至1l 0 2 2 p m 滤膜过滤除菌 分装后储于4 备用 k c l 低渗溶液 o 0 7 5 m 取5 5 9 2 9k c l 适量蒸馏水溶解后定容至1l 固定液 甲醇 冰乙酸 3 1 注 现用现配 1 2 实验动物来源 妊娠4 0 天广西巴马香猪胎儿采自上海农业科学院畜牧所实验动 物中心 2 供体细胞制作方法 2 1 猪胎儿成纤维细胞 将妊娠4 0 天的巴马小香猪处死 无菌取出子宫 在子宫两头用绳子扎好 放 入无菌的袋子中 2 h 内拿回实验室 用无菌的剪刀将子宫剪开 取出胎儿 用含 抗生素的d p b s 清洗 转移到超净工作台中 用眼科剪去除胎儿的头 四肢和内脏 用d p b s 冲洗 在直径1 0 c m 的培养皿中用眼科剪刀将剩余的组织块剪碎 加少许培 养液e f m 用弯头吸管将组织块转移到t 7 5 细胞培养瓶的底壁上 用弯头吸管将组 织块均匀地铺开 将铺有组织块的一面向上 加入1 5 m l 细胞培养液 再放入 3 7 5 c 0 2 饱和湿度的培养箱内培养 待培养6 8 h 后 将培养瓶翻转过来 使细 扬州大学硕士学位论文 胞培养液浸没组织块 培养5 天后观察组织块周围细胞爬出情况 如图2 a 每隔两天换培养液一次 待细胞生长至8 0 汇合时 培养皿底记为p 0 弃去培 养液 用d p b s 洗涤一次 加入3 m l 的0 0 5 t r y p s i n e d t a 3 7 消化5 m i n 加入6 m l e f m 终止消化 吹打之后制成细胞悬液 接种到新的1 0 c m 培养皿 放入培养箱中 培养 记为p 1 自p 1 后 细胞重新接种于一个培养皿中 培养3 4 天 至完全汇合 然后 消化传代 传代比例为1 2 1 3 密度为1 5 1 0 5 的细胞接种于一个新的1 0 c m 的培 养皿 培养细胞至三代 如图2 b 后开始冻存部分细胞 其余的继续培养用于检 测和核移植 冻存 细胞传至3 代以后 细胞数量增多 完全汇合的细胞消化后 细胞悬 液移入1 5 m l 离心管 8 0 0 m 1 0 m i n 离心后弃去上清液 用冻存液稀释沉淀细胞 调整细胞浓度为1 0 5 个m 移入冻存管 记上标记 放入冻存盒内 置超低温冰 箱 冷却至 8 0 过夜 第二天移入液氮内长期保存 复苏 将冻存管从液氮中取出 迅速投入3 8 温水中 摇动至冻存液完全融化 将细胞悬液移入培养皿中 补加新的培养液 3 7 5 c 0 2 培养5 8 h 观察贴壁 后换液 2 2 成年猪耳成纤维细胞 将成年巴马小香猪的耳缘剪毛 先用碘酒消毒 再用7 5 的酒精洗涤除去碘 晾干后用无菌的眼科剪刀剪下一块皮肤组织 迅速放入含有双抗的d p b s 中 带 回实验室 在超净台内 d p b s 洗三次 放入内经为1 0 c m 的培养皿中 用剪毛剪 去其毛发 d p b s 洗三次 其后操作步骤同胎儿成纤维细胞的建系过程 2 3 猪颗粒细胞 屠宰场取卵巢 放入含1 0 0 0 砌恤l 双抗 温度为2 5 3 7 生理盐水中运回实验 室 用预热的3 7 生理盐水冲洗卵巢5 遍 转移至超净台 7 5 酒精浸泡4 5 s 含 1 0 0 0 u m l 双抗的d p b s 液冲洗3 次 用连接1 8 号针头的2 0 m l 一次性无菌注射器抽取 3 m m 8 m m 卵泡 将抽取液放入1 5 m l 离心管中 加4 m 1d p b s 液轻轻吹打均匀 1 0 0 0 印m 离心3 m m 弃上清 加入3 m l 细胞培养液重悬沉淀 再次离心 1 0 0 0 印m 离心3 m i 玛 刘吉宏体细胞克隆猪胚胎制备及鉴定的研究 1 9 一 保留少量上清 重悬沉淀 细胞计数 调整细胞浓度为1 1 0 5 个 m l 接种至t 2 5 细胞培养瓶 再放入3 7 5 c 0 2 饱和湿度的培养箱中培养 待细胞生长至9 0 汇合进行传代培养或者冻存 3 结果 3 1 猪胎儿成纤维原代细胞 猪胎儿组织块经培养1 d 一2 d 可见组织块周围形成生长 晕 2 d 一3 d 可见有细胞沿组织块周围爬出 7 d 左右可以长满培养瓶底 图2a 胎 儿组织块分化程度较耳组织块低 生长较快 经过2 3 次传代后的细胞即可得到纯 化 呈典型的成纤维状态 图2b 黝 0 一r 一 二 图2ab a 组织块法培养的猪胎儿成纤维原代细胞 1 0 0 b 猪胎儿成纤维第3 代细胞 1 0 0 胎儿成纤维细胞染色体数目 随机挑选一个个体的细胞进行体外传代培养 在传 代1 0 次之前 选择分裂相计数 图3 染色体数目为3 8 条的比例在9 2 以上 说明 正常的二倍体细胞占优势 1 2 次传代之后 异倍体细胞逐渐增多到5 0 细胞生长 接触抑制现象不明显 到第1 5 代正常倍性的细胞几乎没有 3 2 耳成纤维细胞 用d m e m 2 0 f b s 培养猪耳组织块 经2 d 一3 d 的培养即可见开始 有沿组织块边缘形成生长晕 4 d 即可见有细胞沿组织块周围爬出 很快形成上皮 细胞贴壁延伸 8 d 一1 0 d 成纤维细胞呈优势生长 图4a 一般1 3 d 左右可以长满 培养瓶底 经过2 3 次的消化传代后即可得到富集的成纤维细胞 细胞呈梭形 扬姗太擎旗士学位论文 灏 图嚣胎童l i 箴缚雅纽胞棱型 三豢彩嚣 为典型的瘸符臻謦蠢 施质麓中袅簸宥椭圆黟臆棱唪成群细胞量瑰放 黜凝 虢涡撇势 圈德籼藤鳃蝴胞每耋蘑溯胞静分离纯 可擞据二辇鳓 壤蛋白酶鳓敏感程度拘不同爹以爱黯壁时阗的不同黔瓤胰蛩白酶快速滂锻釜漤誊蒺 褥成缔霉肇绷臌 成纤维霸腿 写生度绷藏耩比 黯壁邈羹懿德翮虢壁糖着竣膏上废 懿施牢露零西此荔于辩纯努璃嫱 匿雄矗鲷鬻垂燃艨触濑蹲懈缀灞湖施 l 硬璐蕊b 罐辔赫獭簪缝第萋糊艟 l 囝o 糍瓤 3 矿鞯巢颡髓缨胞 鲰巢颥羧缀胞接种密蠖重黧l 鲤锋 目b 艘麟稀j l 驯印可赋壁囊 鹬h 戳詹壁佐势生键 翟巍镌鞘囊藏瞎 缬飑魏蠛纤雏样瓤睡譬麟为壤黪或藕潮测 量黧形 摊勋鐾麟状溷勘净 扬州大学硕士学位论文 2 2 一 围爬出 7 d 左右可以长满培养瓶底 猪耳组织块经2 d 一3 d 的培养即可见开始有沿组 织块边缘形成生长晕 4 d 即可见有细胞沿组织块周围爬出 很快形成上皮细胞贴 壁延伸 8 d 一1 0 d 成纤维细胞呈优势生长 一般1 3 d 左右才可以长满培养瓶底 根 据上皮细胞和成纤维细胞对胰酶的敏感性不同 经过2 3 次传代即可得到纯化的成 纤维细胞系 为了进行重复试验 我们对培养的成纤维细胞进行了冻存 并对复苏的细胞 进行培养 试验发现冻存没有影响细胞生长 染色体检测 细胞仍为正常的二倍体 刘吉宏体细胞克隆猪胚胎制备及鉴定的研究 实验三体细胞克隆胚胎的构建 哺乳动物核移植效率还很低 大约在1 左右 在哺乳动物核移植过程中 每 一个环节都需要做到精确 以确保整个核移植体系的稳定 从而保证核移植后重 构胚胎的发育率 卵母细胞的去核操作是核移植过程中最关键的步骤 卵母细胞 的正确去核 可以避免重构胚的遗传物质非整倍性 有利于胚胎的后期发育 同 时还可以为供体细胞提供良好的重编成环境 目前卵母细胞去核的方法有很多 大部分实验采用盲吸法进行去核操作 但是其效率较低 错误率在3 0 本实验比较了s p i n d l e v i e w 系统和盲吸法在卵母细胞去核去核效率 通过比较 选取最佳方法 实现高去核率 从而提高重构胚的体外发育率 并且通过这种核移 植体系获得克隆猪 1 材料 1 1 试剂与耗材 c b c y t o c h a l a s i nb s i g m a 其它同上 1 2 主要仪器 半自动显微操作仪 锻针仪m f 一9 0 0 磨针仪e g 4 0 0 n a r i s h i a g e 纺锤体 观视仪 c 显微操作热板i x h p l o o o l y n 叩u s 显微操作热台h t 4 0 0 m i n i t u bg m b n h c o k g 拉针仪p u l 1 w p i 移液器 j e n c o n s 离 心机 e p p e n d o r f 同前面部分仪器略 1 3 实验动物来源 受体卵母细胞来源实验动物来源同第一部分 供体细胞和实验 动物来源同第二部分 2 方法 2 1 制作显微操作滴 先在平皿的中央用含有5 0 u 咖l c b 的h n c s u 2 3 作一个 5 0 u l 左右的液滴 作为卵母细胞的操作液滴 然后在操作液滴四周各做1 个 h n c s u 2 3 5 o u g m l c b 液滴 用于注核操作的时候放供体细胞用 在本实验中通 扬州大学硕士学位论文 2 4 一 过s p i n d l e v i e w 纺缍体图像观察 系统进行去核 因此采用专用的d e l t a t p g d i s h o 1 7 m m 皿底为玻璃 更利于光的折射 在盘中覆盖上石蜡油 2 2 供体细胞的制备 将细胞从液氮罐中取出 迅速进行复苏 方法与第二部分相 同 复苏后的细胞进行传代培养 当细胞传代到第5 代的时候 完全汇合后用于 核移植操作 作为正常培养组 将传代后的另一部分细胞进行饥饿培养 饥饿的 细胞在培养2 天后用于核移植作为血清饥饿组 在进行核移植操作前 将供体细胞从培养箱中取出 进行消化吹打制成细胞悬液 将细胞悬液分装到1 5 m l 的离心管中 放入4 冰箱内备用 进行核移植操作前 2 0 m i n 将细胞从冰箱中取出放入3 8 5 培养箱中温热 用时用移液枪吸取离心管底 部1 0 u l 的细胞悬液加入已经做好的操作滴内 覆盖上石蜡油 2 3 去核卵母细胞的准备 2 3 1 卵母细胞的体外成熟 卵母细胞的体外成成熟方法同第一部分 2 3 2 卵母细胞脱颗粒 成熟后卵母细胞脱颗粒方法同第一部分 2 3 3 卵母细胞去核操作 将成熟4 0 4 4 h 的猪卵母细胞去除卵丘细胞 挑选己排出第一极体且形态良好的 卵母细胞 用外径1 0 0 1 2 0 岬的固定针 内径为1 5 2 0 岬的去核针 在s p i n d l e e w 系统方法下去核 将1 0 1 5 个左右的卵母细胞移入含5 p 咖lc b 的h n c s u 2 3 操作液中 在3 7 热板上作用1 0 m i i l 移入玻璃皿中含5 p g m lc b 的h r d 液滴中 液滴大小3 0 山 并覆盖石蜡油 用固定针轻轻固定住卵母细胞 图 6 a 借助s p i n d l e e w 系统确定纺锤体的位置 用去核针拨动卵母细胞使纺锤体 大概处于2 点钟位置 图6 b a 极体在纺锤体偏上大概1 点中的位置 纺锤体和 极体都在赤道平面上 然后用去核针沿赤道线3 点位置刺进去 去除纺锤体 紧 接着吸入极体 图6 c 然后把针撤出 将极体和纺锤体吐出 去核时要一次短时 间内做完 保证去除干净 如果两次还没去除 将卵丢弃 同时采用了另外一种比较常用的盲吸法 图7a b 进行去核操作 此方法不 刘吉宏体细胞克隆猪胚胎制备及鉴定的研究 借助s p i n d l e v i e w 系统 以第一极体的位置为标准确定细胞核的相对位置 在去核 操作过程中 吸取第一极体及其下方的少量细胞质 以达到去核的目的 目的是 进行实验的对比 2 4 卵母细胞的注核操作 在显微操作台上的培养皿中的中间的滴内放去核的卵母细胞 每次放1 0 1 5 个 另外几个放入供体细胞 首先用内径为1 0 1 5 岬的注核针吸取小而圆的供体 细胞 图6 d 然后移动操作台使卵母细胞处在视野下面 用固定针固定卵母细 胞 用注核针拨动卵母细胞 找到去核时在透明带留下的针口 图6 e 使针口在 3 点位置将注射针插入到透明带下 图6 f 将供体细胞注入卵母细胞的卵周隙内 图6 g 构成一个卵一供体细胞复合体 图6 h 而后缓慢抽出注核针 并对 透明带进行整理 使体细胞与卵母细胞膜相互接触 便于随后重组胚的融合 2 5 融合和激活 将操作完毕的重构复合体移入融合液中 洗涤三次 然后移入融合槽中 用 毛细实心玻璃管拨动复合体 使去核卵母细胞和供体细胞的接触面与电流方向垂 直 图8 然后进行电击 电击参数为 2 0 0 v m m 6 0 u s 1d c 激活后的复合体 迅速移入n c s u 2 3 培养液中洗涤3 5 次 然后放置入培养箱中 3 8 5 5 c 0 2 1 0 0 湿度培养箱中培养 融合后的复合体在培养箱中培养3 0 m i l l 6 0 m i l l 后 将复合体移到显微镜下 用 拨卵针拨动 观察融合的状况 记录融合率 将融合的复合体移入含有2 m6 一d m a p 的n c s u 2 3 中洗涤3 5 次 然后放在含有2 m6 d m a p 的n c s u 2 3 中培养4 6 小时 2 6 重构胚的培养和观察 培养4 6 小时后的重构胚 移入n c s u 2 3 0 4 b s a 的培养中洗涤3 5 次 然 后放入其中3 8 5 5 c 0 2 1 0 0 湿度的培养箱中培养 分别观察和记录胚胎发育 情况 扬州大学硕士学位论文 图6 核移植过程 标尺 5 0 m a 卵母细胞及极体的位置 b 纺锤体 a 去核针的位置 c 去核针去除纺锤体 d 注核 针吸取供体细胞 e 卵母细胞和注核针的位置 f 注核针进入去核的卵母细胞中 g 注核 针将供体细胞注入卵腔隙中 h 注核完成 刘吉宏体细胞克隆猪胚胎制备及鉴定的研究 3 结果 3 1 不同去核方法对猪卵母细胞去核率的影响 在卵母细胞成熟培养4 4 h 后 用盲吸去核法和s p i n d l e v i e w 系统去核法 盲 吸法去核是用去核针去掉卵母细胞极体及极体下方的部分胞质而达到去核的目的 一 j 乏 i jj j i 赢 m 赫 蕊 裁赢勰巍战a m 勰渤t j 一赢 m 瓤赫 图7 盲吸过程 标尺 5 0 肿 a 极体和去核针的位置 b 盲吸出极体和极体下面的一部分胞质 图7 a b 卵母细胞去完核后用h c 1 1 e s l 3 3 2 2 染色 比较两者的去核率 结果 如表2 所示 s p i 硼b j e w 系统去核法去核率可以达到9 7 8 9 明显高于盲吸去核 法 6 0 3 2 两者差异极显著 p o 0 1 在卵裂率上同样是差异极显著 图8 电融合示意图 胞 扬州大学硕士学位论文 表2 不同去核方法对猪卵母细胞去核率的影响 注 去核率 去核卵数 mi i 卵母细胞数 同栏内上表字母不同表示差异显著 p o 0 5 3 2 不同供体细胞对重构胚发育的影响 利用不同来源的供体细胞构建克隆胚 探讨胎儿成纤维细胞 成年猪耳成纤 维细胞和颗粒细胞对重构胚体外发育的影响 结果如图3 所示 猪耳成纤维细胞 的融合率和卵裂率较高 与胎儿的成纤维细胞差异不显著 但却显著高于猪颗粒 细胞 p o 0 5 三组之间的卵裂率和囊胚率差异不显著 表3 不同供体细胞类型对重构胚体外发育的影响 注 融合率 融合胚数 重构复合体数 卵裂率 卵裂胚数 融合胚数 囊胚率 囊胚数 融合胚 数 同栏内上表字母不同表示差异显著 p o 0 5 3 3 不同胚胎培养液对重构胚发育的影响 b 2 胚胎培养液是我们实验室首次用于猪重构胚的培养 用n c s u 2 3 常用胚胎 培养液作对照 检验b 2 是否也是适合猪重构胚的培养 结果如表6 所示 b 2 在 融合率 卵裂率 囊胚率和囊胚细胞数上都稍高于n c s u 2 3 但差异不显著 p 0 0 5 刘吉宏体细胞克隆猪胚胎制备及鉴定的研究 表4 不同胚胎培养液对重构胚体外发育的影响 注 融合率 融合胚数 重构复合体数 卵裂率 卵裂胚数 融合胚数 囊胚率 囊胚数 融 合胚数 同栏内上表字母不同表示差异显著 p o 0 5 4 讨论 4 1 关于去核方法 卵母细胞的去核是细胞核移植的关键一步 盲吸去核法是以第一极体为标志 吸去极体及其下方的一部分胞质达到去核的目的 该方法假定纺锤体在极体的正 下方 但是卵母细胞随着卵龄的增加 第一极体与纺锤体的相对位置发生偏转口9 另外由于在洗卵 移卵的过程中 人为的操作也会引起第一极体与纺锤体的位置 变动 4 0 目前盲吸法的去核率一般不超过8 0 去核不成功或不完整 不仅会造 成多倍体或孤雌胚 而且会使发育率统计错误 由于盲吸法的去核率不高 人们 又尝试了其它的去核方法 在荧光染色剂帮助下的 在紫外线下看见细胞核 然 后去除 该方法去核准确 但染料和紫外线对卵母细胞都有伤害 会影响到克隆 胚胎的后期发育 虽然采用这种方法也获得了克隆猪 3 8 在利用化学试剂帮助去 核时 要先激活成熟的卵母细胞 待其将要排出第二极体时加入抑制剂 然后将 凸出卵母细胞膜的纺锤体去掉 该方法在兔 猪和小鼠上有应用1 4 1 4 2 1 我们在去核的过程中采用了s p i n d l e v i e w 系统 该方法不用通过紫外线的照射 就能看到纺锤体 避免了化学试剂和紫外线对卵母细胞的损伤 这是采用电子光 学硬件和计算机数据处理程序 利用有序高分子对偏振光的折射现象来观察细胞 内的高分子结构 卵母细胞内减数分裂纺锤体是高分子物质如微丝微管 肌动蛋 白细丝环等物质有序排列而成 这些物质均可以使偏振光发生折射 因此偏振光 通过卵母细胞减数分裂纺锤体时发生折射 这种折射可以被检偏器捕捉 并通过 扬州大学硕士学位论文 3 0 偏振光显微镜观察 4 3 1 与牛 羊等家畜和小鼠 家兔等实验动物的卵子细胞质较 为清亮 纺锤体易于观察相比 由于猪的卵母细胞中颗粒性物质 如脂肪微滴等 阻光物质 较多 对纺锤体观察影响较大 但通过极体位置辅助寻找可以确定纺 锤体位置 我们用盲吸法作对照 在盲吸的过程中 由于不能确定具体纺锤体的位置 因此将有超过3 0 的细胞质随着第一极体吸出 4 8 前面已经提到胞质是维持供体 细胞重编程的重要物质 如果大量的去处细胞质 将不利于重构胚的发育 通过 实验对比发现运用s p i n d l e v i e w 系统其去核率大大增加 只会去处少量胞质 使去 核变得更加安全 高效m 4 2 关于供体细胞 目前公认的一个观点是 分化程度越低的细胞越易于发生发育程序重编 构 建的重构胚发育潜力也越大 体细胞可以作为供核细胞来克隆动物是因为已分化 的细胞核发生了重编程 完全的重编程是成功产生克隆动物的先决条件 4 5 来源 于不同组织或处于细胞周期不同阶段的细胞作为供核细胞 其重编程的能力是不 相同的 核移植效率也有着明显区别 4 6 猪胎儿成纤维细胞是处于幼稚阶段的细 胞 其分化的程度较低 可能更有利于支持核的重新编程 l e e 等比较猪成体和胎 儿成纤维细胞 颗粒细胞和输卵管上皮细胞对核移植的影响 得到的结果显示胎 儿成纤维细胞效果最好 但是k a t 0 等 4 7 1 认为颗粒细胞能够更加有效支持核的重新 编程 我们在试验的过程中比较了胎儿成纤维细胞 成体成纤维细胞和颗粒细胞 对重构胚发育的影响 发现颗粒细胞对重构胚体外发育能力上没有另两种细胞高 其融合率和卵裂率都很低 我们认为颗粒细胞在形态上比较小 核质比较硬 电 融合不充分 所以其融合率和卵裂率比较低 4 3 关于胚胎体外培养液 目前应用于猪体细胞克隆胚胎移植中的培养基主要有n c s u 2 3 4 m 咖l b s a 和p z m 3 l a ia 1 1 dp r a t h e re ta l 2 0 0 3 i m 等 2 0 0 4 比较了n c s u 2 3 和p z m 3 培养孤雌胚和克隆胚的效果 在孤雌激活胚和克隆胚上的结果是p z m 3 好于 n c s u 2 3 这与中国农大的结果不相符合 他们发现n c s u 2 3 对克隆胚的培养 刘吉宏体细胞克隆猪胚胎制备及鉴定的研究 要优于p z m 3 由于体外培养与体内培养还有一定的差距 所以人们一直在探讨 更好的体外胚胎培养液来进行体外胚胎生产 两种培养液对克隆胚的培养我们发 现 b 2 对孤雌胚的培养效果仍然好于n c s u 2 3 但两者没有明显的差异 我们的 试验结果表明 b 2 是也一种适合培养猪胚胎的培养液 扬州大学硕士学位论文 3 2 实验四克隆胚胎的移植与克隆猪的鉴定 胚胎移植 e m b 巧ot m s 蠡玎 是胚胎工程中一项十分重要的环节 猪胚胎移植 最早于1 9 5 1 年获得成功 到2 0 世纪6 0 年代 已经基本建立了以外科手术方法为 基础的回收胚胎和胚胎移植技术 目前猪胚胎移植技术并没有获得如牛一样的推 广和应用 分析原因 可能是由于以下几个方面的原因 猪本身为多胎动物 这一定程度上影响了其在生产实践中的应用 猪生殖器构造复杂 如子宫颈邹 褶较多较深 子宫角较长等等 还没有建立像牛那样的高效的非手术移植方法 采胚和移植必须用外科手术 增加了难度和费用 且手术后常有粘连的发生 造 成同一头猪不能反复利用 猪无论是体内胚胎还是体外胚胎 其对环境 特别 是对低温非常敏感 损伤的临界温度为1 5 而且目前还没有建立有效的像牛那 样的胚胎长期冷冻保存技术 所采集或体外生产的猪胚胎必须在当天移植 本部分的目的是通过猪输卵管胚胎移植中的不同的麻醉方法效果的比较与移 植方法的讨论 并对出生后克隆小猪的形态特征和微卫星的检测 建立比较完整 的胚胎移植体系 确定出生小猪与供体母猪的遗传物质的一致性 1 实验材料 克隆胚胎 由便携式培养箱带至猪场 移植时取出 戊巴比妥钠水溶液 用生理盐水将进口戊巴比妥钠 b i o s z u l l ep 9 1 2 9 0 稀释成2 5 的水溶液备用 硫喷妥钠水溶液 用生理盐水将硫喷妥钠 上海新亚药业 稀释至2 5 青霉素链霉素准备数瓶 作术中和术后的消炎抗菌用 油汀 红外保温灯 保持手术时麻醉状态下代孕母猪的体温 保温灯还可以起到 照明的作用 保定绳 保定架 自制保定架 木质 便于麻醉状态下对代孕母猪进行手术操作 五十毫升注射器 静脉输液器等一次性麻醉器械 p c r 试剂 u 1 t r a p u r e t m 基因组d n a 快速提取试剂盒 刘吉宏体细胞克隆猪胚胎制备及鉴定的研究 2 实验方法 2 1 受体母猪的选择 我们选择的受体猪品种均为上海白经产母猪 胎次2 8 不等 所选择的猪均 有良好的繁殖纪录 2 2 受体母猪的发情控制 本实验通过带奶母猪的断奶时间来控制母猪的发情时间 带奶母猪一般在仔 猪断奶后5 6d 左右发情 我们一般以母猪适合第一次人工输精时间判定为发生排 卵的时间 选择排卵后1 2 h 的猪作为我们胚胎移植的受体 2 3 胚胎移植 选择发情合适的母猪 于手术当天早上对母猪禁食 手术前简单保定母猪 对猪进行静脉全身麻醉 图9 本实验采用耳静脉缓慢注射2 5 戊巴比妥钠 或者 其配合硫喷妥纳进行全身麻醉 待其完全麻醉后抬上手术架 仰卧 四肢固定在 手术架上 手术部位选择在倒数第二对乳头中间部位 用清水清洗手术部位及四 周 擦干后用碘酒进行大范围消毒 并用7 5 酒精脱碘 盖上创巾布并暴露手术 部位 沿腹中线依次切开皮肤 皮下肌肉 然后用刀柄或大的止血钳钝性分离皮 下脂肪和腹膜 用手探入腹腔 寻找到子宫和卵巢 慢慢牵引出腹腔 此时检查 卵巢和卵泡是否发生排卵 并用浸有3 7 生理盐水的纱布给卵巢和子宫保温保湿 固定输卵管 将装有胚胎的外径为2 3 m m 的玻璃管慢慢从输卵管口插入 经过1 2 个弯曲之后小心将胚胎吹入输卵管内 图1 0 并慢慢撤出玻璃管 我们在移植 过程中只对一侧输卵管进行胚胎移植 将输卵管伞重新包住卵巢 回复子宫和输 卵管到腹腔 并撒入抗生素抗菌消炎 常规缝合腹腔 术后将受体母猪单独隔离 连续4 天使用抗生素消炎 每天仔细观察记录受体猪的生理情况 做好发情观察 扬州大学硕士学位论文 图9 手术中的上海白猪图1 0 胚胎移植入输卵管中图1 1 出生后7 d 的克隆猪 2 4 麻醉方法的比较 a 戊巴比妥钠水溶液麻醉 保定绳保定代孕母猪 使用静脉输液器和五十毫升注 射器耳缘静脉注射戊巴比妥钠 等母猪自行卧倒后 抬上保定架 用保定绳保定 四肢 耳缘静脉滴注戊巴比妥钠保持麻醉 b 硫喷妥钠水溶液麻醉 保定绳保定代孕母猪 使用静脉输液器和五十毫升注射器 耳缘静脉注射硫喷妥钠 等母猪自行卧倒后 抬上保定架 用保定绳保定四肢 观察母猪麻醉状态 耳缘静脉滴注硫喷妥钠保持麻醉 c 硫喷妥钠戊巴比妥钠混合麻醉 保定绳保定代孕母猪 使用静脉输液器和五十 毫升注射器耳缘静脉注射硫喷妥钠 等母猪自行卧倒后 抬上保定架 用保定绳 保定四肢 观察母猪麻醉状态 耳缘静脉滴注戊巴比妥钠保持麻醉 d 酒精麻醉 由于其中一次实验中戊巴比妥钠水溶液麻醉剂的损失 在保定架保 定后 再使用酒精麻醉 使用胃管向胃中灌注酒精 4 5 含量 保持麻醉 麻醉后 猪体进入安静平稳状态后进行外科手术移植克隆胚胎 2 5 受体母猪妊娠识别和维持 胚胎移植时在重构胚中添加了3 0 枚左右的孤雌激活胚 以帮助妊娠的识别和 维持 此外 在受体母猪胚胎移植后的第1 0 d 注射p m s g l 0 0 0 第1 3 d 注射h c g 8 0 0 i u 来维持妊娠 2 6 出生克隆猪的鉴定 2 6 1 外型鉴定 由于代孕母猪是上海白猪 而克隆胚胎是巴马小香猪 所以出生 后的小猪 图1 1 通过体型外貌的观察 可以判定其是否是克隆猪 刘吉宏体细胞克隆猪胚胎制备及鉴定的研究 2 6 2 微卫星检测 2 6 2 1 血液采集 用肝素钠溶液湿润l m l 注射器的针筒 经小猪耳静脉抽血液 0 3 0 5 m l 置于冰中 带回实验室 2 6 2 2d n a 提取 采用u l t r a p u r e t m 基因组d n a 快速提取试剂盒 按照试剂盒 说明书操作 2 6 2 3 微卫星检测 参考19 9 6 年v a nh a e 血g e n 和2 0 0 3 年k b r s t 砌e 的文献 5 9 捌 设计了九对引物对克隆猪 供体猪和代孕母猪的基因组d n a 进行检测 将所测样 品进行随机编号 交由上海基康生物技术有限公司完成荧光标记引物p c r 扩增和 检测 并扫描生成图像 引物序列如下 s 0 7 0 7 a y 2 5 3 9 9 5 f o r w a r dp r i m e rs e q u e n c e 5 g g t a g g g c t t a c t t a a c t c 一3 r e v e r s ep r i m e rs e q u e n c e 5 一g a g a g g g a t g a g a a t c a g 3 s 0 7 1 1 a y 2 5 3 9 9 9 f o n a r dp r i i l l e rs e q u e n c e 5 c a g a a t c l a g c c t c a g c g t c 3 r e v e r s ep r i m e rs e q u e n c e 5 c a c t c c a t c c c t c c c a a g 3 s w l 31 1 a f 2 5 3 5 8 3 f o r a r dp r i m e rs e q u e n c e 5 c a a a t c a t t 1 a c t g c a g a a a a c 3 r e v e r s ep r i m e rs e q u e n c e 5 一g c c t g g g t g t t a a g t a a c a a a c 一3 s w 7 1 7 a f 2 5 3 8 5 0 f o 刑a r d p r i r n e r s e q u e n c e 5 t c t g c t c a t c c a a l a c t t g g c 3 i 沁v e r s ep r i m e rs e q u e r l c e 5 一c a t c c c c t g a a t g g t t c a t c 3 s 0 7 0 3 a y 2 5 3 9 9 1 f o 刑a r dp r i m e rs e q u e n c e 5 a a c c c a c t g a a c a a g g c 3 r e v e r s ep r i m e rs e q u e n c e 5 g c a a g a c a g a t a c t a c a g g 3 s 0 7 1 3 a y 2 5 4 0 0 1 f o r v a r dp r i m e rs e q u e n c e 5 c a t a a t a g c c c t c c a c a t c 3 扬州大学硕士学位论文 f o r w a r dp r i m e rs e q u e n c e 5 一c c a t a t c a t c c a g c a a t t c 一3 s 0 7 6 6 a y 7