银屑病发病分子机制研究.doc

国家自然科学基金申请书申请代码：受理部门： 收件日期：受理编号：第 28 页 版本1.006.023国家自然科学基金申 请 书您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作： 1)如果您是Word2000或以上版本用户，请把Word宏的安全性设为:中 方法: Word菜单-工具-宏-安全性-安全级,设置为中 (如果您是Word97用户，继续执行以下步骤) 2)关闭本文档，重新打开本文档 3)点击启用宏按钮，即可开始填写本文档或打印了资助类别： 亚类说明： 附注说明： 项目名称： 申 请 者： 电话： 依托单位： 通讯地址： 邮政编码： 单位电话： 电子邮件： 申报日期： 200年月日国家自然科学基金委员会基本信息0UQpCL0k申 请 者 信 息姓名性别 出生年月 年 月民族 学位 职称 主要研究领域 电话 电子邮件 传真 个人网页 工作单位 在研项目批准号 依托单位信息名称代 码 联系人 电子邮件 电话 网站地址 合作单位信息单 位 名 称代 码 项 目 基 本 信 息项目名称资助类别面上项目 亚类说明自由申请项目 附注说明 申请代码C030116:皮肤病学C030115:性传播疾病学基地类别 预计研究年限2006年1月 2008年12月研究属性应用基础研究 摘 要项目研究内容和意义简介（限400字）：真皮内T细胞异常活化、角质形成细胞（KC）增殖和分化异常和中性粒细胞异常趋化是银屑病的重要特点。CD147是一种新型跨膜糖蛋白，我们曾率先证实其与KC分化状态密切相关。CD147与T细胞增殖、活化和聚集有关；并可以作为细胞膜受体参与亲环素（CyP）A和B介导的T细胞基质黏附和中性粒细胞趋化。本研究中，我们将首先了解CD147、CyPA和CyPB在Jurkat T细胞，银屑病外周血炎症细胞和皮损中的表达；再通过CD147 siRNA转染明确其在T细胞增殖、活化及基质黏附中的作用，和在CyPA和CyPB介导的中性粒细胞趋化中的作用；最后建立人银屑病皮损-SCID鼠移植模型，在皮损内局部注射转染细胞以明确CD147 siRNA能否在体内缓解银屑病皮损发展。从而明确CD147在银屑病诸多发病环节中的作用和机制，明确CD147 siRNA对移植皮损的效应，为探寻银屑病新的治疗方法提供新的靶分子。关 键 词(用分号分开，最多5个)CD147;银屑病；亲环素；siRNA;SCID鼠 项目组主要成员(国家杰出青年科学基金不填此栏)编号姓 名出生年月性别职 称学 位单位名称电话电子邮件项目分工每年工作时间（月）1 2 3 4 5 6 7 89总人数高级中级初级博士后博士生硕士生822112说明: 1. 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。说明: 2. 项目组主要成员不包括项目申请者。经费申请表 （金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费22.45001.科研业务费3.0000（1）测试/计算/分析费0.8000图像分析、测序、酶联免疫检测等（2）能源/动力费0.2000实验期间所消耗水电的消耗（3）会议费/差旅费1.0000国内及国际学术会议各1次（4）出版物/文献/信息传播费1.0000资料印刷、复印、版面费、计算机和网络费用（5）其它2.实验材料费18.6500（1）原材料/试剂/药品购置费17.3000细胞分离，免疫印迹，引物合成，RT-PCR、质粒构建和转染试剂，细胞生物学试剂（2）其它1.3500实验动物及相关费用3.仪器设备费0.8000（1）购置0.8000补充移液枪、小型电泳仪（2）试制4.实验室改装费5.协作费0.0000二.国际合作与交流费2.00001.项目组成员出国合作交流1.0000中前期实验结果交流和商讨2.境外专家来华合作交流1.0000中后期实验结果交流和商讨三.劳务费1.2000象征性地支付中日双方相关工作人员四.管理费科研管理费合 计25.6500与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）其他经费来源合计0.0000报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）： 1. 项目的立项依据银屑病是一种多基因遗传背景下的免疫异常疾病，因其具有发病率较高和主要累及青壮年等特点而在皮肤科临床和科研领域倍受重视。从病理学上看，角质形成细胞增殖和分化的异常，角质层中性粒细胞聚集所形成的Munro微脓疡以及真皮浅层血管周围以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润是银屑病的三个最主要的特点。尽管三者之间存在非常复杂的相互作用和因果关系，但一般认为，真皮内聚集并活化的T淋巴细胞是银屑病皮损发生的始动因素，活化的T细胞可产生bEGF，INF-和IL-8等细胞/趋化因子，从而导致表皮角质形成细胞增殖和分化状态的异常并诱导中性粒细胞表皮内趋化和聚集1。 从目前银屑病的药物治疗手段上看，维A酸类药物和蒽林的主要作用机理是调节角质形成细胞的异常增殖和分化状态；传统免疫抑制剂 （糖皮质激素和MTX等）以及新型免疫抑制剂（环孢素A，他克莫司，匹美克莫司，西洛莫司等）的主要作用机理是抑制T细胞的增殖和活化；细胞/趋化因子（TNF-，CD4，CD25，CD11a，IL-2R，IL-6R，IL-12等）抗体主要是阻断T细胞活化及其相关作用；IL-8抗体主要是阻断中性粒细胞的趋化。但由于以上药物治疗手段各自不同的副作用和作用靶环节的相对单一性，其治疗效果及运用前景尚不能完全令人满意。因此，我们需要寻找同时参与银屑病多个病理生理学环节的新的靶分子及其适当的抑制途径，从而为开辟银屑病新的研究领域和探寻银屑病新的治疗手段提供理论依据。Basigin/CD147分子是一种属于免疫球蛋白超家族成员的新型跨膜糖蛋白，本研究组成员曾首次克隆该分子并发现它广泛存在于不同组织和细胞中，在细胞粘附及胚胎发育等方面发挥重要作用2。本研究群体从1998年开始围绕CD147在角质形成细胞异常增殖和分化以及皮肤肿瘤中的作用及机制开展了系列研究，并取得了一些原创性的科研成果：首先是明确了CD147位于角质形成细胞膜微绒毛的超微分布特点，从而提示这一分子可能在细胞粘附、细胞内外分子协同作用以及细胞膜受体等方面发挥重要作用3；然后，我们又利用大量实验首次发现：在皮肤鳞状细胞癌及恶性黑色素瘤的肿瘤细胞膜上CD147的表达显著增高，增高表达的CD147分子可以通过诱导肿瘤细胞周围成纤维细胞表达基质金属蛋白酶（MMPs），从而在多种皮肤肿瘤的浸润和转移中发挥作用4-7；另外，我们还率先证实了CD147与生理和病理状态下角质形成细胞分化状态密切相关，是一种新的低分化角质形成细胞的标志蛋白，并可能发挥抑制角质形成细胞分化的作用3，7-9，从而在“角质形成细胞分化异常”这一层面上为开辟银屑病新的科研领域提供了一个很有价值的靶分子。更为引起我们重视的是，几乎所有的T细胞淋巴瘤细胞中均有CD147分子的增高表达10，CD147还被证明与T细胞的发育11、分化12，特别是活化13密切相关。Kasinrerk 等的早期研究发现，经PHA诱导活化的T细胞中CD147的表达显著增高13；进一步的研究发现，T细胞膜上的CD147分子可以参与CD3介导的T细胞活化14；CD98是一种与T细胞等炎症细胞活化和聚集密切相关的分子，而CD147抗体能抑制CD98介导的炎症细胞聚集15；最近的研究显示，T细胞膜上的CD147分子可能是通过受体-配体的信息传导作用影响T细胞的增殖与活化16。亲环素（cyclophilin, CyP）是一种保守的蛋白家族，存在于包括T细胞在内的多种人体细胞中, CyP家族有CyPA、CyPB、CyPC、CyPD等成员，其分子量以及亚细胞定位各不相同。该组蛋白有两个共同特征，一是具有肽基脯氨酸顺/反异构酶活性,可催化细胞内蛋白质的折叠和转运；二是能与进入细胞内的免疫抑制剂（环孢素A等）结合形成复合物，该复合物可抑制神经钙调磷酸酶，进而抑制T细胞核活化因子（NFAT），导致活化T细胞的相关细胞因子基因不能转录和翻译，阻断T细胞信号传递从而实现环孢素A的免疫抑制作用。此外, CyP还可被活化的T细胞分泌,以细胞因子样的方式参与多种生理和病理过程。CyPA是CyP家族的主要成员，由165个氨基酸组成，相对分子量18kDa，约占细胞蛋白总量的0.10.4，主要位于胞质内。可由T细胞等炎症细胞分泌，是一种嗜中性粒细胞17、T细胞18和嗜酸性粒细胞19的趋化因子。实验证实CyPA的受体与人CD147 cDNA 的核苷酸排列有97的同源性，作为CyPA的受体，CD147可以在CyPA介导的信号传递中发挥重要作用20。作为艾滋病毒整合CyPA分子的受体，CD147参与了艾滋病毒进入和感染宿主细胞的过程21。最新的研究显示，CyPA可以调节细胞膜上CD147的表达水平22,23。CyPB是CyP家族的另一主要成员，主要存在于细胞内质网中，并可分泌到细胞外在细胞间信号传导中发挥作用。有研究证实，CD147也是CyPB的细胞膜受体，CD147抗体可阻断CyPB介导的嗜中性粒细胞趋化24。Allain等发现，CyPB可通过促进T细胞膜上41和47整合素的活化而增强T细胞向细胞外基质的粘附，T细胞膜上的CD147是这一信号传导过程中不可缺少的协同刺激分子18。 小干扰RNA(siRNA)是一种新近发现的诱导细胞内特定基因沉默的技术。它通过向细胞内导入长度为21-23的核苷酸序列，高度特异性地降解同源mRNA序列，从而有效地阻止相应蛋白质的表达。近年的研究发现，将目标基因siRNA转染原代培养T细胞是一种有效的基因治疗手段，在艾滋病等免疫相关性疾病中有很好的临床运用前景25，26。本研究组也于近期成功构建CD147 siRNA 表达载体，将它转染恶性黑色素瘤细胞后可有效抑制CD147的表达27，28，从而为项目的顺利开展奠定了很好的实验基础。因为缺乏理想的动物模型，对银屑病发病机制的研究大多停留在体外实验阶段。严重联合免疫缺陷鼠（SCID鼠）因其独有的细胞和体液免疫缺陷特点，而被广泛运用于肿瘤学和器官移植等科研领域。有研究发现，将银屑病患者皮肤移植到SCID鼠身上，有很高的移植存活率，且能较好地保存银屑病的临床、组织病理和免疫学特点29,30。因此，人银屑病皮损-SCID鼠移植模型被公认为目前最好的银屑病实验动物模型。国外有研究发现，在类风湿关节炎关节滑液中CyPA的水平和反应性中性粒细胞上CD147的表达水平与疾病的严重程度相关31，国内也有研究证实，在类风湿性关节炎滑膜组织的中性粒细胞和T细胞中有增高表达的CD147分子32。有学者发现，在银屑病患者的血清中CypA自身抗体的水平明显增高33，但国内外尚无有关CD147分子及其配体，CyPA和CyPB在银屑病发病机制中作用的报道。本研究中，我们将首先了解CD147分子及其配体CyPA和CyPB在Jurkat T细胞，银屑病患者外周血炎症细胞和皮损中的表达情况；然后通过CD147 siRNA技术明确CD147分子在Jurkat T细胞和银屑病患者T细胞增殖、活化及基质黏附过程中的作用，以及在CyPA和CyPB介导的中性粒细胞趋化过程中的作用；最后建立人银屑病皮损-SCID鼠移植动物模型，并通过该模型进一步明确CD147 siRNA能否在体内实验条件下缓解银屑病皮损发展的进程。本研究的最终目的在于，明确CD147分子在银屑病T细胞活化和基质黏附以及中性粒细胞趋化等重要发病环节中的作用和机制，明确CD147 siRNA对人银屑病皮损-SCID鼠移植模型的效应，为探寻银屑病新的研究领域和治疗方法提供理想的靶分子。参考文献1 Schaerli P, Britschgi M, Keller M, et al. Characterization of human T cells that regulate neutrophilic skin inflammation. J Immunol. 2004, 173:2151-8.2 Miyauchi T, Kanekura T, et al. Basigin, a new, broadly distributed member of the immunoglobulin superfamily, has strong homology with both the immunoglobulin V domain and the -chain of major histocompatibility complex class antigen. J Biochem 1990; 107: 316-23.3 Chen X, Kanekura T, Tsuyama S, et al. Ultrastructral localization of basigin in normal human epidermis. Histochem Cell Bio, 2001,115:465-70.4 陈翔，金藏拓郎，张桂英等皮肤鳞状细胞癌转移灶中基质金属蛋白酶的表达湖南医科大学学报，2001，26：297-95 Kanekura T, Chen X, Kanzaki T. Basigin (CD147) is expressed on melanoma cells and induces tumor cell invasion by stimulating production of matrix metalloproteinases by fibroblasts.Int J Cancer, 2002, 99: 520-28.6 陈翔，金藏拓郎，张桂英等皮肤鳞状细胞癌中Basigin/CD147表达与肿瘤进展的相关性中华皮肤科杂志，2002，35 (4)：271-47 陈翔，李吉，谢红付等CD147在角质形成细胞分化过程中的表达和作用中华皮肤科杂志，2003，36：318-218 Chen X, Kanekura T, Kanzaki T. Expression of Basigin in human fetal, infantile and adult skin and in basal cell carcinoma. J Cutan Pathol, 2001,28:184-90.9 陈翔，吴东辉，谢红付等CD147在尖锐湿疣皮损中的表达及意义临床皮肤科杂志，2004，33：209.10 Nabeshima K, Suzumiya J, Nagano M, et al. Emmprin, a cell surface inducer of matrix metalloproteinases (MMPs), is expressed in T-cell lymphomas. J Pathol. 2004, 202:341-51.11 Renno T, Wilson A, Dunkel C, et al. A role for CD147 in thymic development. J Immunol. 2002, 168:4946-50.12 Kirsch AH, Diaz LA Jr, Bonish B,et al. The pattern of expression of CD147/neurothelin during human T-cell ontogeny as defined by the monoclonal antibody 8D6. Tissue Antigens. 1997, 50:147-52.13 Kasinrerk W, Fiebiger E, Stefanova I, et al. Human leukocyte activation antigen M6, a member of the Ig superfamily, is the species homologue of rat OX-47, mouse basigin, and chicken HT7 molecule. J Immunol. 1992, 149:847-54.14 Koch C, Staffler G, Huttinger R, et al. T cell activation-associated epitopes of CD147 in regulation of the T cell response, and their definition by antibody affinity and antigen density. Int Immunol. 1999, 11:777-86.15 Cho, JY, Fox, DA., et al. The functional interactions between CD98, 1-integrins, and CD147 in the induction of U937 homotypic aggregation 2001, Blood, 98:374-82.16 Staffler G, Szekeres A, Schutz GJ, et al. Selective inhibition of T cell activation via CD147 through novel modulation of lipid rafts. J Immunol. 2003, 171:1707-14.17 Sherry B, Yarlett N, Strupp A et al. Identification of Cyclophilin as a Proinflammatory Secretory Product of Lipopolysaccharide- Activated Macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1992, 89:3511-15.18 Allain F, Vanpouille C, Carpentier M, et al. Interaction with glycosaminoglycans is required for cyclophilin B to trigger integrin-mediated adhesion of peripheral blood T lymphocytes to extracellular matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,2002, 99:2714-19.19 Xu Q, Leiva MC, Fischkoff SA, et al.Leukocyte chemotactic activity of cyclophilin. J. Biol. Chem, 1992, 267:11968-71. 20 Yurchenko V, Zybarth G, OConnor M，et al. Active Site Residues of Cyclophilin A Are Crucial for Its Signaling Activity via CD147. J. Biol. Chem., 2002:22959-65.21 Pushkarsky T, Zybarth G, et al. CD147 facilitates HIV-1 infection by interacting with virus-associated cyclophilin A. Proc Natl Acad Sci U S A.2001, 98:636065. 22 Yurchenko V, Pushkarsky T, Li JH, et al. Regulation of CD147 cell surface expression: involvement of the proline residue in the CD147 transmembrane domain. J Biol Chem. 2005 Jan 25; Epub ahead of print.23 Yang H, Li M, Chai H, et al. Effects of cyclophilin A on cell proliferation and gene expressions in human vascular smooth muscle cells and endothelial cells. J Surg Res. 2005 , 123:312-9.24 Yurchenko V, OConnor M, Dai WW,et al. CD147 is a signaling receptor for cyclophilin B. Biochem Biophys Res Commun. 2001,9:786-8.25 Park WS, Hayafune M, et al. Specific HIV-1 env gene silencing by small interfering RNAs in human peripheral blood mononuclear cells. Gene Ther. 2003, 10:2046-50.26 Li MJ, Bauer G, Michienzi A, et al. Inhibition of HIV-1 infection by lentiviral vectors expressing Pol III-promoted anti-HIV RNAs. Mol Ther. 2003, 8:196-206.27 陈翔，颜克香，谢红付等CD147 siRNA 表达载体的构建与鉴定中华皮肤科杂志，2005，已接受，待发表28 Chen X, Lin J, Yan KX. Specific CD147 gene silencing by small interfering RNAs in melanoma cells. Int J Cancer, Submitted.29 Nickoloff BJ, Wrone-Smith T. Injection of pre-psoriatic skin with CD4+ T cells induces psoriasis. Am J Pathol,1999,155:145-58.30 Gilhar A, Ullmann Y, Kerner H, et al. Psoriasis is mediated by a cutaneous defect triggered by activated immunocytes: induction of psoriasis by cells with natural killer receptors. J Invest Dermatol. 2002, 119:384-91.31 Konttinen,YT, Li,TF, Mandelin,J et al. Increased expression of extracelluluar matrix metalloproteinase induce in rheumatoid synonium: increased expression of extracellular matrix metalloproteinase inducer in rheumatoid synovium. Arthritis Rheum, 2000, 43: 275-80.32 董惟佳，朱平， 肖李冰等. 类风湿性关节炎滑膜组织中CD147表达的检测。细胞与分子免疫学杂志 ，2004，2：210-1。33 李卫平，谢震山，康向东等，银屑病和SLE患者血清抗亲环素A抗体的检测及意义。上海免疫学杂志，2001，21：17。2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。2.1研究内容（1） 运用免疫印迹和RT-PCR方法检测Jurkat T细胞，银屑病患者外周血T细胞及中性粒细胞中CD147表达水平，Jurkat 和外周血T 细胞中CyPA和CyPB表达水平。（2） 运用免疫组化法观察CD147，CyPA和CyPB在银屑病皮损中的表达和分布特点及其与病情的相关性。（3） 构建pSUPER/CD147siRNA质粒并转染银屑病患者外周血T细胞、中性粒细胞和Jurkat T细胞。（4） 运用免疫学常规实验方法观察CD147 siRNA转染对Jurkat 和银屑病患者T细胞增殖、活化及基质黏附作用的影响。（5） 运用中性粒细胞趋化性实验（Boyden chamber实验系统）观察CD147 siRNA转染对由CyPA和CyPB介导的中性粒细胞趋化性的影响。（6） 建立银屑病实验动物模型（人银屑病皮损-SCID鼠移植模型），并利用局部注射CD147siRNA转染Jurkat T细胞和患者自体炎症细胞的方法来观察其对移植皮损的临床表现，组织病理和免疫学特点的影响。2.2研究目标（1） 了解CD147分子及其配体CyPA和CyPB在Jurkat T细胞，银屑病外周血炎症细胞和皮损中的表达情况。（2） 通过CD147 siRNA技术明确CD147在Jurkat 和银屑病患者T细胞增殖、活化及基质黏附过程中的作用，及在CyPA和CyPB介导的中性粒细胞趋化过程中的作用。（3） 建立银屑病实验动物模型，并通过该模型进一步明确CD147 siRNA能否在体内实验条件下缓解银屑病皮损发展的进程。（4） 结合本研究和我们前期研究结果，明确CD147分子在银屑病角质形成细胞异常增殖和分化、T细胞活化和基质黏附以及中性粒细胞趋化等重要发病环节中的作用和机制，为探寻银屑病新的研究领域和治疗方法提供理想的靶分子。2.3拟解决的关键问题（1） pSUPER/CD147siRNA质粒的构建及其细胞内的成功转染（干扰有效性）；（2） 银屑病实验动物模型（人银屑病皮损-SCID鼠移植模型）的建立；（3） CD147分子在银屑病多个重要发病环节中的作用和机制，及其在银屑病治疗领域的开发运用前景。3、拟采取的研究方案及可行性分析。3.1 研究方法3.1.1 研究对象收集在中南大学湘雅医学院三家附属医院皮肤科初次就诊，近三个月来未经任何系统和局部治疗的寻常型银屑病患者40例和脓疱型银屑病患者15例，同时收集20例健康人作对照。患者经皮肤活检进一步明确临床诊断，并对银屑病分型和疾病严重程度（PASI积分）进行临床评估。3.1.2 Jurkat 和外周血T细胞及中性粒细胞中CD147表达水平的检测A细胞株：人Jurkat T细胞株从中国科学院上海细胞生物所购入，菜用含10% FCS的PPMI 1640培养液培养。B外周血T细胞的分离：采用密度梯度离心法分离40例寻常型银屑病患者、15例脓疱型银屑病患者和对照组外周血单个核细胞并用E-玫瑰花结法或免疫磁珠法纯化T细胞，用PBS洗涤3次,离心后重悬浮于含10% FCS的PPMI 1640培养液中培养备用（部分细胞中加PHA刺激）。C外周血中性粒细胞的分离：采用Polymorphprep分离液的梯度离心法分离40例寻常型银屑病患者、20例脓疱型银屑病患者和对照组外周血中性粒细胞,用PBS洗涤3次, 离心后悬浮于含10% FCS的DMEM培养液中培养备用。 D免疫印迹法检测CD147的蛋白表达水平：提取Jurkat T细胞，患者T细胞和中性粒细胞总蛋白，经SDS-PAGE分离，电转膜 至PVDF膜上，经封闭后依次加入兔抗人CD147抗体(日本抗体学会制备，鹿大皮肤科赠送)，辣根过氧化物酶标二抗，最后经ECL系统显色，图像分析（Adobe Photoshop）。ERT-PCR法检测CD147的mRNA表达水平：用Trizol提取Jurkat T细胞，患者T细胞和中性粒细胞RNA（按说明书进行），定量后用逆转录试剂盒进行逆转录用于PCR，CD147上游引物：5-GCAGCGGTTGGAGGTTGT-3；下游引物：5-AGCCACGATGCCCAGGAAGG-3，建立25l PCR反应体系，94 4min, 94 50s ,65 50s,72 1min 20s,72 10 min ,循环数35次。3.1.3 Jurkat 和外周血T细胞中CyPA和CyPB表达水平的检测A免疫印迹法检测CyPA和CyPB的蛋白表达水平：除兔抗人CyPA和CyPB抗体(购自Bioreagents公司)不同外，方法与3.1.2 D相同。BRT-PCR法检测CyPA和CyPB的mRNA表达水平：RNA提取及逆转录同前，CyPA上游引物：5-CACCGTGTTCTTCGACATTG-3；CyPA下游引物：5- CCATGGCCTCCACAATATTC -3，CyPB上游引物：5- GGAGATGGCACAGGAGGAAAG -3；CyPB下游引物：5- AAGAAACTCACTGGCAGACACG -3，建立25lPCR反应体系，94 4min, 94 50s ,60 1min50s,72 1min30s, 72 10min ,循环数 36次。3.1.4 患者皮损中CD147，CyPA和CyPB表达和分布特点的检测皮肤活检取患者皮损和非皮损区皮肤及对照组皮肤制备石蜡包埋标本，连续切片，采用免疫组化法分别观察CD147，CyPA和CyPB在皮肤组织角质形成细胞，淋巴细胞和中性粒细胞等细胞成分中的表达和分布特点，并分析其与标本来源，银屑病分型和疾病严重程度间的关系。3.1.5 pSUPER/CD147siRNA质粒转染Jurkat T细胞，患者外周血T细胞和中性粒细胞A.材料与试剂：质粒pSUPER由我院眼科夏晓波教授惠赠，质粒抽提及凝胶回收试剂盒购自TaKaRa公司，RT-PCR试剂盒购自晶美公司，T4DNA连接酶及限制性内切酶Hind 和Bgl 购自Promega公司，转染试剂lipofactamine 2000 购自美国invitrogen公司，大肠埃希菌DH5由我校病原微生物教研室提供。B.shRNA 的设计和构建：（1）shRNA 设计：根据shRNA设计原则和CD147编码序列，设计19-21nt的DNA片段，并利用Blast进行匹配，以确定选定的序列为特异性的序列，设计合成2-4条CD147编码序列的反向重复序列，如：5- GATCCCCGTCGTCAGAACACATCAACTTCAAGAGAGTTGATGTGTTCTGACGACTTTTTGGAAA-3和5- AGCTTTTCCAAAAAGTCGTCAGAACACATCAACTCTCTTGAAGTTGATGTGTTCTGACGACGGG-3,中间为9个插入序列TTCAAGAGA。合成的DNA两端设计有Hind 和Bgl的酶切位点，便于与pSUPER载体相连接。（2）双链DNA的形成：分别取1l 3mg/ml 合成的DNA片段，在48l退伙缓冲溶液中逐步降温退伙形成双链：94 4分钟， 80 4分钟， 75 4分钟， 70 10分钟，3720分钟，最后降到4 保存。（3）shRNA的构建：退火形成的双链与Hind 和Bgl的酶切线形化后的pSUPER在T4DNA 连接酶的作用下形成重组质粒。转化DH5，Amp抗性筛选，阳性克隆酶切，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。（4）序列分析：将筛选的阳性克隆进行序列分析，以证实目的DNA片段克隆入pSUPER载体，构建的重组质粒命名为pSUPER/CD147siRNA。C.转染细胞:大量抽提重组质粒pSUPER/CD147siRNA，并进行DNA定量。待培养细胞生长密度达70-80%时进行转染，转染试剂lipofactamine 2000 与质粒DNA按1：5进行转染,同时设pSUPER空白载体和正常细胞为实验对照组，置37培养箱中培养，4-6小时后弃培养液，加入含血清和抗生素的培养液，第2天加入puromycine筛选。D.建立稳定转染的细胞:（1） 确定筛选细胞的最佳puromycine的浓度：在生长状态良好的培养细胞中加入不同浓度的puromycine,观察细胞的生长情况，保持生长的最低puromycine浓度即为筛选的最佳浓度。（2）转染细胞的puromycine筛选：加入最佳浓度的puromycine进行筛选，至正常细胞全部死亡，并长出单个克隆为止。（3）单克隆的挑取和扩增：将待筛选的细胞单克隆挑入24孔板中培养，长满后传入培养瓶中批量扩增。E . 免疫印迹法和RT-PCR检测CD147的表达并确定抑制效果:方法同3.1.2 D,E。3.1.6 转染CD147siRNA对Jurkat 和患者T细胞增殖和活化的影响A. T细胞增殖状况的检测：实验分未转染、空白载体转染和CD147siRNA转染的Jurkat/患者T细胞（各1106 个细胞）等六组，经PHA刺激后，于37下培养72小时，用常规MTT法检测细胞增殖情况。B. T细胞活化状况的检测：实验分组同上，经PHA刺激后，于37下培养72小时，采用经典的淋巴细胞转化实验，并检测IL-2和-干扰素来了解T细胞活化状况。3.1.7 转染CD147siRNA对Jurkat 和患者T细胞基质黏附作用的影响在无菌96孔板中加入纤维结合蛋白（1 g/100 l/每孔），经4过夜固化，包被并用0.5% BSA封闭非特异性结合位点。加入的细胞分未转染、空白载体转染和CD147siRNA转染的Jurkat/患者T细胞（各1106 个细胞）等六组，经37 孵育半小时后，倒去培养液，并用PBS洗去未黏附的T细胞。每孔加入25 mL MTT(终浓度5 moL/L)继续培养4 h，加入DMSO100 uL，震荡10 min，待紫蓝色颗粒完全溶解，在酶联免疫检测仪以490 nm 为检测波长，测各孔的A490值，并利用标准曲线量化黏附的T细胞数量（每组3个，重复三次，计数平均值）。3.1.8 转染CD147siRNA对由CyPA和CyPB介导的中性粒细胞趋化性的影响中性粒细胞趋化性实验仍采用我们曾成功用于检测皮肤肿瘤细胞迁移情况（国家自然科学基金，30200248）的博伊登室（Boyden chamber）实验系统，并作适当改动。博伊登室由上室和下室组成，上、下室由不含聚维酮的聚碳酸酯膜分隔，膜上有3-m小孔，可通过趋化的中性粒细胞。上室中加入的细胞分为未转染、空白载体转染和CD147siRNA转染的中性粒细胞等三组，下室分为不加T细胞、加Jurkat/患者T细胞和加入经CyPA或CyPB抗体处理的Jurkat/患者T细胞七组。37 孵育1小时后取下聚碳酸酯膜，采用膜染色细胞计数法检测膜底面的中性粒细胞数（每组3个，重复三次，计数平均值）。3.1.9 人银屑病皮损-SCID鼠移植模型的建立十位寻常型银屑病患者的新鲜皮损（五位健康成人皮肤为对照）将作为供体使用，选择6-8周的SCID鼠为移植受体。每位供体取七块0.80.8cm大小皮片（银屑病皮损的临床表现相同）分别移植于七只SCID鼠背部，单线可吸收缝合，无菌纱布覆盖直至10天后愈合。3.1.10 移植皮片内细胞注射及组织学分析移植后第3周根据移植皮损的鳞屑多少、隆起和红斑情况对其进行临床积分评价（分为0-3分四级）。移植后第3周和第4周将用PBS稀释的细胞（200l）注射到移植皮损的皮下（Jurkat 细胞组仅于第4周注射1次）。注射分七组：生理盐水组；Jurkat 细胞组；CD147siRNA转染Jurkat 细胞组；供体T细胞组；供体CD147siRNA转染T细胞组；供体中性粒细胞组和供体CD147siRNA转染中性粒细胞组。移植后第6周再次对皮损进行临床积分评价并作前后比较，处死SCID鼠，将移植皮损行石蜡包埋，切片。组织学分析包括：表皮厚度；角化不全发生情况；表皮中上层中性粒细胞聚集和Munro微脓疡形成情况；真皮浅层血管周围单一核炎症细胞浸润情况，并进行Ki-67（反映角质形成细胞增殖情况）、CD3(T细胞标记)和CD15(中性粒细胞标记)的免疫组化检测。3.2 技术路线SCID鼠皮肤标本人银屑病皮损-SCID鼠移植模型临床评估组织学和免疫组化分析相关分析相关分析转染中性粒细胞构建pSUPER/CD147siRNA质粒免疫印迹、RT-PCR检测CD147表达水平免疫印迹、RT-PCR检测CyPA和CyPB表达水平转染外周血T细胞转染Jurkat细胞细胞增殖状况活化状况基质黏附作用趋化性实验银屑病患者和健康对照临床评估CD147、CyPA和CyPB免疫组化石蜡包埋分离外周血T细胞Jurkat T细胞株分离外周血中性粒细胞3.3 可行性分析我校三家附属医院皮肤科每年超过20万患者的门诊量可以为本研究的标本来源提供可靠的保证。项目申请者于1998年开始会同日本鹿儿岛大学皮肤科金藏拓郎副教授（Basigin/CD147分子的发现者之一）在国际上率先开展了CD147在正常皮肤及皮肤肿瘤中作用及机制的系列研究，先后获得包括两项国家自然科学基金在内的多项国内外科研课题资助，取得了五个创新性的科研成绩，在国内外发表相关论文10篇（其中SCI论文3篇）(详见工作基础和申请人简历)。本项目组的主要成员都曾先后参加过以上工作，为本研究的开展奠定了坚实的人员、理论基础和实验操作经验。本项目主要涉及的细胞生物学实验，siRNA技术和人银屑病皮损-SCID鼠移植模型均为世界公认的成熟技术，没有过高的技术难度。本项目组已成功构建人CD147 siRNA 表达载体并已鉴定了CD147siRNA转染的有效性，从而为本项目的顺利开展奠定了坚实的技术基础(详见工作基础和申请人简历)。我们的RT-PCR预实验发现，在3例寻常型银屑病患者和1例脓疱型银屑病患者外周血T细胞中均有CD147和CyPA的增高表达(详见工作基础)。本项目组有开展裸鼠实验的成功经验（国家自然科学基金，30200248），SCID鼠已先期从中科院上海实验动物中心购进五只，并已准备开始建立人银屑病皮损-SCID鼠移植模型的预实验。本项目细胞生物学和分子生物学实验将在我校肿瘤学卫生部重点实验室、国家遗传学重点实验室及鹿大医学部皮肤科实验室开展。以上三家实验室的技术力量及实验条件均已达到国内乃至国际先进水平。为确保本项目顺利开展，本课题组成员（颜克香）将于今年下半年以共同培养博士生身份，由鹿大皮肤科邀请赴日开展本项目的预备实验。课题实施期间，双方人员将依据近八年合作的惯例，定期互访，交流实验进展情况并开展讨论。基于以上所述，我们认为本项目在实验材料、人员、理论和具体操作等方面有相当扎实的基础，科研构思充分体现了科研工作的延续性，准备充分，是切实可行的。4、本项目的特色与创新之处。经检索1990年以来文献证实，本项目（1）在国内外首次将CD147分子引入银屑病的科研领域；并首次探讨CD147分子与其配体CyPA和CyPB在银屑病发病诸多环节的作用机制及其相互关系。（2）在国内外首次运用CD147siRNA技术研究该分子在人活体细胞（T细胞和中性粒细胞）中的作用机制。（3）在国内首次建立人银屑病皮损-SCID鼠移植模型这一银屑病实验动物模型。5、年度研究计划及预期研究结果。5.1 年度研究计划2006年1月至2006年12月：收集病例及临床资料，石蜡标本制作。HE染色，明确病例诊断、分型和疾病严重程度判断。完成免疫组化实验及结果观察、分析。整理资料，完成论文1篇。完成免疫印迹和RT-PCR方法检测CD147、CyPA和CyPB表达水平的预实验，初步构建pSUPER/CD147 siRNA质粒。2007年1月至2007年12月：完成pSUPER/CD147siRNA质粒转染细胞实验并鉴定干扰效果。观察CD147 siRNA对T细胞增殖、活化及基质黏附作用的影响，以及对由CyPA和CyPB介导的中性粒细胞趋化性的影响。整理资料，完成论文2-3篇