啤酒酿造中双乙酰的代谢调控研究.doc

啤酒酿造中双乙酰的代谢调控研究摘 要:双乙酰是啤酒生产过程中由酵母在合成氨基酸的途径中产生的重要风味物质。其含量是衡量啤酒成熟的重要标志。本文简要综述了啤酒生产中双乙酰的形成机制和代谢调控研究进展。关键词：啤酒酿造；双乙酰；代谢；调控啤酒中双乙酰的主要成分是2，3-丁二酮，是酵母发酵过程中的代谢副产物，是影响啤酒风味的重要因素，是衡量啤酒成熟的主要依据。如果在生产过程中控制不当，就会使双乙酰含量超过阈值，致使啤酒风味改变。国家标准中优级淡色啤酒要求双乙酰含量在013mg/L以下。双乙酰的形成与消除几乎成了促进啤酒成熟以及缩短发酵周期的核心问题。传统的啤酒酿造中，啤酒酵母在主发酵期产生的双乙酰，会在发酵后期和贮酒期由啤酒酵母重新吸收还原成味阈值较高的2，3-丁二醇，从而达到促进啤酒口味成熟的目的。但在啤酒后发酵和贮酒过程中，由于双乙酰还原的速度很慢，要想得到双乙酰含量合格的成熟啤酒，就要延长发酵周期，这对于提高发酵罐的利用率和经济效益都不利。因此，有目的地控制啤酒中的双乙酰含量，对于促进啤酒成熟、缩短发酵周期、改善啤酒质量和提高经济效益具有非常重要的意义。现今在啤酒生产中，无论是优化发酵条件、酵母菌种的改良、还是外加a-乙酰脱羧酶等方法都是从双乙酰的代谢途径出发的。可以说双乙酰代谢途径的调控是解决啤酒发酵过程中双乙酰含量对啤酒风味影响的根本所在。所以研究啤酒酿造过程中形成双乙酰的机制、途径以及如何有目的的控制啤酒中的双乙酰受到了广泛的关注。1、啤酒生产中双乙酰的形成机制和代谢途径最初的啤酒酿造者认为，双乙酰是由啤酒中污染的乳酸菌产生的。直到20世纪60年代。研究者才发现双乙酰是酵母的正常代谢产物。双乙酰是正常发酵过程中，由啤酒酵母细胞体内所进行的缬氨酸生物合成的中间产物-乙酰乳酸在分泌到细胞外时，由非酶促的氧化脱羧反应自发产生的。当酵母生产繁殖，需要大量合成缬氨酸时，丙酮酸被大量转化为-乙酰乳酸，而由于乙酰羟基同分异构还原酶(RI)效率非常低，使得双乙酰前体物质-乙酰乳酸得以积累，在酵母细胞内-乙酰乳酸不会转化为双乙酰，当一部分-乙酰乳酸分泌出细胞进入啤酒中，自发的氧化脱羧形成双乙酰，如果酵母活性高，则双乙酰依靠渗透酶将双乙酰输送进入酵母细胞，被酵母重新吸收，有酵母自身的酶催化，还原成乙偶姻(3-羟基-2-丁酮)和2，3-丁二醇，排出细胞外。乙偶姻在啤酒中有窖霉味和苦味，其阈值为3-50mg/L。乙偶姻极不稳定，当条件适当时，一方面向稳定的2，3-丁二醇转化，另一方面又与双乙酰保持可逆的平衡，乙偶姻和丁二醇的口味阈值高，一般不会对啤酒的风味造成影响。同时由于淡色啤酒的发酵和后熟均在低温下进行，使得-乙酰乳酸的非酶促催化脱羧及双乙酰还原的速度相对变慢，这也造成了-乙酰乳酸的积累，从而延长了发酵周期。2、啤酒生产中双乙酰的调控双乙酰主要在啤酒生产的主发酵期形成，也主要在主发酵期还原。这是因为酵母菌在主发酵期间有旺盛的代谢活动，酵母会在合成氨基酸的同时形成双乙酰。另外，仅一乙酰乳酸和活性乙醛的形成也会产生一定量的双乙酰。在啤酒的后发酵和贮酒阶段，如果代谢积累的-乙酰乳酸不能充分除去，就会有较多的双乙酰形成，进而影响啤酒的成熟和啤酒风味。所以，双乙酰是构成啤酒风味的主要成分，也是衡量啤酒成熟与否的重要标志。在啤酒生产中控制啤酒中双乙酰的含量，对于促进啤酒成熟，缩短发酵周期显得非常重要。从双乙酰形成机制和代谢途径上看，控制啤酒中双乙酰的含量主要应从双乙酰代谢途径上游和下游即从双乙酰的合成和分解两个方面来考虑。一方面可减少-乙酰乳酸的生成，-乙酰乳酸作为双乙酰合成的前体物质，在啤酒生成中大量积累，可以说这是导致双乙酰含量过高和使得发酵周期延长的直接原因，加速-乙酰乳酸的非酶氧化分解，由于-乙酰乳酸的氧化脱羧反应是慢反应，而双乙酰还原为丁二醇的反应为快反应，所以在发酵液中往往积累大量的-乙酰乳酸，容易造成后酵液和成品酒中双乙酰的反弹。另一方面是双乙酰的分解：双乙酰的还原速度与发酵过程中的许多因素有关，如温度、酵母数量以及酵母还原能力等。在啤酒生产过程中应综合考虑各因素，选择适当的生产工艺，即保证啤酒发酵的正常进行，又尽可能加速双乙酰的还原。3、啤酒生产中双乙酰含量的具体调控措施31 应用遗传育种技术控制啤酒双乙酰生成量311 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型酵母的筛选实验研究证明：缬氨酸能通过反馈抑制-乙酰乳酸的生成来影响双乙酰的生成量。所以，为防止啤酒发酵过程双乙酰生成量过多，可采取措施对缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的台成途径进行遗传上改造，通过选育降低或经诱变削弱乙酰羟基酸合成酶的催化功能的菌株来实现。也就是通过对啤酒酵母的诱变筛选，选育出缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型茵株，因其缺少乙酰羟基酸合成酶而较少积累-乙酰乳酸，导致较少生成双乙酰。但实际上此诱变也带来营养缺陷型菌株在利用麦芽糖发酵能力较差的负面效应，因而影响其应用于生产实践。312构建古-乙酰乳酸脱羧酶基因的啤酒酵母工程菌-乙酰乳酸脱羧酶可以直接催化-乙酰乳酸生成乙偶姻，而不经过双乙酰的步骤，从而降低双乙酰的含量，但啤酒酵母本身不含此酶。因此，将-乙酰乳酸脱羧酶基因引入啤酒酵母中并使其表达，是控制啤酒酿造过程中双乙酰的另一条有效的途径.将产气肠杆菌的-乙酰乳酸脱羧酶基因导入啤酒酵母中，在乙醇脱氢酶启动子控制下，利用酵母穿梭质粒YEpl3构建了含-乙酰乳酸脱羧酶基因片段的表达载体，并转化啤酒酵母。用此转化子和亲株进行对比发酵实验，发现双乙酰量明显低于亲株，而其它发酵性能，风味成分的含量基本一致。313选育低产双乙酰啤酒酵母菌株通过化学和激光诱变，选育低产双乙酰啤酒酵母菌株。张秀丽等嗵过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变选育出了低双乙酰啤酒酵母菌株BEZl12，经过500L发酵罐中试，发酵液中双乙酰含量比出发菌降低了27。张智维等用功率为6Mw、波长为623.8nm的He-Ne激光，以滤纸片法照射啤酒酵母5min，得到双乙酰值低的啤酒酵母菌株。用该菌株酿造的啤酒，双乙酰含量比原菌株下降了53。32 麦汁质量对双乙酰生成的影响根据酵母对氨基酸的吸收利用顺序，可把麦汁中的氨基氮分为四组川，即A组：答氨酸、备氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、糖氨酸；B组：组氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；C组：甘氨酸、苯丙氨酸；D组：脯氨酸和氨基丁酸。酵母优先吸收利用A组氨基酸，同时也缓慢吸收利用B组氨基酸时，当缬氨酸的量不足以被酵母吸收利用时，参与缬氨酸合成的酶被激活，开始合成缬氨酸，并且分泌-乙酰乳酸，但如果缬氨酸充足，则对-乙酰乳酸反馈抑制，从而停止合成过程，也就没有多余的-乙酰乳酸分泌，从而使双乙酰的产量降低。只有前三组氨基酸消耗完毕后且在有氧的条件下，酵母才利用D组氨基酸。提高麦芽汁氨基氮(-氮基氮)的含量，也就相应提高了麦芽汁中缬氨酸含量，从而减少-乙酰乳酸的合成和积累，相应地降低了双乙酰的生成量。33 麦汁中的溶解氧含量发酵过程中若麦汁中有充足的溶解氧，能增加单位麦汁中的酵母数即酵母浓度，增加酵母的发酵能力及还原双乙酰的能力。由于麦汁经强烈的煮沸后，麦汁中的溶解氧量很少，根本满足不了酵母正常繁殖的需要。因此，冷却麦汁除了在管路中缓慢通氧外，满罐后最好再向罐中通风搅拌10-15min，以保证通氧量在麦汁：空气=10：1(V:V)，溶解氧在68mg/L范围内。此外，过分通氧及麦汁中的溶解氧量10mg/L时，酵母的繁殖速度以及增殖量就会过快，新生的细胞过多造成酵母缺乏养分，使其代谢能力降低，从而使双乙酰含量增加，所以对冷却麦汁的通氧量要严格检测并加以控制。34 发酵过程的工艺控制提高发酵温度。-乙酰乳酸的非酶解和双乙酰的酶还原作用都与温度有关，温度愈高，反应愈快。因此，主发酵温度提高些，或主发酵结束前保持较高的发酵温度，双乙酰还原很快，啤酒的后发酵时间就大大缩短了。降低接种麦汁的pH值。将接种麦汁的pH值降低至44左右，并不影响发酵速度，但在低pH值下，一方面-乙酰乳酸的生成量减少；另一方面-乙酰乳酸分解为双乙酰的速度加快了。控制酒液与氧的接触。氧作为供电子体可加快-乙酰乳酸非酶氧化进程，加速双乙酰的形成。尤其是经过灭菌的成品酒，具还原能力的酵母已被杀灭，氧的存在将带来双乙酰的反弹。防止杂菌的污染。乳酸杆菌、四联球菌、发酵单胞菌等都可产生双乙酰。可使发酵过程中污染将造成双乙酰含量的大幅飙升。35 添加-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）在双乙酰的形成与消除反应过程中，前体物质-乙酰乳酸的氧化脱羟反应速率比双乙酰还原反应速率慢10倍，在发酵后期啤酒中易积累较多的-乙酰乳酸。待后酵完毕还会降解形成双乙酰 。直接往啤酒中加入食品级-乙酰乳酸脱羧酶制剂被认为是降低啤酒中双乙酰含量的简洁有效的方法。添加-乙酰乳酸脱羧酶不仅可以缩短双乙酰还原时间，同时也减少了酒液中-乙酰乳酸含量。