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酶工程的研究进展及前景展望摘要：概述了21 世纪国际上酶工程研究的新进展和新趋势。本文意在阐述近年来酶工程在分子水平的研究进展,并对其未来前景进行了展望。简单介绍了酶工程研究的进展, 对酶工程的发展前景进行了探讨。介绍了酶工程的应用现状，并对酶工程的作用和发展做出了展望。关键词: 酶工程; 抗体酶；酶的固定化；开发研究; 进展； Abstract: An overview of the enzyme engineering in the21st century international research progress and new trends. This paper aims to elaboratein recent years, progress in enzyme engineering research at the molecular level,anditsfutureprospects. Briefly introduced the progress of the study ofenzyme engineering,discussed the prospects for the development ofenzyme engineering. Introduced the application status of the enzyme works ,and the role and development of enzyme engineering to make theoutlook.Keywords: Enzyme Engineering; Antibodyenzyme; Immobilization; Research and development; Progress1 前言跨入21 世纪,人们在20 世纪认识生命本质高度一致性的基础上,迎来了后基因组时代,将有可能从整个基因组及其全套蛋白质产物的结构- 功能机理的角度,进一步阐明生命现象的核心和本质, 并系统整合生物学的全部知识,建立起真正的统一的普通生物学(general biology)。而生物技术将为解决人类所面临的食品和营养、健康和长寿、资源和能源、环境保护和生态平衡,以及可持续发展等重大问题,发挥无可替代的作用, 为人类作出更大的贡献。酶工程是生物技术的一个重要组成部分, 指在一定的生物反应器内, 利用酶的催化作用, 进行物质转化的技术。其应用范围已遍及工业、医药、农业、化学分析、环境保护、能源开发和生命科学理论研究等各个方面。与此同时,酶工程产业的发展非常迅速。1998年全世界工业酶制剂销售额高达16亿美元。预计到2008年,销售额将达到30亿美元。近年来,美国、欧洲共同体国家和日本,在酶工程研究和酶工程产业方面发展非常迅速,继续居于领先地位。本文拟就21世纪国际酶工程研究领域的若干“热点”和前沿课题, 对21世纪酶工程研究的发展动向作一概述1。2 酶的分离和提纯酶的分离和提纯是酶生产的一个关键问题，也是酶工程的一项中心环节，它不仅影响酶的产率、酶的活性，而且还直接影响到其它技术的发挥，如固定化技术、酶的使用稳定性和稳定化、酶的保存等。从微生物、动植物细胞中得到含有多种酶的提取液后，为了从提取液中获得所需要的某一种酶，必须将提取液中的其它物质分离，这就是酶的分离纯化。经过分离纯化后得到的酶，活性不能降低，因此，分离纯化必须在适宜的条件下进行。可选择各种沉淀法、离心法、膜分离法、柱层析法、双水相系统萃取法等分离纯化酶2。3 酶工程研究进展酶的生产和应用的技术过程称为酶工程。其主要任务是通过预先设计, 经人工操作而获得大量所需的酶, 并利用各种方法使酶发挥其最大的催化功能3。本文将二十多年来围绕酶工程的主要任务进行了一系列的阐述,现将主要研究成果介绍如下：3.1 酶的生物合成及其调节控制研究所有生物体在一定的条件下都能合成多种多样的酶。酶的生物合成受细胞内外许多因素的影响。研究酶的生物合成及其调节控制,对指导酶的生产以及阐明某些抗生素和药物的作用机制有重要意义。1980年郭勇等人4 研究了二环素对大肠杆菌中碱性磷酸酶生物合成、B_半乳糖苷酶诱导合成和其他蛋白质生物合成的影响。发现BCM 能明显阻遏碱性磷酸酶的合成和B_半乳糖苷酶的诱导合成,同时却诱导产生一种47K蛋白。这一结果阐明了二环素杀菌作用的主要原因。1982年,研究了枯草杆菌碱性磷酸酶的生物合成及其调节5。发现枯草杆菌AS1.398 细胞在无机磷酸含量受到限制的培养基中生长时,若培养基中的无机磷酸含量降到0.01 mmol/ L以下,枯草杆菌细胞内将迅速合成碱性磷酸酶;在碱性磷酸酶生物合成的高峰期, 添加1.0 mmol/ L的磷酸盐,该酶的合成完全被阻遏;枯草杆菌碱性磷酸酶的生物合成不受其作用底物的诱导,也不受分解代谢物的阻遏。可见,控制培养基中磷的含量是加速枯草杆菌碱性磷酸酶的合成和提高酶产率的主要措施。此外,我们还对菊糖酶、纳豆激酶、超氧化物歧化酶等的生物合成及其调控进行了研究67。3.2 酶、细胞和原生质体固定化研究1985 年开始, 郭勇等人承担了国家自然科学基金(高技术)项目、国家科委重点项目、国家“七五”攻关项目和广东省重点项目等多个科研项目,从固定化载体、固定化方法、固定化条件、固定化酶生产药物、固定化细胞生产胞外酶和固定化原生质体生产胞内酶等方面对酶、细胞和原生质体固定化技术进行了系统研究.固定化细胞生产A_淀粉酶、糖化酶和果胶酶的研究结果8 表明,固定化细胞生产胞外酶具有稳定性好、酶产率高、可以反复多次使用和可连续生产等显著特点, 有利于胞外酶生产技术的发展。1988年,“固定化微生物细胞发酵生产胞外酶”获广东省生物技术专项奖一等奖,”光交联树脂固定化细胞生产A_淀粉酶和糖化酶研究”获广东省生物技术专项奖二等奖。1989年, 郭勇赴美国爱达荷大学进行合作研究,圆满完成了固定化细胞生产A_淀粉酶的动力学研究。4 酶的定向固定化技术固定化酶技术的发展使酶工程效率更高、成本更低,产品更加丰富多彩,固定化酶在工业、临床、分析和环境保护等方面有着广泛的应用。但是,在大多数情况下, 酶固定化以后活性部分失去, 甚至全部失去。一般认为,酶活性的失去是由于酶蛋白通过几种氨基酸残基在固定化载体上的附着( attachment)造成的。这些氨基酸残基主要有:赖氨酸的E- 氨基和N- 末端氨基,半胱氨酸的巯基,天门冬氨酸和谷氨酸的羧基和C- 末端氨基,酪氨酸的苯甲基以及组氨酸的咪唑基,由于酶蛋白多点附着在载体上,引起了固定化酶蛋白无序的定向和结构变形的增加。近来,国外的研究者们在探索酶蛋白的固定化技术方面,已经寻找到几条不同途径,使酶蛋白能够以有序方式附着在载体的表面,实现酶的定向固定化,而使酶活性的损失降低到最小程度。目前,文献中涉及的定向固定化方法有如下几种9: (1)借助化学方法的位点专一性固定化;(2) 磷蛋白的位点专一性固定化;(3) 糖蛋白的位点专一性固定化;(4)抗体(免疫球蛋白)的位点专一性固定化;(5)利用基因工程的位点专一性固定化。这种有序的、定向固定化技术已经用于生物芯片、生物传感器、生物反应器、临床诊断、药物设计、亲和层析以及蛋白质结构和功能的研究。这种定向固定化技术具有以下一些优点:(1) 一个酶蛋白分子通过其一个特定的位点以可重复的方式进行固定化;(2)蛋白质的定向固定化技术有利于进一步研究蛋白质结构;(3)这种固定化技术可以借助一个与酶蛋白的酶活性无关或影响很小的氨基酸来实现。5 酶工程的应用进展105.1 活性多肽的开发研究近年来,人们利用酶工程技术来开发功能性活性肽取得了很大的进展。生物活性肽是蛋白质20种天然氨基酸以不同排列组合方式构成的从二肽到复杂的线性或环形结构的不同肽类的总称,是源于蛋白质的多功能化合物。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能,易消化吸收,有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用,且食用安全性极高。生物活性肽主要是通过化学法或酶法降解蛋白质而制得。其中,酶法降解蛋白质生产活性多肽安全性极高,能在温和的条件下进行定位水解分裂产生特定的肽, 且水解过程易控制, 因而近几年报道的活性肽的制备方法皆为酶解法。目前已从酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、水产蛋白的酶解物中制得一系列功能各异的生物活性肽。5.2 在污染治理中的应用：(1)辣根过氧化物酶。辣根过氧化物酶是酶处理废水领域中应用最多的一种酶。有过氧化氢存在时,它能催化氧化多种有毒的芳香族化合物,其中包括酚、苯胺、联苯胺及其相关的异构体,反应产物是不溶于水的沉淀物。(2)木质素过氧化物酶。木质素过氧化物酶,也叫木质素酶,是白腐真菌细胞酶系统的一部分。它可以处理很多难降解的芳香族化合物和氧化多种多环芳烃、酚类物质。(3)漆酶。漆酶由一些真菌产生,通过聚合反应去除有毒酚类。而且,由于它的非选择性,能同时减少多种酚类的含量。漆酶的去毒功能与被处理的特定物质、酶的来源及一些环境有关。(4)蛋白酶。蛋白酶是一类水解酶,在鱼、肉加工工业废水处理中得到了广泛应用。蛋白酶能使废水中的蛋白质水解,得到可回收的溶液或有营养价值的饲料。(5)微生物脂酶。脂酶应用于被污染环境的生物修复以及废物处理是一个新兴的领域。石油开采和炼制过程中产生的油泄漏, 脂加工过程中产生的含脂废物,都可以用不同来源的脂酶进行有效处理。一项日本专利报道了直接在废水中培养亲脂微生物来处理废水。脂酶在生物修复受污染环境中获得了广泛的应用。6 酶工程的发展前景1121世纪,生物科学与生物工程的发展将进一步揭示生命的奥秘,在世界科技和经济发展中起主导和支柱作用。作为生物工程重要组成部分的酶工程亦将飞速发展, 前景广阔。我们将在原有的基础上,运用已经熟悉掌握的酶工程基本理论和基本技术,进一步进行酶工程新技术、新工艺和新产品的研究开发,特别是在研究成果的产业化方面下功夫,使我校酶工程研究在新世纪取得新的辉煌。21世纪酶工程的发展主题是: 新酶的研究与开发,酶的优化生产,酶的高效应用。6.1 新酶的研究与开发随着酶工程的发展,目前已知的酶已不能满足人们的需要,研究和开发新酶已成为酶工程发展的前沿课题。新酶的研究与开发,除采用常用技术外,还可借助基因组学和蛋白质组学的最新知识,借助DNA 重排和细胞、噬菌体表面展示技术。目前最令人瞩目的新酶有抗体酶和端粒酶等。我们已经了解了这些新酶的基本特性, 并已开展部分研究,有望在这些新酶的研究中取得突破性的进展。6.1.2 抗体酶的研究与开发抗体酶( Abzyme) 又称为催化性抗体( Cata_lyzed Antibo dies)。是一类具有生物催化功能的抗体分子。抗体是由抗原诱导产生的能与抗原特异性结合的蛋白质。预计人体的免疫系统具有产生10万种抗体的能力。只要在抗体与抗原的结合部位赋予酶的催化特性，抗体就有可能成为有催化活性的抗体酶。其中有些是原本在自然界不存在的新酶.抗体酶可以采用诱导法， 也可采用修饰法获得。修饰法是采用分子修饰技术，将抗体结合部位的结构改变成为酶分子的活性中心，从而产生有催化活性的抗体。诱导法可以采用某种酶为抗原，诱导生成该酶的抗体，再以该酶的抗体为抗原，诱导抗抗体的产生。这样，抗抗体的结合部位与作为抗原的酶的活性中心具有相同的构象，就有可能筛选得到抗体酶，也可以采用某种化合物为半抗原，将它与蛋白质相结合后作为抗原，诱导抗体酶的产生。抗体酶将成为本世纪新酶研究开发的重要方面。6.1.3 端粒酶的研究与开发端粒酶( Telomerase ) 是催化端粒( Telomere)合成和延长的酶，与细胞的衰老及癌症的发生有很大关系。端粒能保护真核生物染色体DNA 免遭破坏，由于细胞中存在各种破坏染色体DNA 的不良因素，加上真核生物中存在的“末端复制问题”，若细胞无法填补这些空隙，染色体DNA 将随每一次细胞分裂而缩短，直至D NA 被破坏而引起细胞消亡。端粒的存在不但可避免外界因素对D NA 的破坏，而且可在复制过程中，通过牺牲自我而保护染色体DNA的完整。自一出生，人的正常体细胞内就有很长的端粒，但却检测不到端粒酶的活性( 生殖细胞和干细胞除外)，所以正常体细胞的端粒不能延长，只会不断缩短，直至生命结束。可见端粒酶与人的衰老有密切关系，端粒酶的研究对延缓衰老有重要意义，在各种癌细胞中都可检测到很强的端粒酶活性。因此癌细胞能不断分裂而不会自然消亡，研究、开发端粒酶的抑制剂，在癌症治疗方面开创崭新的局面。6.2 酶的优化生产酶的优化生产是通过各种调控技术使酶的生产在最优化的条件下进行，以获得更多更好的酶。这是酶工程研究成果产业化的重要条件，常用的方法是对培养基、培养条件和分离纯化条件等进行优化。然而在生物工程高速发展的今天，用于生产酶的细胞大多数都是经过基因转移或基因改造的细胞，传统的方法已不能适应酶工程发展的要求，必须在代谢调控理论的指导下，采用先进的调控技术对酶的生物合成进行全面的调节控制，并采用先进的生化分离技术，才能达到优化生产的目的。我们在酶的生物合成及其调节控制、酶的分离纯化等方面的研究成果和经验，为进一步的研究、开发打下了坚实基础。7 展望酶工程作为生物工程的重要组成部分，其作用之重要、研究成果之显著已为世人所公认。充分发挥酶的催化功能、扩大酶的应用范围、提高酶的应用效率是酶工程应用研究的主要目标。21世纪酶工程的发展主题是12：新酶的研究与开发、酶的优化生产和酶的高效应用。除采用常用技术外，还要借助基因组学和蛋白质组学的最新知识,借助DNA重排和细胞、噬菌体表面展示技术进行新酶的研究与开发，目前最令人瞩目的新酶有核酸类酶、抗体酶和端粒酶等。要采用固定化、分子修饰和非水相催化等技术实现酶的高效应用,将固定化技术广泛用于生物芯片、生物传感器、生物反应器、临床诊断、药物设计、亲和层析以及蛋白质结构和功能的研究，使酶工程技术在医药工业中发挥更大的作用。展望未来, 酶这一神奇的生物催化剂将在更加广泛的领域中得到应用, 酶制剂工业将成为国民经济中不可或缺的重要组成部分。我国的酶制剂工艺起步晚, 底子薄, 虽然近年来发展很快, 但我们也应清醒地看到, 由于我们起步较迟、技术水平落后, 目前酶制剂工业的发展还不能适应国民经济的发展要求。我国的酶制剂与技术进入国际市场参与竞争还有相当大的难度, 我们还必须继续学习, 取人之长,紧跟国际