（动物营养与饲料科学专业论文）耐热木聚糖酶基因表达及不同木聚糖酶的水解特性研究.pdf

致谢 值此论文完成之际，谨向我的导师孙建义教授表示最诚挚的感谢。导师 在我三年的求学生涯中倾注了大量心血。导师严谨的治学态度、深厚的学术 造诣和求是科学精神是学生终生受益的宝贵财富，并时刻激励我不断前进。 本论文能按期顺利地完成，离不开许多老师和同学的大力支持和热心帮 助。首先要感谢许梓荣教援为我们提供优良的科研条件和学习环境，许老师 渊博的知识和开放而深邃的思想令学生受益匪浅。感谢李卫芬副研究员在论 文完成过程中给予的悉心指导。感谢刘明启、许英蕾、井明艳、陆平、沈坚、 付石军、高惠、訾乃涛、王建枫、常巧玲、周绪霞等同学在实验中给予的启 发和莫大的帮助。感谢贾仁清老师对我们学习生活的关心帮助。感谢江南大 学吕文平博士和陈尚卫老师在实验中提供的帮助。 同样要感谢和我一起学习和生活的同窗孙亚丽、初晓娜、刘进国、赵燕 飞、刘光富等同学给我带来快乐和帮助。 最后感谢我的家人给予巨大支持和帮助，我以此论文献给他们，谨表深 深地谢意。 时光飞逝，转眼间研究生阶段的学习生活匆匆而过，美丽的华家池、严 谨治学的老师和可爱的同学都将成为我记忆中一道亮丽的彩虹，祝大家万事 如意，幸福安康。 潘林 2 0 0 5 年5 月于杭州渐大华家池 浙江大学硕士论文 中文摘要 木聚糖酶( e c3 2 1 8 ) 以内切方式水解木聚糖分子中的b 一1 , 4 一木糖苷键， 对半纤维素的降解起着关键作用，可以大幅度提高半纤维素类物质的利用效率。 木聚糖酶通过水解谷物目粮中的木聚糖，降低其在消化道中的粘度，并产生功能 性低聚木寡糖，从而提高饲料利用率，促进动物健康生长。然而，不同木聚糖酶 的酶解产物特征与木聚糖酶催化结构域的关系，以及酶解产物组成与粘度之间的 关系均不清楚。针对这一问题，本研究克隆和表达了褐色高温单孢菌木聚糖酶基 因，分析了不同基因工程菌来源的四种重组纯木聚糖酶( t f x 2 、a n x 、h x 和 a 1 ) 对木聚糖的水解特性，探讨了水解产物与酶催化结构域和粘度两者之间的 关系，并进行了不同酶对小麦麸皮粗木聚糖的水解效果研究( t f x 2 和a n x 分 别为褐色高温单孢菌和黑曲霉重组木聚糖酶，h x 是t f x 2 和枯草芽孢杆菌两种 木聚糖酶的杂合酶，a t x 是t f x 2 和黑曲霉两种木聚糖酶的杂合酶) 。主要研究 结果如下： 采用t d - - p c r 技术，以5 t f x 0 2 ( 含e c o r i 位点) 和3 t f x 0 2 ( 含x h o i 位 点) 为引物，克隆了褐色高温单孢菌木聚糖酶基因，构建了重组克隆质粒 p g e l v l 坷te a s yt f x 2v e c t o r ，经双酶切，将该基因定向插入原核表达载体 p e t - 3 0 a ( + ) 上，得到重组表达质粒p e t - 3 0 a ( + ) t f x 2v e c t o r ，在大肠杆菌b l 2 1 中 成功表达，获得了基因工程菌f 。c o l it f x 2 。酶活分析表明：单位发酵液的酶活 性为2 2 9 u m l ，纯化后活性为15 8u m l 。木聚糖酶t f x 2 的最适反应温度为 6 0 7 0 ，8 0 c 时的酶活是最适温度的9 1 ；木聚糖酶的最适反应p h 为7 0 ， 在p h 5 0 - - 8 0 之间酶活较高，在p h 5 0 、6 0 、和8 0 时，酶活性分别为最适反应 d h 的7 7 9 、9 7 5 和8 8 o ：s d s p a g e 凝胶电泳检测表明，木聚糖酶t f x 2 的分子量为3 6 4 k d a 。 采用高效液相色谱技术，分析了不同基因工程菌来源的重组木聚糖酶对水解 产物的影响。t f x 2 水解桦木木聚糖的主要产物是木二糖，其次是木三糖，两者 含量之和为木糖与寡糖总量的8 6 0 4 ；h x 水解木聚糖的主要产物是木三糖， 其次是木二糖，两者含量之和为木糖与寡糖总量的8 7 9 0 ；a n x 水解木聚糖的 主要产物是木三糖，其次是木四糖，两者含量之和为木糖与寡糖总量的8 0 2 6 ： 浙江大学硕士论文 a t x 水解木聚糖的主要产物是木三糖，其次是木二糖，两者含量之和为木糖与 寡糖总量的7 3 3 0 ；酶活力相同的t f x 2 与h x 混合酶水解木聚糖的酶解产物主 要是含量相当的木二糖和木三糖，两者之和占木糖与寡糖总量的9 1 7 5 。分析 产物组成和变化趋势发现，t f x 2 的最小底物水解单元可能木三糖，h x 、a n x 和a t x 的最小底物水解单元可能是木四糖。 在木聚糖初始浓度为1 0 0 0 m g m l 的反应体系中，反应6 h 后，t f x 2 、h x 、 a n x 和a t x 水解产物中木糖与寡糖之和总浓度分别为5 0 6 m g m l 、3 8 2 m g m l 、 3 2 3 m g m l 和4 0 9 m g m l ，木聚糖水解率分别达到5 0 6 、3 8 2 、3 2 3 和4 0 1 ；反应体系的粘度与加相应灭活木聚糖酶的对照相比，分别降低了3 0 3 、3 4 7 、2 1 o 和3 2 0 ，粘度的降低率与木聚糖水解率呈正相关( r = o 9 8 6 0 ，p 0 0 1 ) 。 对小麦麸皮粗木聚糖酶解产物分析发现，t f x 2 、h x 、a n x 和a t x 水解粗 木聚糖的主要产物有木糖到木七糖等八种糖成份。t f x 2 水解粗木聚糖的酶解产 物中，木糖与寡糖之和总浓度为3 8 7 m g m l ，粗木聚糖水解率为2 9 7 8 ；就h x 而言，木糖与寡糖之和总浓度为3 8 4 m g m l ，水解率为2 9 5 4 ；就a n x 而言， 木糖与寡糖之和总浓度为2 6 6 m g m l ，水解率为2 0 4 6 ：就a t x 而言，木糖与 寡糖之和总浓度为4 8 3 m g m l ，水解率为3 7 1 5 。 对木聚糖酶t f x 2 、h x 、a n x 和a t x 的蛋白质结构分析表明，不同来源的 木聚糖酶的催化结构存在一定的差异，上述研究证明它们在水解特性方面也不同 之处，这与木聚糖酶催化结构相关。 综上所述，t e x 2 、h x 、a n x 和a t x 均对木聚糖有较好的水解性能，在饲 料工业中和功能性低聚木糖的生产中将具有重要意义。 关键词重组木聚糖酶；基因克隆；表达；高效液相色谱：木聚糖水解；木 寡糖：粘度：水解率 塑鋈奎兰堡主丝兰 a b s t r a c t e n d o - b 一1 , 4 一x y l a n a s e s ( e c3 2 1 8 ) ，w h i c hc l e a v eb 一1 ，4 - g l y c o s i d i cb o n d si nt h e x y l a nb a c k b o n e ，a r ei m p o r t a n tc o m p o n e n t so ft h er e p e r t o i r eo fe n z y m e st h a tc a t a l y z e p l a n tc e l lw a l ld e g r a d a t i o na n dr e m a r k a b l yi n c r e a s et h eu t i l i z a t i o ne f f i c i e n c yo ft h e h e m i e e l l u l o s e sr e s o u r c e s x y l a n a s e sc a nh y d r o l y z et h ex y l a ni nt h ef e e d s t u f f s ，h e n c e d e c r e a s et h ev i s c o s i t yo fx y l a ni nt h em o n o g a s t r i ct r a c t s ，g i v i n gr i s et o f u n c t i o n a l x y i 0 0 1 i g o s a c c h a r i d e s ，w h i c he a ni n c r e a s et h ef e e du t i l i z a t i o ne f f i c i e n c ya n dd r o m o t e t h eg r o w t ho fa n i m a l s h o w e v e r , t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h eh y d r o l y s i sp r o d u c t so f x y l a na n dx y l a n a s ec a t a l y s td o m a i n si sn o tc l e a r , n e i t h e ri st h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h ec o m p o s i t i o no fh y d r o l y s i sp r o d u c t so fx y l a na n dv i s c o s i t yo fx y l a n f o c u s i n go n t h ei s s u e s ，t h e r m o m o n o s p o r a f u e e at f g e n ew a sc l o n e da n de x p r e s s e di ne s c h e r i c h i a c o l i , a n dt h eh y d r o l y s i sp r o p e r t i e so ff o u rr e c o m b i n a n tp u r i f i e dx y l a n a s e s ( t f x 2 ， h x ，a n xa n da t x ) w e r ec h a r a c t e r i z e di nt h i ss t u d y , t h eh y d r o l y s i sp r o d u c t so f c r u d eb r a nh y d r o l y z e db yt h ex y l a n a s e sw e r ea l s oe v a l u a t e d ，a i m e dt op r o v i d ei n s i g h t i n t ot h ea b o v ei s s u e s t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： t h e r m o m o n o s p o r a l u c c at fg e n ew a sa m p l i f i e dw i t hp r i m e r s ( 5 t f x 0 2w i t he c o r i s i t ea n d3 t f x 0 2w i t hx h o i ) ，t h ed n a f r a g m e n to b t a i n e dw a sc l o n e di n t op g e m - t e a s yv e c t o r ，g e n e r a t i n gp g e m 回- te a s yt f x 2v e c t o r ，w h i c hw a sd o u b l e d i g e s t e dw i t h r e s t r i c t i o n e n z y m e s e c o r ia n dx h o l ，t h e n c l o n e di n t ot h e e x p r e s s i o n v e c t o r p e t - 3 0 a ( + ) p r e v i o u s l yd i g e s t e d w i t h c o r r e s p o n d i n g r e s t r i c t i o n e n z y m e s t h er e s u l t i n gp l a s m i dp e t 3 0 a ( + ) t f x 2v e c t o rw a s i n t r o d u c e di n t oe c o l ib l 2 1 ，w h i c hw e r ei n c u b a t e di nl bm e d i u m a f t e r c u l t i v a t i o n ，t h ec e l l sw e r eh a r v e s t e d ，p u r i f i e dt oh o m o g e n e i t yb yn i n t a a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ，a n dt h ep u r i t yw a sc h e c k e db ys d s p a g e ，y i e l d i n g a3 6 4 一k d ap r o t e i n t h ea c t i v i t yo ft h ec r u d ee n z y m ew a s2 29 u m l ，a n dt h a t o ft h ep u r i f i e de n z y m ew a s15 8 u m 1 e n z y m a t i cp r o p e r t i e sa saf u n c t i o no f p ha n dt e m p e r a t u r ew e r ed e t e r m i n e d ，t h eo p t i m u mp hf o ra c t i v i t yw a s7 0 ， a n dt h ee n z y m ew a ss t a b l eb e t w e e n p h 5 0a n dp h 8 0 ，w h e ni n c u b a t e di n b u f f e r sa tp h5 0 ，p h 6 0a n d8 0 ，t h ee n z y m ee x h i b i t e d7 7 9 ，9 7 5 a n d 6 塑垩查兰堡主堡兰 一 8 8 0 o ft h em a x i m u ma c t i v i t y ，r e s p e c t i v e l y ；t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ef o r a c t i v i t yw a sb e t w e e n6 0 。ca n d7 0 。c ，w h e nt h et e m p e r a t u r ew a s8 0 * c ，t h ea c t i v i t y w a s9 1 o f 也em a x i m u m ， h p l ce q u i p p e dw i t har e f r a c t i v ei n d e xd e t e c t o rw a se m p l o y e dt od e t e c ta n d i d e n t i f yt h eh y d r o l y s i sp r o d u c t so fs o l u b l eb i r c h w o o dx y l a nh y d r o l y z e db y f o u rx y l a n a s e s ( t f x 2 ，h x ，a n xa n da t x ) w i t hr e s p e c tt ot f x 2 ，t h e p r e d o m i n a n tp r o d u c t sw e r ex y l o b i o s e ，f o l l o w e db yx y l o t r i o s e ，b o t ha c c o u n t i n g f o r8 6 0 4 o ft h et o t a lc o n t e n to fx y l o s ea n dx y l o o l i g o s a c c h a r i d e s ；w i t h r e s p e c t t oh x ，t h ep r e d o m i n a n tp r o d u c t sw e r ex y l o t r i o s e ，f o l l o w e db y x y l o b i o s e ，b o t ha c c o u n t i n gf o r 8 7 9 0 o ft h et o t a lc o n t e n to fx y l o s ea n d x y l o o l i g o s a c c h a r i d e s ；w i t hr e s p e c tt oa n x ，t h em a i np r o d u c t sw e r ex y l o t r i o s e ， f o l l o w e db yx y l o t e t r a o s e ，b o t ha c c o u n t i n gf o r8 0 2 6 o ft h et o t a lc o n t e n to f x y l o s ea n dx y l 0 1 i g o s a c c h a r i d e s ；w i t hr e s p e c tt oa t x ，t h em a i np r o d u c t sw e r e x y l o t r i o s e ，f o l l o w e db yx y l o b i o s e ，b o t ha c c o u n t i n gf o r7 3 3 0 o ft h et o t a l x y l o s ea n dx y l o o l i g o s a c c h a r i d e s e q u i v a l e n tx y l o b i o s ea n dx y l o t r i o s ew e r e o b t a i n e df r o mx y l a ns u b je c t e dt oam i x t u r eo fe q u a la c t i v i t yo ft f x 2a n dh x ， b o t ht h eo l i g o s a c c h r i d e sc o v e r e dap e rc e n to f9 1 7 5o ft h et o t a lx y l o s ea n d x y l o o l i g o s a c c h a r i d e s b a s e do nt h ea n a l y s i so fe n dp r o d u c t sc o m p o s i t i o na n d t h e i rc h a n g i n gt r e n d ，i tc a nd e d u c e dt h a tt h em i n i m u mo l i g o m e rh y d r o l y z e db y t f x 2m a y b ex y l o t r i o s e ，a n dt h a th y d r o l y z e db yh x ，a n xa n da t xm a y b e x y l o t e t r a o s e a f t e r6 - hi n c u b a t i o ni nt h es o l u t i o nw i t hap r e l i m i n a r yc o n t e n to f 1o 0 0 m g m lx y l a n ，t h eo v e r a l lx y l o s ea n dx y l o o l i g o s a c c h a r i d e sc o n c e n t r a t i o n s w e r e5 0 6 m g m l ，3 8 2m g m l ，3 2 3m g m la n d4 0 9m g m l ，t h eh y d r o l y s i sr a t e o f x y l a n w a s 5 0 6 0 ，3 8 2 0 ，3 2 3 0 a n d4 0 9 0 ，r e s p e c t i v e l y ； c o r r e s p o n d i n gt ot f x 2 ，h x ，a n xa n da t x ；t h e v i s c o s i t i e so ft h ex y l a n s o l u t i o nd e c r e a s e d b y3 0 3 ，3 4 7 ，21 o a n d3 2 0 ，r e s p e c t i v e l y ； c o m p a r e dw i t ht h ex y l a ns o l u t i o nw i t hc o r r e s p o n d i n gi n a c t i v ee n z y m e b a s e d o nt h er e s u l t s ，c o n c l u s i o nw a sd r a w nt h a tt h er e d u c t i o nr a t i oo fv i s c o s i t yw a s 7 浙江大学硕士论文 p o s i t i v e l yr e l a t e dt oh y d r o l y s i sr a t eo fx y l a n ( r = 0 9 8 6 0 ，p ( o 0 1 ) c r u d ex y l a ne x t r a c t e df r o mw h e a tb r a nw a ss u b j e c t e dt oh y d r o l y s i sw i t ht f x 2 ， h x ，a n xa n da t x ，r e s p e c t i v e l y ；t h er e s u l t i n gp r o d u c t si n c l u d e dx y l o s e ， x y l o b i o s e ，x y l o t r i o s e ，x y l o t e t r a o s e ，x y l o p e n t a o s ex y l o h e x a o s ea n dx y l o h e p t a o s e t h e m a i nc o m p o n e n t sw e r ex y l o b i o s e ，x y l o t r i o s ea n dx y l o t e t r a o s e w i t hr e s p e c tt o t f x 2 ，t h eo v e r a l lx y l o s e a n d x y l o o l i g o s a c c h a r i d e s c o n c e n t r a t i o nw a s 3 8 7 m g m la n dt h eh y d r o l y s i sr a t eo fc r u d ex y l a nw a s2 9 7 8 ；w i t hr e s p e c tt o h x ，t h eo v e r a l lx y l o s ea n dx y l o o l i g o s a c c h a r i d e sc o n c e n t r a t i o nw a s3 8 4 m g m l a n dt h eh y d r o l y s i sr a t ew a s2 9 5 4 ：w i t hr e s p e c tt oa n x ，t h eo v e r a l lx y l o s e a n dx y l 0 0 1 i g o s a c c h a r i d e sc o n c e n t r a t i o nw a s2 6 6 m g m la n dt h eh y d r o l y s i sr a t e w a s2 0 4 6 ；w i t hr e s p e c tt oa t x ，t h eo v e r a l lx y l o s ea n dx y l o o l i g o s a c c h a r i d e s c o n c e n t r a t i o nw a s4 8 3 m g m la n dt h eh y d r o l y s i sr a t ew a s3 7 15 p r o t e i ns t r u c t u r ea n a l y s i so nt f x 2 ，h x ，a n xa n da t xi n d i c a t e dt h a tt h ec a t a l y s t d o m a i n so fx y l a n a s e sf r o md i f f e r e n ts o n r c e sw e r ed i f f e r e n t ，t h ed i f f e r e n c e si n h y d r o l y s i sp r o p e r t i e s c o n f i r m e dt h i s ，w h i c hc o r r e l a t e dw i t hx y l a n a s ec a t a l y s t s t r u c t u r e s b a s e do nt h eo b o v er e s u l t s ，t h ex y l a n a s e sh x ，t f x 2 ，a t xa n da n xa l lp o s s e s s e d e x c e l l e n th y d r o l y s i sp e r f o r m a n c e ，w h i c hw i l lf m dg r e a ta p p l i c a t i o ni nt h ef e e d i n d u s t r ya n df u n c t i o n a lx y l o o l i g o s a c c h a r i d e sm a n u f a c t u r i n g k e yw o r d s ： r e c o m b i n a n tx y l a n a s e ；g e n ec l o n e ；e x p r e s s i o n ；h p l c ；h y d r o l y s i s o fx y l a n ；v i s c o s i t y ；h y d r o l y s i sr a t e 8 浙江大学硕二e 论文 第一章文献综述 木聚糖是自然界植物多糖中半纤维素的主要组成成分，谷物饲料中的木 聚糖在单胃动物中不能被消化吸收，同时使食糜黏度提高，具有阻碍营养物 质消化吸收的负作用( c h o c ta n da n n i s o n ，1 9 9 2 ) 。因此麦类谷物和糠麸中的 木聚糖限制了其在养殖业中的应用。木聚糖酶( e c3 2 18 ) 催化水解木聚糖， 它以内切方式水解木聚糖分子中的b 一1 , 4 一木糖菅键，对半纤维素降解起着关 键作用，从而大大提高了纤维素类物质的利用效率，这是提高饲料利用率的 一种有效方法。木聚糖来源非常广泛，像麸皮、米糠、玉米芯、稻草、甘蔗 渣、酒糟、硬木等农林业废弃物中都富含木聚糖，木聚糖酶可以将木聚糖水 解成各种长度各异的低聚木糖，而低聚木糖在功能性食品中占有举足轻重的 地位，因其具有独特的生理功能而成为重要的功能性食品基料，已引起全世 界的关注，利用木聚糖酶酶解这些原料制各低聚木糖不仅能产生显著的经济 效益并且还具有良好的社会和生态效益。 第一节木聚糖 1 植物细胞壁结构 植物细胞壁主要为木质纤维素( 1 i g n o c e l l u l o s e ) 所组成，而木质纤维素主要是 由纤维素( c e l l u l o s e ) 、半纤维素( h e m i c e l l u l o s e ) 和木质素( 1 i g n i n ) 所结合而成 的聚合体，在植物干重中约各占4 0 、3 3 和2 3 ( c o u g h l a ne ta 1 ，1 9 9 3 ) ；此 外还与果胶成分共同形成初生细胞壁。初生细胞壁为植物进行细胞壁合成作用时 最先合成的细胞壁前体，其主要由纤维素微纤维( c e l l u l o s em i e r o f i b r i l s ) 及半纤 维素和果胶两种多糖混合物所组成，其中还含有结构性或具有特殊酶活性的蛋白 质存在( h a r a n de ta 1 ，1 9 8 5 ) 。初生细胞壁在合成与分解作用的持续进行下，逐 渐生成含有木质素成份的次生细胞壁，又称老化层，此时细胞壁包含木聚糖、聚 甘露糖及聚半乳糖等，并与纤维素成分共同缠结在一起( e n g l e s ，1 9 8 5 ) ，其单 糖组成主要有阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、海藻糖、葡 萄糖醛酸和半乳糖醛酸等( b a c ie la l ，1 9 8 8 ；s e l v e n d r a n ，1 9 8 4 ；t h e a n d e re la 1 ， 1 9 8 9 ) 。图1 1 为燕麦细胞壁结构( k u n d s e ne t a l ，2 0 0 4 ) 。 浙江大学硕士论文 2 半纤维素 半纤维被定义为碱溶性的植物细胞壁多糖，也就是除去果胶物质后的残留物 能被1 5 n a o h 提取的多糖。这些多糖大多数具有侧链，分子量大小为5 0 4 0 0 个残基，它们是细胞壁中与微纤维非共价结合成为细胞壁的另一类细胞基质多 糖。属于这类多糖的有木聚糖，包括阿拉伯木聚糖和4 o 一甲基葡萄醛酸木聚糖、 葡甘露聚糖( g l u c o m a n n a n ) 、半乳葡甘露聚糖( g a l a c t o g l u c o m a r m a n ) 、木葡聚糖 ( x y l o g l u c a n ) 、b l ，3 - 葡聚糖等，所谓半纤维素就是这些多糖的总称。半纤维素大 量存在于植物的木质化部分，如在木材中占干重的1 5 - - 2 5 ，农作物秸秆中 占2 5 4 5 。半纤维素在植物中所占比例、糖组成及结构皆随植物种类和组 织部位不同而异。 木聚糖是半纤维素中最丰富的一类，其中木聚糖占半纤维素的9 0 以上， 在植物界分布也最广，是自然界中继纤维素之后含量第二丰富的再生生物资源。 图1 1 燕麦细胞壁结构( 引自k u n d s e n 等，2 0 0 4 ) f i g 1 1s t r u c t u r eo f c e l lw a l lf r o mo a t s ( k u n d e s e ne ta 1 ，2 0 0 4 ) 浙江大学硕士论文 3 木聚糖结构 木聚糖是主链由木糖残基通过1 3 1 , 4 糖苷键组成的- - e e 杂多糖，其主链由1 3 一吡哺型木糖残基构成。木聚糖在陆生植物细胞壁中是最普遍的半纤维素多糖， 占细胞干重的3 0 3 5 ( j o s e l e a ue t a l ，1 9 9 2 ) 。木聚糖在被子植物的硬木中是主 要的半纤维素，而在裸子植物软木中的含量较低，大约分别占总干重的1 5 3 0 和7 1 2 。硬木木聚糖为o 乙酰4 o 甲基葡萄糖醛酸木聚糖，这种多糖至少 由7 0 个b 一呲喃型木糖残基通过0 1 , 4 糖苷键连接组成( 平均聚合度d p 在1 5 0 一 2 0 0 之间) ，每十个木糖残基通过4 一o 一甲基葡萄糖醛酸与木糖的第二个位点连接； 硬木木聚糖是高度乙酰化，c 一3 位乙酰化t l c 2 位普遍，由于这些乙酰基团的作用 使得木聚糖在水中微溶，木聚糖在碱性提取液中乙酰基团很容易脱离( s u n n aa n d a n t r a n i k i a n ，1 9 9 7 ) 。软木木聚糖是阿拉伯糖基一4 一o 甲基葡萄糖醛酸木聚糖，它比 硬木木聚糖含有更多的4 o 甲基葡萄糖醛酸，该基团在c - 2 位连接；软木木聚糖 没有乙酰化，a l 阿拉伯呋哺糖基代替乙酰基团通过a 1 ，3 糖苷键连接在木糖的 c 一3 位上( p u l s a n ds c h u s e i l ，1 9 9 3 ) ：1 2 的木糖残基被阿拉伯糖取代基取代( w o n g “a ，1 9 8 8 ) ；d d 一吡喃型木糖残基、4 一o 一甲基，d d 一葡萄糖醛酸和l - 5 可拉伯呋 喃糖基的比例是1 0 0 ：2 0 ：1 3 ( p u l sa n ds c h u s e i l ，1 9 9 3 ) 。软木木聚糖比硬木木聚糖 短，d p 在7 0 13 0 之间，支链含量也少( s u r m aa n da n t r a n i k i a n ，19 9 7 ) 。谷物木聚 糖由d 一葡萄糖醛酸( d g l u c u r o n i ca c i d ) 和4 一o 一甲基醚- d 一葡萄糖醛酸( 4 一o - m y t h y l e t h e r - d g l u c u r o n i ca c i d ) 及阿拉伯糖( a r a b i n o s e ) 组成( b r i l l o u t e re ta 1 ，1 9 8 7 ) 。由于支 链结构的不同，一年生植物胚乳的阿拉伯木聚糖在水中和稀碱中的溶解度要高于 木质纤维素物质中的术聚糖( f e r r e i r a f i l h o ，1 9 9 4 ) 。 大多数木聚糖是杂多糖，主链和侧链都携带不同取代基( b i e l y ，1 9 8 5 ) 。 主链上最常见的取代基是乙酰基、阿拉伯糖基和葡萄糖醛酸残基( w h i s t l e ra n d r i c h a r d s ，1 9 7 0 ) 。根据主链上取代基的不同，木聚糖被分为阿拉伯木聚糖、葡萄 糖醛酸木聚糖、葡萄糖醛酸阿拉伯木聚糖( g l u c u r o n n o a r a b i n o x y l a n ) 和线性匀质 木聚糖等几类。由于分支程度和特性不同，每一类木聚糖在微观上也不均一。由 于侧链的不同，使得木聚糖的结构变化范围很大，也使木聚糖的物理特性有很大 差异。侧链决定木聚糖的溶解性、形成以及其它半纤维素的反应，因此对酶解反 应的方式和程度有很大的影响。 浙江大学砸十论文 4 木聚糖的抗营养作用 木聚糖是自然界植物多糖中半纤维素的主要组成成分，谷物饲料中的木聚糖 在单胃动物消化道中不能被消化吸收，当畜禽采食含大量木聚糖的日粮时，就会 妨碍其它营养物质的消化吸收。其抗营养作用归纳如下： 4 1 对消化道内容物黏度的影响 单胃动物没有分解这种戊聚糖的酶。当动物采食水溶性木聚糖高的饲料时， 可溶性木聚糖在动物肠道内形成粘性物质，提高肠道内的黏度。黏度的上升降低 肠道内食糜通过消化道的速度，导致采食量下降，阻碍消化液与底物的混合，延 缓消化酶对底物的消化( a l m i r a l le t a l ，1 9 9 5 ) 。同时降低肠道内食糜中营养物质 在肠道内的扩散速度，妨碍养分的吸收。 4 2 对消化道酶活性的影响 木聚糖可直接与肠道胰蛋白酶、脂肪酶络合，降低其活性，刺激动物代偿性 大量分泌消化液，导致动物胰脏、肝脏的增生与肥大，内源性氮的损失增加。可 溶性木聚糖引起的高粘性肠道环境还能降低肠道p h 值，增加内源氮的排泄。 4 3 对表观代谢能的影响 c h o c t 和a r m i s o n ( 1 9 9 2 ) 的研究表明，n s p 与小麦的表观代谢能呈负相关，而 与肠道粘稠度呈正相关。c h o c t 等( 1 9 9 0 ) 、a u s t i n 等( 1 9 9 9 ) 研究了n s p 和表 观代谢能的关系，发现随着n s p 含量的增加，表观代谢能几乎呈线性降低。 4 4 对脂肪消化吸收的影响 e d w a r d ( 1 9 8 8 ) 认为，黏度增加阻碍肠道内容物机械混合，减缓乳化作用，严 重影响脂肪消化，特别是长链饱和脂肪酸的吸收不良，该现象在大麦、燕麦、黑 麦日粮中均有发现。由于木聚糖在肠道内相互结成网状结构，降低了饲料的扩散 率，妨碍脂肪形成脂肪微粒，阻止了内源酶与肠道内容物有效接触。 4 5 对肠道微生物的影响 肠道黏度增加导致营养物质在肠道内蓄积，形成富含养分的食糜，这为肠道 微生物的繁殖提供了良好的条件。大量有害微生物的增殖，会产生许多有害物质， 并改变肠道p h 环境，从而影响消化酶发挥最佳效应，同时微生物会竞争性地消 耗大量营养物质，降低营养物质的利用率( w h i t e ，1 9 8 3 ) ，另一方面，肠内微生 物过多会刺激肠壁，并使其增厚，同时损伤绒毛，导致吸收营养物质的能力下降。 浙江大学硕= 论文 木聚糖对肉鸡生长性能的影响，部分是因肠道微生物增殖的结果( c h o c t ，1 9 9 2 ) 。 第二节木聚糖酶解 微生物木聚糖酶能水解木聚糖生成长度各异的木寡糖，对半纤维素降解起着 关键作用( b i e l y ，1 9 8 5 ) 。木聚糖酶能大幅度提高木质纤维素物质的利用率，在 饲料工业、食品工业和造纸工业中具有巨大的应用前景( c o u g h l a ne t a l ，1 9 9 3 ) 由于植物木聚糖结构的不均一性和其复杂的化学性质，其主链含有不同的侧链， 包括有乙酰基、阿拉伯糖基和葡萄糖醛酸基等；当内切木聚糖酶随机作用于木聚 糖时便受到这些基团的空间阻碍，而不能达到所作用的木糖苷键，所形成的产物 只能是带侧链的低聚糖。所以木聚糖要完全水解需要具有多种特异性和作用模式 的水解酶( 图1 _ 2 ) 。这也导致了微生物木聚糖水解酶系统的多态性，使得各种 水解酶具有各自特异的功能，这也可能是微生物高效利用木聚糖的一种策略。木 聚糖酶对木聚糖的降解是由一系列降解酶协同作用，这些酶包括b 一1 ，4 一内切性 木聚糖酶、6 木糖酶、a l 一阿拉伯呋喃糖酶、d 葡萄糖苷酸酶、乙酰木聚糖酯酶 和石炭酸( 阿魏酸和p 香豆酸) 酯酶。这些酶共同作用把木聚糖水解成各种低分 子糖类。在真菌( b e l a n c i ce l a l ，1 9 9 5 ；b i e l y ，1 9 8 5 ) 、放线菌( e l e g i r e t a l ，1 9 9 5 ) 、 细菌( d e y e ta 1 ，1 9 9 2 ) 中这种多功能木聚糖水解酶系统是普遍存在的。现已有 报道许多微生物产的木聚糖酶是多酶复合物。如在黑曲霉中，现已知有s 种 不同特性的木聚糖酶( j o h ne t a l ，1 9 7 9 ) ，在粪堆梭菌、链霉菌3 1 3 7 、脱叶链霉 菌、木霉e 5 8 、里氏木霉、气单孢菌和微紫青霉等微生物中也至少有3 种以 上的木聚糖酶存在( o h k o s h ie ta 1 ，1 9 8 5 ；t a k e n i s h ie ta 1 ，1 9 7 3 ；y o s h i k ae ta 1 ， 1 9 8 1 ) 。这些木聚糖水解酶系统中每种木聚糖酶除了各自发挥特异性作用外， 它们之间又存在协同增效作用( w o n ge ta 1 ，1 9 8 8 ) 。b i e l y 等( 1 9 8 6 ) 发现乙酰 木聚糖需要在乙酰木聚糖酶和内切木聚糖酶的共同作用下才能彻底降解，且 由乙酰木聚糖酶降解而来的乙酸能增强内切木聚糖酶对木聚糖主链的进攻， 而内切木聚糖酶产生短链乙酰木聚糖又是乙酰木聚糖酶的良好底物。嗜热单 孢菌( t h e r m o m o n o s p o r a f u s c a ) 能产生内切木聚糖酶、b 一木糖甘酶、a 。l 阿 拉伯呋喃糖苷酶和乙酰木聚糖酶。0 一木糖甘酶促进内切木聚糖酶对木聚糖的 降解，减轻终产物对内切木聚糖酶的抑制，同样，a l 一阿拉伯呋喃糖苷酶与 内切木聚糖酶相互作用能促进阿拉伯木聚糖的水解( b a c h m a n ne t a l 1 9 9 1 ) 。 浙江犬学硕上论文 图1 2 木聚糖结构及其酶解示意图( 引自b e g 等，2 0 0 1 ) f i g 1 2ah y p o t h e t i c a lp l a n ts t r u c t u r es h o w i n gd i f f e r e n ts u b s t i t u e n tg r o u p sw i t hs i t e so f a t i a c kb y m i c r o b i a lx y l a n a s e s ( b e ge td ，一2 0 0 1 ) 第三节木聚糖酶分类 现已从不同微生物中分离纯化出木聚糖酶，并对其特性进行了研究，在此基 础上，克隆和分析了基因序列( s u n n ae l 口f ，1 9 9 7 ) 。作用于木聚糖骨架的木聚 糖酶主要分为两类：内切b 一1 , 4 一木聚糖酶( ec 3 2 1 8 ，e n d o b 一1 , 4 一x y l a n a s e ，x y l a n x y l a n o h y d r o l a s e ) ，外切b 一1 , 4 -