3种烟草基因组SSR位点信息分析和标记开发.pdf

西北植物学报 2 0 1 4 3 4 8 1 j 4 9 1 5 j 8 A c f 口B o f B o r e f 一o c c i d P n f S i n 文章编号 1 0 0 0 一4 0 2 j 2 0 1 4 0 81 5 4 9 一l Od o i 1 0 7 6 0 6 j i s s n 1 0 0 04 0 2 5 2 0 1 4 0 8 1 5 4 9 3 种烟草基因组S S R 位点信息分析和标记开发 童治军 肖炳光 云南省烟草农业科学研究院 烟草行业烟草生物技术育种重点实验室 国家烟草基因工程研究中心 昆明6 j 0 0 2 1 摘 要 利用生物信息学方法对绒毛状烟草 林烟草和本塞姆氏烟草3 份烟草野生种基因组数据中的s s R 位点信 息进行了分析 结果表明 在全长分别为2 1 4G b 2 4 4G b 和2 5 9G b 的绒毛状烟草 林烟草和本塞姆氏烟草基 因组中分别获得15 33 5 7 个 1 9 64 9 3 个和2 7 87 8 4 个S S R 位点 平均相隔13 9 4k b 12 4 2k b 和9 3 1k b 出现一个 s s R 在s s R 位点分布区域上 绝人部分的s s R 位点分布在内含子和u T R 尤其是5 u T R 区域 在s s R 基序类 型上 主要集中在二 三碱基基序且二者占总s s R 位点数目的8 0 以上 并以二碱基基序类型丰度最高 在s s R 基 序结构上 基因组中出现频率及数量最高的是含有A T 的基序结构 在s s R 基序的重复次数上 除单碱基基序 类型外 重复次数多在3 l o 次之间 利用分别属于5 个不同烟草组的8 份烟草材料验证所合成的3 0 0 对引物 所 有合成的引物均能扩增获得目标片段 其中有8 0 对引物存在扩增多态性 表明来源于绒毛状烟草 林烟草和本塞 姆氏烟草基因组的s s R 标记在亲缘关系相对较近的烟草种间具有高度保守性和通用性 基于此3 份烟草野生种基 因组数据开发s S R 引物用于后续的相关遗传研究具有可行性 关键词 绒毛状烟草 林烟草 奉塞姆氏烟草 基因组 S S R 中图分类号 Q 7 8 9文献标志码 A S u r V e yo fS S RL o c iI n f o r m a t i o ni nT h r e eT o b a c c o G e n o m e sa n dD e V e l o p m e n to fS S RM a r k e r s T N GZ h i ju n X 1 A B i n g g u a n g K e yI a b o r a t o r yo fT o b a c c oB i o t e c h n o l o g i c a lB r e e d l n g N a o n a lT o b a c c G e n e t i cE n g i n e e r i n gR c s e a r c hC e n t e r Y u n n a nA c a d e m y o fT o b a c c oA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s K u n m i n g6 5 0 0 2 l C h i n a A b s t r a c t S i m p l es e q u e n c er e p e a t s S S R s i nt h ew h o l eg e n o m e so ft h r e ew i l dt o b a c c o s N i f o f 施行 f o P 门f o s i 一 内r m 孤 N j f o f i n 行 5 v f u P f i a n dN j o f i z 6 P 门f f i 行 d o w n l o a d e df r o mt h eC h i n aT o b a c c oG e n o m eD a t a b a s e C T G D B w a sa n a l v z e dh vt h eb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d At o t a lo f1 5 33 5 7 1 9 64 9 3a n d2 7 87 8 4S S R l o c iw e r em i n e do uci nt h e2 1 4G b 2 4 4G ba n d2 5 9G bo ft h et h r e ew i l dt o b a c c o s g e n o m i cs e q u e n c e s a n dt h ea v e r a g ed i s t a n c eb e t w e e nS S Rl o c iw a sa p p r o x i m a t e l y1 3 9 4k b 1 2 4 2k ba n d9 3 1k b r e s p e c t i v e l y A 1 m o s ta 1 1t h eS S Rl o c iw e r ed i s t r i b u t e di ni n t r o nd o m a i n sa n dU T Rd o m a i n s e s p e c i a l l yt h e57 一U T R D i n u c l e o t i d ea n dt r i n u c l e o t i d er e p e a t s t o t a l l ya c c o u n t i n gf o rm o r et h a n8 0 w e r et h em a i nm o t i ft y p e s a n dt h ed i n u c l e o t i d ew a st h em o s ta b u n d a n c ei na l lS S R s T h eh i g h e s tf r e q u e n c ya n dt h em o s ta b u n d a n c e o fS S Rm o t i f sc o n f i g u r a t i o nw e r eA T E x c e p tt h em o n on u c l e o t i d em o t i ft y p e t h er e p e a tn u m b e ro ft h e m o t i ft y p e sw a sb e t w e e n3a n d1 0 T h r e eh u n d r e dS S Rp r i m e rp a i r sr a n d o m l ys y n t h e s i z e df r o mt h r e ew i l d t o b a c c og e n o m e sw e r es u b j e c t e dt oP C Ru s i n g8t o b a c c oa c c e s s i o n sa sm a t e r i a l sw h i c hb e l o n gt o5d i f f e r e n t s p e c i e so ft h eg e n u sN f o f i 门 a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a ta 1 1t h ep r i m e rp a i r sc o u l dp r o d u c ec l e a r s t a b l e 收稿日期 2 0 1 40 40 6 修改稿收到日期 2 0 1 卜0 60 6 基金项目 中国烟草总公司项目 1 10 2 0 13 1 0 0 6 J Y0 6 中国烟草总公司云南省公司项目 2 0 1 3 Y N 0 1 作者简介 童治军 19 8 0 一 男 博士 主要从事烟草分子育种研究 Em a i l t z J 8 6 l 16 3 c m 通信作者 肖炳光 博上 研究员 主要从事烟草育种与生物技术研究 Em a l x i a o b g 2 6 3n c t 万方数据 西北植物学报 a n dt a r g e tb a n d s o fw h i c h8 0S S Rp r i m e r sw e r ep o l y m o r p h i c T h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tS S R1 0 c ii nt h e c l o s e rg e n e t i cr e l a t i o n s h i pa m o n gt o b a c c os p e c i e sw e r eh i g h l yc o n s e r v e da n dc o u l db eu s e di nt h ef o l l o w i n g r e s e a r c h I ti sm e a n i n g f u lt od e V e l o pS S Rp r i m e rp a i r sf r o mw i l dt o b a c c og e n o m i cd a t af o rt h ea p p l i c a t i o no f r e l a t i v eg e n e t i ca n a l y s i s K e yw o r d s N i f o f i n 行乜 o m P 川 0 5 i 厂o m i 5 N s y Z u P s r i 5 N 6 P 九 n m i 口卵盘 g e n o m e S S R 烟草为茄科 S o l a n a c e a e 烟属 N i f o i c z 行n 一年 生或多年生经济作物 属内植物共有1 4 个组 s e c t i o n 6 6 个种 s p e c i e s 其体细胞染色体数目有9 1 0 1 2 1 6 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 等1 1 种之多 1 在烟属6 6 个种中 除起 源于南美洲安第斯山区的普通烟草种和黄花烟草种 外 剩余的6 4 个种均是烟草野生种 其中绒毛状烟 草 N i f o f i n 以乜f o m P 豫f o s o 厂0 m i sL 2 n 一1 2 一2 4 T T 林烟草 N 5 y z 口P s r i sL 2 n 1 2 一2 4S S 和本塞姆氏烟草 N 6 鲫施n m i n 以I 2 n 一1 9 一 3 8B B 是体细胞染色体数目分别为1 2 和1 9 的 3 份烟草野生种 由于烟草属内各种间多态性水平 低L 2 染色体数目多 7 基因组较大且重复序列含 量较高 8 j 因此烟草的S S R 分子标记开发和利用研 究比较滞后 严重制约了烟草的遗传研究和分子育 种 s s R s i m p l es e q u e n c er e p e a t s 简单重复序列 标记 是基于重复序列两侧保守的特定短序列设计 引物来扩增重复序列本身的D N A 分子标记口 1 与众多D N A 标记一样 S S R 标记除具有无表型效 应 不受环境限制和影响 在生物基因组内大量存在 且分布均匀外 还具有稳定 可靠 等位基因间呈共 显性遗传等优点 使其广泛地应用于遗传图谱构建 基因定位等领域n 1 I 但S S R 标记成功开发的局限 性及重要环节是严重地依赖于对生物基因组信息的 了解 尤其是对基因组 或E S T 序列 数据中的S S R 信息进行分析 由于烟草全基因组测序工作十分困 难 以至于关于绒毛状烟草 林烟草和本塞姆氏基因 组中S S R 信息分析和标记开发方面的研究 国内外 的报道较少 张俊娥等口 胡重怡等 3 I 薛金爱 等 1 43 和王卫峰等r l 钓分别利用烟草E S T 序列数据和 绒毛状烟草基因组序列数据对烟草E S T S S R 和基 因组s s R 位点的信息及分布特征进行了分析 利 用生物信息学在其他植物 如谷子 胡椒 拟南芥 水 稻 西红柿 小麦 高粱 玉米等 基因组或E S T 序列 数据中挖掘 分析S S R 信息的报道较多 1 6 2 1 目 前 S S R 标记在烟草遗传分析中虽有一定的应用 如遗传图谱构建 2 2 2 基因定位心i 2 分子标记辅 助选择育种 2 遗传多样性分析嵋 2 胡等 但规模和 力度远不如其他作物 本研究拟利用中国烟草基因组数据库 C T G D B 中的绒毛状烟草 林烟草和本塞姆氏烟草基因 组测序产生的海量数据 探索其基因组S S R 位点分 布情况 具体包括S S R 基序类型和结构 S S R 位点 的数量及密度 S S R 位点分布的区域和重复次数 并依据S S R 位点信息开发引物在烟草属内进行验 证 为S S R 分子标记应用提供参考 1 材料和方法 1 1材料 1 1 1 植物材料本研究共用了8 份烟草材料 表 1 其中普通烟草栽培种和烟草野生种各4 份 均由 云南省烟草农业科学研究院 中国烟草育种研究 南 方 中心 提供 1 1 2 基因组数据绒毛状烟草 林烟草和本塞姆 氏烟草全基因组数据以F A S T A 文件格式下载自中 国烟草基因组数据库 C h i n aT o b a c c oG e n o m eD a t a b a s e C T G D B 其中绒毛状烟草和林烟草基因组 数据目前尚未公开 经数据分析 获得的绒毛状烟 草和林烟草基因组大小分别为21 3 80 3 54 4 0b p 和 24 4 04 1 79 5 2b p 各包含90 0 6 个和96 3 3 个S c a f f o l d s 其中 基因组常染色质区覆盖度达到9 5 以 上 基因区覆盖度达9 8 以上 获得的全基因组序 列图谱 第一版 c o n t i gN 5 0 超过2 0k b s c a f f o I d N 5 0 超过3 5 0k b 获得的本塞姆氏烟草基因组大 小为25 9 36 4 00 3 6b p 共包含1 4 08 9 0 个片段 表1 供试材料的名称和类型 组 T a b l e1N a m e sa n dt y p e s s e c t i o n s o ft h em a t e r j a l s 万方数据 8 期 童治军 等 3 种烟草基因组S S R 位点信息分析和标记开发 1 2方法 1 2 1 绒毛状烟草 林烟草和本塞姆氏烟草基因组 s s R 位点的搜寻利用S S R I T 软件 h t t p w w w g r a m e n e o r g g r a m e n e s e a r c h e s s s r t 0 0 1 在所获得 的3 份烟草野生种基因组内进行S S R 位点信息的 搜索 该软件仅用于查找二 三 四 五 六碱基5 种 类型的s s R 对于单碱基类型的S S R 信息则利用 T R F 软件 T a n d e mR e p e a t sF i n d e r h t t p t a n d e m b u e d u t r f t r f h t m l 进行搜寻 S S R 搜索的 参数设置为 单碱基重复 2 0b p 基序M 一1 重复 次数N 2 0 二碱基重复 1 2b p M 一2 N 6 三 碱基重复 1 5b p M 一3 N 5 四碱基重复 1 6 b p M 一4 N 4 五碱基重复 1 5b p M 一5 N 3 六碱基重复 1 8b p M 一6 N 3 1 2 2s s R 引物的开发与P C R 扩增分析利用 P e r l 语言编写程序 在符合条件的S S R 位点两侧各 截取长度为2 0 0b p 的核苷酸序列 用P r i m e r3 h t t p w w w f r o d o w i m i t e d u c g i b i n p r i m e r 3 设 计S S R 引物 在设计引物时 主要考虑以下几个关 键因素 1 引物长度 1 8 2 5b p 理想值为2 0b p 2 P C R 预期扩增的产物长度 1 5 0 4 0 0b p 理想 值为2 0 0b p 3 退火温度 T m 5 5 6 2 理 想值为5 8 4 G C 含量 G C 4 0 6 0 理 想值为5 0 5 尽量避免引物二聚体 发夹结构 及错配 P C R 扩增体系为2 0 弘L 其中1 5 3 0 n g LD N A 样品1 5 肛L 1 0 P C RR e a c t i o nB u f f e r M 9 2 一p l u s 2 肛L 2 5m m o l Ld N T P s1 2 扯L 1 0 弘m o l L 正反向引物各2p I r T 口go 7 5U 最后用 d d H 0 补足2 0 肚L P C R 扩增程序为9 5 预变性 5m i n 然后进行3 0 个循环 每个循环包括9 5 变 性3 0s 5 8 视引物的不同而变化 复性3 0s 7 2 延伸3 0s 最后7 2 延伸5m i n P C R 产物在 6 的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离 2 2 0V 恒 压下电泳1 5h 按照S a n g u i n e t t i 等瑚一的快速银染 法进行染色 并拍照保存 2 结果与分析 2 13 份烟草野生种基因组s s R 位点数量和分布 在全长分别为21 3 80 3 54 4 0 24 4 04 1 79 5 2 和 25 9 36 4 00 3 6b p 的绒毛状烟草 林烟草和本塞姆氏 烟草基因组内利用S S R I T 和T R F 软件分别搜寻到 符合要求的S S R 位点1 5 33 5 7 个 1 9 64 9 3 个和 2 7 87 8 4 个 平均每隔1 3 9 4 1 2 4 2 和9 3 0k b 出现 一个S S R 表2 1 5 33 5 7 个绒毛状烟草基因组S S R 位点中 分 布在5 L U T R 外显子 内含子和3 U T R4 种基因 组不同区域的位点个数分别为78 5 2 个 1 53 6 6 个 5 57 7 6 个和58 4 3 个 分别占总数的5 1 2 1 0 0 2 3 6 3 7 和3 8 1 S S R 位点在4 种不同 区域的密度分别为2 5 1 5 4 个 M b 3 4 3 4 个 M b 6 4 9 4 个 M b 和8 4 6 1 个 M b 平均密度为7 1 7 3 个 M b 1 5 33 5 7 21 3 8 0 3 5M b 1 9 64 9 3 个林烟 草基因组S S R 位点中 分布在5 U T R 外显子 内 含子和3 U T R4 种基因组不同区域的位点个数分 别为97 0 7 个 1 91 0 0 个 8 45 5 1 个和58 9 5 个 分别 占4 9 4 9 7 2 4 3 0 3 和3 0 1 S S R 位点在 4 种不同区域的密度分别为2 4 9 3 5 个 M b 4 7 5 9 个 M b 8 1 3 8 个 M b 和9 5 2 3 个 M b 平均为 8 0 5 2 个 M b 1 9 64 9 3 24 4 0 4 1 8M b 2 7 87 8 4 个 本塞姆氏基因组S S R 位点中 分布在5 U T R 外显 子 内含子和3 U T R4 种基因组不同区域的位点 个数分别为1 42 4 6 个 2 89 1 0 个 1 3 65 2 1 个和 83 6 3 个 分别占5 1 1 1 0 3 7 4 8 9 7 和 2 9 9 S S R 位点在4 种不同区域的密度分别为 3 3 3 1 7 个 M b 6 5 6 8 个 M b 1 1 7 9 3 个 M b 和 1 2 9 0 4 个 M b 平均为1 0 7 4 9 个 M b 2 7 87 8 4 25 9 3 6 4M b 在S S R 位点分布区域和密度上 绒 毛状烟草 林烟草和本塞姆氏烟草基因组有两个相 同点 1 在U T R 区域 尤其是5 一U T R 区域 S S R 位点出现频率 密度 最大 而S S R 位点数目 或所 占比例 最低 2 在外显子区域 S S R 位点出现的密 度和所占比例均远低于内含子区域 表3 2 23 份烟草野生种基因组S S R 基序类型和结构 在全部的6 种基序 单 二 三 四 五 六碱基 类型中 绒毛状烟草 林烟草和本塞姆氏烟草基因组 S S R 位点有以下相同之处 1 单碱基基序类型的 S S R 位点数目占各基因组S S R 位点总数的比例基 本相同 2 基因组S S R 位点主要集中在二 三碱基 基序类型上 且两者共占各自总S S R 位点数目的约 8 0 分别为7 9 5 0 8 1 9 5 和8 3 9 1 3 六碱 基基序类型的S S R 位点所占的比例要高于单 四 五碱基基序类型 且四 五碱基基序类型是6 种基序 类型中出现频率最低的 表2 从基序结构出现的 频率上看 绒毛状烟草基因组S S R 中 单碱基基序 出现频率最高的结构是A T 占单碱基基序结构的 8 0 9 4 二碱基基序中出现最多的是A T T A 占 二碱基的6 1 0 3 最少的是C G G C 占0 3 3 三 碱基基序以A A C T T G A T T T A A 和A C A T G T 万方数据 1 5 5 2西北植物学报 3 4 卷 较多 分别占三碱基的1 1 9 9 1 0 1 2 和9 2 7 6 2 2 1 最少的是C G G C 占0 1 1 三碱基基序 在林烟草基因组S S R 中 单碱基基序出现频率最高以A A C T T G C A A G T T 和A T T T A A 较多 分 的仍足A T 占单碱基基序的8 1 0 3 二碱基基序 别占三碱基的1 2 2 2 1 2 2 0 和1 1 6 9 本塞 中出现最多的仍是A T T A 占二碱基基序的 姆氏烟草基因组S S R 中 单碱基基序出现频率最高 表2绒毛状烟草 林烟草和本塞姆氏烟草基因组中S S R 位点信息 T a b l e2T 1 1 eS S Rl o c ii n f o r m a t i o no fN f o z 删f D s D r n i sg e n o m e N 5 y Z u P s f r i sg e n o m ea n dN 妇以f A n 州如盯盘g c n o m e 项目 t c m 鬻 P 奏型兰彩 平均距离 A v e r a g ed i s t a n c e k b 注 平均距离 2 1 4 2 4 4 或2 j 9 G b 碱基类型的S S R 数目 N o t e A v e r a g ed i s t a n c e 一2 1 4 2 4 4o r2 59 玷 S S RN u 表3s s R 在绒毛状烟草 林烟草和本塞姆氏烟草基因组中的分布 T a b l e3S S R sd i s t r i b u t i o no ft h eg e n o m ei nN f o m P 九f 0 5 i b r n i s N s y Z 可P 5 f r i 5a n dN 6 P 押f i 口 口 万方数据 8 期 童治军 等 3 种烟草基因组S S R 位点信息分析和标记开发 的结构也是A T 占单碱基基序结构的8 0 6 3 二 碱基基序中出现最多的是A T T A 占二碱基的 5 9 2 0 最少的是c G G c 占o 2 3 三碱基基序以 C A A G T T A A C T T G 和A C A T G T 为较多 分别 占三碱基的2 2 1 7 1 5 2 1 和8 9 1 表4 2 33 份烟草野生种基因组S S R 基序重复次数 从基序重复次数上看 绒毛状烟草基因组S S R 中 单碱基基序重复次数多在2 0 3 0 2 0 N 3 0 表4 绒毛状烟草 林烟草和本塞姆氏烟草基因组中的S S R 基序结构信息 T a b l e4T h ei n f o r m a t i o no fS S Rm o t i fc o n f i g u r a t i o ni nN f o 删f o s i 如r m i s N 删f u P s r i sa n dN 加行加 m i n 行 g e n o m e s 万方数据 西北植物学报3 4 卷 之间 约占单碱基基序的9 3 1 8 54 1 3 58 0 9 其 中重复次数最多的基序结构为A 重复4 7 1 次 二 碱基基序的重复次数多在6 1 0 之间 约占 7 3 9 2 其中重复次数最多的基序结构为A T 21 5 0 次 三碱基基序的重复次数多在5 1 0 之 间 约占8 8 17 其中重复次数最多的基序结构为 G A A 18 0 9 次 四碱基基序的重复次数多在4 1 0 之间 约占9 6 1 6 其中重复次数最多的基序结构 为A T A C 8 3 次 五碱基基序的重复次数多在3 5 之间 约占9 4 5 5 其中重复次数最多的基序结 构为T C A T A 和A T A C T 各4 7 次 六碱基基序的 重复次数多在3 5 之间 约占9 8 1 2 其中重复 次数最多的基序结构为A A A G A A 3 3 次 林烟 草基因组s s R 中 单碱基基序的重复次数多在2 0 3 0 之间 约占9 4 0 7 其中A 3 7 9 次 是重复次数 最多的基序结果 二碱基基序的重复次数多在6 1 0 之间 约占7 8 5 9 其中A T 9 6 1 3 次 是重复次 数最多的基序结构 三碱基基序的重复次数多在5 1 0 之间 约占8 8 4 1 其中T T A 46 5 5 次 是重 复次数最多的基序结构 四碱基基序的重复次数多 在4 1 0 之间 约占9 2 7 6 其中T A C A 43 8 4 次 是重复次数最多的基序结构 五碱基基序的重复 次数多在3 5 之间 约占9 4 7 0 其中A A T A T 3 4 次 是重复次数最多的基序结构 六碱基基序的 重复次数多在3 5 之间 约占9 8 4 9 其中A G T A G C 10 2 1 次 是重复次数最多的基序结构 本 塞姆氏烟草基因组S S R 中 单碱基基序的重复次数 多在2 0 3 0 之间 约占9 1 2 4 其中A 1 7 3 次 是 重复次数最多的基序结构 二碱基基序的重复次数 多在6 1 0 之间 约占7 1 0 2 其中A T 3 2 次 是 重复次数最多的基序结构 三碱基基序的重复次数 多在5 1 0 之间 约占8 7 1 2 其中A T A 2 1 次 是重复次数最多的基序结构 四碱基基序的重复次 数多在4 1 0 之间 约占8 9 5 4 其中A T A G 2 6 次 是重复次数最多的基序结构 五碱基基序的重复 次数多在3 5 之问 约占9 3 8 5 其中T f 盯T A 1 4 次 是重复次数最多的基序结构 六碱基基序的重复 次数多在3 5 之间 约占9 7 7 5 其中A A A A C A 1 7 次 是重复次数最多的基序结构 表5 2 43 份烟草野生种基因组S S R 标记的P C R 扩增 分析 在绒毛状烟草基因组 林烟草体基因组和本塞姆 氏烟草基因组中利用P r i m e r3 软件分别开发1 5 12 9 3 对 19 2 6 0 2 对和2 7 1 4 8 0 对S S R 引物 开发的成功率 表5s S R 基序在绒毛状烟草 林烟草和本塞姆氏烟草基因组中的重复次数 T a b l e5T h er e p e a tN o o fS S Rm o t i fi nN f o P n f o s i b r 抑i s N s y Z u P s f r i sa n dN 6 P n 腑n 州i n ng e n o m e s 单碱基M o n o n u c l e o t l d e 二碱基D i n u c l e o t i d e 972 9 j2 36 3 7 本塞姆氏烟草基因组 三碱基T n n u c l e t l d e 4 2 8 2 7 4 16 2 9j4 j 4 如 拍d m 如 g e n o m 8 四碱基T e 盯an u c l e o t i d e 2j 3 2l7 7 35 0 2 五碱基P e n t a n u c l e o t i d e 46 7 22 6 j 4 1 六碱基H e x an u c l e o t l d e2 6 7 176 0 94 注 a 重复次数为2 0 时 N 2 0 单碱基基元数目 b N j 时三碱基基元数目 c4 N j 时四碱基基元数目 N o t e a N o o fm o n on u c l e o t i d em o t i fa tt h el e v e l o fN 2 0 b N o o f in u c l e o t l d em o t l fa tt h el e v e lo fN j c N o o fp e n t a n u c l e o t l d em o t i fa tt h el e v c lo f4 瑚蚴 枷 篇黛l i 万方数据 8 期 童治军 等 3 种烟草基因组S S R 位点信息分析和标记开发 分别约为9 8 6 5 1 5 12 9 3 1 5 33 5 7 9 8 0 2 1 9 26 0 2 1 9 64 9 3 和9 7 3 8 2 7 14 8 0 2 7 87 8 4 在 开发的S S R 引物中各自随机选取1 0 0 对引物进行合 成并验证 用于验证的3 0 0 对S S R 引物在参试的8 份 烟草材料中均能扩增得到稳定清晰的目标条带 1 0 0 对绒毛状烟草基因组S S R 引物 以T M t 为引物名称 的前缀 在供试的4 份普通烟草品种中虽均能进行有 效扩增 但未出现多态性 即在普通烟草中的多态率 为0 而在另外4 份烟草野生种中筛选到1 9 对有多态 性的引物 多态率为1 9 1 9 1 0 0 图1 A 1 0 0 对 林烟草基因组S S R 引物 以T M s 为引物名称的前 缀 在4 份普通烟草品种中同样未获得有多态的引 物 而在4 份野生烟草中却获得了2 1 对有多态的引 物 多态率为2 1 2 1 1 0 0 图1 B 1 0 0 对本塞 姆氏烟基因组S S R 引物 以T M b 为引物名称的前 缀 在供试的4 份普通烟草品种中检测出1 3 对引物 呈现出现多态性 即在普通烟草中的多态率为1 3 1 3 1 0 0 而在另外4 份烟草野生种中筛选到2 7 对 有多态性的S S R 引物 在野生烟草中的多态率为 2 7 图1 C A 图l普通烟草和野生烟草不同引物的扩增结果 A 引物T M t 0 7 0 3 7 的扩增产物 B 引物T M s l3 1 0 7 的扩增产物 C 引物T M b l 6 0 0 j 的扩增产物 1 4 普通烟草 5 8 野生烟草 F i g 1 P C Rp r o d u c t so fd i f f e r e n tp r i m e r so nn o n P A G Eb y s i l v e rs t a i n i n gb e t w e e nN i f o f i n 行nt o b a c c o sa n dw i l dt o b a c c o s A P C Rp r o d u c t so fT M t 0 7 0 3 7 B P C Rp r o d u c t so fT M s l 3 1 0 7 C P C RD r o d u c t so fT M b l 6 0 0 5 l 4 C u l t i v a t e dt o b a c c o m a t e r i a l s 5 8 W i l dt o b a c c om a t e r l a l s 3 讨论 3 1基因组S S R 位点与物种进化关系 绒毛状烟草 林烟草和普通烟草基因组中的1 6 碱基基序的s s R 位点以二碱基基序出现频率 最高 其次是三碱基基序与六碱基基序 这与拟南 芥 1 9 3 0 水稻 1 6 1 8 矗 3 0 小麦 1 6 1 9 2 玉米 1 8 棉 花 18 胡椒 3 1 西红柿 马铃薯 3 2 1 和葡萄 3 3 基因组S S R 位点中存在大量的单 二 三碱基基序 的结果一致 与高粱 3 豆科植物根瘤菌和秀丽线 虫 3 朝基因组中S s R 位点信息的研究结果有所不 同 这些物种基因组S S R 位点以四 五 六碱基基序 为主 研究表明 短重复基序的大量存在表明该物 种的进化水平相对较高 引 而长重复基序占绝大多 数的物种一般具有较低的突变频率或具有较短的进 化时间 3 6 8 本研究中的3 份烟草野生种基因组 中 二 三碱基基序占绝大多数 表明烟草在生物进 化与分类地位中处于相对较高的进化水平 其基因 组经历了较长的进化时间或具有较高的突变频率 3 23 份烟草野生种基因组S S R 位点的分布特征 在对植物基因组S S R 位点信息分布特征研究 中 大量的研究主要集中在S S R 位点出现频率 分 布区域 基序类型和基序结构4 个方面 1 在S S R 位点出现频率方面 以S S R 长度 1 8b p 为标准 L a w s o n 等 3 盯研究表明 拟南芥和水稻全基因组中 S S R 位点出现频率分别为2 3 7 和1 1 4k b 在烟 草E s T S S R 的研究中 张俊娥等 胡重怡等r l 刀 和薛金爱等 4 3 分别按照S S R 长度 1 2b p S S R 长 度 1 6b p 和S S R 长度 1 0b p 为标准 在烟草 E S T 序列数据中进行搜索发现 烟草E S T S S R 出 现频率分别为o 9 2 1 4 2 1 和3 1 6k b 王卫峰 等 1 副利用S S R F I N D R 软件并以S S R 长度 2 0b p 为标准 在绒毛状烟草基因组数据进行搜索 结果表 明 绒毛状烟草基因组中S S R 出现频率为4 0 0k b 本研究为了方便下一步设计S S R 引物及尽可能提 高所开发的S S R 引物的实用性 采用了比以往研究 者更为严格的搜寻S S R 位点统计标准 结果显示 在绒毛状烟草 林烟草和本塞姆氏烟草基因组中 s S R 位点出现频率为分别为1 3 9 4 1 2 4 2 和9 3 0 k b 在绒毛状烟草基因组中S S R 位点出现的频率 上 本研究结果是王卫峰等口朝搜索结果的2 8 6 倍 原因可能是使用软件的不同及基因组数据的质量不 同而造成的 2 在S S R 位点分布区域方面 通过 对拟南芥和水稻全基因组中的S S R 位点分布研究 万方数据 西北植物学报 I a w s o n 等 叫发现S S R 在U T R 区域 尤其是5 U T R 区域 出现的密度最高 其次是内含子区域 外 显子区域最低 薛金爱等口2 1 发现位于G S s 中S S R 位点比例明显高于E S T 序列 分析可知 G S S 序列 中包含了非编码区而E S T 序列中则不包含非编码 区 本研究结果与前人对植物S S R 位点信息分析 报道十分吻合口4 删 这一结果也刚好与生物自身的 进化相吻合 即在物种的进化过程中 由于核酸不同 区域所承受的选择压不同而最终导致了相对保守的 外显子区域出现S S R 重复序列的概率大大降低 而 在非翻译区域 U T R 及内含子区域出现S S R 重复 序列的概率大大增加 3 在S S R 基序类型上 现 有的研究一致认为 在全基因组中不论是绝对数目 还是所占的相对比例 均以二碱基基序出现最多 三 碱基基序次之 0 30 3 9 一 而在E S T 序列中 则是以 三碱基基序最多 二碱基基序次之 12 1 弘 本研 究中 我们搜寻的s s R 位点信息是基于绒毛状烟 草 林烟草和本塞姆氏烟草全基因组序列 其结果与 前人在全基因组中的报道一致 即二碱基基序出现 最多 三碱基基序次之 4 在S S R 基序结构方面 本研究表明在单碱基基序类型中以A T 基序结构 出现频率最高 此结果与以往的研究一致 在二碱基 基序类型中本研究的基因组S S R 位点均以A T T A 基序结构出现的频率最高 此结果与小麦 玉米 大 豆 水稻及绒毛状烟草基因组中以A G T C 出现的 频率最高有所不同口 3 虬 在三碱基基序类型中 拟 南芥和绒毛状烟草基因组以A A G T T C 基序结构 出现频率最高 1 一 而大麦 小麦 玉米 高粱 水 稻 黑麦等禾本科作物中则以C C G G C C 基序结构 最丰富 A T T T A A 最少 1 6 1 8 3 本研究中则以 A A C T T G 的出现频率最高 此外 在本研究中检 测到的共6 2 86 3 4 1 5 33 5 7 1 9 64 9 3 2 7 87 8 4 个 S s R 位点中 其基序结构方面均存在着含有G 或 C 数量 含量 越少则该基序结构出现频率也越高 的趋势 这种趋势很可能与碱基对所含的能量有 关 即打破G C 键所需的能量要远高于A T 所需的 能量 因此 A T 相较于G c 更易变动 所以在产生 S S R 重复序列时含有A T 重复基序结构的类型出现 的频率更高 3 3 3 33 份烟草野生种基因组S S R 的应用 现有的S S R 位点功能研究表明 一般情况下基 因内或基因附近的S S R 影响基因的表达L 10 3 7 3 S S R 标记在基因组内已知的位置及侧翼保守序列 对重要农艺性状功能基因的分析 Q T L 精细定位 群体遗传分析等方面的研究十分有利 有助于快速 准确找到基因连锁位点 为候选基因的筛查 鉴定 基因注释及功能分析等提供线索 B i n d l e r 等口2 2 3 和T o n g 等口4o 利用s s R 标记分别在烟草类型间 烤 烟与晒烟 和类型内 烤烟与烤烟 构建了高密度的 普通烟草 2 n 一4 8 分子遗传图谱 T o n g 等心刊和 V o n t i m i t t a 等 2 6 利用S S R 标记分别对烟草赤星病 抗性基因和烟草黑胫病抗性基凶进行了全基因组的 Q T I 扫描并获得了主效Q T L J o h n s o n 等心7 0 利用 与烤烟C o k e r 3 7 1 一G o l d 中黑胫病抗性基因紧密连锁 的S S R 标记对K 3 2 6 进行了分子标记辅助选择育 种 M O O n 等口8 3 利用S s R 分子标记分析了5 4 份烟 草属材料的遗传多样性 本研究基于绒毛状烟草 林烟草和本塞姆氏烟草基因组开发合成的3 0 0 对 S S R 引物均能在供试的8 份烟草材料中扩增获得 稳定清晰的目标片段 2 份烟草祖先种 绒毛状烟 草和林烟草 基因组S s R 引物均未能在参试的4 份 普通烟草品种中扩增获得多态性 而在4 份娴草野 生种中获得较高的多态率 绒毛状烟草基因组s s R 的多态率为1 9 林烟草基因组S S R 的多态率为 2 l 表明我们开发的这2 种基因组S S R 引物不 适合普通烟草种内研究 而在种属间或更高的分类 级别上对烟草进行进化 分类 资源多样性 功能基 因等遗传育种领域的研究是可行的 基于本塞姆氏 烟草基因组开发的S S R 引物在参试的4 份普通烟 草品种中多态率为1 3 在4 份烟草野生种巾多态 率为2 7 适合普通烟草种内和不同烟草种间研 究 究其原因 可能是 1 栽培烟草 尤其是烤烟 由于经历了长期的人工驯化和定向选择等因素的影 响导致了其亲缘关系较近 遗传基础相对狭窄 野生 烟草因受人为因素影响较少而保留了较丰富的遗传 多样性 7 8 3 2 绒毛状烟草 N f o m P 订f o 盯 厂0 r i s2 n 一2 一2 4T T 和林烟草 N y z 口P s r i s2 n 一2 一 2 4S S 两祖先种杂交后 经染色体自然加倍形成的 普通烟草 N 口施f 槲2 n 一2 2 一4 8T T S S 中含有的T 和S 两套基因组成分虽经长期的进化 选择但仍相对保守 而野生烟草种间则不存在此现 象 因此 野生烟草种间存在着较丰富的多样性 此 外 由于本塞姆氏烟草 N 抛种 倪 i a n2 n1 9 一3 8B B 与参试的其余7 份烟草材料在基因组成分 上存在一定程度的差异 1 因此 源于该基因组的 S S R 引物既能在普通烟草种内获得较高的多态率 也能在野生烟草种间呈现极高的多态性 万方数据 8 期童治军 等 3 种烟草基因组S S R 位点信息分析和标记开发 1 5 5 7 参考文献 1 j D s P E E DTH T h eG e n u sN 2 f o 口 日 M T h eC h r o n i c aB o t a n i ac o m p a n y 19 5 4 9 0 一1 1 6 2 B A ID R E E L E D E RR B R A N D I EJE I d e n t i f i c a t i o no ft w oR A P Dm a r k e r st i g h t l yl l n k e dw i t ht h eN i f o f 口 dd e 6 H P y g e n ef o rr e s i s t a n c e t ob l a c kr o o tr o to ft o b a c c o J 丁 P o r P f j f dzd n dA p 户zz P dG P n P f 七s 19 9 5 9 1 11 8 4 11 8 9 3 4 5 6 7 8 R E NN T I M K MP A F I Pa n a l y s i s fg e n e t i cp o l y m o r p h i s ma n de v o l u t i o n a r yr e l a t I o n s h i p sa m o n gc u l t i V a t e da n d w i l dN l c o f I d n ds p e c i e s J G P o 坍P 2 0 0 l 4 4 j 5 9 5 7 1 R 0 s s II B I N D L E RG P l J N E N B u R GH P o t e n t i a lo fm o l e c u l a rm a r k e ra n a l y s i sf o rv a r i e t yi d e n t i f i c a t i o ni np r o c e s s e dt o b a c c o