（有机化学专业论文）井冈霉素菌种选育和提取工艺研究.pdf

一7 l j j j e j j 摘要 本文采用微生物发酵的方法 从井冈霉素生产工艺的菌种着手 系统研究了菌种的选育与纯化 发酵的营养基成份 发酵条件控制和 提取精制等生产工艺流程 首先 用自然选育的方法挑选和培育了高产菌种 使发酵效价有 了大的提高 从而提高了产品质量和降低了生产成本 其次 采用正交试验的方法 确定了合适的种子营养成份和发酵 营养基成份 再次 针对井冈霉素生产工艺中发酵染菌这一直接影响产品质 量 提取收得率和成本的关键问题 通过对生产工艺中种子 培养基 和设备及其附件等各个工段的染菌原因分析 综合生产试验 取得了 制服井冈霉素生产工艺中染菌的有效办法 最后 根据井冈霉素分子结构含有弱碱性氨基 自制l 大孑l 交联 聚丙烯酸 p a a 弱酸性阳离子交换树脂 详细研究了p a a 对井冈 霉素的吸附性能及影响因素 得到了生产井冈霉素高含量产品的可靠 酸度范围和浓度范围 设计了用离子交换树脂提取井冈霉素的生产工 艺流程 其实验产品的质量达到或超过了国外同类市场产品 结果表明 优良菌种的产素能力达到2 7 万单位 较原来相比 增加了o 5 万单位 发酵染菌率从1 5 4 降低到6 o 粉剂提取收得 率从大约8 0 提高到9 1 粉剂产品含量从2 0 3 0 提高到9 3 达 到或超过国外同类产品水平 关键词 井冈霉素 菌种选育 发酵 染菌控制 聚丙烯酸树脂 提 取 卜 一n i p j i l f l j f j i a b s t r a c t i nt h i sd i s s e r t a t i o n s t a r t i n gf r o mt h es t r a i nf o rt h ep r o d u c i n gp r o c e s s o fj i n g g a n g m y c i n s t r a i nc u l t i v a t i n ga n dp u r i f y i n g c o m p o n e n t so f t h e c u l t i v a t i n gm e d i u m c o n t r o l l i n go ff e r m e n t a t i o n c o n d i t i o na n dp r o d u c t e x t r a c t i o n p r o c e s s h a v e b e e ni n v e s t i g a t e ds y s t e m a t i c a l l yb y u s i n g m i c r o b i a lf e r m e n t a t i o n f i r s t h i g h y i e l dj i n g g a n g m y c i n s t r a i nh a sb e e ns e l e c t e d a n d c u l t i v a t e db yu s i n gt h em e t h o do fs p o n t a n e o u sb r e e d i n g w h i c hi n c r e a s e d t h e f e r m e n t i n ge f f i c i e n c y a n d t h u se n h a n c e dt h eq u a l i t y o f j i n g g a n g m y c i np r o d u c ta n dd e p r e s s e dt h ep r o d u c t i o n c o s t s e c o n d a p p r o p r i a t e n u t r i t i o n c o m p o s i t i o n f o r j i n g g a n g r n e i s u p r o d u c t i o n i nd i f f e r e n ts t a g eo ff e r m e n t a t i o nw a sd e t e r m i n e du s m g o r t h o g o n a le x p e r i m e n t s t h i r d i no r d e rt o r e d u c eb a c t e r i a l i n f e c t i o n i n j i n g g a n g m y c i n p r o d u c t i o n w h i c hi st h ek e yp r o b l e mi n f e c t i n gt h eq u a l i t ya n do u t p u to f j i n g g a n g m y c i n f a c t o r s a f f e c t i n g b a c t e r i a l i n f e c t i o n i nt h es t r a t a c u l t i v a t i n gm e d i u m e q u i p m e n t sa n da p p e n d i x e sw e r ea n a l y z e d a n da s e r i e so fe f f e c t i v e m e t h o d sf i o rc o n t r o l l i n g b a c t e r i a l i n f e c t i o ni n j i n g g a n g m y c i nf e r m e n t a t i o nw a sp r o p o s e da c c o r d i n gt o t h ep r o d u c t i o n e x p e r i e n c e a tl a s t b a s i n go nt h ew e a k l yb a s i ca m i n og r o u pi nj i n g g a n g m y c i n m o l e c u l e aw e a k l y a c i d i cc a t i o ne x c h a n g er e s i n m a c r o p o r o u s c r o s s l i n k e d p o l y a c r y l i ca c i d s h o r t e d a sp a a w a sp r e p a r e d f o r p u r i f i c a t i o n o fj i n g g a n g m y c i n a d s o r p t i o np r o p e r t y o fp 八af 0 r j i n g g a n g m y c i n a n df a c t o r sa f f e c t i n gt h ea d s o r p t i o np r o p e r t yi n f l u e n c eo n w e r ei n v e s t i g a t e d n o v e lp hr a n g ea n dc o n c e n t r a t i o no fj i n g g a n g m y c i n f o rp r o d u c i n gh i g h c o n t e n tj i n g g a n g m y c i nw a so b t a i n e d ap r o c e s so f e x t r a c t i n gj i n g g a n g m y c i nw i t hi o ne x c h a n g e r e s i nw a sp r o p o s e d a n dt h e q u a l i t yo fj i n g g a n g m y c i n w a sb e t t e rt h a nt h a to ft h ep r o d u c t si nm a r k e t s m t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ej i n g g a n g m y c i ns t r a i np r o d u c t i o n c a p a b i l i t ya r i s e dt o2 7 0 0 0i 上g m l w h i c hi n c r e a s e d5 0 0 0r i g h ac o m p a r e d t ot h ei n i t i a ls t r a i n t h er a t i oo fb a c t e r i a l i n f e c t i o nd e c r e a s e df r o m15 4 t o6 t h ee x t r a c t i n gy i e l do fj i n g g a n g m y c i np o w d e r si n c r e a s e dt o9 1 f r o ma b o u t8 0 t h ec o n t e n to fj i n g g a n g m y c i np o w d e r si n c r e a s e dt o 9 3 f r o m2 0 3 0 w h i c hr e a c h e da n ds u r p a s s e dt h e l e v e lo fl i k e p r o d u c t sa b r o a d k e y w o r d s j i n g g a n g m y c i n s t r a i n s e l e c t i n g f e r m e n t a t i o n b a c t e r i a l i n f e c t i o nc o n t r o l p o l y a c r y l i ca c i dr e s i n e x t r a c t i o n i v 一 j 目录 中文摘要 英文摘要 1 井冈霉素文献综述 1 1 井冈霉素的性质 1 2 井冈霉素生产工艺 1 3 井冈霉素的应用领域和开发前景 1 4 研究课题的提出及设想 2 井冈霉素高产发酵菌种选育和制备及性能研 究 2 1 井冈霉素生产菌种选育 2 2 井冈霉素菌种产素能力研究 2 3 高产菌种发酵条件研究 3 井冈霉素发酵工艺研究 3 1 前言 3 2 材料与设备 3 3 控制发酵染菌的方法 3 4 结果与讨论 4 井冈霉素提取工艺研究 4 1 前言 4 2 设备与试剂 4 3 实验部分 4 4 结果与讨论 结语 o 2 2 4 o l l l 1 5 8 8 憾 汐 旧 b c l 1 2 7 二i l 1 l 2 3 3 3 4 3 3 3 3 3 4 4 参考文献 4 4 附录 4 8 致谢 5 1 学位论文原创性声明与版权使用授权书 5 2 一 井冈霉索菌种选育和提取工艺研究 1 文献综述 1 1 井冈霉素的性质 井冈霉素 i 2 1 纯品易溶于水和甲醇 微溶于乙醇和丙酮 不溶于 乙醚 苯等有机溶剂 分解点1 3 5 吸潮性强呈弱碱性 常温下中 性及弱酸弱碱介质中稳定 在较强酸性或碱性介质中易分解 井冈霉 素农用抗生素是一种含井冈霉素各组分 多种无机盐和糖类等的混合 物 其有效成分为a b c d e f g 在室温p h 3 9 水溶液 中稳定 对人 畜 鱼 蚕等无毒 动物口服井冈霉素可被肠内细菌 分解成葡萄糖和井冈胺 后者不被肠道吸收 可全部排出体外 纯品 小白鼠毒性实验l d 5 0 2 0 0 0 0m g k g 本品系强内吸性 具选择作用的 抗生素类杀菌剂 对防治水稻纹枯病具有特效 也可用于水稻稻瘟病 小麦纹枯病 3 1 蔬菜立枯病和根腐病 4 1 棉花 豆类立枯病 5 1 及水稻 小粒菌核病 6 玉米大斑病川 玉米纹枯病 玉米穗腐病 引 稻粒黑 粉病 9 1 柑桔果梗炭疽病 1 0 1 1 白术根茎腐烂病 1 2 家鱼烂鳃病 1 3 的 防治 多年大规模的田间使用结果充分显示其 防效高 无药害 无 污染 的环保型农药的特点 深受国内外用户欢迎 在水稻任何生育 期使用均不影响生长发育 使用十分方便 施用后耐雨水冲刷 四小 时后遇到雨水 不影响药效 持效期2 0 3 0 天 井冈霉素 以组分a 为例 化学名称 n 1 s 1 4 6 5 一3 一羟甲基 4 5 6 一三羟环己一2 烯基儿0 1 3 d 一吡喃葡萄基一 1 3 一 1 s 1 2 4 3 5 2 3 4 三羟基一5 羟甲基环己 基 胺 分子式 c 2 0 h 3 5 0 1 3 n h 2 0 分子量 5 1 5 5 1 按照1 9 8 3 年国际 原子量表 结构式 h 硕士学位论文 1 2 井冈霉素的生产工艺 一 在七十年代初 水稻纹枯病 俗称稻瘟病 危害十分严重 染菌 水稻几乎是颗粒无收 没有好的防治农药 1 9 7 3 年 上海农药研究 所组织有关专家 参照日本防治稻瘟病的农药产品一有效霉素 v a l i d a m y c i n 分别从江西井冈山地区和杭州植物园的土壤中定向 筛选 得到了一种菌株 吸水链霉菌井冈变种 s h y g r o s c o p i c u s v a r j i n g g a n g e n s i s y e n 通过对这一菌种的多次筛选 采用生物发酵方 法 合成了一种抗生素农药 1 4 1 5 l 井冈霉素 井冈霉素这一农用抗菌 素 在我国开发研究和生产已经有三十多年的历史了 作为水稻纹枯 病克星的这一品种 到目前为止已经推广到小麦 玉米 棉花 油菜 蔬菜和果树等多种农作物上 甚至推广到家鱼的疾病治疗上 产品的 市场还在延伸和扩大 是目前市场上最廉价的纯生物农药 是农民家 喻户晓的不可替代的生物农药 其有效成份与日本生产的有效霉素 或百里达新 基本相刚幡1 8 j 目前已测定的组成成份有a b c d e f g 具体结构式如表1 1 经过大田的药效试验证明井冈 霉素对水稻三大主要病害 水稻纹枯病具有特效 1 9 2 7 井冈霉素从研究开发三十多年以来 是我国治疗水稻纹枯病的首 选农用抗生素 已成为我国农民家喻户晓的理想生物农药 它的生产 可分为以下几个工艺阶段 菌种一孢子制备 种子制备一发酵一发酵液预处理一提取及精 制一成品检验一成品包装 i 潦 n i 卜 2 峰validamine 鹏 t a b l e l l s t r u c t u r eo f t h ev a l i d a m y c i n o l c o l u c o p y r a n o s y l 1 2 1 菌种 在生产过程中 不经过人工处理 利用菌种的自然突变而进行菌 种筛选的过程 叫做自然选育或自然分离 菌种选育的目的是改良已知菌种或生产菌株的特性 使其符合工 业生产的要求 根据菌种自然变异而进行的自然选育 用人工方法引 起菌种变异或形成新的杂种 h y b r i d 再按照工业微生物学的要求进 行筛选来获得新的变株或杂种 这就是当前菌种选育的基本内容 菌种选育在抗生素工业中的地位越来越重要 抗生素产量和质量 的不断提高 是由于在菌种选育 发酵和提炼等三个方面不断取得进 展的结果 但其中菌种选育的作用是主要的 根本的 发酵培养基成 份和发酵条件的改进 能够充分发挥菌种的生产潜力 提高发酵单位 但这些因素的改进不能离开菌种本身固有的遗传特性 提炼方法的改 进 可以提高发酵产物的回收率 但是理想的最高回收率也只能以达 到菌种的潜在产量为极限 而且实际上还受到工艺和成本核算的限制 总之 抗生素的产量 质量及其抗菌性能 主要是由菌种特性所决定 的 菌种选育有两个基本任务 一个是抗生素工业生产方面的任务 另一个是抗生素产生菌的遗传研究方面的任务 总的来说菌种选育的 任务是随着抗生素工业的发展而发展的 也是随着菌种本身特性的改 3 硕士学位论文 变而变化的o 在抗生素生产中 通过菌种选育可以达到以下几项目的 提高发酵单位 对已经投入生产的菌种要通过菌种选育继续提高其发酵单位 对 新菌种更需要迅速提高其发酵单位 使之迅速投入工业生产 在工业 生产上所使用的菌种都是经过选育以后的变种 抗生素发酵单位的不 断提高主要是不断选育菌种的结果 提高产品质量 减少多余的代谢产物 合成新抗生素 通过菌种选育 可以分离到各种突变型菌株 其中生物合成障碍 突变型菌株的一部分酶引起遗传性阻断 积蓄了合成中间体 这样 就有可能增添新抗生素或去除有毒的或活性低的多余组分 自然选育以微生物的自然突变为基础 在工业生产中 抗生素产 生菌呈现出巨大的自然变异能力 这种自然变异的结果往往导致菌种 的退化 常常表现出生活力减弱 产孢子能力减少和生产抗生素能力 降低等 菌种退化实质上是遗传上的退化 严重的退化甚至造成菌种 的死亡 但自然变异有时也会出现生产抗生素能力提高的优良特性 因此 经常地从大量的天然孢子群体中 淘汰衰退的菌株 保存优良 的菌株 可以达到纯化菌种 稳定生产的目的 生产菌种在使用过程中 要在人工培养的条件下进行传代 虽然 原始斜面是由单菌落发育而来 但菌落上的许多分生孢子已经具有不 同的遗传基础 所以菌种的性状实际上是孢子群体的特征 群体较纯 的 传代后变异较少 群体不纯的 传代后变异菌株将会占优势 因 此 菌种在传代过程中 很容易丧失一种或多种特性而导致退化 在 抗生素生产中 为使生产不断向前发展 要求发酵单位不断提高 需 要反复对生产菌株进行挑选 尽管生产上使用的菌种都用合理的方法 保藏着 而且研究工作者还在不断地改进保藏方法 但是菌种在保藏 过程中仍不断发生变异 综上所述 自然选育可以达到纯化菌种 防止菌种衰退 稳定生 产 提高产量的目的 自然选育的一般程序是把菌种制备成单孢子悬 浮液 经过适当的稀释以后 在固体平板上进行分离 然后挑选单个 菌落进行测定 从中选出优良菌落 4 井冈霉素菌种选育和提取工艺研究 其选育流程如下 出发菌株砂土一一斜卺5 6刊成孢子悬浮液竖一划平板分镒 啼 天 戥目蕊万丙 挑取单菌落接种二5 坠6l 筛选褪鲫 宴一 保藏 生产菌种制备工艺流程 堡燮墨翌确定菌株 一砂土 砂土管一一砂斜一一孢瓶斜面一一摇瓶发酵一一种子罐 1 2 2 孢子制备 孢子制备这是发酵工序的开端 是一个主要的环节 抗生素的产 量和成品质量同菌种性能以及同孢子和种子制备有密切关系 生产用 的孢子需经过纯种和生产能力的检验 符合规定的孢子才能用来制备 种子 制备孢子时 一般是将保藏的处于休眠状态的孢子 通过严格的 无菌手续将其接种到灭过菌的固体斜面培养基上 在2 8 3 7 下培养 3 6 天 这样培养出来的孢子数量还是有限的 为了获得数量更多的孢 子以供生产需要 可进一步继续采用有较大表面积的固体培养基 如 小米或麸皮 进行扩大培养 1 2 3 种子制备 种子制备这一过程的目的是使孢子发芽 繁殖和获得足够数量的 菌丝 以便接种到发酵罐中去 种子制备有的从摇瓶培养开始 再接 入种子罐进行逐级扩大培养 有的直接从种子罐开始进行逐级扩大培 养 摇瓶培养过程是否需要和种子扩大培养级数的多少有关 决定于 菌种的性质 生产规模的大小和生产工艺特点 种子制备一般在种子 罐中进行 扩大培养级数通常为二级 一i t 5 硕士学位论文 摇瓶培养是在锥形瓶内装入一定数量的液体培养基 灭菌后用无 菌操作接入孢子 放在摇床上恒温培养 种子罐培养时 在接种前有 关设备和培养基都必须经过严格灭菌消毒 孢子接入一级种子罐的方 法是制成孢子悬浮液 通过微孔差压法 也可采用火焰保护法 接种 如用孢子悬浮液接种 约为1 2 个孢瓶 具体视孢瓶内孢子丰富程度 和种子罐的大小而定 如用菌丝接种 也是酎隋接入1 3 瓶 相当于 0 1 2 o 接种量的百分率 以罐内发酵液体积而言 以下均同 二 级种子罐接种量一般为5 2 0 培养温度一般为2 8 3 7 在罐内培养 过程中 需要搅拌和通入无菌空气 控制罐温和罐压 并定时取样作 无菌试验 观察菌丝形态和进行生化分析等 确保种子质量后方可移 种 1 2 4 发酵 这一过程的目的主要是为了使微生物分泌大量的抗生素 发酵开 始前 有关设备和培养基必须先经过灭菌 后接入种子 井冈霉素接 种量一般为5 发酵周期为4 0 小时 在整个过程中 需要不断通入 无菌空气和搅拌 维持一定的罐温和罐压 并隔一定时间取样进行生 化分析和无菌试验 观察代谢变化 抗生素产生情况和有无杂菌污染 在发酵过程中往往要加入消泡剂控制泡沫 和加入酸碱控制发酵液的 p h 发酵中可供分析的参数主要有菌丝的浓度和形态 残糖含量 氨 基氮 溶解氧浓度 p h 和抗生素含量 发酵过程中主要控制罐内温度 通气量和搅拌转速以及添加酸 碱 消泡剂 每种抗生素发酵都有它 自己的控制点和最合适的参数进行控制 所谓各种参数的最合适值是 指在其它条件都保持不变的情况下的数值 如果其它条件改变就不一 定为最适值 影响发酵的因素是错综复杂的 各种因素相互影响 相 互制约 因此抗生素发酵要得到预期的效果 需要各方面密切配合和 严格操作 抗生素生物合成过程较为复杂 影响因素比较多 因此控制生产 往往要凭经验 随着对抗生素生物合成机理和微生物遗传学的研究 特别是分子生物学及遗传工程的研究 对微生物生命活动的规律 代 谢的控制和调节有了进一步的了解 大大地促进了发酵工业 现在有 6 井冈霉紊菌种选育和提取工艺研究 人试图研究把产生抗生素的基因移植给发育快 易于培养的微生物例 如大肠杆菌上 以简化抗生素的生产方法 还有研究无细胞合成 亦 即是运用离析的酶合成抗生素 这些研究如果成功将会引起抗生素工 业发生巨大变革 1 2 5 发酵液的预处理 通常在提取前 需先进行过滤 将菌丝和滤液分开 如抗生素分 泌在液体中 则需将滤液进行预处理 以利于以后的提取 如抗生素 分泌在菌丝中 则通常先用有机溶剂萃取 井冈霉素属于前者 发酵液的过滤和预处理是抗生素提炼的第一步操作 过滤和预处 理的目的不仅在于分离菌丝 还着眼于将一些杂质除去和改变滤液性 质 以利于后续各步的操作 当发酵终了时 抗生素可能在溶液中 也可能在菌丝内部或两相中同时存在 预处理时应尽可能使抗生素转 入便于以后处理的相中 多数是液相中 这常可用调节p h 至酸性或 碱性的方法来达到 1 2 6 提取和精制 发酵液预处理后 发酵液即送去提取和精制 利用一些物理和化 学方法将抗生素提纯为合乎标准规定的成品 目前井冈霉素提取方法 是采用真空浓缩的办法 将发酵液直接浓缩到一定的浓度 经检验合 格后进入包装工艺 或将浓缩到一定浓度的发酵液采用真空喷雾干燥 或真空烘烤经粉碎过筛后制成粉剂 检验合格后进入包装工艺 1 2 7 成品检验和成品包装 成品检验和成品包装必须遵从国家标准 2 8 或各企业的标准 1 2 9 1 3 井冈霉素的应用领域和开发前景 1 3 i 井冈霉素 7 硕士学位论文 水稻纹枯病是常发病多发病 是我国水稻高产的主要障碍 我国 水稻种植面积达2 6 7 万h m 2 除水稻之外 玉米纹枯病防效高 小麦 纹枯病 大豆等根腐病也同样需要井冈霉素 另外井冈霉素还推广到 其它作物的菌害防治上 并且对棉花 疏菜等其它农作物的纹枯病也 有很好的疗效 市场稳定潜力很大 微生产生物发酵农药为当今社会 经济发展的朝阳产业 是我国二十一世纪重点开发研究的生物工程领 域 中国抗菌素开发较早 水平处于世界先进之列 井冈霉素是内吸 性很强的抗菌素 被植物吸收后 接触菌体很快被菌丝细胞吸收并在 菌丝内传导 干扰和抑制菌体细胞的正常生长反应而起治疗作用 主 要用于防治水稻纹枯病 兼有保护和治疗作用 也可以用于防止小麦 纹枯病 稻曲病 玉米大斑病 蔬菜立枯病和根腐病 棉花 豆类 人参立枯病等 对人畜无害 不污染环境的无公害农药 解决了水稻 主要多发病 水稻纹枯病的防治 二十多年来经久不衰 年防治面 积达2 亿多亩 为我国水稻的高产稳产做出了重要的贡献 为目前农 村中无法替代的优良药剂 占全国农用抗生素生产应用的8 0 以上 1 3 2 井冈霉素的复配剂 国内各大井冈霉素生产厂家和各大农药生产企业和科研院所 已 将井冈霉素与其它化学农药制成复配药剂 4 0 都 并取得了很好的结 果 例如粉锈宁 井冈霉素混用防治稻粒黑粉病 纹枯灵与担菌胺 防治水稻纹枯病 毗虫啉 杀虫单 井冈霉素协同防治水稻中后期病 虫害 纹霉清及其复配剂防治水稻纹枯病 立克秀防治小麦纹枯病 井冈霉素还应用在果树上m 等 江苏省农科院微生物研究所将益菌芽孢杆类一多效菌与井冈霉 素这两种生物制剂经科学研究配制而成4 0 多效井冈霉素粉剂 试验 表明该合剂除对人畜毒性低 对水稻安全 不污染环境外 在促进水 稻健壮生长 防病和增产上均优于单一井冈霉素 主要表现在 1 合剂防治水稻纹枯病效果比单用提高1 6 9 并对稻曲病 稻瘟病等 也有一定的兼治效果 2 能增加水稻有效穗数 实粒数 粒重 提 高单位面积产量5 左右 3 提高经济效益 每亩每季施4 0 多效井 冈霉素粉剂两次 比单用增收l o 元以上 是当前水稻病虫害综合防 井冈霉紊菌种选育和提取工艺研究 治中较为理想的防病 增产生物制剂 4 5 l 1 3 3 井冈霉素残渣利用 井冈霉素残渣是国内井冈霉素生产厂家的一个严重污染源 全国 年产约l o 万吨 井冈霉素的残渣水分含量高 粘性大 残余淀粉1 0 5 左右 粗蛋白2 5 4 左右 无毒性 但是其残渣长期露置在外 其中 的有机质会腐烂发臭 严重影响环境 因此井冈霉素残渣的利用是亟 待解决的问题 废渣固态发酵生产饲料蛋白 4 6 是井冈霉素废渣资源的 持续利用 具有发酵周期短 酵母产量高 工艺简单 生产成本低的 潜在优势 有良好的应用前景 早在二十世纪八十年代末 湖南益阳 生物化工有限公司将新鲜残渣作为鱼用饲料直接投放鱼池获得成功 解决了井冈霉素残渣污染问题 并能治疗鱼的几种疾病 1 3 4 高效低毒 对环境安全 在二十多年以前 井冈霉素用药量是每亩农田为几十克 甚至几 百克 而通过二十多年的研究和开发 产品质量和产品浓度大幅度提 高 现在每亩用药量只需3 5g 即可达到9 0 以上的防治效果 一次 用药可维持2 0 3 0 天 比一般的化学农药药效长几倍 如果能合理掌 握用药时机 整个水稻生育期用药一次即可达到防治纹枯病的目的 井冈霉素对哺乳动物毒性低 对大白鼠的毒性试验l d 5 0 2 0 0 0 0 m g k g 应用有效剂量的3 0 倍对水稻是安全的 井冈霉素在环境中易 被分解 对有益微生物及水生动物均无显著毒性 是一种理想的非常 安全 3 仉3 7 1 的生物农药 1 3 5 成本低 无抗药性 从井冈山土壤中分离得到的原始菌种只能产生1 个单位的井冈 霉素 按此计算每亩用药成本在1 0 0 元以上 通过三十多年的研究开 发 现在每亩的用药成本在o 5 元左右 n 十世纪八十年代之后 井冈霉素一直成了用药成本最低的生物农药 通过实验室驯化和突变 纹枯病菌的抗性品系 发现对井冈霉素的敏感性没有显著改变 从长 期用药地区的水稻田中采取纹枯病菌测定对井冈霉素的敏感性也没 9 硕士学位论文 有改变 综合有关文献 3 粥9 1 至今没有发现有关井冈霉素抗药性的报 i 厶 遭o 1 3 6 拥有一个稳定的市场和长的生命期 水稻纹枯病是常发病 多发病 是我国水稻高产的主要障碍 我 国水稻种植面积达2 6 7 万h m 2 除水稻之外 对玉米纹枯病防效高 小麦纹枯病 大豆根腐病等也同样需要井冈霉素 另外井冈霉素还推 广到其它作物的防治病害上 并且对棉花 疏菜和水果等其它农作物 的纹枯病也有很好的疗效 市场稳定 潜力很大 自井冈霉素开发应用三十多年来 没有发现其安全性问题 也未 发现其抗药性的文献报道 由于井冈霉素对纹枯病的作用机制特殊 它不能消灭病原菌 而只使病原菌失去致病性 一旦药物消失 病原 菌也恢复正常 因此药物无法使病原菌消失 因此在没有一种新的替 代药物诞生之前 井冈霉素是目前防治水稻纹枯病药剂中最安全 最 经济 最有效的生物农药 即使目前发现有一个化合物具有优良的性 状 有可能和井冈霉素竞争 它形成产业化也需要十年以上 因此 井冈霉素虽然已使用很长时间 但经久不衰的局面还将继续下去 1 4 研究课题的提出及设想 由于井冈霉素具有前面所述的各种优良特征 同时生产井冈霉素 无论是从工艺方面 还是从技术方面来讲 都有值得我们进一步研究 发展的必要 一 井冈霉素研究开发3 0 多年了 其生产工艺还是没有大的改 进和提高 发酵效价也没有大的突破 几乎停留在2 2 万单位左右 产品质量与国外同类产品相比还有较大的差距 同类产品最初在日本 研制成功 其水剂清澈透明 具有清香气味 加有香料 而我国的 井冈霉素水剂产品如酱油一样 时间稍长一点 一般会内有菌苔 外 有霉味 日本的粉剂产品为白色粉末 我国产品为棕黄色 含量是我 国市场产品的3 4 倍 质量明显优于我国的产品 因此发酵过程中各 工段的操作和设备灭菌等都有很多值得研究的地方 就灭菌一项 如 1 0 井冈霉素菌种选育和提取工艺研究 果能得到完全控制 发酵不再染菌 那生产成本将明显下降 产品质 量显著提高 二 井冈霉素的提取还存在很大的问题 我国目前井冈霉素产品 还是发酵过滤液的全体进行真空浓缩制成水剂 3 5 或浓缩到 高浓度时进行真空喷雾干燥和真空烘烤经粉碎过筛制成粉剂 2 0 左 右 水剂产品由于发酵液的残糖未能剔除 致使水剂含量在1 0 以 内 否则就成了棕褐色的糖膏子 粉剂由于没有除杂 糖含量过高 极易结块 且粉剂含量也只能控制在2 0 3 0 左右 进行此项研究的 目的在于如何选择优良菌株 提高发酵效价 降低染菌率 改善提取 工艺 进而提高产品质量和提高产品含量 三 井冈霉素的应用范围有待于进一步拓宽 使用方法要尽可能 地简便 要能与其他药物充分复合和混配 简化使用程序 提高使用 效果 这就需要高品质高含量的井冈霉素产品才行 硕士学位论文 2 井冈霉素发酵菌种选育及性能研究 2 1 井冈霉素生产菌种选育 2 1 1 前言 从自然土壤中获得的能产生抗生素的微生物菌株 经过人工分离 筛选纯化以及选育 4 7 4 8 1 后称为菌种 一般菌种用砂土法或冷冻干燥法 保存 以供生产和研究使用 抗生素的生物合成可分为两个阶段 首 先是菌种的繁殖 其次是抗生素的形成 优良的菌种生长得快而且茂 盛 并在一定的情况下能保持持久的抗生素生产能力 其发酵过程易 于控制 目前所有的抗生素产生菌都是需氧菌 在生产上需供给大量 氧气 无菌空气 因此为保证纯种培养 对获得无菌空气的技术要求 就比较高 一般生产菌种经多次移植往往会发生变异而退化 故必须 经常进行菌种选育工作 以人工的方法加以纯化和育种来提高其生产 能力和产品质量 此外 还必须重视菌种保存工作 一般以低温法保 存的菌种可以保存多年而不发生变异 使用时用白金环挑取少许 涂 抹在固定培养基上面进行繁殖 十分方便 移植菌种时 要采用严格 的无菌操作 以防杂菌污染 自然分离后的平板 一般挑选各种形态的菌落于斜面上 结合传 代进行复筛 经传代复筛三次 对照效价有明显提高的菌种 由于井 冈霉素是多组份化合物 对田间防治作用较好的是a b e f 四个 组份 而生物测定法只能测出a e f 三个组份 而化学测定法能测 出a b c d e f 六个组份 包括二个无效组份c d 在内 因 此我们用化学测定法为初筛测定方法 选择化学价高的菌种 对已经 录取的高产菌种再进行生物测定法测定 通过这样的测定我们选得的 菌种不仅化学效价是高的 生物效价也是高的 可保证产物中a b e f 的有效成份占多数 2 1 2 材料 1 2 井冈霉索菌种选育和提取工艺研究 出发菌种 9 8 撑 实验菌种来源于湖南益阳生物化工有限公司一九九八年的一次 偶然的工业发酵 意外 在那次 意外 的发酵中 单罐发酵效价 达到3 4 万单位 但随后多次模拟 均未得出相同结论 只是保留了菌 种 命名为9 8 撑 斜面 平板培养基 l 天门冬素0 0 5 葡萄糖1 k 2 h p 0 4 0 0 5 琼脂1 5 灭 菌3 0 分钟 摇瓶培养基 玉米淀粉3 葡萄糖2 玉米浆l 酵母粉1 蚕蛹粉1 鱼粉1 n a c l0 5 k h 2 p 0 40 4 5 p h 7 2 发酵温度 3 7 振荡器 型号h z q rn 2 2 0 次 分 效价测定方法 比色法 2 1 3 选育方法 菌悬浮液制备 将菌株置于天门冬素葡萄糖琼脂斜面上 在3 7 时培养3 天左右挑菌筛选 挑选好的菌株镊入生理盐水 o 9 呦中用 玻璃棒倒烂制成菌悬浮液 悬浮液用生理盐水稀释成不同倍数 每次稀释1 0 倍 即取稀释 成1 0 倍液再稀释1 0 倍 循环几次 一般稀释浓度1 0 4 一l o7 倍即可 以 每稀释后 取数滴于培养皿中的培养基 天冬素葡萄糖琼脂 上 用无菌推棒涂抹 置于温箱中3 7 培养 3 天左右即可挑菌筛选 2 1 4 结果和讨论 2 1 4 1 井冈霉素产生菌的形态变异 井冈霉素产生菌在自然分离的平板上可见到多种形态 一般常见 的有以下几种 光秃型 只有宫养菌丝不长气生菌丝黄色 白色型 只有白色气生菌丝 没有孢子 菌落边缘不整齐 表 1 3 硕士学位论文 面皱折 突起 基内菌丝为姜黄色 灰色型 不吸水型 形成孢子 突起成馒头型 或帽子形q 不吸水 基质菌丝黄褐至红棕色 吸水型 菌落形成黑色吸水斑 有的中心吸水 周围不吸水 有的周边吸水中心不吸水 有的菌落全吸水 基质菌丝黄褐至棕红色 形态成帽形或馒头形 皱折型 灰色表面皱折 基质菌丝黄到黄褐 可溶性色素黄色 眼睛型 菌落中空 形成一似眼睛状裂缝 裂缝处没有菌丝 边缘不整齐 白色很少带灰色孢子丝 凹陷型 灰色 但菌落中央凹陷处仍有菌丝生长 此外随着培养条件的不同 常常使菌落大小 基质菌丝可溶性色 素以及孢子丝的颜色发生变化 如基质菌丝可以从淡黄变到褐色 可 溶性色素可能从黄色变为红棕色 孢子丝的颜色也有各种不同的灰色 如绿灰 红灰 鼠灰等 有的菌落不表现吸水的特征 经多次传代仍 表现不吸水特征 吸水的特征亦和培养条件有关 如培养基的水分 培养及存放环境湿度 以及平板上菌落生长的密度有关 可见井冈霉素产生菌的形态变化是多种多样的 如果将各种形态 的菌落单独进行自然分离仍然可以分离成不同形态的菌落 2 1 4 2 自然分离在井冈霉素产生菌选育中的成效 对井冈霉素产生菌进行多次自然分离 我们进行自然分离的目的 有三 试图从自然分离中获得高产的变异菌株 把经过诱变育种 后选出的高产菌种经过自然分离稳定高产遗传性状 保持高产菌种 防止菌种退化 几年来的实践证明自然分离在井冈霉素菌种选育中是 一种行之有效的方法 如自然分离得到的9 8 4 菌种比出发菌井冈霉素 原始菌有显著的提高 在选育谱系中其他的多次自然分离都起到了稳 定生产能力 防止菌种退化的作用 2 2 井冈霉素菌种产素能力研究 2 2 1 前言 1 4 井冈霉紊菌种选育和提取工艺研究 井冈霉素发酵的种子制备过程目的是使孢子发芽 繁殖和获得足 够数量的菌丝 以便接种到发酵罐中去 种子制备有的从摇瓶培养开 始 再接入种子罐进行逐级扩大培养 有的直接从种子罐开始进行逐 级扩大培养 摇瓶培养过程是否需要和种子扩大培养级数的多少有 关 决定于菌种的性质 生产规模的大小和生产工艺特点 根据井冈 霉素生产经验 种子摇瓶培养是井冈霉素种子制备工艺中非常重要的 工段 在锥形瓶内装入一定数量液体培养基 灭菌后用无菌操作接入孢 子 放入摇床中恒温培养 9 8 拌菌株在天冬素 葡萄糖琼脂上的生长 晴 况和平板上自然分离的形态基本相同 但大部分菌落在菌落中心和外 圈不吸水而在中间有一圈吸水呈黑色 在几种常用培养基上的培养特 征和原始菌种比较如表2 1 表2 1不同菌株培养特性比较 2 2 2 材料与设备 种子 天冬素 葡萄糖斜面上培养到刚出现黑色吸水 发酵培养基 大米淀粉 药用酵母粉 肉粉 大米淀粉 山芋淀 粉 玉米粉 黄豆粉 花生粉 细度在6 0 目以下 k h 2 p 0 4 n a c l m g s 0 4 振荡器 型号h z q r 2 5 0 m l 三角瓶装2 0m l 培养液 8 层沙布 培养温度3 7 培养压力 la r m p h 7 0 7 2 0 硕士学位论文 2 2 3 方法 2 2 3 1 摇床发酵产素传代能力测试 在2 5 0m l 三角瓶装2 0m l 培养液 大米淀粉9 药用酵母粉 l k h 2 p 0 4o 0 5 n a c l0 1 m g s 0 40 0 5 肉粉l 调 p h 7 0 7 2 用8 层沙布封口 消毒 放入h z q r 振荡器 调n 2 2 0 r p m 温度为3 7 分别调振荡时间8 8 小时或1 1 2 小时 2 2 3 2 摇床发酵中培养基碳源和有机氮源 4 9 5 0 1 研究 在多个2 5 0m l 三角瓶分别装入2 0m l 培养液 具体配比见表 3 调p h 7 0 7 2 用8 层沙布封口 消毒 放入h z q r 振荡器 调n 2 2 0 r p m 温度为3 7 振荡时间1 l o 小时 采用l 1 8 2x3 8 对影响发酵的8 个因素进行试验即 时间 8 8 小时 1 1 0 小时二个水平 黄豆饼粉 采用1 2 3 三个水平 花生饼粉 采用1 2 3 三个水平 酵母粉 采用o 1 2 三个水平 肉粉 采用0 1 2 三个水平 玉米粉 采用o 1 5 3 三个水平 淀粉 采用大米淀粉7 山芋淀粉7 山芋淀粉3 5 0 n 大米粉3 5 三个因子 k h 2 p 0 4 采用0 0 5 0 1 o 2 三个水平 各组配方中共有成分有m g s 0 40 0 5 n a c io 5 对影响发酵的8 个因素进行试验得到的测试结果如下 表2 2 2 2 3 3 几种有机氮源和碳源进一步摇瓶发酵 在多个2 5 0m l 三角瓶分别装入2 0m l 培养液 具体配比见表 2 3 调p h 7 0 7 2 用8 层沙布封口 消毒 放入h z q r 振荡器 调n 2 2 0r p m 温度为3 7 振荡时间1 1 2i n 1 6 井冈霉素菌种选育和提取工艺研究 大米淀粉山芋淀粉肉粉酵母粉花生饼粉黄豆饼粉 2 2 4 结果与讨论 2 2 4 1 井冈霉素产素能力的传代稳定性 根据9 8 撑菌株在传代试验中产效素能力的测试 得到如下的试验 结果 表2 4 试验结果表明没有显著的变化 菌种的稳定性很好 1 7 硕士学位论文 2 2 4 2 有机氮源和碳源对井冈霉素产素能力的影响 通过对有机氮源和碳源等8 个因素采用正交试验得到的结果 并 将各因素在不同水平时的效价统计如表2 5 由此可见 黄豆饼粉可采用1 2 效价较高 提高到3 时 效价有下降 的趋势 一般用1 5 左右 花生饼粉可采用1 3 对效价均无显著的影响 一般用1 5 左右 酵母粉和肉粉可采用o 1 提高到2 以上的时效价有下降的 趋势 玉米粉的加入反而使效价下降 在发酵培养基中完全可以用大 米淀粉来代替 而效价反而提高 这可以降低粮耗 磷酸二氢钾以采用0 0 5 为好 大米淀粉和山芋淀粉比较以采用大米淀粉为好 发酵时间以1 1 2h r 为好 影响发酵的因素是多方面的 不仅和培养基的组成关系 还和培 养基的c n 比 培养基的固形物含量 物理性状有关 此外也和各组 份间的互相组合有关 观察正交试验的各组配方中最高单位的c n 比 一般为l o 4 5 1 o 5 7 之间 固形物含量在1 1 左右 根据正交试验的 结果和正交试验配方中那些单位比较高 滤液多 易过滤 滤液清晰 的配方为6 1 4 1 2 见表2 2 2 2 4 3 几种有机氮源和碳源对产素的影响 由于有了上面的实验结果 在此基础上对氮源和碳源作了进一步 的实验 得到了表2 6 的结果 井冈霉索菌种选育和提取工艺研究 表2 5 不同因素对产素的影响 表2 6 氦源和碳源对产素的影响 从表中结果和前面的结论可得 在以大米粉为主要碳源时 大米 粉的含量以7 9 为宜 酵母粉和肉粉太多对发酵没有好处 均以1 1 9 硕士学位论文 为佳 因此采用大米粉的配方时只要碳氮比例适当 发酵能达到较高 的水平 根据摇瓶正交试验的结果和氮源和碳源进一步的实验的结 果 下列几种培养基 表2 7 可作为上罐试验的参考 表2 7 不同因素对产素的影响 考虑到上罐时通气搅拌条件较好 糖耗较快 配方中的c n 可 适当提高一些 2 3 高产菌株发酵条件研究 2 3 1 前言 井冈霉素产生菌是一种活的菌株 它的生长需要合适的条件 如 营养物质和温度 压力等 发酵时具有最适宜温度 压力在常压下进 行 发酵周期短等是井冈霉素生产的特点 由于这些特点井冈霉素的 生产动力消耗少 设备利用率高 因此在高产菌株试验时 把这些特 点作为研究标准 使被试的菌种一定要4 0 个小时左右的短周期内分 泌大量的抗菌素 所以在此课题 我们作条件试验时 主要研究高产 菌株的营养要求和营养成本 根据摇瓶试验的结果 井冈霉素生产菌种经过菌种选育 发酵单 位已有很大的提高 经摇瓶条件试验的研究 在适当条件下菌种产生 井冈霉素的能力平均可达2 7 0 0 0 单位以上 为了充分发挥生产菌种的 生产能力 寻找发酵罐上较适宜的发酵条件 5 i 彤 在容积为2 3 0 0 立 升的发酵罐上进行条件试验 以取得数据后在大罐上应用 井冈霉素菌种选育和提取工艺研究 从摇瓶试验的结果来看 培养基的组成对发酵单位影响很大 因 此在发酵罐上的研究 原材料主要以培养基的组成为主 充分发挥菌 种的生产能力 提高发酵的生产能力 提高发酵单位 降低粮耗 降 低能源消耗 力求原料因地制宜 同时兼顾设备 环境 提高灭菌操 作技能 降低染菌率 这样方可保证试验的可靠性 2 3 2 设备材料 试验菌株 9 8 撑 茄子瓶培养基 天门冬酰氨素一葡萄糖培养基 发酵罐培养基 碳源 大米淀粉 6 0 目以下 山芋粉 8 0 目以下 葡萄糖 氮源 黄豆饼粉 8 0 目以下 花生饼粉 8 0 目以下 肉粉 8 0 目以下 芝麻饼粉 8 0 目以下 棉子饼粉 8 0 目以下 酵母粉 工业试剂 无机盐 n a c i 工业试剂 k h 2 p 0 4 工业品 消泡剂 工业 试剂 m g s 0 4 工业试剂 种子罐 2 0 0 立升不锈钢罐 投料1 0 0 立升 罐内有上下二档 六弯叶搅拌 搅拌转速为2 4 0r p m 桨式搅拌 搅拌用电动机功率为 1 5k w 另一只种子罐容积为1 0 0 立升 投料6 0 立升 罐内有上下 二档二弯叶搅拌 搅拌速度为2 8 0r p m 电动机功率为lk w 缸内都有 挡板 起增加溶氧作用 温控系统采用夹套结构 发酵罐 5 6 发酵罐容积2 3 0 0 立升 直径1 0 0 0 毫米 罐高2 8 2 6 毫米 罐内有上下二档六弯叶搅拌桨 叶轮直径为4 0 0