（物理化学专业论文）生物多糖的电化学分析新方法的研究.pdf

青岛科技大学研究生学位论文 生物多糖的电化学分析新方法的研究 摘要 糖类物质是自然界中含量最为丰富的生物大分子，是一切有机生命体必不可 少的成分。糖类同蛋白质、核酸一样，也是一类非常重要的信息分子，在生命科 学、医学、化学、生物学等学科研究领域中有着非常重要的地位。电化学方法具 有成本低、选择性好、操作简单、线性范围宽、灵敏度高等优点，已被广泛用于 研究生物大分子与有机小分子之间的相互作用。本论文采用电化学方法研究了常 见生物多糖肝素钠、硫酸软骨素、透明质酸和壳聚糖与有机小分子染料之间的相 互作用，进而建立了测定生物多糖的电化学分析新方法。本论文主要包括以下内 容： 1 开展了以有机染料吖啶橙、孔雀石绿为电化学探针线扫极谱法测定肝素钠 的研究。 对吖啶橙、孔雀石绿与肝素钠的相互作用进行了研究。染料还原峰电流的降 低值与肝素钠的加入量呈线性关系，并以此建立了测定肝素钠的电化学新方法。 优化了结合反应条件，在最佳实验条件下建立了测定肝素钠的工作曲线并成功用 于肝素钠注射液样品的测定。讨论了染料肝素钠反应体系在滴汞电极上的电化学 行为，并求解了该结合反应的结合比和结合常数。 2 开展了以有机染料结晶紫为电化学探针线扫极谱法测定硫酸软骨素的研 究。 研究了结晶紫与硫酸软骨素之间的相互作用。优化了结合反应条件，在最佳 实验条件下建立了测定硫酸软骨素的工作曲线并将该法用于硫酸软骨素模拟样 品的测定，结果令人满意。讨论了结晶紫与硫酸软骨素反应体系在滴汞电极上电 化学行为，并利用电化学数据求解了该结合体系的结合比和结合常数。 3 开展了以有机染料钍试剂为电化学探针线扫极谱法测定壳聚糖的研究。 对钍试剂和壳聚糖反应体系进行了研究。优化了结合反应条件，在最佳实验 条件下绘制了测定壳聚糖的工作曲线并将该法应用于壳聚糖模拟样品的测定，结 果令人满意。讨论了钍试剂与壳聚糖反应体系在滴汞电极上电化学行为，利用电 化学数据对该结合反应的结合比和结合常数进行了求解。 4 开展了以有机染料藏酚花红、甲苯胺蓝为电化学探针线扫极谱法测定透明 生物多糖的电化学分析新方法的研究 质酸的研究。 考察了有机染料酚藏花红、甲苯胺蓝与透明质酸的相互作用，优化了结合反 应条件，在最佳实验条件下绘制了测定透明质酸的工作曲线并成功用于透明质酸 模拟样品的测定，结果令人满意。讨论了有机染料与透明质酸反应体系在滴汞电 极上电化学行为，利用电化学数据求解了该结合反应的结合比和结合常数。 关键词：电化学分析法，肝素，硫酸软骨素，壳聚糖，透明质酸，吖啶橙，孔 雀石绿，结晶紫，钍试剂，酚藏花红，甲苯胺蓝，相互作用，超分子 复合物 i i n e we l e c t r o c h e m i c a l a n a l y t i c a lm e t h o d sf o r t h e d e t e r m i a n t i o no fb i o l o g i c a l p o l y s a c c h a r i d e a bs t r a c t g l y c o s a m i n o g l y c a n s ( g a g s ) a r et h em o s ta b u n d a n tb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s i nt h en a t u r ea n da r ee s s e n t i a lc o m p o n e n t st oa l lo 昭a m cl i f e g a g sa l ea l s ov e r y i m p o r t a n ti f i f o r m a t i o nm o l e c u l ea sw e l l a sp r o t e i n sa n dn u c l e i ca c i d s ，w h i c hp l a y s i g n i f i c a n tr o l e si nt h er e s e a r c hf e l d so f l i f es c i e n c e ，m e d i c i n e ，c h e m i s t r y , b i o l o g ye t c e 1 e c t r o c h e m i c a lm e t h o d sh a v eb e e nw i d e l yu s e di nt h er e s e a r c ho f t h ei n t e r a c t i o n b e t w e e nb i o m o l e c u l ea n do r g a n i cm o l e c u l e sw i t ht h ea d v a n t a g e so fl o wc o s t ，h i g h c h o i c e 。s i m p l eo p e r a t i o n ，w i d el i n e a rr a n g e ，h i g hs e n s i t i v i t y i n t h i st h e s i s ，t h e i n t e r a c t i o no fs m a l lo 玛a m cd y e sw i t hc o m m o ng a g ss u c ha sh e p a r i n ，c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h i t o s a na n dh y a l u r o n i ca c i dw e r es t u d i e db y e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d f u n h e 彻o r e t h en e we l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d s f o rg a g sd e t e r m i n a t i o nw e r e e s t a b l i s h e d t h i sp a p e rc a nb es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 s t u d i e so nt h ei n t e r a c t i o no fa c r i d i n eo r a n g e ( a o ) a n dm a l a c h i t eg r e e n ( m g ) w i t hh e p a r i n t h ei n t e r a c t i o no fa c r i d i n eo r a n g e ( a o ) a n dm a l a c h i t eg r e e n ( m g ) w i t hh e p a r i n w e r ei n v e s t i g a t e d ，r e s p e c t i v e l y a f t e rt h ea d d i t i o no fh e p a r i ni n t ot h es o l u t i o n ，t h ep e a k c u r r e n td e c r e a s e da p p a r e n t l ya n dt h ed i f f e r e n c eo ft h ep e a kc u r r e n tw a sp r o p o r t i o n a lt o t h ec o n c e n t r a t i o no fh e p a r i n t h ec o n d i t i o n sf o rt h ei n t e r a c t i o nw e r eo p t i m i z e da n d t h e w o r k i n gc u r v ef o rh e p a r i nw a se s t a b l i s h e d u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s t h e e l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so ft h es y s t e mo nt h ed r o p p i n gm e r c u r yw o r k i n ge l e c t r o d e w e r ec a r e f u l l yd i c u s s e db yl i n e a rs w e e pv o l t a m m e t r y t h ep r o p o s e dm e t h o d sw e r e u s e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fh e p a r i ns o d i u mi n j e c t i o ns a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s t h ei n t e r a c t i o nr a t i oa n dc o n s t a n tw e r ec a l c u l a t e db yt h ev o l t a m m e t r i cd a t a i 2 s t u d i e so nt h ei n t e r a c t i o no fc r y s t a lv i o l e t ( c v ) w i t hc h o n d r o i t i ns u l f a t e ( c s ) t h ei n t e r a c t i o no fc vw i t hc sw a ss t u d i e db yl i n e rs w e e pv o l t a m m e t r ya n dt h e c o n d i t i o n sf o rt h ei n t e r a c t i o nw e r eo p t i m i z e d u n d e rt h e o p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h e w o r k i n gc u r v ef o rc sw a se s t a b l i s h e d t h en e wm e t h o d w a su s e dt ot h ed e t e r m i n a t i o n o fc ss y n t h e t i cs a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so ft h e s y s t e mo nt h ed r o p p i n gm e r c u r yw o r k i n ge l e c t r o d ew e r ec a r e f u l l yd i c u s s e db yl i n e a r s w e e pv o l t a m m e t r y t h ei n t e r a c t i o nr a t i oa n dc o n s t a n tw e r ec a l c u l a t e db yt h e v o l t a m m e t r i cd a t a 3 s t u d i e so nt h ei n t e r a c t i o no ft h o r i nw i t hc h i t o s a n ( c t s ) t h ei n t e r a c t i o no ft h o r i nw i t hc t sw a ss t u d i e db yl i n e rs w e e pv o l t a m m e t r y t h e c o n d i t i o n sf o rt h ei n t e r a c t i o nw e r eo p t i m i z e d u n d e rt h e o p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h e d e c r e a s eo fr e d u c t i o np e a kc u r r e n tw a sp r o p o r t i o n a lt ot h ea m o u n to f c t s ，w h i c hw a s f u r t h e ru s e dt oe s t a b l i s ht h ew o r k i n gc u r v ef o rc t s t h ep r o p o s e dm e t h o dw a su s e dt o d e t e r m i n et h ec t sc o n c e n t r a t i o ni ns y n t h e t i cs a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s t h e i n t e r a c t i o nr a t i oa n dc o n s t a n tw e r ec a l c u l a t e db yt h ev o l t a m m e t r i cd a t a 4 s t u d i e so nt h ei n t e r a c t i o no fp h e n o s a f r a n i n e ( p s f ) ，t o l u i d i n eb l u e ( t b ) w i t h h y a l u r o n i ca c i d ( h a ) t h ei n t e r a c t i o no fp s fa n dt bw i t hh aw e r es t u d i e db yl i n e rs w e e p v o l t a m m e t r y t h ec o n d i t i o n sf o rt h ei n t e r a c t i o nw e r eo p t i m i z e d t h ew o r k i n gc u r v ef o rh aw a s e s t a b l i s h e du n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s t h ep r o p o s e dm e t h o d se r e ru s e dt o t h e d e t e r m i n a t i o nh ac o n c e n t r a t i o n i ns y n t h e t i cs a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s t h e i n t e r a c t i o nr a t i oa n dc o n s t a n tw e r ec a l c u l a t e db yt h ev o l t a m m e t f i cd a t a k e y w o r d s ：e l e c t r o c h e m i s t r y , h e p a r i n ，c h o n d r o i t i ns u l f a t e ，c h i t o s a n ，h y a l u r o n i ca c i d ，a c r i d i n e o r a n g e ，m a l a c h i t eg r e e n , c r y s t a lv i o l e t ，t h o r i n , p h e n o s a f r a n i n e ，t o l u i d i n eb l u e ，i n t e r a c t i o n ， s u p r a m o l e c u l e i v 青岛科技大学研究生学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书使用过 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种生物活性，在抗病毒、抗凝、抗炎、抗衰老、抗肿瘤及免疫调节等方面显示出 了良好的应用前景，且几乎无毒性，是一类比较理想的药物，现在已经成为天然 药物、生物化学、生命科学的研究热点。因此对糖类物质及其分析方法的研究将 对二十一世纪生命科学的发展有着深远的影响。本文利用线扫极谱法建立了测定 四种常见生物多糖的电化学新方法，并求解了相关实验参数。 1 1 生物多糖的分类、结构和功能 1 1 1 生物多糖的分类 根据糖类物质能否水解和水解后的产物，可以将糖分为单糖、寡糖、多糖三 类。 单糖，是构成多糖、寡糖的基本单位，自身不能被水解为更小的糖类物质。 根据单糖分子中含有碳原子数的多少，可分为丙糖、丁糖、戊糖、己糖等。其中 戊糖和己糖在自然界中分布最广，如核糖、脱氧核糖为戊糖，是构成核酸的基本 生物多糖的电化学分析新方法的研究 组分；葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖为己糖，是形成糖原、淀粉等多糖的基本 单元。 寡糖，由2 1 0 个单糖分子缩合而成。最常见的是二糖，是由两个单糖分子 缩合失水而成的糖，如蔗糖( 葡萄糖葡萄糖) 、麦芽糖( 葡萄糖果糖) 、乳糖( 半乳糖 葡萄糖) 等。 多糖，由许多个单糖分子缩合而成的糖，水解后又能生成许多单糖分子。多 糖在自然界中无所不在，按照来源可分为哺乳动物类多糖、原生动物类多糖、植 物类多糖、藻类多糖和微生物类多糖；按照结构可分为同聚糖( 糖原、淀粉、纤维 素、葡聚糖等) 、同聚氨基糖( 甲壳素等) 、同聚糖醛酸糖( 果胶酸、藻酸等) 、异聚 糖( 多为糖胺聚糖类，如神经氨酸、硫酸角质素、透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、 硫酸软骨素、硫酸皮肤素等) 。 1 1 2 生物多糖的结构与功能 在生命科学领域，生命及生命过程复杂性的研究已经引起人们的广泛兴趣。 “复杂性 是当今生命科学界最时髦的词汇之一。生物系统的复杂性不单单表现 在其组成、结构的复杂性，主要还体现在生物系统中化学过程、生物应答分子机 制等方面的复杂性，其中对生物大分子的结构和功能复杂性的研究是生物学家们 所共同关注的。 糖类物质的结构比蛋白质、核酸的结构更为复杂，可以说是最复杂的生物大 分子，大多数糖类物质由各种不同的单体通过各种不同类型的键相互连接而成的 具有立体结构的分支状物质。但糖类物质的分子构型、物理常数都会随条件的不 同而发生显著的变化，这也就决定了影响生物多糖活性的环境因素的多样性，包 括温度、浓度、纯度、添加剂、溶剂、p h 值、相对分子质量、放置时间以及其 它一些物理因素等等【4 ，5 】。生物大分子的空间结构是决定其生物活性的重要因素， 因此对生物大分子空间结构的研究具有重要的意义。目前，对糖类的结构与功能 关系的研究已经成为生命科学的最前沿领域之一。 糖类的结构是非常复杂的，具有一级结构、二级结构、三四级结构。糖的一 级结构指单糖基的构型( l 或d ) 、异头物的构型( 0 【或d ) 、糖基环化方式( 五元环或 六元环) 、有无分支、糖基上多个羟基是否被取代( 如氨基、硫酸基、磷酸基、酰 基等取代) 、相邻单糖基相连糖苷键的位置( 1 _ 2 ，1 3 ，1 4 ) 的不同等。而糖的 一级结构又决定着其高级结构，但目前对其高级结构研究的深度和广度不及蛋白 质。糖的二级结构是指多糖主链间以氢键结合的各种聚合体。三级结构是以二级 结构为基础，糖单位的羟基、羧基、氨基以及硫酸基之间的非共价相互作用，导 致有序的有二级结构空间有规则而粗大的构象。四级结构是指多聚链间以非共价 2 青岛科技大学研究生学位论文 键结合而形成的聚集体。面对如此复杂的结构，使得人们对糖类物质的研究步履 维艰。 人们对糖的研究由来己久，随着现代分析技术的发展与进步，新技术不断引 入到糖链的结构分析t 6 1 ，已建立了许多阐明糖一级结构的分析方法，但终因其 复杂性而远远落后于对核酸和蛋白质的研究，目前能有效分析糖的一级结构的方 法主要有化学方法、仪器分析方法和生物学方法。化学方法包括水解法【7 】、高碘 酸氧化法【8 9 】、s m i t h 降解【1 0 】、甲基化反应【1 l 】、免疫化学法等。仪器分析法主要有 气相色谱、质谱、气质联用、红外光谱、x 射线衍射光谱、核磁共振波谱、高效 毛细管电泳、原子力光谱和圆二色谱等。生物学方法主要有利用特异性糖苷酶进 行的酶法分析和免疫学分析。 糖类的构效关系是指糖的一级结构和高级结构与其生物活性的关系。对糖的 结构与功能关系的研究是糖生物学的一个重要研究领域，也是当前糖生物学和糖 化学共同关注的焦点之一。目前对于多糖的研究显示，多糖的空间构象与其生物 活性有着密切的关系，并且多糖的高级结构比一级结构在活性方面起更大的决定 作用。具有什么结构的多糖才具有生物活性、结构的改变对其活性又有何影响， 这些研究将为人们寻找具有生物活性的多糖及对多糖药物的开发提供了理论基 础。人们对多糖构效关系的研究还不完善，目前主要是通过确定糖单元的组成、 糖苷键的类型、主链的构型、支链、空间构型、取代基的种类及数量、相对分子 质量的大小等推断出活性多糖较为准确的一级结构，然后将现代分析方法与物理 常数计算结合起来，进而推断出多糖的高级结构，还可通过多糖的高级结构模型 和生命细胞的受体模型对多糖的作用方式进行推断，从而为筛选对人类有价值的 生物多糖提供理论基础。近些年，人们利用精确三维结构知识对重要生命活动规 律的研究已经得到飞速发展【l2 1 。糖类作为生物体内普遍存在的一类重要的生物大 分子，随着对其结构研究的深入必将人们对多糖的认识推向更高层次。根据人们 对多糖不同生物活性的需要，可以对多糖分子的结构进行改造、优化，如对多糖 进行降解、硫酸化、烷基化、乙酰化、磺酰化处理使其生物活性得到提高或改进。 多糖与蛋白质和核酸是最重要的三种生物大分子，是具有与蛋白质和核酸相 比拟的一类信息载体，具有多种生物活性如：抗感染、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、 抗辐射、增强免疫等。因此，多糖在临床、医药、卫生、食品、生物技术、化学、 农业及环境工程等领域均具有重要的应用价值【13 1 。 早在上世纪4 0 年代多糖就开始作为药物，而到上世纪6 0 年代多糖作为广谱 免疫促进剂而引起了医学界的广泛关注【1 4 】。国内外的众多学者研究发现多糖及糖 缀合物( 如糖蛋白、糖脂等) 不仅参与调节细胞的各种生命现象，还参与调节细胞 的转化、分裂、再生等各种生理过程。研究还表明，多糖类化合物是一种免疫调 生物多糖的电化学分析新方法的研究 节剂，能激活免疫细胞，提高机体免疫能力，已逐渐发展成为一种免疫治疗方法， 对肿瘤的治疗比手术、化疗和放疗都更具优越性【1 5 】。 上世纪8 0 年代以来，对植物多糖的研究已成为人们关注的热点 1 6 - 1 8 】，药理 实验证明不同的植物多糖具有不同的免疫调节功能。如目前已经成功用于临床的 香菇多糖和灵芝多糖，香菇多糖不仅具有降血脂的作用，还能通过非特异性地激 发和增强机体的免疫功能，激活宿主产生抗肿瘤免疫应答，以达到控制和杀灭肿 瘤细胞的目的【l9 】；灵芝多糖具有免疫调节、抗肿瘤、清除自由基、抗衰老、抑制 血栓、改善血液循环等作用【2 0 】；茶多糖具有明显的降血糖的作用【2 1 】；黑木耳多糖 具有降血脂、抗凝血、抗肿瘤等多种生理活j 胜【2 2 】；硫酸酯化多糖能抑制靶细胞与 病毒结合，增强机体免疫作用，是一类治疗艾滋病的新药【2 3 | 。 下面介绍几种常见的生物多糖，包括肝素、硫酸软骨素、壳聚糖、透明质酸。 肝素是一种含有长短不一的酸性粘多糖，由葡萄糖胺和葡萄糖醛酸交联而 成，主要由硫酸d 葡萄糖胺、硫酸l - 艾杜糖醛酸、硫酸d 葡萄糖胺及d 葡萄糖 醛酸中两种双糖单位交替连接而成，是一分子量为5 0 0 0 - 3 0 0 0 0 的混合物。肝素 分子中有大量硫酸基和羧基存在，在水溶液中可以发生解离而成为带有多个负电 荷的大阴离子【2 4 1 。肝素及其衍生物具有多种生物活性，目前在临床上已作为药物 用于调节血脂、抗血栓、抗炎、抗过敏、抗病毒、改善血液流变学指标及免疫调 节等【2 5 1 ，也是人类克隆癌细胞生长的唯一刺激物。针对不同的疾病，临床上通常 采用生物方法对肝素的最佳剂量进行监型2 6 】。但此方法易受生物个体的影响，从 而大大限制了它的应用。刘绍璞【2 7 , 2 8 等用光度法研究了不同染料作为探针与肝素 的相互作用。 硫酸软骨素是由氨基己糖和葡萄糖醛酸交替链接而成的直链大分子，广泛存 在于动物软骨组织中，含有5 0 7 0 个双糖单元，分子量在1 0 0 0 0 5 0 0 0 0d a 之间 2 9 , 3 0 常与蛋白质结合在一起以蛋白多糖的形式存在【3 1 , 3 2 。硫酸软骨素具有许多重要的 生理活性和药理作用，如预防动脉粥状硬化【3 3 】、降低l f l tj 旨 3 4 , 3 5 】、抗炎作用 3 6 1 等， 在临床上用于治疗风湿痛、关节炎及防止动脉硬化和血栓的形成；此外，硫酸软 骨素在食品、化妆品等行业也有着广泛的应用 3 7 , 3 8 。焦庆才等【3 9 1 利用光谱法对硫 酸软骨素与亚甲基蓝的相互作用及其分析应用进行了研究。 壳聚糖，又名甲壳胺，是自然界中天然存在的唯一碱性多糖，由d 氨基葡萄 糖通过d 1 ，4 糖苷键结合而成，是甲壳素( c h i t i n ) 脱乙酰后产生的，不溶于水和碱 溶液，可溶于盐酸、硝酸等无机酸和多数有机酸溶液，无毒、无刺激性、无致敏 性、无致突变作用，具有良好的生物相容性和生物降解性。壳聚糖及其衍生物具 有多种重要的生物活性物质，如抗肿瘤、抗血栓、降血脂、降胆固醇、调节血糖 和增强免疫力等功能，在临床、医药、环保、生物工程、农业、食品、化妆品 4 青岛科技大学研究生学位论文 等领域具有广阔的应用前景【4 叫2 1 。目前，对壳聚糖及其衍生物的研究尤其是对它 的生物活性及其在生物体内的作用机理的研究已经引起国内外的积极关注。近年 来，许多国家都在积极开发壳聚糖产品，但对壳聚糖含量的测定方法比较单一， 多采用酸水解间接比色法测定，此法操作繁琐，不适合复杂样品中微量壳聚糖含 量的分析检测。焦庆才等【4 3 彤】研究了壳聚糖与锌试剂和茜素红等相互作用的作用 机理，并建立了能简便、快速测定壳聚糖含量的分光光度法。 透明质酸，又名玻璃酸，在1 9 3 4 年由m a y e r 首先从牛眼玻璃体中分离得到， 是由n 乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸二糖单位重复交替连接形成的直链粘多糖【4 5 】， 分子量一般在5 o 1 0 4 8 o x l 0 6 范围之内。作为人体和动物体中重要的一种多糖成 分，透明质酸广泛存在于人体和动物组织及细胞外基质中，如关节、玻璃体、滑 液、脐带、软骨、皮肤、鸡冠之中，以满足一些重要功能如韧性、支持结构以及 细胞的代谢调节。它还能维持体内水分平衡等生理作用，在新血管形成，外周神 经再生等生理过程中也具有重要意义【椎5 0 1 。透明质酸被公认为最好的保湿剂，可 以吸收与保持比其自身重量重上千倍的水分，在结缔组织中，透明质酸分子的保 水值约为8 0m l g ，高于其他任何天然或合成的聚合物，因此也被称为天然保湿 因子。透明质酸还有其它的应用功能，如化妆美容、眼科手术、关节治疗、皮肤 保养和药物缓释等。透明质酸还可以用于防止外科手术后组织粘连，使粘连的发 生率大大降低，其应用效果早已在临床实践中得到证明 5 1 ，5 2 1 。l e e 等鳓研究了透 明质酸与壳聚糖共轭磁铁矿粒子的相互作用以及纯化；刘绍璞等【5 4 】采用分光光度 法研究了碱性二苯基奈基甲烷染料与透明质酸的相互作用，并建立了测定透明质 酸的新方法。 1 2 生物多糖的分析研究 1 2 1 生物多糖的研究意义 蛋白质、核酸和糖类物质是生物体内最重要的三类生物大分子。糖类物质是 继蛋白质和核酸后新发现的又一类信息载体，具有相对稳定性、生物安全性、生 物相容性、生物可降解性、粘度可调节性、金属离子络合性、吸湿保湿性、成膜 性、絮凝性、凝胶性、生物再生性和多种生物活性，因此，生物多糖在医药、食 品、日用品、生物技术、农业及环境工程等领域有着重要的应用意义。多年来， 人们一直致力于蛋白质和核酸在生命过程中作用的研究，以蛋白质工程和基因工 程为代表的生物工程的飞速发展已经造福于人类社会，但对于多糖的研究却远远 落后。随着人们对多糖研究的重视及深入，“多糖时代 势必将取代“蛋白质时 生物多糖的电化学分析新方法的研究 代 成为2 1 世纪生命科学新的研究热点之一。糖生物学是研究聚糖及其衍生物 的结构，化学，生物合成及生物功能的科学，是生物化学和生物医学交叉点的前 沿，内容涉及许多生物学科，如分子生物学、病理学、细胞生物学、神经生物学、 免疫学等等。毫无疑问，糖生物学的研究发展对这些学科的发展起着推动作用， 与此同时，这些学科的发展反过来又会积极促进人们对多糖结构分析及改造、药 理机能、合成机理及控制等各个方面的研究。研究发现各种生物多糖对人体都有 着不可忽视的作用，人类已经进入了研究一提取一利用生物多糖的阶段。目前从 各种生物材料中寻找及提取具有一定生理活性的多糖成分的研究已经引起了世 界各国研究人员的广泛兴趣，进而大大推动了人们对多糖类物质的研究。 随着生命科学的不断发展及先进的分离、提取、合成、分析技术在糖生物学 中的应用，人们对糖类物质的认识也在不断深入，许多糖类物质已经得到了广泛 应用。多糖类物质由于其重要的生理作用如机体免疫、细胞识别、生物分子识别 及信息传递等日益受到人们的重视。对糖类物质合成、结构及其与活性之间的关 系以及糖类药物开发等方面的研究已成为分子生物学发展道路上的又一次高峰 【5 5 ，5 6 1 。 1 2 2 生物多糖的分析研究进展 早在2 0 世纪初期德国著名科学家e m i l 就开始了对糖类的研究。随着研究的 不断深入，人们对多糖物质有了进一步的了解，产生了更新的认识，也使对糖类 物质的研究成为生命科学中最为活跃的研究领域之一【5 7 5 8 1 。 对多糖的研究，国内外学者做了大量的工作，取得了长足的进步，特别是随 着分子生物学免疫物质的化学研究与发展以及新药物资源的寻找与开发，对多糖 的研究已引起医药界的高度重视。近年来，日本研究人员在中药多糖活性片段的 化学结构与功能关系方面做了系统研究，并取得了可喜的结果，研究表明多糖像 蛋白质、酶一样，在多糖分子中可能存在一个或几个寡糖片断的“活性中心”， 并通过多糖的一级结构对其活性片段进行了研究。对多糖的活性片段及活性片段 与多糖之间的关系进行研究，有利于研究多糖更为复杂的高级结构，对揭示多糖 结构与功能之间的关系，阐明多糖在机体内的吸收分布、代谢途径等动态变化以 及作用机制都有重要的价值，国内学者对多糖也做了大量的研究，在真菌多糖、 中医药多糖研究方面取得了一定的成绩，但国内对多糖的研究多数集中在对多糖 的分离纯化、化学组成、生物活性和免疫药理的研究。 糖类物质经过一个世纪的不断研究，已有很大进展，但是，与蛋白质和核酸 研究的飞跃式发展相比仍显得远远落后，这是因为：一是糖类的结构比蛋白质、 核酸复杂得多，难以研究；二是早年发现糖类的功能比较单调，只注意到多糖作 6 青岛科技大学研究生学位论文 为能源物质的重要性和细胞的组成成分，制约了对多糖的深入研究。而从近年来 对糖类物质的研究中人们认识到：糖类不仅是一种重要的生命物质，而且是一种 信息载体，在生物体内发挥着多方面的生命作用。对糖类的结构及其与生物活性 的关系、大分子的空间形态、与小分子的相互作用的模式及机理的研究，以及对 糖类物质进行定性定量分析都是生命科学研究中的重要课题。 多糖的研究方法主要有：分子光谱法、电泳法、质谱法、高效液相色谱法、 生物传感器法、电化学分析法等。 1 2 2 1 分子光谱法 分子光谱法是研究生物大分子与小分子相互作用及对其进行定量分析的重 要方法。但是，由于多糖分子中既无紫外吸光基团，又无荧光发光基团，所以很 难直接利用分子光谱法对多糖进行研究，往往需要对其进行预处理，常用的办法 是向被研究的多糖体系中加入光谱探针( 如染料) ，使其具有某种可用分子光谱法 进行测定的光学性质。常用的分子光谱法主要包括分光光度法、荧光分析法、光 散射法和圆二色性法。 ( 1 ) 分光光度法。分光光度法是利用在水溶液中长链多糖大阴离子与染料阳 离子之间能发生相互反应，从而引起染料吸收光谱的变化进行分析测定的。目前 已经研究过且用于多糖分析的染料类型主要有碱性吩噻嗪类染料、碱性吩嗪染 料、碱性二苯基萘基甲烷染料、碱性三苯甲烷染料及偶氮染料等。 刘绍璞等【5 9 , 6 0 】用碱性二苯基萘基甲烷类染料和碱性三苯甲烷类染料为光谱探 针，建立了分光光度法分析测定海藻酸钠的新方法。焦庆才等 6 1 , 6 2 研究了天青a 与肝素钠和透明质酸之间的相互作用，并对其空间定向和作用机理进行了讨论， 指出糖类大阴离子与染料阳离子的结合反应除存在静电引力外，还可能存在疏水 作用或耦合作用。孙伟等 6 3 - 6 5 】利用吖啶橙、中性红、：曲烂钾酚蓝建立了分光光度 法测定肝素钠的新方法。c h e n 等【6 6 】研究了天青a 与：透明质酸的相互作用机理并 建立了测定透明质酸的分光光度法。 分光光度法具有仪器简单、使用范围广和结果直观等特点，但也有其局限性， 如其灵敏度不够高，这也大大影响了其在在线、在位适时、微型化、自动化及 多组分同时测定方面的应用。 ( 2 ) 荧光光谱法。荧光光谱法由于具有高灵敏度和高选择性的特点而成为生 物大分子的主要分析手段之一。但由于糖类物质本身：并无荧光基团，需使其与某 种特定的衍生化试剂发生反应，从而使糖类物质具有荧光特性。目前常用的荧光 探针主要有有机探针和金属探针。 m i a o 等【6 7 】利用t b 3 + 与环丙沙星( c i p r o f l o x a c i n ，简称c w ) 生成的复合物作为 7 生物多糖的电化学分析新方法的研究 光谱探针建立了测定肝素的新方法，检测限达到了6 8 9n g m l ，并对结合机理进 行了讨论。 m o m o s 等 6 8 , 6 9 先后使用5 羟基萘满酮作为荧光探针对血糖和葡萄糖进行了 测定。i m a n a r i 等 7 0 , 7 1 1 利用肼作为先标记试剂先后建立了测定黏多糖分离出来的不 饱和二糖和硫酸软骨素异构体的荧光分析法，后者成功用于测定正常人体尿中的 硫酸软骨素异构体的含量。 目前，实际可利用的荧光探针相对较少，这大大限制了荧光光谱法的应用， 因此，探索新的荧光探针并与其它分析方法联用将成为荧光光谱法发展的主要方 向。 ( 3 ) 光散射分析法。光散射是指当光通过某种介质时，在入射光以外的各个 方向上所观察到光强的现象，它是电磁辐射与物质相互作用的一种表现形式，源 于光电磁波的电场振动而导致分子中电子产生的受迫振动所形成的偶极振子。 1 9 9 3 年，p a s t e m a c k 掣圮j 首次将这一技术应用于卟啉、叶绿素a 的白聚集过程及 卟啉类化合物在核酸分子上的j 型堆积过程的研究。近年来，光散射法作为一种 新兴的分子光谱法已经被广泛用于生物大分子与小分子相互作用及生物大分子 的微量测定等方面的研究。t o n g 掣7 3 ，7 4 】利用此法研究了核酸和金属钴复合物、蛋 白质与有机小分子溴酚蓝之间的相互作用，并建立了灵敏的测定核酸和蛋白质的 新方法。黄承志等【_ 7 5 j 利用该技术研究了肝素钠与亚甲基蓝的相互作用，并建立了 测定肝素钠的新方法，检测限达0 3 4l x g l 。l i u 等【7 每7 8 1 用法对碱性三苯甲烷类、 碱性二苯基萘基甲烷类、碱性吩噻嗪等染料与肝素的相互作用进行了研究，并成 功用于肝素钠注射液样品的测定。l i 等【_ 7 9 】利用共振瑞利光散射法研究了乙基紫与 透明质酸的相互作用，建立了测定透明质酸的新方法。 ( 4 ) 圆二色性法。圆二色谱是以高频变换的左旋或右旋偏振光作为入射光， 当通过某一手性样品时，该样品对左、右旋偏振光的吸收差异而建立起来的测定 有机物构型、构象以及反应机理的方法。从糖类化合物圆二色性谱的形状和强度， 可以了解到多糖的一级结构和空间构象等方面的结构信息，也可以作为糖类化合 物结构变化的一种检测手段。目前此法主要作为定性分析。g e k k o 等【8 0 】在2 5 水溶液中成功测定了壳聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、肝素四种生物多糖在 2 4 0 - 1 6 0n n l 范围内真空紫外圆二色光谱，为揭示多糖在溶液中的详细结构提供的 基础信息。 1 2 2 2 电泳法 由于电泳法符合生物科学各领域中对大分子( 肽、蛋白质、d n a 等) 的高效分 离的要求，而得到了飞速发展，正逐步成为生物科学以及其它科学实验室中的常 8 青岛科技大学研究生学位论文 规分析手段。糖类一般是电中性，亲水性比较强，且无发光基团，这给电泳法分 析糖类造成了一定的困难。 h o n d a 等【8 1 1 率先将电泳法用于糖类分析。p a t e l 等【8 2 】利用电泳法建立了快速分 离和鉴定不同低分子量的肝素钠的新方法，该法并成功应用于欧洲药典低分子量 肝素标准。m a s t r o g i a n n i 等【8 3 】首先应用微乳毛细管电泳分析由软骨素和硫酸角质 素生成的硫酸二糖，利用含有微乳辛烷1 丁烷s d s 的1 0m m o v l p h 为9 3 的硼 酸盐缓冲液，可将不含硫酸基与分别含一、二、三个硫酸基的二糖完全分开，结 果表明此法可用于糖胺聚糖的分析测定。p a s s i 等畔】利用电泳法和色谱技术分别 建立了定量分析含有肝素和硫酸乙酰肝素链的二糖。a m p o f o 等【8 5 】利用毛细管区 带电泳分析了肝素和硫酸乙酰肝素中的二糖结构，检出限为5f i n o l 。p u i g n o u 等【8 6 】 利用毛细管电泳法通过间接激光诱导产生荧光特性的办法建立了分析测定单糖 的新方法。 1 2 2 3 质谱法 人们将质谱法用于对糖类物质的研究开始于2 0 世纪5 0 年代。但是，由于糖 类化合物的分子量很大而且容易分解，在未达到其气化温度时就已经分解，从而 限制了传统有机质谱在糖结构分析中的应用。近年来，随着快原子轰击电离质谱 ( f a s t a t o mb o m b a r d m e n t m a s s s p e c t r o m e t r y , f a b m s ) 、电喷雾电离质谱 ( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n m a s ss p e c t r o m e t r y , e s i m s ) 和基质辅助激光解吸电离质谱 ( m a t r i x a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o ni o n i z a t i o n m a s ss p e c t r o m e t r y , m a l d i m s ) 等软电离 技术的诞生及在糖生物学中的广泛应用，使其取得了日新月异的进展【8 刀。c a m a r a 等【8 8 】利用e s i m s 技术对不同天然肝磷脂及经肝素酶消化了的低分子量的肝磷脂 中已知的二糖进行了定量检测，检测线达到了0 2p m o v m g 。 1 2 2 4 高效液相色谱法 高效液相色谱法用于糖类的研究在2 0 世纪7 0 年代就已经开始，现在已取得 了较大的进展，成为常量及微量糖类有效的分析分离方