（微生物学专业论文）冠菌素的发酵研究.pdf

摘要 穗壤豢篡有与聪簿酸 繁麓酸盛粪觳鹣结搦 摹f l 劝能 楚攘魏秘生茨调节貔囊 瓣蔫装 落黢幕l 苯裁羧蕊逶裹瓣生产成本羧裁7 黄在农渡生产上静嶷翔 拯象笈耀发酵法生产二 者的替代物一冠随索 将有利于农业生产 飙鞠个骰攀骢蕴中筛选得到冠藏素产生菠株0 0 3 号 紫羚诱变精掰到1 0 4 号菌株产最 提黼了4 3 1 第二敬用n 甲基一ni 硝基州一珏硝基瓤诱窝后褥到2 1 2 母蘸椿 产鼙谯第一 次蒸黼上疆麓了捷 3 著鼠褥鞠产蕺莲繁豹掰嘉灏薤拣4 0 9 号 虽然箕产蘩其存滋黢蔼 株静4 瓣 毽燕部分抒酸了滠发对冠菝素产受翡隧翻 为今爱的缔造孬 菇溢藏橡鑫 造了 霹裁槛 蓬谯遴纾静第兰次诱燮 希羹辘黟褥剽辩餐撬懿淫豹嚣蘩索产生蘩 掰难交法霹其发瓣条传遴孝亍德纯 各搿泰妻次鞭痔为 攥魏装鼙 疆 k x 捣 4 9 s o 珏鼬 n h 4 c i 攘莓耩 遥过二次2 0 0 势发辩壤发辩叟产 获褥豹藏夔索榉晶缝鼹曩饕搜i 母片穗绿 抑蒜l 丈短 蒸 申长和使舄铃薯块畸形靛生物学活性 经过高教渡相魏谱 毛纲管气谱一质落联阕 核 磁欺撵等检潮 确定为被茹素 关瓣谶 冠藏豢 缓攀熬蔼 游爱 貔他塔募摹袋俸 簦定 a b s t r a c t c o r o n a t i n eh a st h es i m i l a rs t r u c t u r et oa b s c i s i oa c i da n d j a s m o n a t e s t h e ya l lc a nr e g u l a t et h e g r o w t ho fp l a n t s t h eh i g hc o s to fp r o d u c t i o no f a b a s c i s i ca c i da n d j a s m o n a t e sh a sl i m i t e dt h e a p p l i c a t i o no ft h e m c o r o n a t i n e a st h es u b s t i t u t eo f a b a s c i s i ca c i da n d j a s m o n a t e s p r o d u c e db y f e r m e n t a t i o n w o u l db e n e f i ta g r i c u l t u r e i tw a sc o n f i r m e db ye x p e r i m e n t st h a tn o 0 0 3 o n eo f p s e u d o m o n a sc o u l dp r o d u c ec o r o n a t i n e a f t e rt r e a t m e n to fu l t r a v i o l e tr a d i a t i o n as t r a i nn o 10 4 w i t h 4 3t i m e st h a nt h e o r i g i n a ls t r a i nw a s o b t a i n e d a f t e rt r e a t m e 嫩o f n t g as t r a i nn o 2 t 2w i t h 1 1 4 t i m e st h a nn o 1 0 4w a so b t a i n e d o nt h eo t h e rs i d e as t r a i nn o 4 0 9w h i c hc o u l dp r o d u c e e o r o n a t i n ei n2 6 2w a s a t t a i n e d a l t h o u g hn o 4 0 9c o u l do n l yp r o d u c e4 5p e r c e n tc o r o n a t i n eo f t h e o r i g i n a ls t r a i n i th a do v e r c o m e t h er e s t r i c t i o no f t h eh i g ht e m p e r a t u r e w i t ho n e v a r i a b l e a t t i m ed e s i g n o p t i m i z e df e r m e n t a t i o nm e d i aw a so b t a i n e d t h eo p t i m u m m e d i a c o m p o s i t i o n sf o rc o r o n a t i n ef e r m e n t a t i o n v e mi n d i c a t e da sf o l l o w s o 0 3 k n 0 3 o 0 2 m g s 0 4 7 h 2 0 o 1 n h 4 c i 1 5 羽u c o s e t h eo p t i m u mc o r o n a t i n ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n w e r e5 0 m l b r o t h 5 0 0 m lf l a s k p h 7 o n eg r a mo f t h ec r y s t a lo f c o r o n a t i n ew a s p r e p a r a t e df r o mt h e3 0 0l c u l t u r eo f n o 1 0 4 t h e c r y s t a lc o u l dc a u s et h ec h l o r o s i so fg r e e nl e a v e s h y p e r t r o p h yo fp o t a t ot u b e rd i s c sa n dc o u l d p r e v e n te l o n g a t i o n o ft h es t e mo fs o y b e w i t ht h er e s u l to fh i g h p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h g a sc h r o m a t o g r a p h y m a ss p e c t r o s c o p y n u c l e a rm a g n n e t i e r e s o n a n c e s l 删r o s c o p y t h es t m c r u eo ft h ec r y s t a l w a sc o n f i r m e dt ob ec o n s i s t e n tt ot h es p e c i m e no f c o r o n a t i n e k e yw o r d c o r o n a t i n e f e r m e n t a t i o n p s e u d o m o n a s m u t a t i o n o p t i m i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果 也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意 研究生签名 欺国始 时间 2 0 0 3 年0 6 月2 0 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 可以采用影印 缩印或扫描等复制手 段保存 汇编学位论文 同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表 传播学 位论文的全部或部分内容 保密的学位论文在解密后应遵守此协议 研究生签名 歌国朽 时间 2 0 0 3 年0 6 月2 0 目 导师签名 时间 2 0 0 3 年0 6 月2 0 日 a b a a c c d m s o b f e g c h p l c i a a j a j a m e j a s m s n m r f i a l r u b i s c o s o d t l c 缩写 a t s c i s i ca c i d 1 a m i n o c y c l o p r o p a n e 1 c a r b o x y l i ca c i d d i m e t h y ts u l f o x i d e e t h y l e n ef o r m i n ge n z y m e g a sc h r o m a t o g r a p h y h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y i n d o l e 3 a c e i i ca c i d j a s m o n i ea c i d m e t h y lj a s m o n a t e j a s r e 站n a t e s m a s p e c t r o s c o p y n u c l e a rm a 鲫 n e t i cr e s o n a n c es p e c t r o s c o p y p h e n y l a l a n i n e a m m i n a l y a s e r i b u l o b i s p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e o x y g e n a s e s u p e r o x i d e d i s m u t a s e t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y 脱簿酸 1 氨基环丙烷 1 一羧酸 二擎基贬瓣 乙烯形成酶 气相色谱 高效液相色滋 3 埘i 哚乙酸 藁蕤酸 茉莉酸甲酯 暮裁酸盐 质谱 核磁共振 苯瓣氮酸解鬣薅 核酮糖 1 5 磷酸羧化酶 加氧酶 超甄纯物竣纯酶 薄鬏层柝 中旧椒业入学坝l 学位论史笫 1 部分文献综述 竺皂置ii 皇 曼 曼熊嬲蔓曼 舅量篡燃皇 曼寰燃皇曼曼 曼寰燃烹曼 曼麓删蔓曼 曼曼皇黑麓曼曼 曼懋攀蔓 寰麓蔓皇曼蔓鼍烹嬲皇 量詈女 第一部分文献综述 冠蕊素 c o r o n a t i n e 的发现 l e h i h a m 在1 9 7 7 年报道扶丁霉缀擎胞藤终红致瘸变耪 p s e u d o m o n a s s y i n g a ep v a t r o p u r p u r e a 的培养液中分离到一种化合物 他根据p p v a t r o p u r p u r e a 的旧菌名晕斑假单 胞菌缘红变种 p s e u d o m o n a sc o r o n a f a c i e n sv a t a t r o p u r p u r e a 将之命名为c o r o n a t i n e 丁香假单 胞菌缚红致病变种能导致穰物l o l i u mm u l t i f l o r u ml a i n 发生c h o c o l a t es p o t 病变 1 c h i h a r ae ta 1 1 9 7 7 艏来他们又陆续从导致植物l y e o p e r s i c o n e s c u l e n t u mm i l l 发生b a c t e r i a ls p e c k 病燮的致 病蘸了霉弦单藏鏊番蘸致瘸变秘 p s e u d o m o n a ss n g a ep v t o m a t o 鞫簿致毽携g l y c i n em a x l m i t c h e l le ta 1 1 9 7 8 t 9 8 2 1 9 8 3 发生b a c t e r i a lb l i g h t 病交的致病菌丁香假单胞菌大豆致病变 耪 p s e u d o m o n a s s y b g a ep c g l y e i n e a 豹壤葬渡孛分离到e o r o r t 8 t i n e k e n y o n e ta 1 9 9 0 c o r o n a t i n e 的产生菌包括 丁香假单胞蕴大擞致病变种 p s e u d o m o n a s s y i n g a ep v g l y c i n e a n u s k e a l 1 9 9 3 丁香假翠胞菌番茄致病变种 p s e u d o m o n a s s y i n g a ep v t o m a t o b e n d e r 1 9 8 7 丁香假肇胞菌斑生致病变羊申 p s e u d o m o n a ss y i n g a ep v m a c u l i c o l a 丁香鬣攀腮蘑绛敬致病交稗 p s e u d o m o n a s s y i n g a ep v a t r o p u r p u r e a 丁香假单胞菌李死致病变种 p s e u d o m o n a s s y l n g a ep v m o r s p r u n o r u m 翳漶菜黄单艇蘩糖新嚣兰臻致寤交弹 x a n t h o m o n a s c a m p e s t r i s p v p h o r m i c o l a n u s k e a 1 9 9 3 t a m u r ae ta 1 9 9 2 我溜撞掳痰理学家当瓣只撮糕对榱掳致瘸挂一蘸 将e o r o n a t i n e 熟译成嚣鬻素 1 9 9 2 年以 来 y o u n g 等陆续发现冠菌素与脱落酸 策莉酸盐有类似的功能 遂使一个植物病原蔼产生的 毒素转变成对植物具有极大生理港性豹生长调节物虞 我们搬据其目瓣的生理功能 改称之为 冠菌素 1 2 溅蕴素及其类擞物豹结梅朝功缝 麓落紊c i z h 2 n 0 4 分子量为3 1 9 1 c h i h a r a e t a l 1 9 7 7 圈l 1 魏括一枣食毡一氨基黢懿嚣 烷酸 c o r o n a m i ca c i d m i t c h e l le t a l t 9 9 4 图1 2 和 个聚酮结构的冠苗酸 c o r o n a f a c i c a c i d 翻1 3 两个缎分以酰胺键连结 对予麓萤索弱能的研究菲常欠缺 原因楚褥到冠菌素非常困难 麟际上不仪没有产黼 也 没有标准品出售 只有个别实验室为了研究需要 研制出少最样品 文献报道髓本北海道大学 弗嚣致毯等 1 9 9 8 搦发酵浚麸2 5 0 拜发酵液串褥巅麓落素 瓣耱酸藕麓烷酸共2 0 0 毫克f 冀串麓 r 旧农业人学坝l 学位论文 第一部分义献综述 菌素6 0 毫克 闪此市原狄 屯认为 冠菌素产苗如此之低 不可能通过发酵法生产 这就限制 了在植物上进行人耸功能研究的可能 仪有的极少量样品只能步脱落酸和茱莉酸盐的后尘进行 功能探讨 为此有必要对脱落酸和茉莉酸盐的功能有所了解 疑r j 瑰 h 0 o 团12 冠烷酸的结构 图1 3 冠曹酸的结构 脱落酸c i h2 0 1 0 4 a b s c i s i ea c i d a b a 是一种酸性类倍半萜 图1 4 分子量为2 6 4 化 学名称是3 一甲基一5 1 一羟基一4 一氧一2 6 6 一三甲基一2 一环己烯一l 基 2 4 戊二烯 酸 它有两种旋光异构体 右旋型 一或 s 一与左旋型 一 一或 r 一 又有两种 几何异构体 2 一顺式 c i s 与2 一反式 t r a n s 植物体内的天然形式是2 一顺 4 反一 a b a 有时也含痕量的2 一反一4 一反一 a 队 紫外光 3 5 2 纳米 照射可促进前者向后者的异构化反 应 化学合成的a b a 是一种外消旋混合物 含相等数量的 a 队与 一 a b a 熔点1 9 0 而由灰葡萄孢霉 b o t r y t i s c i n e r e a 发酵生成的a b a 则具有右旋型 熔点为1 6 0 1 6 1 吴江等 1 9 9 7 儿乎所有高等植物体内都有a b a 它在植物的叶绿体或其他质体里通过甲 羟戊酸途径合成 另外类胡萝h 素 紫黄质 光氧化或者生物氧化也能产生脱落酸 当植物受到 水胁迫或者冻害时 a b a 的合成增加 余叔文等 1 9 9 9 a b a 是植物五大激素之一 a b a 在 转录水平上抑制核酸和蛋白质的合成 也对植物体内 些生理过程有显著促进作用 a b a 能促 进 叶 花 果脱落t 气孔关闭 侧芽 块茎休眠 叶片衰老 光合产物运向发育着的种子 2 孛辍农盘a 学谈 学位论文鬟一郏分文皴综述 果实产生乙烯 粜实成熟 a b a 能抑制种子发芽 3 一吲哚乙酸 i n d o l e 一3 一a c e t i ca c i d i a a 运输 攮椿生 疆壤靛等 1 9 9 5 o o 鼙 4 袋落酸瓣结秘 o h 荣赫黢盐骜纷为a b a 躲类 毁物鞠替代物 l 起太弱雏兴趣 r u l i e h e t a l 1 9 9 5 b e n e d e t t i a 1 9 9 5 茉莉酸c 1 2 h o j a s m o n i ca c i d j a 结构觅图1 5 分子量为2 1 0 1 9 7 1 年 a l d f i d g e 等首次从囊蕴 l a s i o d i p l o d i a t h e o b r o m a e 培弊液中分辫出游离的茉莉酸 随后发现 j a 广泛存在于植物界 包括藻类 关文华等 1 9 9 6 一 j a 及其异构体 2 吣p 卜 j a 和荣莉酸甲酯 m e t h y lj a s m o n a t e j a m e 图i 6 是其主要代表物 目前把具有j a 基本结 籀豹 类衍生耪统舔为茉籁酸薤 j a s m o n a t e s j a s 至今己熟有秘多耱j a s 存在于植秘界 它们的生物合成途径起始于距麻酸及一些中间代谢物 j a s 具有广谱的生理效应即多效性 可 壤归纳为互令方嚣 诱导 健送秘攒裁 0 0 4 号菌株 0 0 1 号麓株 0 0 2 号菌株 未 经稳释豹耀攫样菇j l 孝马铃饕豹影嚷魏袭2 2 表2 2 糨撼样品对马特薯块的影响 2 2 1 2 抑制小麦种子发芽实验和抑制小麦根和芽的伸长实验 将冠蔼素糨提样品溶予水中 得到悬浮辩液 用孔径为0 4 5 微米徽膜过滤器过滤 得到冠 籍素粗攥滚 在捧剃水麦静子萌发安验串嚣个簿株静搬提藏都脊掷箭种予耱发豹效果 效鬃明 撼程度如 f 0 0 3 0 0 1 0 0 4 0 0 2 四个菌株的糨提液都有对小赛根和芽的伸长抑制作用 其中 散莱蕞箨熬0 0 3 孽麓撩 耨努裂培莽了毒 5 6 7 天耱0 0 3 孽耱椽5 0 0 囊舞发簿滚鹊餐鬟徉螽 溶于1 0 毫升水溶液中 测獭其对小燮芹长的影响 发现培养了5 天的发酵液效果最明显 处理 避懿小麦劳长只有对照懿4 1 o 鳍 袭2 3 衰2 30 0 3 号样品对小麦芽伸长的影响 2 2 1 3 抑制植物节阕伸长实验 另外 0 0 3 号藏株提驳耪的水溶液明显抑制向日葵 黄瓜等植物节阐舶伸长 用0 0 3 譬菌 株提取物滁在向日葵幼苗的叶子上 测量向日葵的茎长如表2 4 襄2 4 缝冠菌素燕壤的商e l 赘幼苗茎长 莲米 1 4 审强表监大学疆土学位论文第二舔分遥壤素工业生产蔼橡缒遗蛮 在三种生物检测过程中 0 0 3 号菌株均袭现了比其他菌株更强的生物学活性 由此确定了 0 0 3 号莹拣为出发藏株 2 2 2 发酵温魔的确定 0 0 3 号菌株在2 6 下墙养5 天的发酵液 用h p l c 检测不到冠裔素的雌 丽在1 8 卜 培养 5 天的发酵液可以检测到冠菌素 但是菌体在1 8 下生长缓慢 于是采用变温培养 即在2 6 下培蓦1 天最转劐 8 下端葬4 天 2 2 30 0 3 号繁拣的生长曲线测定 将0 0 3 号勰谢菌种接种于液体培养基中 2 6 1 6 0 r r a i n 培养2 4 小时后荐按2 接种最 转接到种子培养基中 2 6 1 6 0 d r a i n 培养 每隔2 小时取样测定o 风 以时间为横坐标 培 莽基o d 篷为缓黛标 得到0 0 3 号蓊撩的生 法线如潮2 t 互甜5 藩1 i 5 o 圉210 0 3 号菌株的生长曲线 从图中可以着出 0 0 3 母菌株在8 小时左右进入对数生长期 在1 3 小时左右好始生长缓 镬 逐澎进入稳是期 西藏菌株的对数生长斓为8 3 小时 2 2 4 絮终线游变墨蹇o 号蘩拣戆产量 对出发菌株0 0 3 号进行紫外线诱变 得到2 0 0 株单菌落 根据初筛缩果选取2 0 株菌株进行 艇筛 结槊如表2 5 其中1 0 4 号蕴株产量最麓 其产鬃为出笈越株o 孵譬躲1 4 3 l 1 5 菏寺 磊 1 三 中团瓜业人学坝 学位论义 第二部分碰菌素t 北生产菌株的选育 袭25 0 0 3 号菌株媾变后的麓筛结果 微克 毫升 菌株号重复i重复2 重复3 平均 1 3 72 1 53 4 52 6 4 2 7 5 1 3 98 6 94 6 98 8 l7 1 3 1 5 34 2 35 6 45 4 6 5 1 l 1 7 73 2 34 1 2 4 3 l3 8 9 1 8 44 6 85 2 8 5 6 45 2 0 1 8 68 316 7 8 5 9 67 0 2 2 2 5 n t g 嚣交挺寒1 0 4 号蘩绦戆产鬟秘耩选瓣雾瀑蘩株 n t g 诱变1 0 4 号萄株得到2 0 0 株单菌落 根据韧缔结聚选取2 0 株菌株进杼复筛 结果如 表2 6 其中2 1 2 号蓥拣产量最凑 是1 0 4 号貔1 1 4 3 篮 是搬发蓥糖0 0 3 号懿l 秘 6 舅 选 取1 5 0 个单菌落进行常潞发酵培养 即在2 6 cf 培养5 天 得到1 0 个在常温下也能产澈菌素 的墓株t 各萤株躲产量熙表t 6 其中产量最高的是4 0 9 号 虽然4 0 9 号莹撩的产量只露1 0 4 号 菌株的3 1 3 甚至不如出发原始菌株0 0 3 号 但避打破了张菌素对低温的依赖 6 m渤m弼翳弛辩镐舔邵豁引弱 5 4 5 6 6 7 7 矗i z i i t 勰引飘弘鼹j斟然叭勰昭捧回毪似硎泓 曼糯引蹦镰删泌蝴嗽册躐烈川乃硝川跖埘薛稻越撕钟蹦截 5 5 5 5 s 5 7 5王 重采i 嚣心甜始豫甜9 鳃礴斟弱鼬融瑙锄谢 棚蝴 泓挑懈拟蹦册瞅 强扪筠勰 弘竹辨外矩卯姒 竺 璺 中闽农业人学坝i 学位论义第一部分冠菌素t 业生产曲株的选育 表261 0 4 号菌株诱变后的复筛结果 微克 毫升 裹271 0 4 号曹株诱变詹耐常温产冠酋囊的蕾株 微克 毫升 1 7 巾冈农业人学顺i 学位论文 第一部分冠菌索r 业生产菌株的选育 2 2 6 紫外线诱变4 0 9 号菌株筛选耐有机氮的菌株 对菌株4 0 9 号进行紫外线诱变得到2 0 0 株菌株 同时在发酵培养基a b c 中进行培养 初筛目前正在进行中 已有的结果表明绝人多数菌株在发酵培养基a 中产量最高 人约为在发 酵培养基b 和c 中的2 倍 但有个别菌株出现相反的情况 即在有机氮培养基中产生较高冠菌 素 经过稳定培育 这有可能成为耐有机氮的菌株 2 2 7 冠菌素工业生产菌株的选育过程 冠苗素工业生产菌株的选育大致经历如f 几个阶段 首先筛选到以0 0 3 号菌株为出发菌株 效价为6 2 0 微克 毫升 接着进行了三次诱变 第一次用紫外线诱变得到1 0 4 号菌株 第 二次用n t g 诱变得到2 1 2 效价为1 0 2 4 微克 毫升 和4 0 9 号菌株 第三次用紫外线诱变 第三次的诱变结果正在处理中 1 0 4 号菌株比0 0 3 号菌株产量提高了4 3 1 2 1 2 号菌株比1 0 4 号菌株产量提高了1 4 3 4 0 9 号菌株能在常温下产生冠菌素 第三次诱变希望能得到耐有机 氮源的萄株 流程如图2 2 由于出发菌株的水平不高 所以目前产量还很低 进一步诱变的余 地还很大 2 3 讨论 出发菌株0 0 3 号菌株 紫外线诱变 土亚硝基胍诱变 上 紫外线诱变 圈2 2 冠菌素工业生产菌株的选育过程 t 对菌种的诱变选育有多种方法 诱变剂有物理冈素如紫外线 x 射线 y 射线 快中 1 8 中闻农业人学坝l 学位论义 第一部分冠菌素t 业生产茁株的选育 子 激光等 化学网子如碱基类似物 5 一氟屎嘧啶 炕化剂 物理因素中目前使j h 的最方便而 且有效的是紫外线 许多高产菌株的选育都州过紫外线 对丁一般实验室 中小型j 厂都适 州 也假安全 其他的儿种射线都是电离性质的 有一定穿透力t 一般都由专业人员在专门的 设备中使用 化学诱变剂中使j l 最多 晟有效的是烷化剂如甲基磺酸乙酯 乙烯 胺笛 以上 方法都有一定的盲目性 属于经典育种的范畴 随着微生物学 生化遗传学的发展 出现了转 化 转导 原生质体融合 代谢调控和基因 1 程等较为定向的育种方法 由丁冠菌素的具体台 成机制尚不清楚 因此采用定向诱变等方式来诱变还不可能 只能根据经典的微生物育种方法 米选育冠菌素的工业生产菌株 2 低温能促进冠菌素的产生 如 一香假单胞菌大豆致病变种产冠菌素的最佳温度是1 8 然而低温不利于菌体的增殖从而限制了其代谢产物的产量 虽然采用变温培养 如将细菌 培养液先在2 6 c 下培养1 天 再转到1 8 c 下培养 可以部分解决问题 但是不能解决根本问 题 如果能继续诱变将其温度限制解除 则产量有望得到大幅升高 3 在发酵培养基氮源的选择上 由于发酵培养基a 只有无机氮源 菌体生长不如在有机氮 源下迅速 常见的有机氮源有花生饼粉 黄豆饼粉 棉子饼籽粉 玉米浆 尿素 鱼粉等 有 机氮源除含有丰富的蛋白质 多肽和游离氨基酸外 往往还含有少量的糖类 脂肪 无机盐 维生素及某些生长因子 因而微生物在含有有机氮源的培养基中常表现出生长旺盛的特点 这 可能是微生物在有机氮源培养基中 直接利用氨基酸和其他有机氮化合物中的各种不同结构的 碳架 来合成生命所需要的蛋白质和其他细胞物质 而无需从糖代谢的分解产物来合成各种所 需的物质 玉米浆和尿素是生产上常用的有机氮源 所以在发酵培养基a 的基础上分别添加了 两种氮源 得到发酵培养基b 和c 玉米浆是玉米 也可用谷类 的亚硫酸提取物 含有丰富 氨基酸 丙氨酸 谷氨酸 缬氨酸 苯丙氨酸等 还原糖 磷 微量元素和生长素 尿素也 是常用的有机氮源 但它成分单一 不具有上述有机氮源的特点 但是在有机氮源存在下 冠 菌素的产量大大降低 如在第三次诱变中 每个菌株都平行的在三种培养基下进行筛选 这三 种培养基分别是发酵培养基a 发酵培养基b 和发酵培养基c 其中a 不含任何有机氮源 b 含 有0 2 尿素 c 含有2 玉米浆 结果是几乎每个菌株在发酵培养基a 中的产量都是在b 或c 中的两倍 而出发菌株0 0 3 号菌株在含有玉米浆的培养液中根本测不出冠菌素的峰 推测可能 的原因有两点 一 冠菌素对渗透压十分敏感 玉米浆或其他氮源的加入使培养基的渗透压升 高从而降低了冠菌素的产量 二 冠菌素的结构部分冠烷酸的合成涉及到亮氨酸合成途径 玉 米浆中丰富的游离氨基酸可能对亮氮酸的合成途径造成了抑 m i t c h e l l 1 9 8 2 但是菌株本身大 量增殖需要丰富的氮源 为了解决这个矛盾 今后可以逐步筛选出对有机氮源有一定耐受力的 冠菌素生产菌株 如能使用固定化细胞来生产冠菌素则能很好的解决问题 可以先在高温下和 提供丰富有机氮源让菌体大量增殖 将细胞固定化之后再降低温度和使爿j 无机氮源进行次级代 谢生产冠菌素 4 由于冠菌素产生菌是植物病原细菌 如果进行工业化生产 发酵得到的菌体应该进行灭 菌处理后再排放到环境中 1 9 中闻桃业人学坝i 学位论义 笫一部分冠菌素t 北生产菌株的选育 5 在确定出发菌株0 0 3 号时进行的马铃薯块炎验中 发生变化的马铃薯体积变小 质地变 较 颜色变黧 可能的解释跫马铃薯块瓣淀狯裁裂瓣 鲴藤鼙酶瓣瓣瑷累导致薅较交套 矮缝 变软 酚类物质浓度增加导致燮黑 k e n y o n e l d f 1 9 9 0 a 而g n a n a m a n i c k m a n 等 1 9 8 1 报道码 铃饕块经过蕊菠素娃理会出现嚷形生疑 如受处理处璃形突出 廷蠢出现蚕似矛霸豹结果 究 其原因可能悬由丁冠博索在不同浓度卜对马铃薯块的作用也不相同 第点部分优化发酵条件 刖置 发黪条释惫攥营莠条l 孛秘其缝终器条襄 p h 滚瓣氧 滋疫 渗透压等 逶予工渡生产 的培养基应该既有利丁微生物生k 又要保证高产优质地产生所需的代谢产物 另外还要具有来 源丰富 价格低廉 质量稳定的特点 对冠蕊素发酵条 牛的优化有助于提高产量 降低发酵成 本 3 材料和方法 3 1 1 麓株 0 0 3 母菠撩 3 2 壤葬基 3 1 2 1 种子培养基 参见2 1 2 3 1 2 2 发酵培养基a 参见2 1 2 3 1 3 还原糖测定法 骧源是主要浆髓潺 豢惩嚣碳溅寄糖类 涵脂 露掇酸辣低级酵 蘩麓糖楚碳漯孛鼗荔列 用的糖 几乎所有的微生物都能利用葡萄糖 所以葡萄耱常作为培养基的 种主臻成分 并且 作为搬遮微生物生长的一种有效的糠 但是过多的葡虢糖会过分加速落髂的呼吸 以致壤葬基 中的溶解氧不能满足需要 使一些中问代谢物不能完全氧化而积累在菌体或者墙箨基中 如丙 酮酸 乳酸 己酸等导致p h 下降 影响某些酶的活性 从而抻制微生物的生长期产物的仓 壤 新氍在微生黪发酵过程串 发酵液森耱瓣消耗情况楚一璜熏要的生蠖指标 它也是掌握发 酵进程的霆要依据之一 糖的定量测定方法很多 如焚林氏法 碘量法 葸酮法 3 5 二二硝基 农场酸法簿 它键嚣毒貔疑点 3 5 二硝基水杨酸法 d n s 测定还原糖比较简便 d n s 是一种氧化剂 能与还原糖作 捌 馒磷基还蹑戏氮基 溶渡变为撩色 在一定还原撼戆浓度藏围内 掇色豹深发与还蔗糖憨 浓度成正比 冈此 可采用比色法求得还原糖的含蹙 取t 毫升标准溶液或发酵液放入2 5 毫升 试管中 加3 5 二硝基水杨酸溶液1 5 毫升 水1 5 爨砖 摇匀 沸水浴加热5 分钟 冷承浴 巾立帮冷却 铡o d 5 2 0 2 l 阔农业人学坝l 学位论义第二部分优化发酵条件 3 1 4 氨态氮测定法 氮源是微生物的营养要素2 一 因为氮是构成细胞蛋白质 核酸和含氮代谢物的元素 氩 原也是产物冠菌素的组成成分 因此发酵液内含氯量豹变化也是微生物发酵过程中的重要生理 指标 可用康惠皿法测氨态氮的含餐 周德庆 1 9 8 6 3 1 5 优化培养基成分 优化培养基成分包括确定重要因素 和确定重要因素的最佳水平 确定重要因素可以采用 p l n c k e t t b u r m a n 法或者跟制性随机平衡法 确定重要因素的最佳水平可以采用b o x b e h n k e n 法 b o x w i l s o n 法 均匀设计法和改进单纯形法 而缳简洁的方法是单次单因子法 本实验采 用六个因子三个水平 表3 1 进行发酵培养基的优化 共1 8 种培养基 表3 2 每种培养基三个 重复 衰3 1芷交试验中的六个因子与三个水平 表32 正交法优化培养基的培养基配方 m g s 0 4 揸鲞墨麴呈堡塑薹塑塑笪煎型婪 曼 塑2 q 垦塑q 2p h 11 l11t 1 212 222 2 3 13 333 3 42 l l2 23 522 23 31 62 33l 12 73 l2i 32 832 32 13 933i 321 1 01 l33 22 1 11 211 3 3 1 21 322 11 1 32l 23 13 1 42 231 21 1 52 312 32 1 6313 23 1 1 732 13 12 3 2 结果与分析 3 2 1 还原糖的测定 还原糖的标准曲线如图3 1 l 0 9 0 8 07 o 6 扣s o 4 0 3 o2 o 1 o y o 5 9 x 1 1 2 o 9 9 6 5 o03o 6 o9 12 古塘量 m g 毫升 圈31 还原糖的标准曲线 2 3 15 中国椒业大学坝士学位论文第三部分优化擞酵条件 0 0 3 1 0 4 2 1 2 4 0 9 号筒株从揆种开始到第六天结束 每天l 艇样测定发酵液巾述原糖宙量 表 3 3 褥垂代涂鏊线见鬻3 2 鑫羹可汉霉窭0 0 3 鼍 1 0 4 母 2 1 2 号藩棘在第一天鞫第二天赣 消耗不明显 但从第三 夭开始剥第四天结束糖消耗迅速 占总糖消耗的8 0 以上 而4 0 9 号菌 拣剩瓿第一天强嚣糖瓣耗藏报明显 茧鞠天结枣嚣据个萤株述疆糖泰平均趋予乎稳 袭330 0 3 1 0 4 2 1 2 4 0 9 母萄株发酵挝程中迸牒糖含量的燮化 毫觉 蓬升 菌株号j 陵种时第一晨第二天搿三天第四天第五必第a 天 31 7 0 71 8 蠢3t 8 2 21 3 辚0 6 9 l 0 8 瓣 1 0 41 8 8 l1 8 0 1 1 8 2 21 3 1 41 0 21 3 11 6 8 2 1 21 7 2 01 7 5 01 8 0 l t 4 9 23 4 82 7 to 9 9 4 0 91 7 3 71 7 8 01 3 1 4 5 2 90 韶1 1 20 蚪 ol 3 2 2 氨态氯蚋测寇 2 3456 发酵嚣窝 舞 篷3 20 0 3 t t 0 4 2 t 2 4 0 9 弩藿株的糖代谢魏娥 氨惑氮的标准曲线如图3 3 瓣埔醛聪聪辩0莓0 2 0 末鞯 慷懈v 罄蹑睃 中国农业大学硕士学位论文第三部分优化发酵条件 鞋 蛙 窖 z 鼋 z 糕 韶 3 r 2 5 2 蠢 s v 1 0 5 0 00 2 v 2 7 6 3 6 x r 0 9 9 7 0 40 60 8 n h 4 c i 的浓度 图33 氨态氖的标准曲线 1 2 0 0 3 1 0 4 2 1 2 4 0 9 号菌株从接种开始到第六天结束 每天取样测定发酵液中氨态氮含量 表 3 4 得到代谢曲线见图3 4 由图可以看出0 0 3 号 1 0 4 号 2 1 2 号 4 0 9 号菌株在第二天开 始到第三天结束氨态氮消耗迅速 表340 0 3 1 0 4 2 12 4 0 9 号菌株发酵过程中氨态氮的变化 毫克 t l t 1 鱼楚曼堡壁啦蔓二垂箜三墨 蔓三垂塑凹丕篁亘垂塑查盔 0 0 30 7 01 0 5o 7 0 o 0 50 3 5o 3 9 0 3 9 1 0 40 6 8o 7 50 6 1 0 2 50 2 00 3 90 3 3 2 1 2o 7 0 o 8 6o 5 00 3 5 0 4 0o 3 5o 3 8 兰 竺 i 竺 旦 l 2 1 o 8 睁 e 0 2 4 0 o 234 56 发酵时间 天1 图34 0 0 3 1 0 4 2 1 2 4 0 9 号菌株发酵液中的氨态氯代谢曲线 2 5 中田农业人学城i 学位论史 第二部分优化发酵条件 3 2 3 优化培养条件 根据止交法的实验结果 可看出摇瓶装量楚影响最大的因素 当摇床转速一定时 摇瓶的 装掇人小反映了溶解氧的大小 摇瓶装量越犬则溶解氧越少 反之 摇瓶装量越小则溶解氧越 人a 高的溶解氧对冠菌素的生产有利 而较低的溶解氧则对冠菌素的产生不利 试验中涉及的 培养条件 其影响大小依次是摇瓶装量 起始p h k n 0 3 m g s 0 4 7 h 2 0 n h 4 c i 葡萄糖 表35 正交实验结果 耋篆 量 起始州 篙 萎姜霎嚣 s 毫升 5 毫升摇瓶 0 j 3 2 4 发酵过程中的发酵单位测定 0 0 3 1 0 4 2 1 2 4 0 9 号菌株从第二天开始到第六天结束 每天取样测定发酵液中冠菌素含量 表3 6 得到冠菌素效价变化曲线见图3 5 由图可以看到0 0 3 1 0 4 2 1 2 号菌株都是在发 酵第五天发酵单位达到最高 到第六天有所下降 可能是在发酵后期菌体开始降解冠菌素 因 此确定合适的发酵结束时间非常重要 寰3 6 发酵过程中的发酵单位测定 微克 毫升 隶 迎 怔 拦 一 蛔 抽 懈 掘 曜 1 0 0 3 3 讨论 发酵时间 天 6 1 冠菌素产生菌菌体本身在常温和有机氮源存在时生长旺盛 但在常温和有机氮源存在下 冠菌素产量很低 为了解决这个矛盾 可以采用固定化细胞法生产冠菌素 可以在常温和提供 丰富有机氮源的条件下大量生产细胞 然后将细胞固定化 再转到低温和只提供无机氮源条件 下进行冠菌素的生产 菌体固定有很多方法如 吸附法 包埋法 交联法 共价法 分批发酵 法生产和固定化细胞生产比较 固定化细胞有很多优点 固定化细胞可以连续使用 而单批发 酵的细胞只用一次即行排弃 所以固定化细胞不但操作方便而且可节省供生长消耗的养料 使 用固定化细胞一边进培养液 一边即排出发酵液 可以避免反馈抑制或产物的消耗 但是从 5 0 0 毫升摇瓶装1 0 0 毫升发酵液产量不如只装5 0 毫升发酵液产量 可以看出冠菌素的产生需要 较高的溶氧 而在固定化细胞中溶氧问题 直难以解决 如果能解决供氧问题 用同定化细胞 法生产冠菌素将更有效 2 在进行发酵条件优化时选取的六个因子中影响最大的是摇瓶装量 当摇床转速固定时 摇瓶装量反应的是通气量 即发酵液中的溶氧 冠菌素在最小摇瓶装量下产量最高 反应了冠 菌素产生需要充足的氧气供应 氧是细胞主要成分 主要可从大量存在于培养基中的水得到 但是细胞还需要有分子态的氧作为呼吸链电子传递系统末端的电子受体 最后与氢离子结合成 水 在呼吸链的电子传递过程中 释放出大量能量 供细胞的维持 生长和合成反应使用 此 外 氧还直接参与一些生物反应 供氧不足就会造成代谢异常 所以在发酵中氧容易变为主要 矛盾 考虑到冠菌素产生菌在存在有机氮源的培养基中往往产量很低 可能是由于有机氮源的 存在使细胞增值迅速 菌量大幅升高 相对的使每个菌体获得的溶氧f 降而造成的 另一方 面 有可能是由于有机氮源能造成培养基的黏稠度升高 使溶氧降低 如果通过减少菌的生 2 7 中周农业人学坝i 学位论文鞯三部分优化发酵条件 速率达剑控制菌对氧的人越消耗从而提高溶氧水平 这看来似乎有 消极 的作 j 但从总的 经济效果来看 在供氧条什不足的情况r 控制苗体越 使发酵液中有较高的氧浓度 以致有 利下代谢产物的合成而提高产鳝 这样考虑似乎义是合理的 俞俊棠等 1 9 9 9 另外冠茁素 产生苗在常温f 2 6 c 的产量不如在低温i 1 8 c 主要原因是冠菌素的合成酶系的活性 或者酶量随温度升高降低 但是溶氧问题可能也是原因之一 因为氧气和其它气体一样 它在 水中的溶解度随着温度的升高而降低 如在常压下1 5 c 时氧在纯水中的溶解度是1 5 4 摩尔 升 在2 5 c 时 溶解度只有1 2 6 摩尔 升 下降了1 8 2 所以降低培养温度可得到较高的溶 氧值 3 起始p h 作为第二大影响因子的原因复杂 因为发酵培养基中用磷酸一氢盐和磷酸二氢 盐的不同比例来调节p h 所以不同的起始p h 意味着不同磷酸盐配比 影响较复杂 4 氮源消耗与冠菌素形成在时间上似乎有某种联系 氮源在第一天至第三天消耗最快 在第四天以后所剩氮源很少 而冠菌素的形成在第三天前几乎没有 在第四天后才大量产生 是否说明冠菌素的合成是在氮源大量消耗后才开始 如果在此时补入氨源是抑制冠菌素合成 还是促进冠菌素合成 如果认为是后者 是基于冠菌素结构上有氨基酸 要求大量合成冠菌素 就需要有充足的氮源供应 如果认为是前者 那么氮源消耗越早 合成冠菌素开始也越早 那 么加入有机氮源的发酵培养基b 和c 冠菌素产量之所以不高 有可能就是因为这两种培养基与 无机氮培养基相比在相同的时间内 氮源还没有被大量消耗 所以冠菌素的积累时间延后 以 至于产量不高 中国农她天学矮l 学链论文第爨部分邋蔫素斡姑敬 第四部分嚣菌素的提取 潮盖 产物的提取是发酵产业的重要部分 此次进行较大量的提取目的有两个 一是探索上q k 提 取静可靠途径 二是鳝凌标准样静鞠麓 由予没有有关冠蘧素夫规模提款的文献可供精錾 只 能根据本课题前期研究的结果制定提取工艺 这些结果包括 i 薤藏囊癌鲴蕴产生 分泌予藏照 2 在有机相中 8 0 以f 对冠菌素的结构和功能不受影响 3 冠萤鬃在酸性条谗下不溶予采 聪易溶于甲醇 乙醇 丙鬻 z 酸己酝中 碱蛙条 件下冠菌素形成钠盐或钾盐易溶予水 根据以上性质 设计溶媒萃取法方案 步骤如下 1 除去蘸细胞 2 浓缩过滤液 3 港媒摹取 镬越蓥素进入蠢摄稳 除去拳滚杂覆 4 用水反萃 使冠菌素进入水相 除去有机相中的杂质 5 硅胶 主屡据 迸一步纯饿冠莛素 4 1 材料和方法 4 1 1 堵养基 4 1 1 1 耱子壤募蒸 参见2 1 2 4 l 1 2 发簿培养基 参觅2 1 2 4 1 1 3 溉菌素样晶 参觅2 1 3 4 1 2 发酵和撼取设备 4 1 2 12 0 0 升发酵罐 标准溅 夹层装商加热簿 冷却水进蜀装有电磁阕 用子瀣发自控 固定式搅搀器 搅捧 速度2 4 0 r r a i n 通气量由转予流量计调节 4 1 2 2 大孔树胎 也叫大网格树脂 吸附柱 柱矗经l o 疆米 柱褰1 1 5 来 豺矮不锈钢 内装y p r l i 麓天孔辫 约8 千克 4 1 2 32 0 升减压浓缩罐 自动加热控制的标准式蒸发器 一个冷凝器和一个冷却器 中瑚农业人学坝l 学位论立第p q 部分冠菌素的提耳 c 4 1 3 有机溶剂 i 业丙酮 l 业乙酸乙酯 4 1 4 发酵工艺 4 1 4 1 菌种 1 0 4 号菌株 4 1 4 2 发酵工序 如图4 1 冰箱保存菌种移接至斜面上 2 6 1 2 培养2 天使其活化 然后从斜 面上挑取一环 接入种子培养基中 2 6 2 摇瓶培养2 4 小时 再转入3 0 个1 0 0 毫升的种子培养 基中或2 个3 0 0 0 毫升 内装1 5 0 0 毫升种子培养基 三角瓶中 2 6 c 摇瓶培养2 4 小时后接入灭 菌冷却的发酵罐中 2 6 2 发酵2 4 小时 1 8 发酵9 6 小时 即可得到成熟发酵液 保存菌种 i i2 6 c 培养2 天 0 斜面菌种 j l2 6 c 摇瓶培养2 4 小时 1 0 0 毫升种子培养基 2 6 2 摇瓶培养2 4 小时 3 0 埘鹏丁子纛量 2 6 2 发酵2 4 小时 1 8 2 发酵9 6 小时 围4 1 冠菌素的发酵工艺 4 1 4 3 发酵管理