实验性急性胰腺炎大鼠胰蛋白酶原激活肽的产生及意义初探.doc

实验性急性胰腺炎大鼠胰蛋白酶原激活肽的产生及意义初探首都医科大学学报2000年第21卷第4期高军李非孙家邦提要：探讨了胰蛋白酶原激活肽(TAP)在预测大鼠实验性急性胰腺炎严重程度中的意义。将90只大鼠按抽签法随机分为5组：EP和NP（3%和5%牛磺胆酸钠逆行胆胰管注射）组，TP（乌司他丁治疗）组，CP（生理盐水对照）组，OP（假手术）组。用酶联免疫法测定各组制模后3、6、24 h的血浆TAP浓度。结果：制模后3 h和6 h血浆TAP浓度NP组（4.7980.169)、(3.9990.299)nmol/L比EP组（2.4160.148)、(3.3560.211) nmol/L明显增高(P0.01)；在制模6 h后TP组血浆TAP浓度（1.6110.113) nmol/L，比EP组明显降低(P0.01)。提示：血浆TAP浓度可以作为预测急性胰腺炎严重程度的指标。关键词：胰蛋白酶原激活肽；急性胰腺炎；蛋白酶抑制剂胰蛋白酶原激活肽（trypsinogen activation peptides,TAP）是位于脊椎动物胰蛋白酶原氨基末端的激活肽。典型的激活肽是6肽或8肽，包括1个阳离子氨基酸残基，其中包含1个ASPASPASPASPLYS（D4K）序列1。TAP这个包含5个氨基酸的序列在脊椎动物的进化中被很好地保存了下来。迄今为止，所有哺乳动物的胰蛋白酶原氨基末端都包括D4K序列。在生理状态的消化过程中，胰蛋白酶原被十二指肠和上段空肠肠腔内的肠激酶(enterokinase，EK)和胰蛋白酶所识别并在其作用下使胰蛋白酶原氨基末端的TAP断裂下来，TAP随即被小肠粘膜内的寡肽酶降解，而有活性的胰蛋白酶被释放出来。在实验性急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)模型和临床AP患者中，肠道外的胰蛋白酶原异常激活将会导致TAP直接被释放进入腹腔和血液循环2。 近年来，TAP的测定已在AP的基础和临床研究的多个领域中得到应用，使人们在AP的研究中多了1个有用的工具，但这些研究工作多局限在国外少数几个实验室，尚未推广，而且关于TAP在不同程度和不同发病机制的AP中的产生及水平尚无统一认识。本实验研究了由不同含量的牛磺胆酸钠逆行胆胰管注射诱发的不同严重程度的大鼠急性胰腺炎中，血浆TAP的动态变化及其与胰腺组织病理学改变之间的关系，并观察胰酶抑制剂乌司他丁（ulinastatin,UTI）对血浆TAP水平和胰腺病变的影响，以探讨TAP作为早期预测AP严重程度的指标的可行性及UTI对AP的疗效。1材料和方法实验动物：雄性SD大鼠90只，体质量250350 g，购自首都医科大学实验动物中心。主要仪器：SP-100型微量注射泵（日本JMS公司）；TGL-16G恒温高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；LP-400型酶标仪（法国Basture公司）。主要试剂：牛磺胆酸钠（美国Sigma公司产品）。乌司他丁（广东天普生物化学制药有限公司产品）。TAP eIA测试药盒（爱尔兰Biotrin International公司产品）。淀粉酶测试药盒（首都医科大学临床医学科技中心产品）。实验设计：90只SD大鼠采用抽签法随机分成5大组，每大组18只。EP组（3%牛磺胆酸钠逆行胆胰管注射组）；NP组（5%牛磺胆酸钠逆行胆胰管注射组）；TP组（3%牛磺胆酸钠逆行胆胰管注射后30 min经股静脉注入乌司他丁组）；CP组（0.9%生理盐水逆行胆胰管注射组）；OP组（假手术组）。将每大组再采用抽签法随机分成3组，每组6只，分别于制模后3、6、24 h后取血处死，留取标本。动物模型的制备：实验前，大鼠禁食12 h，自由饮水。1%硫喷妥钠0.3L/g腹腔内注射麻醉。经上腹正中切口进入腹腔，于近肝门处以血管夹夹闭胆胰管。用4号头皮静脉针于十二指肠乳头附近穿刺十二指肠壁，逆行刺入胆胰管末端，十二指肠乳头处用手指捏闭胆总管末端，用SP-100微量注射泵的速度向胰胆管内注射牛磺胆酸钠，以24 mL/h恒速注入，注射量为1 L/g，持续时间为40 s。其中，EP组和TP组注入3%牛磺胆酸钠，NP组为5%牛磺胆酸钠。TP组于逆行胆胰管注射30 min后经股静脉注入乌司他丁2.5万U/mL，36 mL/h，持续1 min（用微量注射泵控制）。CP组注入与牛磺胆酸钠等量的0.9%生理盐水。OP组为假手术组，只行开关腹术。制模后于皮下注射0.9%生理盐水510 mL/只，以保证足够的血容量。标本的取得与贮存：各组动物分别于制模后3、6、24 h后取血处死。为测定血浆TAP浓度，将1 mL全血加入含有0.2 mol/L EDTA 50 L的试管中（EDTA的终浓度为510 mmol/L），在取血后60 min内用低温高速离心机分离血浆（4 ，3000 r/min，30 min），然后抽吸分离上层血浆保存于-80 环境。另留取血清测定血清淀粉酶等生化指标（置于4环境，24 h内进行）。留取胰头部分胰腺浸于10%甲醛溶液中作病理检查，病理切片采用苏木素-伊红染色。血浆TAP的测定：血浆TAP浓度的测定采用TAP酶免疫测定法试剂盒来完成。统计学处理：所有结果均用均数标准误表示，采用单因素方差分析来分析各组均数的差异，然后再进行各组间的两两比较。2结果各组血清淀粉酶测定值见表1。各组胰腺病理改变及组织病理学评分见表2。胰腺炎组动物肉眼病理改变为：胰腺颜色晦暗，明显水肿，胰腺表面及胃网膜组织表面有多处皂化斑，腹腔内有量大小不一的血性腹水。24 h组动物可见胰腺与周围脏器粘连，有的可见胰腺片状坏死，小肠等脏器有充血表现。胰腺组织病理学评分以改良的Schmidt法，并参照Pozsar的方法进行3，4。表1各组血清淀粉酶测定值U/L组别t(取血)/h3624EP3 058193*2 714203*1 32491NP3 738175*7 994393*1 690148TP2 947117*3 049296*2 180171*CP1 8191451 9681611 50933OP1 23855*1 11260*1 24145*与CP组比较P0.05;与EP组比较P0.05表2各组胰腺病理组织学评分组别t(处死)/h3624EP3.670.61*3.830.30*5.830.30*NP4.500.42*5.330.49*7.830.31*TP2.670.382.830.48*3.830.61*CP2.330.331.507OP0.660.210.88*与CP组比较P0.05；与EP组比较P0.05各组血浆TAP的浓度见表3。由表3可见，EP、NP、TP、CP与OP组血浆TAP浓度比较均有非常显著性差异(P0.01)。EP组和NP组动物在制模后3、6、24 h的血浆TAP浓度均有非常显著的差异(P0.01)。CP组动物中3组之间无显著性差异。表3各组血浆TAP浓度nmol/L组别t(取血)/h3624EP2.4160.148*3.3560.211*1.6750.188NP4.7980.169*3.9990.299*1.9370.182*TP2.6180.103*1.6110.1131.5490.142CP1.5770.1121.3690.1311.4230.103OP0.7080.015#0.7030.023#0.5450.101#*与CP组比较P0.05；与EP组比较P0.01# 与EP、NP、TP、CP组比较P0.013讨论自从Chiari 1896年提出，早期发生的肠道外酶前体激活导致了AP的组织病理学改变以来，经过100多年的研究，虽然AP的确切发病机制尚未被完全阐明，但大多数研究者认为，异常的酶激活导致的胰腺的自身消化如果不是全部的也是AP主要的致病因素。在这个酶的激活过程中，胰蛋白酶原发挥着中心作用5。胰蛋白酶原是胰腺内最丰富的蛋白酶前体物质，胰蛋白酶原激活的程度与AP的严重程度密切相关。因为1分子胰蛋白酶原只产生1分子TAP，所以定量测定组织和体液中的TAP就可以直接反应胰蛋白酶原激活的程度2。本实验的动物模型参照Aho等的方法制作6。此模型制作方法简单，病变产生速度快，重复性好。本实验表明3%和5%牛磺胆酸钠逆行胆胰管注射可以诱发出胰腺病变严重程度有明显差异的AP模型。在文献中，尚无单纯应用牛磺胆酸钠逆行胆胰管注射诱发的大鼠AP模型来研究血浆TAP浓度的报道。Wang等在用1.5%牛磺胆酸钠和0.1%牛胰蛋白酶逆行胆胰管注射诱发的大鼠AP模型中发现7，血浆TAP在制模后1 h明显增高，并持续增高至6 h。Yasuyuki nakae等用7.5%牛磺胆酸钠和5%牛胰蛋白酶逆行胆胰管注射诱发的大鼠AP模型中发现8，血清TAP峰值出现于制模后4 h。在本实验中，各实验组与假手术组相比，血浆TAP浓度明显增高，差异非常显著(P0.01)。除去NP组外，各实验组与生理盐水对照组在各时间点上亦有显著性差异。在制模后3 h和6 h，NP组血浆TAP浓度比EP组明显增高。在制模后24 h，EP组与NP组血浆TAP浓度无明显差异。EP组血浆TAP峰值出现于制模后6 h，而NP组血浆TAP峰值出现于制模后3 h。在制模后3 h，EP组与NP组动物胰腺病理组织学改变尚无显著性差异时，EP组与NP组血浆TAP浓度已有非常显著性差异。这种改变一直维持到制模后6 h。而制模后24 h胰腺病理组织学改变最严重，且2组间病理改变差异最明显时，血浆TAP浓度已无显著性差异。这表明血浆TAP浓度的升高先于胰腺病理改变的出现。在24 h胰腺病理改变最严重时，血浆TAP浓度与胰腺病变不平行可能是由于胰腺微循环灌注受损后，胰腺组织中TAP向血中释放减少所造成9。乌司他丁是1种从健康男性尿中提取的糖蛋白，是1种广谱的酶抑制剂。在本实验中，TP组动物在制模后30 min自股静脉注入UTI后发现，TP组与EP组血浆TAP浓度在制模后3 h无显著性差异，而在6 h差异有显著性。TP组动物在制模后24 h胰腺组织病理学评分比EP组明显降低，说明UTI的应用能部分抑制胰蛋白酶原的异常激活，对胰腺病变的发展亦有一定程度的抑制作用。综上所述，在牛磺胆酸钠逆行胆胰管注射诱发的大鼠AP模型中，血浆TAP浓度在制模后早期（3 h或6 h）明显增高，并因胰腺病变程度不同而出现峰值的时间不同，胰腺病变愈严重，血浆TAP峰值出现得愈早，TAP浓度也高。在胰腺病变严重时，血浆TAP浓度的升高要先于胰腺病理组织学改变的出现。因此，血浆TAP浓度作为早期预测此类AP模型严重程度的指标是可行的。高军(首都医科大学宣武医院外科实验室)李非(首都医科大学宣武医院外科实验室)孙家邦(首都医科大学宣武医院外科实验室)参考文献1，Gudmundsdottir A,Gudmundsdottir e,Oskarsson S,et al.Isolation and cha-racterization of cDNAs from Atlantic cod encoding two different forms of trypsinogen.Eur J Biochem,1993,217(3):109110972，Alistair Cook,Ahmed Jehanli.Development of radioimmunoassays for free tetra-L-aspartyl-L-lysine trypsinogen activation peptides.J Immunol methods,1988,111:1952033，Schmidt J,Lewandrowsi K,Warshaw A L,et al.Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat.Int J pancreatol,1992,12(1):41454，Pozsar J,Berger Z,Simon K,et al.Biphasic effect of prostaglandin E1 on theseverity of acute pancreatitis induced by a closed duodenal loop in rats.Pancreas,1996,12(2):1591645，Carlos fernandez-del Catillo,Schmidt J,David W,et al.Generation and possible significance of trypsinogen activation peptide in experimental acute pancreatitis in rat.Pancreas,1992,7(3):2632706，Aho H J,Koskensalo M L,Nevalainen T J.Experimental pancreatitis in the rat:Sodium tauro